CN110220987B - 胆汁酸联合标志物在制备用于预测或诊断糖尿病的检测试剂或检测物的用途 - Google Patents

胆汁酸联合标志物在制备用于预测或诊断糖尿病的检测试剂或检测物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了胆汁酸联合标志物在制备用于预测或诊断糖尿病的检测试剂或检测物的用途，胆汁酸联合标志物由甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸钠、牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸钠和牛磺熊去氧胆酸钠组成，通过检测上述胆汁酸联合标志物的浓度水平，基于上述ROC曲线计算所得数据用于预测糖尿病发生风险，检测灵敏度高、检测成本低、重复性好。

Description

胆汁酸联合标志物在制备用于预测或诊断糖尿病的检测试剂 或检测物的用途
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及胆汁酸联合标志物在制备用于预测或诊断糖尿病的检测试剂或检测物的用途。
背景技术
糖尿病(DM)是最常见的慢性疾病之一，以长期慢性高血糖为其主要临床特征，随着经济全球化和生活现代化水平的提高，糖尿病的患病率日益增加，已成为重要的全球性公共卫生问题。据世界卫生组织(WHO)报告，在2014年全球已有4.22亿成人患有糖尿病，糖尿病的全球患病率达8.5％，中国是糖尿病患病大国，据中国疾病预防控制中心和上海交通大学医学院附属瑞金医院于2010年开展的一项全国调查显示，我国成人糖尿病的患病率为11.6％，成人罹患者高达1.1亿人，糖尿病并发症多且发生率高，一旦发现难以治愈，是造成患者高死亡率的重要原因。
目前，糖尿病的诊断主要依据血浆葡萄糖的水平，但由于血糖检测易受药物、饮食、情绪等因素影响，波动较大，其诊断具有一定的局限性，且早期糖尿病起病隐匿，缺乏或无典型临床症状，一经发现往往为时已晚。因此，开发具有潜力的新型诊断检测方法，预测早期糖尿病的发生，对于降低糖尿病的发病率和死亡率具有重要意义。
近年来，代谢组学技术在糖尿病领域快速发展，色谱质谱联用技术是代谢组学的主要研究手段，胆汁酸组学技术是利用代谢组学技术探究胆汁酸对结果的作用和影响，Marlene Wewalka等的研究表明，与正常对照人群相比，糖尿病患者血清胆汁酸水平显著升高，然而目前尚无将胆汁酸联合标志物应用于新发糖尿病检测的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供胆汁酸联合标志物在制备用于预测或诊断糖尿病的检测试剂或检测物的用途，为临床上筛查早期糖尿病提供新的辅助检测方法。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
胆汁酸联合标志物在制备用于预测或诊断糖尿病的检测试剂或检测物的用途。
所述的胆汁酸联合标志物由甘氨胆酸(glycolcholic acid，GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸钠 (Sodium glycochenodeoxycholate，GCDCA)、牛磺胆酸(Taurocholic acid，TCA)、牛磺鹅去氧胆酸钠(Sodium taurochenodeoxycholate,TCDCA)和牛磺熊去氧胆酸钠(Sodiumtauroursodeoxycholate，TUDCA)组合。
所述的糖尿病为2型糖尿病。
所述的检测试剂或为血液检测试剂。
所述的检测物或为试剂盒，且所述试剂盒包含上述由甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸钠、牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸钠和牛磺熊去氧胆酸钠组合而成的胆汁酸联合标志物，分别作为用于对应的血清代谢物甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸钠、牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸钠和牛磺熊去氧胆酸钠定性的标准品。
所述的用途通过岛津nexera x2超高效液相色谱、岛津三重四级杆8050质谱仪的electrospray ionization(ESI)源负离子模式检测人血清中所述胆汁酸联合标志物浓度水平。
进一步地，通过检测人血清中所述胆汁酸联合标志物浓度水平后进行ROC曲线统计分析，并经上述ROC曲线下面积判断受试者患2型糖尿病风险，当ROC曲线下面积＞0.7提示受试者患有2型糖尿病的风险。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
将由甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸钠、牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸钠和牛磺熊去氧胆酸钠组合而成的胆汁酸联合标志物制备用于预测或诊断糖尿病的检测试剂或检测物，为临床上筛查早期糖尿病提供新的辅助检测方法和理论依据。
附图说明
图1为实施例中胆汁酸联合标志物用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图。
图2为(A)验证组湖北中心胆汁酸联合标志物用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图；(B) 验证组吉林中心胆汁酸联合标志物用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图；(C)验证组甘肃中心胆汁酸联合标志物用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图；(D)验证组贵州中心胆汁酸联合标志物用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图；(E)验证组浙江中心胆汁酸联合标志物用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
糖尿病的定义：空腹血糖(FBG)≥126mg/dL或餐后2小时血糖(2-h BG)≥200mg/dL，或研究对象自报之前由专业医师诊断过糖尿病和正在服用降糖药物。
本实例先从发现人群(n＝122)中，我们采用岛津nexera x2超高效液相色谱，质谱仪为岛津三重四级杆8050，采用electrospray ionization(ESI)源负离子模式用于分析血清中不同胆汁酸进行检测，经过校正相关混杂因素(包括年龄、BMI、空腹血糖、吸烟及饮酒状态、糖尿病家族史、教育水平、体育活动等)，结果发现5种胆汁酸与糖尿病的发生具有显著统计学意义：甘氨胆、甘氨鹅脱氧胆酸钠、牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸钠和牛磺熊去氧胆酸钠。
再在来自全国不同省份的5个验证中心(吉林、甘肃、湖北、浙江和贵州)人群(n＝550) 中对结果进行验证，发现以上5种胆汁酸对糖尿病的发病风险仍具有显著相关性，如图2所示。
然后在ROC模型中显示，与传统诊断标志物空腹血糖(FBG)和餐后2小时血糖(2-hBG) 相比，当加上上述胆汁酸联合标志物后，其对2型糖尿病的诊断灵敏度和特异度显著增高，曲线下面积从0.7713增加到0.8388，如图1所示。
具体操作过程为：
(1)血清样品收集和处理
所有纳入研究的志愿者在血清样品采集前均签署知情同意书。在相同条件下收集122例 (发现组)和550例(验证组)研究对象的血液标本，采集后静置60分钟后直接取血清，储存于-80℃的冰箱中保存备用。
(2)研究对象
采用病例对照研究方法，发现组从全国队列4C研究人群中纳入符合标准的基线葡萄糖耐量正常(NGR)者共122例，其中包括随访后61例新发糖尿病者和61例NGR者。验证组从4C队列人群中纳入基线NGR者共550例，其中包括随访后225例新发糖尿病者和225 例NGR者。纳入标准为：1)研究对象年龄≥40岁，2)接受口服葡萄糖耐量试验(OGTT)；排除标准：基线时已患有糖尿病或糖调节功能受损。此外，所有受试者均接受标准的问卷调查和体格检查。
采用空腹静脉血浆标本检测FBG，OGTT-2h静脉血浆标本检测2-h BG。使用ADVIA-1650 化学自动分析仪(Bayer Diagnostics，Tarrytown，NY，USA)测量FBG和2-h BG的浓度。
表1：发现组人群的基线特征
Control Case P value
N 61 61
Age，years 51.64±7.91 53.02±7.59 0.3291
Malegender，no.(％) 29(47.54) 29(47.54) 1.0000
BMI，kg/m<sup>2</sup> 25.21±3.54 25.30±3.59 0.8888
Education,no.(％) 27(44.26) 24(39.34) 0.7137
Currentsmoking，no.(％) 19(31.15) 13(21.31) 0.3034
Currentdrinking，no.(％) 11(18.03) 8(13.11) 0.6185
Physicallyactive，no.(％) 3(4.92) 0(0) 0.2438
Familyhistoryofdiabetes，no.(％) 3(4.92) 6(9.84) 0.4909
SBP，mmHg 133.38±17.37 141.18±21.63 0.0301
DBP，mmHg 78.01±10.32 82.48±12.79 0.0358
FBG，mg/dL 5.51±0.35 5.55±0.38 0.6162
2-hBG，mg/dL 5.52±1.44 6.46±0.94 <0.0001
HDL-c，mg/dL 1.41±0.32 1.34±0.28 0.1825
LDL-c，mg/dL 3.22±0.97 2.96±0.82 0.1170
TG，mg/dL 1.39(1.02-2.04) 1.45(1.08-2.11) 0.0031
ALT,U/ml 21.18±14.04 21.77±12.76 0.8085
AST,U/ml 13.06±14.00 8.10±12.00 0.5892
Fasting insulin，uU/mL 6.42±4.31 7.98±4.17 0.0438
HOMA-IR 1.59±1.09 1.98±1.06 0.0483
从表1结果表明，与NGR者相比，糖尿病患者基线时仅TG存在显著差异，而HDL-c 和LDL-c在组间没有统计学差异。
(3)血清样本预处理
取血液样品50μL，加入200μL含内标(每个化合物所采用内标及各内标浓度请见表1) 乙腈提取目标化合物并沉淀蛋白，涡旋，离心，吸取上清200μL冻干，用50μL含25％乙腈水溶液复溶，等待进样。
(4)胆汁酸组学分析
液相仪器为岛津nexera x2超高效液相色谱，质谱仪为岛津三重四级杆8050，采用electrospray ionization(ESI)源负离子模式用于样品分析。主要参数包括：nebulizinggas flow 3 L/min，heating gas flow 10L/min，interface temperature 300℃，DLtemperature 250℃，heat block temperature 400℃，drying gas flow 10L/min。Multiple Reaction Monitoring(MRM)被用于检测各胆汁酸结果。
样品采集的液相分离条件同为：色谱柱为100mm×2.1mm ACQUITY UPLC C8，粒径1.7μm(Waters,USA)，A相含10mM碳酸氢铵水溶液，B相为纯乙腈。初始时25％B相，保持0.5分钟。随后在12.5分钟内线性升高到40％B。接着，在1min内升高到90％B，冲洗3min，然后在0.5min恢复到初始流动相，平衡2.5分钟。流速为0.35ml/min，柱温35℃，进样体积 5μL。
用多元Logistic回归方程对测量的胆汁酸进行与新发2型糖尿病的风险评估后发现，在校正了年龄、体质量指数、吸烟、饮酒、体育活动、教育水平、糖尿病家族史和FBG后，共有5种胆汁酸与2型糖尿病的发生风险增加显著相关：甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸钠、牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸钠和牛磺熊去氧胆酸钠。
用数据统计软件SAS进一步将甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸钠、牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸钠和牛磺熊去氧胆酸钠作为胆汁酸联合标志物通过ROC曲线判断其对2型糖尿病的检测效果，结果如图1和2所示。
图1中，发现组结果显示，与FBG和2-h BG对诊断糖尿病发生风险的曲线下面积0.7713 相比，当联合标志物用于糖尿病的预测诊断时，得到ROC曲线的曲线下面积值增高到0.8388。
图2A中，验证组湖北中心结果显示，与FBG和2-h BG用于诊断新发糖尿病的曲线下面积0.6986相比，联合标志物用于诊断新发糖尿病的曲线下面积增高到0.7557。
图2B中，验证组吉林中心的曲线下面积由0.6798增高到0.7344。
图2C中，验证组甘肃中心的曲线下面积由0.6796增高到0.7273。
图2D中，验证组贵州中心的曲线下面积由0.7311增高到0.7886。
图2E 中，验证组浙江中心的曲线下面积由0.8240增高到0.8788。
以上结果表明该联合标志物具有较好的糖尿病诊断潜力，同时与临床诊断指标FBG和 2-h BG具有较好协同作用。由此可见，由上述5种胆汁酸组成的胆汁酸联合标志物可以作为 2型糖尿病的新型血清标志物，为临床上评估糖尿病的发生风险提供辅助检测途径。
以上所述为本发明的较佳实施例，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (2)

1.胆汁酸联合标志物在制备用于预测或诊断2型糖尿病的血液检测试剂中的用途，所述胆汁酸联合标志物由甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸钠、牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸钠和牛磺熊去氧胆酸钠组合。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，通过检测人血清中所述胆汁酸联合标志物的浓度水平后进行ROC曲线统计分析，经上述ROC曲线下面积预测或判断2型糖尿病风险，所述ROC曲线下面积＞0.7可作为受试者患有2型糖尿病风险的指标。
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