CN105296620B - 肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志 - Google Patents

肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志 Download PDF

Info

Publication number
CN105296620B
CN105296620B CN201510703463.9A CN201510703463A CN105296620B CN 105296620 B CN105296620 B CN 105296620B CN 201510703463 A CN201510703463 A CN 201510703463A CN 105296620 B CN105296620 B CN 105296620B
Authority
CN
China
Prior art keywords
visible
peristalsis
acarbose
intestinal peristalsis
diabetes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510703463.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105296620A (zh
Inventor
宁光
张东亚
王卫庆
王晓凯
顾燕云
冯强
刘瑞欣
徐晓强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI INST OF ENDOCRINE-METABOLIC DISEASE
BGI Shenzhen Co Ltd
Original Assignee
SHANGHAI INST OF ENDOCRINE-METABOLIC DISEASE
BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI INST OF ENDOCRINE-METABOLIC DISEASE, BGI Shenzhen Co Ltd filed Critical SHANGHAI INST OF ENDOCRINE-METABOLIC DISEASE
Priority to CN201510703463.9A priority Critical patent/CN105296620B/zh
Priority to EP15907079.6A priority patent/EP3301185B1/en
Priority to US15/771,398 priority patent/US20180340225A1/en
Priority to KR1020187003917A priority patent/KR102061985B1/ko
Priority to PCT/CN2015/097566 priority patent/WO2017071018A1/zh
Priority to JP2018511310A priority patent/JP6644133B2/ja
Publication of CN105296620A publication Critical patent/CN105296620A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105296620B publication Critical patent/CN105296620B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G01N27/622—Ion mobility spectrometry
    • G01N27/623—Ion mobility spectrometry combined with mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志；所述肠道微生物宏基因特征为拟杆菌属肠型。本发明首次运用肠型的概念发现了，具有不同肠道寄生菌群的2型糖尿病患者，对糖尿病降糖药物，阿卡波糖的治疗反应差别显著，因此，在用该药前，可以对患者进行肠型的分型，以选择最佳疗效人群，判别个体2型糖尿病患者是否适合运用阿卡波糖进行糖尿病治疗。此外，肠型惯常的分型是利用粪便中的寄生菌的DNA进行测序或PCR扩增，然而基线情况下胆汁酸组分，尤其是次级胆汁酸即能对肠型有良好的区分作用；可实现通过血中的标志物鉴定肠型，成为用于诊断的标志。

Description

肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志
技术领域
本发明具体涉及一种肠道微生物宏基因特征在作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志物中的用途。
背景技术
目前2型糖尿病治疗领域并没有药物疗效判断，以及治疗前的分型诊断。根据2型糖尿病的病理生理机制，主要为胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷。虽然2型糖尿病治疗领域内分别有针对胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷的药物，但是对于患者本身以胰岛素抵抗还是分泌缺陷为主的分型诊断并没有科学简便可行的方法。
现有临床上有可行性的方案是，测量患者BMI，腰围和胰岛素水平。BMI，腰围超过中国人标准，或者通过患者空腹血糖和胰岛素水平计算HOMAIR值即可判断其存在胰岛素抵抗。而胰岛素水平并无国际或国内通用标准，一般以患者血糖和胰岛素计算得HOMAβ指数来代表，但无法做为判断胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷的程度的指标，因此无法满足精准医疗的要求。
临床上目前能够精确评判胰岛素抵抗和β细胞功能的实验为葡萄糖钳夹实验。评判胰岛素抵抗水平运用正糖高胰岛素水平的葡萄糖钳夹实验，而β细胞胰岛素分泌功能运用高葡萄糖水平的钳夹实验。这两种方法历时长，患者需卧床4-5个小时，需名有经验的医护人员操作，对患者进行多点采血，实时监测血糖，同时测定胰岛素水平。代价高昂，患者依从性差，不易在临床开展。
所谓精准医学把临床个体化诊疗的诉求提到了一个新的高度。肿瘤靶向药物已经应用到临床。然而，迄今并未找到一个2型糖尿病靶向治疗的有效方案。2型糖尿病的治疗方案繁多，患者反应不一，是导致2型糖尿病的血糖控制率低下的一个原因。针对2型糖尿病主要发病机制，胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗的药物种类不可谓不多，但是患者本身以胰岛素抵抗为主，还是胰岛素分泌缺陷为主并没有简单确切的临床诊断方法。
目前的研究把肝脏、脂肪(胰岛素抵抗)和胰岛β细胞(胰岛功能)做为参与2型糖尿病发病的主要器官。而最近肠道微生物群落以及肠道粘膜上皮吸收，屏障以及内分泌功能的病理生理在2型糖尿病的发病机制以及治疗策略中的地位越来越受到重视。比如肠道菌群宏基因组研究发现，肠道菌群在2型糖尿病患者和正常患者中有显著差异[Qin,J.,etal.,A metagenome-wide association study of gut microbiota in type2diabetes.Nature,2012.]而肠道改道的减肥手术除了减轻肥胖患者的体重，出乎意料得可使得肥胖型2型糖尿病患者的血糖在术后脱离药物治疗也能得到良好的控制，甚至达到彻底治愈[Carlsson,L.M.S.,et al.,Bariatric Surgery and Prevention of Type2Diabetes in Swedish Obese Subjects.New England Journal of Medicine,2012.367(8):p.695-704,Schauer,P.R.,et al.,Bariatric surgery versus intensive medicaltherapy for diabetes--3-year outcomes.N Engl J Med,2014.370(21):p.2002-13]。而模拟肠道激素作用的药物，比如GLP-1激动剂以及DPPIV抑制剂等也已成为世界范围内处方量最大的口服降糖药物，并有不少相关心血管的受益。
肠型[Arumugam,M.,et al.,Enterotypes of the human gutmicrobiome.Nature,2011.473(7346):p.174-80]的概念被Peer Bork首次提出，意即肠道寄生菌组成成分在人群中有比较固定的模式。人群中大概可以分成2-3类，随着样本的增多和测序技术的提高，尤其是二代测序的推广，目前的肠型分型为2类，一个普氏菌属为主的普氏肠型，一个是拟杆菌属为主的拟杆肠型。目前看来肠型和人体的各种医疗健康指标并未找到直接相关的证据，相应的基因功能研究提示不同肠型代谢维生素的能力有差异，且与宿主荤素饮食习惯有关。然而，虽然肠道寄生菌群也被认为是参与药物在人体内代谢的一个重要媒介[Haiser,H.J.and P.J.Turnbaugh,Is it time for a metagenomic basisof therapeutics？Science,2012.336(6086):p.1253-5],目前无临床试验证据可以证明。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术存在的肠型和人体的各种医疗健康指标缺少直接相关的证据的缺陷，提供了肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志；具体提供了一种肠道微生物宏基因特征在作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志物中的用途。本发明首次发现具有不同肠道寄生菌群的2型糖尿病患者，对糖尿病降糖药物，阿卡波糖的治疗反应差别显著，因而，以拟杆菌属为主的拟杆肠型可作为2型糖尿病患者阿卡波糖疗效筛选标志。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种肠道微生物宏基因特征在作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志物中的用途，所述肠道微生物宏基因特征为拟杆菌属肠型。
优选的，所述拟杆菌属肠型是通过对离体粪便中的寄生菌的DNA进行测序或PCR扩增来确定的。
优选的，所述PCR扩增具体包括：提取离体粪便中寄生菌DNA，针对特异富集的菌属，进行16Srna PCR扩增。
优选的，所述拟杆菌属肠型是通过检测离体血液样本中的次级胆汁酸来确定的。所述次级胆汁酸包括UDCA、TUDCA、GUDCA、DCA、TDCA、GDCA、LCA、TLCA、GLCA。在本发明研究的对象中，主要发现两种肠型一个普氏菌为主的普氏肠型，一个是拟杆菌为主的拟杆肠型。在拟杆肠型中，次级胆汁酸中的脱氧胆酸和石胆酸水平显著低于普氏肠型，而有保护作用的熊脱氧胆酸则高于普氏肠型。进一步肠道宏基因组分析，也发现熊去氧胆酸进一步降解成石胆酸的KO明显在普氏肠型中富集。说明两种肠型的患者，其肠道菌群代谢胆汁酸的能力有显著差异。
优选的，所述次级胆汁酸的检测包括如下步骤：
S1、样品预处理：每75μL血液样品，加入300μL含内标甲醇，提取目标化合物并沉淀蛋白，涡旋、离心，吸取上清，冻干，用50μL含25％(体积)乙腈水溶液复溶，等待进样；
S2、检测：采用1290Infinity液相及6460A三重四级杆质谱联用系统用于样品分析；
液相分离采用100mm×2.1mm ACQUITY UPLC C8色谱柱，粒径1.7μm，A相为10mMNH4HCO3水溶液，B相为纯乙腈；初始时25％(体积)B相，保持0.5分钟，随后在12.5分钟内线性升高到40％(体积)B相，接着，在1min内升高到90％(体积)B相，并冲洗系统3分钟，在0.5分钟恢复到25％(体积)B相，平衡2.5分钟，流速为0.35ml/min，柱温35℃，进样体积5μL；
质谱采用ESI源负离子模式检测，主要参数如下：Gas Temp:350℃；Gas Flow:8l/min；Nebulizer:40psi；Sheath Gas Temp:400℃；Sheath Gas Flow:8l/min；Capillary:3500V；Nozzle voltage:400V。
优选的，拟杆菌属肠型的2型糖尿病患者阿卡波糖疗效包括降糖外改善胰岛素抵抗、降低次级胆汁酸、促进心血管风险降低。
优选的，所述降低有害次级胆汁酸的指标包括：GDCA,TDCA,TLCA，降低牛磺酸结合胆汁酸指标包括，TCA,TDCA,TLCA,TUDCA。
优选的，所述改善胰岛素抵抗的指标包括空腹血糖下降，空腹C肽和胰岛素水平的下降，腰臀比下调，HOMA胰岛素抵抗指数下调，Adiponectin上调。
优选的，所述促进心血管风险降低的指标包括PDGFAA、PDGFAABB、内皮素、VegfC血浆因子的下降。
本发明还涉及一种用于2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选的试剂盒，所述试剂盒包括：
收集离体粪便样品或离体血液样品的试剂；
对离体粪便样品中的寄生菌的DNA进行测序或PCR扩增来确定肠型的试剂，或检测离体血液样本中的次级胆汁酸来确定肠型的试剂。
检测出的肠型主要有两种肠型，一个是普氏菌为主的普氏肠型，一个是拟杆菌为主的拟杆肠型。不同肠型可以预测患者接受阿卡波糖治疗糖尿病的受益，尤其是降糖外改善胰岛素抵抗，降低次级胆汁酸，促进心血管风险降低的作用。具体而言，拟杆菌属肠型具有更好的降糖外改善胰岛素抵抗，降低次级胆汁酸，促进心血管风险降低的作用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明首次运用肠型的概念发现了，具有不同肠道寄生菌群的2型糖尿病患者，对糖尿病降糖药物，阿卡波糖的治疗反应差别显著。因此，在用该药前，可以对患者进行肠型的分型，以选择最佳疗效人群，判别个体2型糖尿病患者是否适合运用阿卡波糖进行糖尿病治疗。
2)肠型惯常的分型是利用粪便中的寄生菌的DNA进行测序或PCR扩增，然而基线情况下胆汁酸组分，尤其是次级胆汁酸即能对肠型有良好的区分作用；可实现通过血中的标志物(即血浆中次级胆汁酸的水平)鉴定肠道寄生菌群落的分型(即，肠型)，成为用于诊断的标志。
附图说明
图1为肠型分型示意图，其中，A、拟杆菌肠型生物属水平聚类及相关关系，B、普氏菌肠型生物属水平聚类及相关关系，C、拟杆菌属生物丰度在两个肠型中的比较，D、普氏菌属生物丰度在两个肠型中的比较，EntB:拟杆菌肠型。EntP:普氏菌肠型；
图2为两种肠型中各类临床疗效指标在阿卡波糖治疗后的变化示意图，黑色代表治疗后显著下降，白色代表治疗后显著上升，灰色代表治疗后无显著变化，P<0.05；
图3为胆汁酸谱在两种肠型中的差异及阿卡波糖治疗后的变化示意图，其中，A、两种肠型基线水平有差异的胆汁酸，B、两种肠型胆汁酸谱在两个肠型基线中的差异，C、次级胆汁酸代谢相关两条KO在两个肠型基线水平中的差异，D、两种肠型在阿卡波糖治疗后水平有变化的胆汁酸成分及其信号图，黑色代表治疗后显著下降，白色代表治疗后显著上升，灰色代表治疗后无显著变化，P<0.05。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
对初发2型糖尿病患者进行用药前评估肝肾功能，血糖血脂指标，肠道激素，炎症因子，以及心血管风险相关因子。并留取大便，尿液，以及血样。诊断明确，评估完成后，给予3个月阿卡波糖300mg每天的剂量进行治疗。3月内每月随访血糖，根据血糖调整用药。3月后，重复用药前评估，并同样留取尿液，大便和血样。
具体步骤如下：
1、临床标本收集
a)首先运用随机开放、阳性对照方法，收集初发2型糖尿病人群及其正常配偶对照人群,比较糖尿病患者服用阿卡波糖前后不同时期的临床及生化资料，胃肠运动情况并同时收集血样及粪便标本。在初诊未用药的2型糖尿病患者进行常规检查，包括粪便和血样留取。粪便样品的采集
b)粪便
ⅰ、实验器材：塑料小盆(直径小于家用抽水马桶口径)
ⅱ、保鲜袋，无菌细长柄小勺
ⅲ、无菌50ml离心管
ⅳ、将塑料小盆(直径小于家用抽水马桶口径)放入抽水马桶中，套上保鲜袋(勿将保鲜袋边缘浸入马桶的水中)；如在医院内取样可直接在清洁便盆内套上保鲜袋，留取粪便样品；
ⅴ、用细长柄小勺将新鲜粪便样品上层混匀，挑取少量装入无菌的50ml离心管中，每管取至少10g样品，旋紧管盖(离心管壁上标明采样时间，采样个体组别、编号)。每个受试者每次留取大便，共取3管样品(RNAlater处理管，甘油管，以及无处理管)
ⅵ、采集的样品均立即置于－80℃冻存。
c)血清标本的留置
ⅰ、空腹抽取静脉血15ml，其中1.5ml检测血浆糖，余6.5ml于普管(含抑肽酶，DPPV抑制剂),6.5ml于抗凝管(含肝素和RNA later)
ⅱ、普管血于4℃离心，待血清析出后吸出约3ml，平均分于3个1.5ml Eppendorf中，盖紧管盖；
ⅲ、抗凝血需立即于4℃离心，析出血浆约3ml，平均分于3个1.5ml进口RNAasefree Eppendorf管中，
ⅳ、管上详细注明标本姓名，中心编号和随机号；
ⅴ、用胶布封管盖一周；
ⅵ、置于－20℃保存(有条件者可置于－80℃)，分装血浆需立即置于-20℃或干冰内。
2、胆汁酸测定
试剂：Sodium taurochenodeoxycholate(TCDCA)，Sodium glycocholate hydrate(GCA)，Sodium taurodeoxycholate(TDCA)，Chenodeoxycholic acid(CDCA)，Ursodeoxycholic acid(UDCA)，Taurocholic acid(TCA)，Sodium glycodeoxycholate(GDCA)，Glycoursodeoxycholic acid(GUDCA)，Cholic acid(CA)，Deoxycholic acid(DCA)，Sodium glycochenodeoxycholate(GCDCA)，Sodium tauroursodeoxycholate(TUDCA)，Sodium taurolithocholate(TLCA)，Lithocholic acid(LCA)，NH4HCO3均购自美国Sigma公司；Glycochenodeoxycholic Acid 3-Sulfate Disodium Salt(GCDCS)由浙江大学实验室合成；Chenodeoxycholic Acid-d4(CDCA-d4)，Glycochenodeoxycholic Acid-d53-Sulfate Disodium Salt(GCDCS-d5)，Taurochenodeoxycholic Acid-d5(TCDCA-d5)，Cholic Acid-d5(CA-d5)，Glycocholic acid-d5(GCA-d5)，Lithocholylglycine(GLCA)均购自加拿大TRC公司；Taurodeoxycholic Acid-d5(TDCA-d5)，Taurocholic acid-d5(TCA-d5)购自美国CIL公司。乙腈，甲醇购自德国Merk公司。
样品预处理：取血液样品75μL，加入300μL含内标甲醇，提取目标化合物并沉淀蛋白，涡旋30S，转速15000rpm离心10min，吸取上清200μL，冻干，用50μL含25％乙腈水溶液复溶，等待进样。仪器方法:1290Infinity液相(Agilent,USA)及6460A三重四级杆质谱(Agilent,USA)联用系统用于样品分析。液相分离采用100mm×2.1mm ACQUITY UPLC C8色谱柱，粒径1.7μm(Waters,USA)。A相10mM NH4HCO3水溶液，B相纯乙腈。初始时25％B相，保持0.5分钟。随后在12.5分钟内线性升高到40％B。接着，在1min内升高到90％B，并冲洗系统3分钟，在0.5分钟恢复到25％B，平衡2.5分钟。流速为0.35ml/min，柱温35℃，进样体积5μL。质谱采用ESI源负离子模式检测。主要参数如下：Gas Temp:350℃；Gas Flow:8l/min；Nebulizer:40psi；Sheath Gas Temp:400℃；Sheath Gas Flow:8l/min；Capillary:3500V；Nozzle voltage:400V。各胆汁酸检测采用反应监测模式(MRM)。内标的配置浓度及主要的质谱参数如表1所示，胆汁酸分析的质谱参数设置如表2所示，
表1内标的配置浓度及主要的质谱参数
表2胆汁酸分析的质谱参数及校正采用内标
3、肠道菌群DNA测序
HiSeq 2500测序，每个样本以350bp长度的片段建库与9.9M人类肠道基因集比对。得到IMG的门，种，属的生物谱系(with门水平是70％的覆盖率和65％识别率，属水平有85％识别率,以及95％的种水平的识别率)。运用主成分分析的方法(PCA)对肠道寄生菌聚类进行分析判断。
本发明通过对患者粪便进行肠道微生物集落DNA抽提和宏基因组二代测序，并与已发表的9.9M人类肠道宏基因组基因集进行比对，比对率达到77％左右。运用聚类分析的方法找到有注释信息的肠道微生物在用药前后有差异的大概143种。根据属水平的情况进行分析的结果，发现2型糖尿病患者基线的肠道菌群有不同聚集的情况，据此根据特征性肠道菌群聚集的情况，得到所谓肠型(Enterotype)。在本发明研究的对象中，主要发现两种肠型一个普氏菌为主的普氏肠型，一个是拟杆菌为主的拟杆肠型(图1)。
根据肠型分型后，两种类型的2型糖尿病患者，性别年龄分布并无显著差异。基线血糖，体重以及各项肝肾功能等健康指标均无明显差异。仅红细胞，血红蛋白和白介6在普氏肠型中略高(P<0.05)。(表3)
治疗后观察基线状态下两组人群对该药治疗糖尿病的疗效。
首先，阿卡波糖最主要的疗效体现在餐后2小时血糖和糖化血红蛋的降低程度。这两个指标并没有在两种肠型中体现出差异(图2，表4)
第二，两种肠型在控制空腹血糖水平上出现了差异，无论是看治疗后较治疗前是否改善，还是看治疗后相对治疗前的改善程度，均在拟杆肠型中显著；而普氏肠型的2型糖尿病患者并无明显的空腹血糖改善。而其余代谢相关指标包括，胰岛素，体重，体重指数，腰围，心血管风险因子以及肠道激素等，均有明显差异。
空腹C肽和胰岛素水平均在拟杆肠型中在治疗后显著下降，经过计算，体现胰岛素抵抗的HOMAIR指数在阿卡波糖治疗后下降，但这种受益仅在拟杆肠型中显著，而普氏肠型中下降不显著。提示拟杆肠型的2型糖尿病患者更易在服用阿卡波糖后改善其胰岛素抵抗的状态。与胰岛素抵抗相关而标准餐诱导的胰岛素释放曲线，腰臀比和Adiponectin水平都是拟杆肠型肠型的T2DM患者接受拜糖平治疗后显著下降。在普氏肠型中这些疗效都不显著。
阿卡波糖带来血清甘油三酯，APOA和舒张压的降低，两个肠型中的治疗后变化并无显著差异，然而PDGFAA和PDGFAABB,内皮素，VegfC等一些和糖尿病血管并发症相关的血浆因子在拟杆肠型中下降显著，提示了有更好的降低血糖降低大血管病变风险以外，拟杆肠型在应用阿卡波糖后亦能收获更多降低血管并发症的益处。
肠道激素中作为最近2型糖尿病治疗领域中的热门靶点，其水平在阿卡波糖的应用中也得到显著改变。在检测到的几个肠道激素中，用药后上升的GLP1,glucagon,PYY,以及各个时间点的ghrelin和GIP都在拟杆肠型中显著，但在普氏肠型中不显著。提示如果阿卡波糖任何通过肠道激素所带来的代谢益处，可能都只在拟杆肠型中更为显著。
第三，两种肠型在基线水平上就出现了胆汁酸谱的差异(图3A、B)。在拟杆肠型中，次级胆汁酸中的脱氧胆酸和石胆酸水平显著低于普氏肠型，而有保护作用的熊脱氧胆酸则高于普氏肠型。进一步肠道宏基因组分析，也发现熊去氧胆酸进一步降解成石胆酸的KO明显在普氏肠型中富集(图3C)。提示两种肠型的患者，其肠道菌群代谢胆汁酸的能力有显著差异。经过阿卡波糖治疗之后，胆汁酸组成差异在两种肠型中更为显著(图3D)。两种初级胆汁酸在阿卡波糖治疗后在两种肠型中菌显著的升高，但并未出现肠型特异的变化,提示阿卡波糖可能整体影响了胆汁酸在小肠的重吸收。
因此，该研究显示，不同肠型可以预测患者接受阿卡波糖治疗糖尿病的受益，尤其是降糖外改善胰岛素抵抗，降低次级胆汁酸，促进心血管风险降低的作用。肠型的诊断，可以运用普通的DNA PCR扩增特征菌属的16sRNA即可完成，方便经济。为2型糖尿病的精准医疗带来新的可能。
表3两个肠型基线临床指标比较
表4

Claims (5)

1.一种肠道微生物宏基因特征在作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志物中的用途，其特征在于，所述肠道微生物宏基因特征为拟杆菌属肠型；
拟杆菌属肠型的2型糖尿病患者阿卡波糖疗效包括降糖外改善胰岛素抵抗、降低次级胆汁酸、促进心血管风险降低。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述拟杆菌属肠型是通过对离体粪便中的寄生菌的DNA进行测序或PCR扩增来确定的。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述PCR扩增具体包括：提取离体粪便中寄生菌DNA，针对特异富集的菌属，进行16Srna PCR扩增。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述改善胰岛素抵抗的指标包括空腹血糖下降，空腹C肽和胰岛素水平的下降，腰臀比下调，HOMA 胰岛素抵抗指数下调，Adiponectin上调。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促进心血管风险降低的指标包括PDGFAA、PDGFAABB、VegfC血浆因子的下降。
CN201510703463.9A 2015-10-26 2015-10-26 肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志 Active CN105296620B (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510703463.9A CN105296620B (zh) 2015-10-26 2015-10-26 肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志
EP15907079.6A EP3301185B1 (en) 2015-10-26 2015-12-16 Intestinal metagenomic feature as selection marker of curative effect of acarbose for treating type 2 diabetes
US15/771,398 US20180340225A1 (en) 2015-10-26 2015-12-16 Intestinal metagenomic feature as selection marker of curative effect of acarbose for treating type 2 diabetes
KR1020187003917A KR102061985B1 (ko) 2015-10-26 2015-12-16 제2형 당뇨병을 가진 환자에서 아카보즈 효능 스크리닝 마커로서의 장 미생물 메타게놈 특성의 용도
PCT/CN2015/097566 WO2017071018A1 (zh) 2015-10-26 2015-12-16 肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志
JP2018511310A JP6644133B2 (ja) 2015-10-26 2015-12-16 ２型糖尿病患者のアカルボース治療効果のスクリーニング方法及び試薬キット

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510703463.9A CN105296620B (zh) 2015-10-26 2015-10-26 肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105296620A CN105296620A (zh) 2016-02-03
CN105296620B true CN105296620B (zh) 2019-01-15

Family

ID=55194439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510703463.9A Active CN105296620B (zh) 2015-10-26 2015-10-26 肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20180340225A1 (zh)
EP (1) EP3301185B1 (zh)
JP (1) JP6644133B2 (zh)
KR (1) KR102061985B1 (zh)
CN (1) CN105296620B (zh)
WO (1) WO2017071018A1 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950779A (zh) * 2016-07-22 2016-09-21 昆明医科大学第附属医院 艾滋病相关肠道普氏菌移位的特异性检测引物及应用
CN105950780A (zh) * 2016-07-22 2016-09-21 昆明医科大学第附属医院 艾滋病相关肠道梭形巨单胞菌移位的特异性检测引物及应用
CN108072704B (zh) * 2016-11-08 2021-05-11 中国科学院大连化学物理研究所 基于液相色谱质谱联用的粪便中胆汁酸的检测方法
CN107510697A (zh) * 2017-09-12 2017-12-26 上海市内分泌代谢病研究所 一种降糖药在阻断肠道共生菌次级胆汁酸生成的应用
CN107625775A (zh) * 2017-09-12 2018-01-26 上海市内分泌代谢病研究所 一种降糖药在提高人肠共生扭链瘤胃球菌及udca丰度的应用
CN111134329A (zh) * 2018-11-06 2020-05-12 深圳华大生命科学研究院 植物性多聚糖作为制备肠型相关的高尿酸血症药物的应用
CN109797190B (zh) * 2019-03-11 2020-05-05 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种用于评估ii型糖尿病风险的微生物标志物及其应用
CN110220987B (zh) * 2019-06-11 2021-09-28 上海市内分泌代谢病研究所 胆汁酸联合标志物在制备用于预测或诊断糖尿病的检测试剂或检测物的用途
CN111370069B (zh) * 2020-02-26 2023-09-12 康美华大基因技术有限公司 一种人体肠道菌群检测方法、装置及存储介质
CN112458157A (zh) * 2020-12-01 2021-03-09 贾卫国 一种基于肠道微生物的体外代谢活性检测系统

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1872781A4 (en) 2005-04-20 2009-04-01 Kissei Pharmaceutical COMBINED PHARMACEUTICAL PREPARATION FOR THE TREATMENT OF TYPE 2 DIABETES
US20100172874A1 (en) 2006-12-18 2010-07-08 The Washington University Gut microbiome as a biomarker and therapeutic target for treating obesity or an obesity related disorder
JP6133005B2 (ja) * 2010-02-25 2017-05-24 富士フイルム株式会社 一次胆汁酸及び二次胆汁酸生成調節剤
CN102477460A (zh) * 2010-11-24 2012-05-30 深圳华大基因科技有限公司 对宏基因组16s高可变区v6进行测序聚类分析的方法
WO2014019271A1 (en) * 2012-08-01 2014-02-06 Bgi Shenzhen Biomarkers for diabetes and usages thereof
WO2014019408A1 (en) * 2012-08-01 2014-02-06 Bgi Shenzhen Biomarkers for diabetes and usages thereof
CN104603283B (zh) 2012-08-01 2017-09-19 深圳华大基因研究院 确定异常状态相关生物标志物的方法及系统
CN104540962B (zh) * 2012-08-01 2017-09-19 深圳华大基因研究院 糖尿病生物标志物及其应用
US20150299776A1 (en) * 2012-10-03 2015-10-22 Metabogen Ab Identification of a Person having Risk for Atherosclerosis and Associated Disease by the Person's Gut Microbiome and the Prevention of such Diseases
ES2683826T3 (es) * 2012-10-17 2018-09-28 Institute National De La Recherche Agronomique Determinación de la diversidad bacteriana intestinal reducida
KR101445243B1 (ko) * 2014-03-28 2014-09-29 서울대학교산학협력단 장내 세균의 군집과 기능의 변화를 이용한 대사성 및 염증성 질환의 조기진단

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017071018A1 (zh) 2017-05-04
JP2018516593A (ja) 2018-06-28
EP3301185A1 (en) 2018-04-04
EP3301185A4 (en) 2018-06-13
KR20180021388A (ko) 2018-03-02
EP3301185B1 (en) 2021-09-15
JP6644133B2 (ja) 2020-02-12
KR102061985B1 (ko) 2020-01-02
CN105296620A (zh) 2016-02-03
US20180340225A1 (en) 2018-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105296620B (zh) 肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志
JP7454867B2 (ja) 肝疾患関連バイオマーカーおよびその使用方法
Gupta et al. Role of small intestinal bacterial overgrowth and delayed gastrointestinal transit time in cirrhotic patients with minimal hepatic encephalopathy
Ginos et al. Circulating bile acids in healthy adults respond differently to a dietary pattern characterized by whole grains, legumes and fruits and vegetables compared to a diet high in refined grains and added sugars: a randomized, controlled, crossover feeding study
Pai et al. Deoxycholic acid activates β-catenin signaling pathway and increases colon cell cancer growth and invasiveness
JP2018516593A5 (ja) ２型糖尿病患者のアカルボース治療効果のスクリーニング方法及び試薬キット
Kord Varkaneh et al. Effects of the 5: 2 intermittent fasting diet on non-alcoholic fatty liver disease: a randomized controlled trial
CN103627785B (zh) 胃癌的生物标志物dact1
Lee et al. Associations among SPARC mRNA expression in adipose tissue, serum SPARC concentration and metabolic parameters in Korean women
CN108866045A (zh) 一种人类粪便dna提取方法
KR20210014609A (ko) 비알코올성 지방간 질환의 예측 또는 진단용 키트, 및 진단방법
Pan et al. Distinct common signatures of gut microbiota associated with damp-heat syndrome in patients with different chronic liver diseases
CN115089622A (zh) 芹菜外泌体组合物及其制备方法与应用
Hasan et al. The association among serum leptin, insulin and insulin resistance in Iraqi patients with cholelithiasis
Liang et al. GLP-1 receptor agonists modulate blood glucose levels in T2DM by affecting Faecalibacterium prausnitzii abundance in the intestine
Wu et al. Imidazole propionate is increased in diabetes and associated with stool consistency
AL-Obiady et al. Determination of Hormones and Some Liver Enzyme in the Patient with Gallstone in Diyala Governorate.
CN107385100A (zh) Mcm8作为胃腺癌转移标志物的用途
CN106706925B (zh) 一种筛查或辅助诊断炎症性肠病的方法及适用于该方法的试剂盒
Jasim et al. Serum Zonulin Levels as New parameter into Non-Alcoholic Fatty Liver Disease and Coronary Artery Disease
Zhumaevich A METHOD FOR PREDICTING A POLYDEFICIENCY STATE IN ELDERLY AND SENILE PERSONS
CN115466776A (zh) 检测嗜酸性粒细胞的试剂、嗜酸性粒细胞及其胞质内容物和羟基二十二碳六烯酸的应用
Llop-Talaveron et al. SUN-PO065 GENETIC CONDITIONS IN THE ALTERATION OF LIVER FUNCTION TESTS IN ADULT HOSPITALIZED PATIENTS TREATED WITH PARENTERAL NUTRITION WITH LIPIDS OF VEGETAL ORIGIN
Filik High-density lipoprotein, apolipoprotein AI concentrations, and celiac disease
CN116735732A (zh) 缺血性脑卒中预后程度标志物的筛选方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant