KR20220040782A - 대사체 분석을 이용한 제2형 당뇨병 위험도 예측 방법 및 키트 - Google Patents

대사체 분석을 이용한 제2형 당뇨병 위험도 예측 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대사체 분석을 이용한 제2형 당뇨병 위험도 예측 방법 및 키트에 관한 것으로, 구체적으로는 혈청 대사체인 스퍼민(spermine), 헥소스(hexose, H1), 이소류신(Ile), 발린(Val), 알라닌(Ala), 류신(leu), SM (OH) C22:2 (Hydroxy sphingomyelin C22:2), PC ae C34:3(Phosphatidylcholine acyl-alkyl C34:3), PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3 및 PC aa C42:1(Phosphatidylcholine diacyl C42:1)의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병 위험도 예측 방법 및 상기 혈청 대사체의 농도를 측정하는 장치를 포함하는 제2형 당뇨병 위험도 예측 키트를 제공한다.

Description

대사체 분석을 이용한 제2형 당뇨병 위험도 예측 방법 및 키트{A KIT AND METHOD FOR PREDICTING TYPE 2 DIABETES RISK SCORE BY USING ANALYSIS OF METABOLITES}
본 발명은 대사체 분석을 이용한 제2형 당뇨병 위험도 예측 방법 및 키트에 관한 것으로, 구체적으로는 혈청 대사체인 스퍼민(spermine), 헥소스(hexose, H1), 이소류신(Ile), 발린(Val), 알라닌(Ala), 류신(leu), SM (OH) C22:2 (Hydroxy sphingomyelin C22:2), PC ae C34:3(Phosphatidylcholine acyl-alkyl C34:3), PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3 및 PC aa C42:1(Phosphatidylcholine diacyl C42:1)의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병 위험도 예측 방법 및 상기 혈청 대사체의 농도를 측정하는 장치를 포함하는 제2형 당뇨병 위험도 예측 키트를 제공한다.
당뇨병(Diabetes mellitus)은 완치가 어려우며 발병하면 지속적인 약물 치료와 생활습관 관리가 필요한 만성질환이다.
국내 30세 이상 성인의 당뇨병 유병률은 2007년 9.7%에서 2017년 12.4%로 꾸준히 증가하고 있으며(질병관리본부, 2019), 전국의 의료기관에서 실제로 당뇨병 치료를 받는 환자 수 또한 해마다 증가하여 2018년에는 302만 8128명에 달하였다.
당뇨병은 췌장의 베타 세포(β-cell)가 파괴되어 체내 인슐린(insulin) 생산이 저하됨으로써 절대적 인슐린 결핍 상태가 나타나는 제1형과 체내 인슐린 저항성(insulin resistance)이 현저하게 높아져 인슐린의 생산, 분비기능과 무관하게 상대적 인슐린 결핍 상태를 보이는 제2형으로 구분되는데, 이 중에서 성인에게 빈발하는 당뇨병 유형은 제2형(2형 당뇨; type 2 diabetes mellitus)이다(American Diabetes Association, 2010). 현재까지 알려진 2형 당뇨 발생의 위험 인자로는 비만, 연령, 당뇨병 가족력, 인종, 고혈압, 적은 신체활동량, 식이습관, 임신성 당뇨병, 다낭성 난소 증후군 또는 심혈관 질환의 기왕력, 저고밀도콜레스테롤(high-density lipoprotein cholesterol; HDL)혈증, 고중성지방혈증 등이 있다.
대사체학(Metabolomics)은 생체내 저분자인 대사산물(metabolites)을 체내 수치와 질병과 같은 다양한 표현형 간의 관련성을 포괄적으로 해석하여, 표현형 결정에 중요한 영향을 미치는 생물학적 기전과 원인을 총체적으로 연구하는 생물학의 한 분야이다. 특히, 대사체는 시료 수집 순간까지 발생된 생체내 생화학적 변화 과정에 대한 다양한 정보를 반영하기 때문에 유전체로부터 입력된 정보와 변화무쌍한 환경적 영향에 의해 나타나는 기능적 표현형을 대변할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 대사체와 유전체의 통합 분석을 통해 유전변이에 대한 기능적 증거(functional evidence) 제시가 가능하고, 이를 통해 제2형 당뇨의 병리 생리학적 기전이나 질병을 이해하는데 유용한 정보를 획득할 수 있다.
당뇨를 예측하는 모델은 인구학적 변수와 임상 지표를 활용하여 당뇨의 위험도를 계산하고 국내에서도 임상 지표를 활용한 당뇨 위험도를 예측하기 위한 연구들이 있었다.
첫 번째로 국민 건강 영양 조사 데이터를 활용한 당뇨 예측 모델은 나이, 가족력, 고혈압 여부, 허리 둘래, 흡연 상태, 및 음주 상태를 예측 변수로 하여 로지스틱 회귀 분석을 하였을 때 0.73의 AUC를 나타내는 것으로 보고하였다(Lee, Yong-ho, et al. "A simple screening score for diabetes for the Korean population: development, validation, and comparison with other scores." Diabetes care 35.8 (2012): 1723-1730.)
두 번째 연구는 한국인 유전체 역학 조사 데이터를 활용하여 당뇨 예측 모델을 만들었고 사용된 변수로는 나이, 당뇨 가족력, 흡연 여부, 체질량지수, 고혈압 여부, 공복혈당, HDL 콜레스테롤, 중성 지방, 당화 혈색소를 예측 변수로 사용하였으며 0.77의 AUC를 나타내었다(Lim, Nam-Kyoo, et al. "A risk score for predicting the incidence of type 2 diabetes in a middle-aged Korean cohort." Circulation Journal 76.8 (2012): 1904-1910.)
최근에는 임상 변수에 유전적 위험도를 추가하여 당뇨의 위험도를 예측하기 위한 연구들이 수행되었고 국내에서도 임상 변수에 유전적 위험도(gentic risk score)를 활용하여 당뇨 위험도를 에측한 연구에서 0.77 정도의 AUC를 나타내었다.
대한민국 등록특허 제10-1764323호
유전적 위험도에 기반한 당뇨병 위험도 예측 모델은 기존 임상 지표를 이용하였을 때에 비하여 유의미한 예측력의 차이를 가지고 오지 못하였으며 이를 개선할 수 있는 새로운 바이오 마커 및 예측 변수를 활용한 당뇨 위험도 예측 모델이 필요하다. 이에 본 발병은 당뇨와 관련된 대사체를 이용하여 제2형 당뇨병의 위험도를 예측하는데 있어 필요한 정보를 제공하기 위한 최적의 예측 모델을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시 예에서, 혈청 대사체인 스퍼민(spermine), 헥소스(hexose, H1), 이소류신(Ile), 발린(Val), 알라닌(Ala), 류신(leu), SM (OH) C22:2 (Hydroxy sphingomyelin C22:2), PC ae C34:3(Phosphatidylcholine acyl-alkyl C34:3), PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3 및 PC aa C42:1(Phosphatidylcholine diacyl C42:1)의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병 위험도 예측 방법 또는 제2형 당뇨병 위험도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 대사체는 랜덤 포레스트 예측 모델에 의하여 선별되었다.
상기 혈청 대사체 중 스퍼민(spermine), SM (OH) C22:2, PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3, 류신(leu)의 농도가 대조군의 시료에서보다 증가하는 경우 제2형 당뇨병 발병 저위험군으로 예측할 수 있다. 본 발명의 실험 결과에 따르면, 상기 혈청 대사체는 1SD 증가하는 경우 당뇨 위험도가 감소하는 것으로 나타났다.
구체적으로 스퍼민(spermine), SM (OH) C22:2, PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3, 류신(leu)의 농도가 대조군의 시료(평균값)에서보다 1SD 증가하는 경우 제2형 당뇨병 발병 저위험군으로 예측할 수 있다.
상기 혈청 대사체 중 헥소스(hexose), 이소류신(Ile), 발린(Val), PC ae C34:3, 알라닌(Ala), PC aa C42:1의 농도가 대조군의 시료에서보다 증가하는 경우 제2형 당뇨병 발병 고위험군으로 예측할 수 있다. 본 발명의 실험 결과에 따르면, 상기 혈청 대사체는 1SD 증가하는 경우 당뇨 위험도가 증가하는 것으로 나타났다.
구체적으로 헥소스(hexose), 이소류신(Ile), 발린(Val), PC ae C34:3, 알라닌(Ala), PC aa C42:1의 농도가 대조군의 시료에서보다 1SD 증가하는 경우 제2형 당뇨병 발병 고위험군으로 예측할 수 있다.
상기 대사체의 농도를 측정하기 이전에 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은 인구학적(Demographic) 변수인 나이, 성별, 고혈압 유무, 체질량지수, 가족력, 흡연 및 음주량을 평가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은 생화학적 인자인 당화혈색소, 공복혈당, 총콜레스테롤, HDL 콜레스테롤 및 중성지방을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 혈청 대사체인 스퍼민(spermine), 헥소스(hexose, H1), 이소류신(Ile), 발린(Val), 알라닌(Ala), 류신(leu), SM (OH) C22:2 (Hydroxy sphingomyelin C22:2), PC ae C34:3(Phosphatidylcholine acyl-alkyl C34:3), PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3 및 PC aa C42:1(Phosphatidylcholine diacyl C42:1)의 농도를 측정하는 장치를 포함하는 제2형 당뇨병 위험도 예측 키트를 제공한다.
상기 예측 키트는 스퍼민(spermine), SM (OH) C22:2, PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3, 류신(leu)의 농도가 대조군의 시료에서보다 증가하는 경우 제2형 당뇨병 발병 저위험군이라고 표시할 수 있다.
또한 상기 예측 키트는 헥소스(hexose), 이소류신(Ile), 발린(Val), PC ae C34:3, 알라닌(Ala), PC aa C42:1의 농도가 대조군의 시료에서보다 증가하는 경우 제2형 당뇨병 발병 고위험군이라고 표시할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 혈청 대사체인 스퍼민(spermine), 헥소스(hexose, H1), 이소류신(Ile), 발린(Val), 알라닌(Ala), 류신(leu), SM (OH) C22:2 (Hydroxy sphingomyelin C22:2), PC ae C34:3(Phosphatidylcholine acyl-alkyl C34:3), PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3 및 PC aa C42:1(Phosphatidylcholine diacyl C42:1)의 농도 변화에 따른 지표를 인구학적 변수와 임상 지표와 함께 사용하는 경우 제2형 당뇨병의 발병 예측 정확도를 증가시키는 효과가 있다.
도 1은 혈청 대사체 135개로 랜덤 포레스트 예측 모델을 구축할 때 중요도(0.012)에 따라 분류한 그래프이다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 "상에" 또는 "전에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "~ (하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
일 실시 예에 따르면, 본 발명의 제2형 당뇨병 위험도 예측 방법 또는 제2형 당뇨병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법으로, 상기 방법은 혈청 대사체 중 스퍼민(spermine), 헥소스(hexose, H1), 이소류신(Ile), 발린(Val), 알라닌(Ala), 류신(leu), SM (OH) C22:2 (Hydroxy sphingomyelin C22:2), PC ae C34:3(Phosphatidylcholine acyl-alkyl C34:3), PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3 및 PC aa C42:1(Phosphatidylcholine diacyl C42:1)의 농도를 측정하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 “혈청 대사체"란 혈액 기원의 액상 시료로부터 수득한 대사 산물을 의미한다. 상기 혈액 기원의 액상 시료는 예를 들어 전혈, 혈장, 또는 혈청이다. 일 실시예에서, 상기 혈액 기원의 액상 시료는 혈청이다. 상기 혈액 기원의 액상시료는 혈청 대사체의 검출을 위해, 전처리할 수 있으며, 예를 들어 여과, 증류, 추출, 분리, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 혈청 대사체는 대사 및 대사 과정에 의해 생산된 물질, 또는 생물학적 효소 및 분자에 의한 화학적 대사 작용으로 발생한 물질 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것(예컨대, 대사 이상 또는 당뇨병의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "제2형 당뇨병"은 인슐린은 정상적으로 분비되나 인슐린이 제 기능을 못하는 경우에 발병하는 당뇨병을 말하며 "성인형 당뇨병" 또는 "인슐린 비의존형 당뇨병"으로도 불리운다. 제2형 당뇨병은 세포가 췌장에서 생성된 인슐린에 효과적으로 반응하지 않는 경우에 발생하는데 이러한 상태를 인슐린 저항성이라고 한다. 인슐린 저항성이 있는 환자들은 처음에는 정상적인 혈당을 유지하기 위해 추가적으로 더 많은 인슐린을 생산하는데, 결국에는 인슐린 저항성이 진행하여 췌장이 인슐린 요구량을 감당할 수 없게 되어 혈당이 상승하게 되는 것이다.
본 발명자는 제2형 당뇨병 환자는 정상인과 비교하여 헥소스(hexose, H1), 이소류신(Ile), 발린(Val), PC ae C34:3, PC ae C42:4, 알라닌(Ala) 및 PC aa C42:1의 농도가 증가하였으며, 스퍼민(spermine), SM (OH) C22:2, PC ae C42:1, PC ae C36:3 및 류신(leu)의 농도가 감소하는 것을 확인하였다.
상기 12개의 혈청 대사체는 총 135개의 대사체 중에서 랜덤 포레스트 알고리즘을 이용하여 impurity-based feature importance (or mean decrease impurity; MDI)라는 feature selection 방식을 통해서 선별하였다.
랜덤 포레스트(random forest, RF; Breiman L, Machine Learning 45(1):5-32, 2001)는 CART의 의사결정나무의 조합으로 이루어진 Bagging 알고리즘의 일종으로 Leo Breiman과 Adele Cutler에 의해 제안된 방법이다. 각 나무들의 마디들은 고차원을 갖는 자료를 하위 차원들의 작은 조각으로 나눠 빠르게 분류할 수 있도록 구성되어 있다. 이런 각 나무들은 조합(Ensemble)과 투표(Voting)에 의해 최종적인 분류를 완료하게 된다. 확률 분포가 같은 랜덤 벡터(Random Vector)에 의해 생성된 나무들은 각각 독립적으로 구성되고, 구성된 나무들의 개수를 무한으로 가져가면 오분류가 일반화되어 수렴하게 되는데, RF는 불규칙성(Randomness)과 Out-of-bag(Random Selection without Replacement) 기법을 이용하여 Adaboost 만큼의 정확도를 낼 수 있게 하고 경계면과 잡음(Noise)에 강한 성능을 보이며, Bagging과 Boosting 보다 빠르게 수렴하도록 도와주는 효과를 낸다.
RF 알고리즘은 자체적으로 주어진 데이터로부터 (training data set, test data set)를 복수 개(예를 들어 50개, 이 개수는 옵션으로 사용자가 조정 가능함) 만들어서 각각으로부터 의사결정 나무를 생성한다. 이렇게 되면 독립적인 의사결정 나무가 50개 생성되게 된다. 이렇게 50개의 의사결정 나무를 생성한 뒤에, 테스트 세트(test set)를 넣으면 하나의 테스트 샘플당, 50개의 결정(당뇨/정상)을 갖게 되며(각 의사결정 나무로부터 나온 값), 50개의 결정 값을 추려서 많은 쪽(majority vote)으로 최종 결과를 갖게 된다. 예를 들어 사람 A의 경우 45개의 의사결정 나무는 암으로 판정하고 5개의 의사결정 나무는 정상으로 판정했다면, vaverage score(전체 50개의 판정 중에서 암으로 판정된 비율)=45/50=0.9로 계산된다. 이때 암/정상을 구분하는 기준이 되는 컷-오프 값(cutoff value)을 0.5로 가정했을 때 A의 average score 0.9는 0.5보다 크므로 "당뇨"로 판정할 수 있다.
상기 혈청 대사체는 랜덤 포레스트 방식에 의하여 중요도 0.012를 기준으로 하였을 때 상위 12개를 선별한 것이다.
상기 혈청 대사체의 농도는 크로마토그래프(liquid chromatography, LC) 및 질량분석기로 측정될 수 있으며, 상기 크로마토그래피는 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할수 있다.
상기 질량분석기는 MALDI-TOF MS, Q-TOF MS, 또는 흐름주입-질량분석기(FIA MS)를 포함하지만, 이에 제한되지 않고 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정성용 질량분석기를 사용할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 질량분석기는 흐름주입-질량분석기이다. 상기 혈청 대사체는 다른 이동성에 따라 액체 크로마토크래피에서 각 성분들이 분리되며, 질량분석기를 거쳐 얻어진 정보를 이용하여 정확한 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elemental composition)를 통해 구성성분을 확인할 수 있다.
상기 혈청 대사체의 농도는 바람직하게 액체크로마토그래프(liquid chromatography, LC) 및 흐름주입-질량분석기를 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 제2형 당뇨병 위험도 예측 방법 또는 제2형 당뇨병 위험도를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 인구학적(Demographic) 변수의 평가 단계 또는 생화학적 인자의 측정 단계와 함께 이루어질 수 있다.
상기 인구학적 변수의 평가 단계는 나이, 성별, 고혈압 유무, 체질량 지수, 가족력, 흡연 및 음주량을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
또한 상기 생화학적 인자의 측정 단계는 당화혈색소, 공복혈당, 총콜레스테롤, HDL 콜레스테롤 및 중성지방을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명자는 본 발명의 제2형 당뇨병 위험도 예측 방법을 인구학적 변수의 평가 결과와 함께 당뇨병 발생 예측 정확도(ROC)를 측정한 결과, 인구학적 변수만을 이용하였을 때에 비해 본 발명의 12가지 대사체 정보를 추가적으로 사용할 경우 예측정확도는 14.2% 증가하였고 (AUC = 0.623 에서 0.765)로 증가하였다.
또한 본 발명의 제2형 당뇨병 위험도 예측 방법을 인구학적 변수 및 생화학적 인자와 함께 사용하였을 때, 인구학적 변수 및 생화학적 인자만을 사용한 경우에 비하여 예측 정확도(ROC)가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이에, 결과적으로 현재 사용되고 있는 인구학적 변수 및 생화학 인자에 본 발명의 12개의 대사체 정보를 추가할 경우 더욱 정밀한 당뇨 예측 능력을 확보할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 혈청 대사체인 스퍼민(spermine), 헥소스(hexose, H1), 이소류신(Ile), 발린(Val), 알라닌(Ala), 류신(leu), SM (OH) C22:2 (Hydroxy sphingomyelin C22:2), PC ae C34:3(Phosphatidylcholine acyl-alkyl C34:3), PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3 및 PC aa C42:1(Phosphatidylcholine diacyl C42:1)의 농도를 측정하는 장치를 포함하는 제2형 당뇨병 위험도 예측 키트를 제공한다.
상기 혈청 대사체 또는 상기 혈청 대사체의 농도를 측정하는 장치에 대한 설명은 전술한 바와 동일하므로, 중복 기재를 피하기 위하여 생략한다.
또한 상기 제2형 당뇨병 위험도 예측 키트는 상기 혈청 대사체의 농도를 측정한 결과와 함께 제2형 당뇨병 위험도를 표시할 수 있는 디스플레이부를 더 포함할 수 있다. 이러한 디스플레이부는 당업자에 의하여 용이하게 실시될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실험예>
1. 실험 대상자 선별 및 의학적, 생화학적 특성 분석
본 발명의 실험대상자들은 한국인 유전체 역학조사사업중 2005년과 2006 에 사업에 참여한 7515명 중 역학 자료, 생화학적 자료, 대사체 자료가 있는 대상자 1905명 중 2형 당뇨로 진단받지 않은 대상자 1425명을 선별하였다. 당뇨 진단은 [표 1] 미국 당뇨 협회 2020년 가이드라인에 따랐다. 참여자 대상자의 의학적, 생태학적 특징은 [표 2]에 나타내었다.
공복혈당 당화혈색소 2시간
경구혈당부하검사
정상군 <100 <5.7 <140
당기능장애군 100-125 5.7-6.4 140-199
2형 당뇨군 ≥126 ≥ 6.5 ≥ 200
대상자의 의학적, 생화학적 특징
역학 및 생화학 지표 당뇨 비 발생군 당뇨 발생군
n (%) 1094 (76.8 %) 331 (23.2 %)
성별 (여성, n (%)) 613 (56.0 %) 168 (50.8 %)
나이 (연령) 55.6 ± 8.9 57.0 ± 8.5
고혈압, n (%) 273 (25.0 %) 112 (33.8 %)
체질량 지수 (kg/m^2) 24.0 ± 3.1 25.2 ± 3.2
당뇨 가족력, n (%) 22 (2 %) 8 (2.4 %)
흡연력, n (%)
비흡연군 714 (65.3 %) 197 (59.5%)
과거흡연군 185 (16.9 %) 64 (19.3 %)
현재흡연군 195 (17.8 %) 70 (21.1 %)
음주량, g/week 8.0 ± 18.0 11.8 ± 25.4
당화 혈색수 (%) 5.4 ± 0.3 5.8 ± 0.3
골복혈당 (mg/dL) 87.6 ± 9.0 97.6 ± 10.3
총 콜레스테롤 (mg/dL) 191.5 ± 34.1 195.8 ± 37.2
HDL 콜레스테롤 (mg/dL) 45.2 ± 10.1 41.9 ± 9.1
중성 지방 (mg/dL) 125.0 ± 95.5 177.4 ± 158.0
2. 대사체 분석
연구 참여자 1425명의 혈청 시료로부터 AbsoluteIDQTM p180 kit (BIOCRATES Life Sciences, Innsbruck, Austria)를 활용하여 186개의 대사체를 정량적으로 분석하였다. 상기 대사체 중 40개의 아실카르티닌(acylcarnitines), 1개의 헥소스(hexose), 90개의 글리세로인지질(glycerophospholipids)의 수치는 흐름주입-질량 분석법(flow injection analysis/tandem mass spectrometry; FIA-MS/MS) 을 통하여 분석하였고 21개의 아미노산(amino acids), 19개의 바이오제틱 아민(biogenic amines)은 액체크로마토그래프(liquid chromatography/tandem mass spectrometry; LC-MS/MS)을 사용하여 분석하였다.
3. 통계적 분석
프로그램 R 과 Python을 활용하여 2형 당뇨와 연관성이 있는 대사체를 불순도 기반 변수 중요도 (impurity-based feature importance ranking method of the random forest; RF) 알고리즘을 사용하여 선별하였다. 선별 기준은 Importance 기준 0.012를 사용하였고 선별 기준을 통과한 대사체만 예측 알고리즘에 포함되었다. 총 3가지의 예측 모델을 구성하였고 로지스틱 회귀 분석과 랜덤 포레스트 분석을 통하여 대사체의 2형 당뇨 예측 능력을 비교 분석하였다.
1번 모델의 변수는 인구학적(Demographic) 변수인 나이, 성별, 고혈압 유무, 체질량 지수, 가족력, 흡연 및 음주를 포함하였고 2번 모델은 1번 모델에 추가적으로 선별된 대사체를 포함하여 2형 당뇨 예측 능력을 분석하였다.
3번 모델은 1번 모델에 생화학적 인자(임상 지표)인 당화혈색소, 공복혈당, 총콜레스테롤, HDL 콜레스테롤 및 중성지방을 추가하였고 4번 모델은 3번 모델에 대사체를 추가하여 2형 당뇨 예측 능력을 비교하였다.
상기 인구학적 특성(Demographic) 및 생화학적 인자는 대한당뇨병학회에서 발행하는 당뇨병 진료지침에 따라 평가하였다.
4. 분석 결과 검증
상기 분석 결과의 타당성을 확인하기 위해서 로지스틱 회귀 분석과 랜덤포레스트(random forest) 분석을 통해 나온 결과값은 10번의 교차 검증과 100회 반복을 거쳤으며 최종 모델 성능은 교차 검증 결과의 앙상블로 나타내었다.
<실험결과>
1. 대사체 분석 및 변수 선별
1425명에 대한 186개의 대사체 분석 결과 아래의 정도 관리 기준을 통과한 135개의 대사체가 선별되었다(13개의 acylcarnitines, 21 amino acids, 10 biogenic amines, 1 hexose, 78 glycerophospholipids, and 12 sphingolipids);
첫째, 36개 참조표준(reference standard) 시료 농도의 변동계수(coefficient of variance) < 25%,
둘째, 검출 한계(limit of detection) 빈도 > 50%.
셋째, 실험용 시료군에서 대사체 정량 검출한계 빈도 > 50%.
상기 선별된 135개의 대사체 중에서 불순도 기반 변수 중요도 알고리즘의 중요도 0.012를 기준으로 하였을 때 상위 12개의 대사체가 아래와 같이 선별되었다(도 1).
상기 12개의 대사체는 변수를 임의 추출하여 여러 개의 분류자를 생성하고 이로부터 하나의 분류자를 만드는 통계적 기법인 랜덤 포레스트(random forest; Breiman L, Machine Learning 45(1):5-32, 2001) 방법을 사용하였다.
* 선별된 12개의 대사체
Spermine, Hexose(H1), Isoleucine(Ile), Valine(Val), Phosphatidylcholine acyl-alkyl(PC ae) C34:3, Hydroxy sphingomyelin(SM (OH)) C22:2', PC ae C42:1, PC ae C42:4, Alanine, PC ae C36:3, Phosphatidylcholine diacyl(PC aa) C42:1, Leucine(leu).
2. 통계 분석 결과
선별된 12개의 대사체를 대상으로 1094명의 당뇨 비발생군과 331 당뇨군을 대상으로 로지스틱 회귀분석과 랜덤 포레스트 분석을 수행하여 2형 당뇨 위험도를 분석하였다.
[표 3]에서 역학 인자 중에서 나이가 증가할수록 당뇨의 위험이 1.17배 증가하였고, 고혈압이 있는 경우 당뇨의 위험도가 1.12배 증가하였다. 체질량 지수가 증가할수록 당뇨의 위험도는 1.34배 증가하는 것으로 나타났다.
생화학 검사 결과 중에서 당뇨 진단 기준에 들어가는 혈당과 당화 혈색소를 제외하고 중성 지방이 1SD 증가할 때 2형 당뇨의 위험은 41% 증가하였다.
대사체 중에서는 Spermine, SM (OH) C22:2, PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3, Leucine의 경우 1SD 증가할 때 당뇨 위험도가 감소하는 것으로 나타났으며, Hexose, Isoleucine, Valine, PC ae C34:3, Alanine, PC aa C42:1의 경우 1SD 증가할 때 당뇨 위험도가 증가하는 것으로 나타났다.
Demo Demo + Clinical Demo + Clinical + PRS Demo + Clinical + PRS + Metabolites
Variable OR (95 % CI) p-value OR (95 % CI) p-value OR (95 % CI) p-value OR (95 % CI) p-value
성별 1.04 (0.89, 1.2) 0.608 1.05 (0.88, 1.26) 0.564 1.08 (0.88, 1.32) 0.482 1.12 (0.89, 1.41) 0.331
나이 1.17 (1.04, 1.31) 0.009 0.98 (0.86, 1.12) 0.795 1.14 (0.99, 1.32) 0.078 1.16 (1.0, 1.34) 0.056
고혈압 유무 1.12 (1.0, 1.26) 0.049 1.12 (0.98, 1.26) 0.09 1.07 (0.93, 1.24) 0.312 1.08 (0.94, 1.25) 0.272
체질량지수 1.34 (1.19, 1.5) <0.0001 1.0 (0.86, 1.13) 0.88 1.14 (0.97, 1.33) 0.111 1.09 (0.93, 1.29) 0.281
가족력 1.04 (0.93, 1.16) 0.493 1.0 (0.86, 1.17) 0.953 1.04 (0.88, 1.23) 0.661 1.04 (0.92, 1.19) 0.522
흡연 1.04 (0.89, 1.22) 0.603 1.01 (0.85, 1.21) 0.876 1.02 (0.84, 1.25) 0.809 1.02 (0.84, 1.25) 0.811
음주량 1.11 (0.98, 1.27) 0.097 1.01 (0.89, 1.14) 0.907 1.04 (0.92, 1.19) 0.516 1.04 (0.88, 1.24) 0.623
당화혈색소 2.04 (1.75, 2.37) <0.0001 1.88 (1.58, 2.22) <0.0001 1.8 (1.51, 2.15) <0.0001
공복혈당 1.64 (1.41, 1.91) <0.0001 1.54 (1.3, 1.83) <0.0001 1.44 (1.16, 1.8) 0.001
총콜레스테롤 0.87 (0.76, 1.01) 0.073 0.95 (0.8, 1.11) 0.498 1.01 (0.83, 1.23) 0.905
HDL콜레스테롤 0.92 (0.79, 1.07) 0.283 0.9 (0.76, 1.06) 0.215 0.94 (0.77, 1.14) 0.536
중성지방 1.41 (1.14, 1.76) 0.002 1.15 (0.93, 1.41) 0.195 1.11 (0.89, 1.39) 0.349
대사체
Spermine 　 　 　 　 　 　 0.86 (0.75, 0.99) 0.032
Hexose 　 　 　 　 　 　 1.06 (0.89, 1.26) 0.019
Isoleucine 　 　 　 　 　 　 1.15 (0.84, 1.58) 0.371
Valine 　 　 　 　 　 　 1.09 (0.85, 1.41) 0.502
PC ae C34:3 　 　 　 　 　 　 1.04 (0.80, 1.34) 0.781
SM (OH) C22:2 　 　 　 　 　 　 0.88 (0.73, 1.06) 0.188
PC ae C42:1 　 　 　 　 　 　 0.95 (0.81, 1.12) 0.570
PC ae C42:4 　 　 　 　 　 　 0.94 (0.77, 1.13) 0.497
Alanine 　 　 　 　 　 　 1.02 (0.92, 1.14) 0.047
PC ae C36:3 　 　 　 　 　 　 0.87 (0.68, 1.12) 0.292
Leucine 　 　 　 　 　 　 0.95 (0.69, 1.32) 0.768
PC aa C42:1 　 　 　 　 　 　 1.04 (0.87, 1.25) 0.675
3. 역학, 생화학 지표 및 선별된 대사체를 활용한 당뇨 예측
상기 변수와 대사체가 당뇨 발생을 얼마나 잘 예측하는지 3개의 모델을 통해 검증하였다.
첫번째 모델은 나이, 성별, 고혈압 유무, 체질량 지수, 가족력, 흡연 및 음주를 포함하였고 두번째 모델은 1번 모델에 추가적으로 선별된 대사체를 포함하여 2형 당뇨 예측 능력을 분석하였다.
세번째 모델은 2번 모델에 혈당, 당화혈생소, 총 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤을 추가하여 2형 당뇨 예측 능력을 분석하였다.
모델 Type Model Sensitivity Specificity AUC
모델 1 Demo. Logistic 0.7159 0.5427 0.6230±0.0502
RF 0.7734 0.4840 0.6154±0.0500
모델 2 Demo + Metabo Logistic 0.7659
RF 0.7847
모델 3 Demo. + Clin. Logistic 0.8124 0.7797 0.8442±0.0361
RF 0.8003 0.7785 0.8445±0.0357
모델 4 Demo. + Clin. + Metabo. Logistic 0.8479 0.7592 0.8507±0.0340
RF 0.8391 0.7683 0.8527±0.0341
예측 정확도는 ROC(Receiver-Operating Characteristic) 분석을 통해 수행하여 AUC(Area Under Curve)를 계산하였다. 역학 자료만을 이용하였을 때에 비해 대사체 정보를 추가적으로 사용할 경우 예측정확도는 14.2% 증가하였다(AUC = 0.623 에서 0.765).
역학 자료와 생화학 분석 결과를 함께 사용할 경우 역학 자료 단독으로 분석한 결과보다 22.3% 높은 예측 정확도를 보여주었고 (AUC =0.623 에서 0.844), 여기에 대사체 정보를 추가하면 더욱 높은 예측 정확도를 확보할 수 있었다. (AUC 0.852) 결과적으로 현재 사용되고 있는 역학 및 생화학 지표에 대사체 정보를 추가할 경우 더욱 정밀한 당뇨 예측 능력을 확보할 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 혈청 대사체인 스퍼민(spermine), 헥소스(hexose, H1), 이소류신(Ile), 발린(Val), 알라닌(Ala), 류신(leu), SM (OH) C22:2 (Hydroxy sphingomyelin C22:2), PC ae C34:3(Phosphatidylcholine acyl-alkyl C34:3), PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3 및 PC aa C42:1(Phosphatidylcholine diacyl C42:1)의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병 위험도 예측 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    스퍼민(spermine), SM (OH) C22:2, PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3, 류신(leu)의 농도가 대조군의 시료에서보다 1SD 증가하는 경우 제2형 당뇨병 발병 저위험군으로 예측하는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    헥소스(hexose), 이소류신(Ile), 발린(Val), PC ae C34:3, 알라닌(Ala), PC aa C42:1의 농도가 대조군의 시료에서보다 1SD 증가하는 경우 제2형 당뇨병 발병 고험군으로 예측하는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 대사체의 농도를 측정하기 이전에 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 인구학적(Demographic) 변수인 나이, 성별, 고혈압 유무, 체질량 지수, 가족력, 흡연 및 음주량을 평가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 생화학적 인자인 당화혈색소, 공복혈당, 총콜레스테롤, HDL 콜레스테롤 및 중성지방을 측정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 대사체는 랜덤 포레스트 예측 모델에 의하여 선별된 것인, 방법.
  8. 혈청 대사체인 스퍼민(spermine), 헥소스(hexose, H1), 이소류신(Ile), 발린(Val), 알라닌(Ala), 류신(leu), SM (OH) C22:2 (Hydroxy sphingomyelin C22:2), PC ae C34:3(Phosphatidylcholine acyl-alkyl C34:3), PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3 및 PC aa C42:1(Phosphatidylcholine diacyl C42:1)의 농도를 측정하는 장치를 포함하는 제2형 당뇨병 위험도 예측 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    스퍼민(spermine), SM (OH) C22:2, PC ae C42:1, PC ae C42:4, PC ae C36:3, 류신(leu)의 농도가 대조군의 시료에서보다 1SD 증가하는 경우 제2형 당뇨병 발병 저위험군이라고 표시하는 제2형 당뇨병 위험도 예측 키트.
  10. 제8항에 있어서,
    헥소스(hexose), 이소류신(Ile), 발린(Val), PC ae C34:3, 알라닌(Ala), PC aa C42:1의 농도가 대조군의 시료에서보다 1SD 증가하는 경우 제2형 당뇨병 발병 고위험군이라고 표시하는 제2형 당뇨병 위험도 예측 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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