KR20160087035A

KR20160087035A - Ｐｂｍｃ 대사체를 이용한 당뇨병 진단 키트 및 진단방법

Info

Publication number: KR20160087035A
Application number: KR1020150004252A
Authority: KR
Inventors: 이종호; 김민주; 정샘
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2015-01-12
Filing date: 2015-01-12
Publication date: 2016-07-21
Also published as: KR101698394B1

Abstract

본 발명은 PBMC 대사체를 분석하여 당뇨병을 진단하는 키트 및 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 동정한 PBMC 대사체의 수준을 측정 및 분석함으로써, 전당뇨 혹은 제2형 당뇨병을 진단할 수 있다.

Description

ＰＢＭＣ 대사체를 이용한 당뇨병 진단 키트 및 진단방법{Kit and Method for Diagnosing Diabetes mellitus using PBMC Metabolites}

본 발명은 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 대사체를 이용한 당뇨병 진단 키트 및 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

소아 당뇨병이라 불리우는 제1형 당뇨병과 달리, 제2형 당뇨병은 운동부족, 비만 또는 스트레스 등에 의한 후천적 요인으로 인슐린의 분비 조절은 원활하나 인슐린이 제기능을 하지 못하여 혈당 조절이 실패하는 경우 발생한다(Stumvoll M, et al., Lancet 365:1333-46(2005)). 2008년 질병관리본부의 통계에 따르면 30세 이상 국민에서 당뇨병의 유병률은 9.1%에 달하며 40세가 넘으면 유병률이 급격히 증가하여 50대에는 20%에 달하는 것으로 나타났다. 이러한 급격한 유병률의 증가는 영양상태의 개선과 운동의 부족 등 환경적 요인의 변화가 가장 주된 원인인 것으로 추정된다.

우리나라의 경우 인슐린 비의존형의 제2형 당뇨환자가 전체 당뇨 환자의 90-95%를 차지하고 있으며, 선진국뿐만 아니라 개발도상국의 사람들도 점차 신체활동은 줄고 비만은 늘면서, 제2형 당뇨병의 발생이 무서운 속도로 증가하고 있다. 최근 10년간 한국인의 식단에서 지방이 차지하는 비율이 1969년 7.2%에서 2007년 18.5%까지 증가(South Korea Ministry of Health and Social Affairs. The Third Korea National Health & Nutrition 4 Examination Survey(2008))하였으며, 당뇨병으로 인한 사망률은 빠르게 증가하여 1988년 7.4%에서 2007년 22.9%(South Korea National Statistical Office. Annual Report on the Cause of Death Statistics (2007))에 이르렀다.

전당뇨(prediabates) 또는 당뇨 환자의 대사체 패턴에 대한 몇몇 보고가 있다. 비특허문헌 1은 공복혈당장애(impaired fasting glucose, IFG)와 제2형 당뇨병이 아미노산, 지방산, 글리세롤인지질 및 스핑고마이엘린 대사의 비정상 특징으로 특징지어질 수 있음을 보고하였다. 또한, 비특허문헌 2는 혈장과 소변에서의 분지(branched-chain) 케토산 대사체, 3-메틸-2-옥소발레르산 및 IFG 사이의 연관성을 보고하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

Xu F, Tavintharan S, Sum CF, Woon K, Lim SC, Ong CN. J Clin Endocrinol Metab 2013; 98:E1060-E1065. Menni C, Fauman E, Erte I, Perry JRB, Kastenmㆌller G, Shin S-Y, Petersen A-K, Hyde C, Psatha M, Ward KJ, Yuan W, Milburn M, Palmer CNA, Frayling TM, Trimmer J, Bell JT, Gieger C, Mohney RP, Brosnan MJ, Suhre K, Soranzo N, Spector TD. Diabetes 2013; 62:4270-343 4276.

본 발명자들은 비타겟(nontargeted) 대사체 연구를 통하여 당뇨병의 진단이 가능한 키트를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 전당뇨 혹은 제2형 당뇨병으로 새로이 진단받은 환자의 PBMC와 혈장의 대사체를 분석하여, 정상인에서 보다 당뇨병 환자에서 유의성 있게 증가한 11가지의 PBMC 대사체를 동정함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 당뇨병 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 류신, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 발린, 트립토판, 올레아미드, 피로글루탐산(L-pyroglutamic acid), 팔미틱 아미드, lysoPC (16:0) 및 lysoPC (18:0)으로 구성된 군으로부터 선택된 PBMC 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 당뇨병 진단용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 비타겟 대사체 연구를 통하여 당뇨병의 진단이 가능한 키트를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 전당뇨 혹은 제2형 당뇨병으로 새로이 진단받은 환자의 PBMC와 혈장의 대사체를 분석하여, 정상인에서 보다 당뇨병 환자에서 유의성 있게 증가한 11가지의 PBMC 대사체를 동정하였다. 또한, 본 발명자들은 정상인에서 보다 당뇨병 환자에서 유의성 있게 증가하거나 감소한 7가지의 혈장 대사체를 동정하였다.

본 발명자들은 증가 또는 감소한 PBMC 및 혈장의 대사체를 변수중요도척도(variable importance in the projection, VIP)에 따라 선별하였으며, 이중에서 VIP 수치가 1 이상인 대사체를 최종 선별하였다. 구체적으로, 당뇨군에서 농도가 증가한 발린, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 피로글루탐산, 팔미틱 아미드, 올레아미드, lysoPC (16:0) 및 lysoPC (18:0)은 VIP 수치가 1 이상인 PBMC 대사체로서 정상 대조군과 큰 차이를 보인 대사체이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "PBMC 대사체"는 PBMC로부터 수득한 대사물질을 말하며, 용어 "혈장 대사체"는 혈액 기원의 액상 시료로부터 수득한 대사물질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "진단"은 당뇨병에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 당뇨병을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 당뇨병에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 프롤린, 발린, lysoPC (16:0), lysoPC (17:0), lysoPC (18:2), lysoPC (18:1) 및 lysoPC (18:0)으로 구성된 군으로부터 선택된 혈장 대사체에 대한 정량장치를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명자들은 PBMC 대사체 외에도 정상인에 비하여 당뇨환자에서 유의성 있게 증가 또는 감소한 혈장 대사체를 추가 동정하였으며, 상기 혈장 대사체들에 대한 정량을 추가적으로 실시함으로써 보다 일관성 있고 신뢰도 높은 정확한 당뇨병의 진단이 가능하다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트로 진단 가능한 당뇨병은 제2형 당뇨병이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "제2형 당뇨병"은 인슐린은 정상적으로 분비되나, 인슐린이 제기능을 못하는 경우에 발병하는 당뇨병을 말하며, 성인형 당뇨병 또는 인슐린 비의존형 당뇨병으로도 불리운다. 제2형 당뇨병은 세포가 췌장에서 생성된 인슐린에 효과적으로 반응하지 않는 경우에 발생하는데, 이러한 상태를 인슐린 저항성(insulin resistance, IR)이라고 한다. 인슐린 저항성이 있는 환자들은 처음에는 정상적인 혈당을 유지하기 위해 추가적으로 더 많은 인슐린을 생산하는데, 결국에는 인슐린 저항성이 진행하여 췌장이 인슐린 요구량을 감당할 수 없게 되어 혈당이 상승하게 된다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트로 진단 가능한 당뇨병은 전당뇨병(prediabetes)이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "전당뇨병"은 혈당이 정상보다는 높지만, 당뇨병으로 확진되기까지 추가적인 정보가 필요한 상태를 의미하며, 당뇨 전단계와 동일한 의미로 사용된다. 대부분의 사람들은 제2형 당뇨병으로 확진되기 전에 전당뇨병 과정을 거친다. 전당뇨병에서 나타나는 혈당의 상승은 인슐린 저항성 문제로 인해 시작되지만, 전당뇨병에 있다고 해서 자동적으로 당뇨병으로 진행하지는 않지만 당뇨병으로 진행될 위험성이 높은 것은 사실이며, 전당뇨병은 심장 질환 발생의 위험요인이 된다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 전당뇨병은 공복혈당장애(impaired fasting glucose, IFG) 또는 내당능장애(impaired glucose tolerance, IGT)를 나타낸다. 상기 내당능장애는 공복 시 혈당이 126 mg/dL 미만이면서 당 부하 2시간 후 혈당이 140-199 mg/dL 사이인 경우를 지칭하며, 공복혈당장애는 8시간 공복 후 혈당이 100-125 mg/dL 사이인 경우를 지칭한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트에 포함되는 PBMC 및/또는 혈장 대사체의 농도측정 또는 동정을 위한 정량장치는 크로마토그래피/질량분석기이다. 본 발명의 PBMC 및/또는 혈장 대사체는 이동성의 차이에 따라 크로마토그래피에서 각 성분들이 분리되며, 질량분석기를 거쳐 얻어진 정보를 이용하여 정확한 분자량 정보뿐만 아니라, 구조 성분(elemental composition)을 확인할 수 있다.

본 발명에서 이용 가능한 크로마토그래피는, 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 고성능 액체 크로마토그래피(ultra performance liquid chromatography, UPLC)이다.

본 발명에서 이용 가능한 질량분석기는 MALDI-TOF MS, Q-TOF MS 및 UPLC-LTQ-Orbitrap MS 등이 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:

(a) 대상체로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC) 내의 대사체 수준을 측정하는 단계로서, 상기 대사체는 류신, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 발린, 트립토판, 올레아미드, 피로글루탐산(L-pyroglutamic acid), 팔미틱 아미드, lysoPC (16:0) 및 lysoPC (18:0)으로 구성된 군으로부터 선택되고;

(b) 상기 측정된 PBMC 대사체의 수준을 정상 대조군 시료에서의 측정값과 비교하는 단계.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 PBMC 대사체의 수준이 정상 대조군 시료에서의 측정값 보다 높은 경우, 당뇨병으로 진단할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 단계 (a)에서는 프롤린, 발린, lysoPC (16:0), lysoPC (17:0), lysoPC (18:2), lysoPC (18:1) 및 lysoPC (18:0)으로 구성된 군으로부터 선택된 혈장 대사체의 수준을 추가적으로 측정하고, 단계 (b)에서는 측정된 혈장 대사체의 수준을 정상 대조군 시료에서의 측정값과 비교할 수 있다.

이 경우, 상기 프롤린과 발린의 수준이 정상 대조군 시료에서의 측정값 보다 높은 경우, 당뇨병으로 진단할 수 있고, 상기 lysoPC의 수준이 정상 대조군 시료에서의 측정값 보다 낮은 경우, 당뇨병으로 진단할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 PBMC 대사체를 분석하여 당뇨병을 진단하는 키트 및 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명에서 동정한 PBMC 대사체의 수준을 측정 및 분석함으로써, 전당뇨 혹은 제2형 당뇨병을 진단할 수 있다.

도 1은 각 소그룹에서 유의성 있게 변한 PBMC와 혈장 대사체의 동정 결과를 보여준다. A: NFG(n=65)와 IFG 또는 T2D 그룹(n=65)으로 분류하는 PLS-DA 모델로부터 얻은 PBMC 대사체의 스코어 플롯. B: NFG(n=65)와 IFG 또는 T2D 그룹(n=65)으로 분류하는 PLS-DA 모델로부터 얻은 혈장 대사체의 스코어 플롯. C 및 D: PLS-DA 모델로부터 얻은 공변인 [p] 및 신뢰도 관계(reliability correlation) [p(corr)]에 대한 S-플롯.
도 2는 각 그룹에서의 대사체와 생화학적 특징 간의 상관관계 매트릭스를 보여준다. 모든 생화학적 특징은 대수 변환하여 테스트하였다. 스피어만 상관계수를 도출하여 상관관계를 얻었다. PBMC 대사체, 혈장 대사체 및 생화학적 특징을 히트 맵의 오른쪽 면에 기재하였다. 빨강색은 양의 상관관계를, 보라색은 음의 상관관계를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

실험대상

연세대학교 영양유전학/영양유전체학 국가지정 선도연구실에서 수행중인 임상 영양학적 연구 참가자를 대상으로 본 실험 참가자를 선정하였다. 2013년 1월부터 6월 동안 국민건강보험공단 일산병원의 건강검진센터에서 통상적인 건강검진을 받은 사람으로부터 30-70세의 비만이 아닌 참가자(18.5 ≤ BMI < 30 kg/m²)를 모집하였다. 건강검진 데이터에 기초하여, 공복혈당장애(IFG; 100 ≤ 공복 혈당 < 126 mg/dL)를 갖거나, 또는 새로이 제2형 당뇨병(T2D; 공복 혈당 ≥ 126 mg/dL)으로 진단된 사람을 선정하였다. 지난 1개월 동안 지질 감소용 약물, 지질 대사에 영향을 미치는 것으로 알려진 약물 또는 보조제, 또는 프로바이오틱스를 복용한 사람은 실험에서 제외하였다. 또한, 이상지질혈증, 고혈압, 간 질환, 신장 질환, 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 췌장염 또는 암으로 진단된 자, 치료전력이 있거나 알코올 남용으로 진단된 자, 임신 중이거나 모유수유 중인 자는 실험에서 제외하였다. 전당뇨(prediabates) 혹은 새로이 진단된 T2D(30-70세)를 갖는 65명의 비비만인이 실험에 참가하였고, 65명의 성별 매칭 된 건강한 사람이 대조군으로 실험에 참여하였다. 각 참가자의 일반적인 식이의 다량 영양소 조성물은 상당수의 한국인이 소비하는 전형적인 식이였다. 이 식이는 탄수화물 유래의 약 63%의 에너지, 지방 유래의 약 21%의 에너지 및 단백질 유래의 약 16%의 에너지를 나타낸다. 모든 참가자들에게 본 연구의 목적에 대하여 상세히 설명한 뒤 동의를 얻었으며, 수행된 연구의 프로토콜은 연세대학교와 일산병원의 생명윤리심의위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았다.

인체측정학적 파라미터, 혈압 및 혈액 채취

옷과 신발을 탈의한 채로 몸무게와 체중을 재고, kg/m²로 BMI를 계산하였다. 허리와 엉덩이 둘레를 재고 WHR(waist to hip ratio)을 계산하였다. 자동혈압 측정기(FT-200S, Jawon Medical)를 사용하여 20분 휴식 후에 앉아있는 상태로 참가자의 왼팔의 혈압을 측정하였다. 12시간의 금식 후, 정맥혈 시료를 EDTA-처리 전혈 및 혈청 튜브에 모았다. 혈액 샘플을 원심분리 하여 혈장과 혈청을 얻고, -70℃에서 보관하였다.

공복 혈당, 인슐린, 인슐린 저항성의 항상성 모델 평가(HOMA), 및 헤모글로빈 A _1c

공복 혈당 수준을 Hitachi 7600 자동분석기를 사용하여 헥소키나아제법으로 분석하였다. 인슐린 수준은 방사면역측정 키트(DIAsource ImmunoAssays S.A.)를 사용하여 측정하였다. 인슐린 저항성(IR)은 수학식 "HOMA-IR = [공복 인슐린(μIU/mL) x 공복 당(mmol/L)]/22.5"를 사용하여 HOMA(homeostasis-model assessment)로 계산하였다. 헤모글로빈 A_1c(HbA_1c)는 immunoturbidimetric 분석으로 측정하였다.

혈 청 지질 프로파일과 유리지방산 분석

공복 총 콜레스테롤과 중성지방 수준을 Hitachi 7600 자동분석기(Hitachi Ltd.)를 사용하여 분석하였다. 상청액 분획물에 남아있는 HDL-콜레스테롤을 다른 리포단백질 침전 후에 효소적 방법으로 측정하였다. LDL-콜레스테롤 농도를 혈청 중성지방 수준이 < 400 mg/dL인 참가자를 대상으로 프리데발트 공식, 즉 LDL 콜레스테롤 = 총 콜레스테롤 - [HDL 콜레스테롤 + (중성지방/5)]를 사용하여 간접적으로 계산하였다. 혈청 중성지방 수준이 ≥400 mg/dL인 참가자를 대상으로, Hitachi 7600 자동분석기를 사용하여 LDL-콜레스테롤 농도를 직접적으로 측정하였다. Hitachi 7600 자동분석기를 사용하여 아실 CoA 합성효소-아실-CoA 산화효소(ACS-ACOD) 효소 분석법으로 유리지방산(free fatty acids, FFA)을 분석하였다.

혈청 고감도 C-반응 단백질, Lp-PLA ₂ 활성, 혈장 말론디알데하이드, LDL 입자크기 및 산화된 LDL의 평가

고감도 CRP-Latex(II) X2 키트(Denka-Seiken Co., Ltd.)를 사용하여 ADVIA 2400 임상 케미스트리 시스템(Siemens Ltd.)으로 혈청 고감도 C-반응 단백질(High-Sensitivity C-Reactive Protein, hs-CRP)을 측정하였다. 변형된 고속대량 방사성 활성 분석(high-throughput radiometric activity assay; Wilensky RL, et a;., Nat Med 2008;14:1059-1066)을 사용하여 Lp-PLA₂ 활성을 측정하였다. TBARS 분석 키트(ZeptoMetrix Co.)를 사용하여 TBARS (thiobarbituric acid-reactive substances)로부터 혈장 말론디알데하이드(MDA)를 측정하였다. 순차적인 초원심분리(sequential flotation ultracentrifugation)로 LDL 입자를 분리하였다. 입자크기의 분포(1.019-1.063 g/mL)를 선형(linear) 2-16% 아크릴아미드 구배(CBS Scientific Company)를 포함하는 비변성 겔 상의 공극-구배 리포단백질 시스템(pore-gradient lipoprotein system; CBS Scientific Company)을 사용하여 조사하였다. 라텍스 비드(30 nm)에 접합된 티로글로불린(17 nm), 페리틴(12.2 nm) 및 카탈라아제(10.4 nm) 표준품(standard)을 상대적 밴드 이동률을 추정하기 위하여 사용하였다. GS-800 칼리브레이트 이미징 농도계(GS-800 Calibrated Imaging Densitometer; Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 겔을 스캔하였다. 효소 면역분석 키트(Mercodia AB)를 사용하여 혈장 산화된(ox)-LDL을 측정하고, 도출된 색 반응을 Wallac Victor² 다중라벨 계측기(Wallac Victor²multilabel counter; Perkin-Elmer Life Sciences)로 450 nm에서 색상 반응 결과를 판독하였다.

소변 8-에피-프로스타글란딘 F _2α 및 TNF-α 측정

12시간의 단식 후, 1% 부틸히드록시톨루엔이 담긴 폴리에틸렌 용기에 소변을 모으고, 즉시 용기를 알루미늄 호일로 감싼 다음 -20℃에서 보관하였다. Urinary Isoprostane ELISA 키트(Oxford Biomedical Research Inc.)를 사용하여 8-에피-프로스타글란딘 F_2α(8-epi-prostaglandin F_2α; 8-epi-PGF_2α)의 수준을 측정하였다. Creatinine Jaffe 법을 사용하여 소변 크레아틴 수준을 측정하였다. 혈청 TNF-α수준은 Bio-Plex Reagent 키트와 Bio-Plex(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용하여 측정하였다.

전반적(비타겟) 혈장 대사 프로파일링

시료의 준비 및 분석

분석 전, 100 ㎕의 혈장에 80% 아세토나이트릴 800 ㎕를 첨가하고, 볼텍싱 하여 혼합한 다음 4℃에서 10,000 rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 상청액을 N₂로 건조시키고, 10% 메탄올에 용해한 다음 볼텍싱 하여 혼합한 후 4℃에서 10,000 rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 이후, 상청액을 새로운 바이알로 옮겨 담았다.

초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)

혈장 추출 시료(4 ㎕)를 UPLC-LTQ-Orbitrap XL(Thermo Fisher Scientific)이 결합된(coupled in-line) Acquity UPLC-BEH-C18 컬럼(2.1 X 50 mm, 1.7 ㎛; Waters)에 주입하였다. 0.1% 포름산이 함유된 물로 주입된 시료를 평형화시켰다. 0.35 ㎖/분의 흐름 속도로 0.1% 포름산이 함유된 아세토나이트릴 농도구배(acetonitrile gradient)를 사용하여 20분간 시료를 용출하였다. 대사체를 UPLC(Thermo Fisher Scientific)로 분리하고, LTQ-Orbitrap-XL(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분석하였다. 질량분석계는 ESI-양성 모드로 작동시켰다. 스프레이 전압은 5 kV로 설정하였다. 질소 가스(nitrogen sheath gas)와 보조가스의 유속은 50 및 5(arbitrary units)였다. 모세관 전압(V), 튜브-렌즈 전압(V) 및 모세관 온도(℃)는 각각 35V, 80V 및 370℃로 일정하게 유지시켰다. 오비트랩 데이터(Orbitrap data)를 m/z 50-1,000 범위에서 수집하였다. 55-65 eV에서의 충돌에너지 램프(collision-energy ramp)를 이용하여 대사체의 MS/MS 스펙트럼을 측정하였고, 엑스칼리버 2.1과 MS 프론티어 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 분석하였다.

데이터 처리 및 대사체 동정

머무름 시간, m/z 및 이온 강도를 포함한 모든 MS 데이터를 SIEVE 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 추출하고, 출력된 MS 데이터 결과를 매트릭스로 조합하였다. SIEVE 파라미터는 다음과 같이 설정하였다: m/z 범위 50-1,000; m/z 폭 0.02; 머무름 시간 폭 2.5; m/z 저항 0.005. 대사체는 다음의 데이터베이스를 이용하여 검색하였다: ChemSpider (www.chemspider.com), Human Metabolome (www.hmdb.ca), Lipid MAPS (www.lipidmaps.org), KEGG (www.genome.jp/kegg) 및 MassBank (www.massbank.jp). 머무름 시간 및 질량 스펙트럼에 기초하여 선택된 대사체들을 표준 샘플과 비교 확인하였다.

통계 분석

SPSS v. 21.0(IBM SPSS Statistics 21)을 사용하여 통계 분석을 실시하였다. 통계 분석을 위하여 왜곡된 변수(Skewed variable)를 대수적으로 변환하였다. 기술적(descriptive) 목적을 위하여, 평균값은 변환되지 않은 값으로 제시하였다. 결과는 평균±표준 오차(S.E.)로 표현하였다. 양측 P-검정값(two-tailed P-value) < 0.05를 통계적 유의성으로 간주하였다. 두 그룹 사이의 생화학적 변수의 차이를 Student's 독립 t-검정을 사용하여 테스트하였다. 기준시점 값으로 보정하여 두 그룹 사이의 파라미터 변화를 비교하기 위하여 GLM(General linear model) 테스트를 적용하였다. 시간경과에 따른 변수 사이의 관계를 조사하기 위하여, 단순관계수와 편상관계수(Pearson's and partial correlation coefficients)를 사용하였다. R 패키지 'fdrtool'을 이용하여 오류 발견율(FDR: false discovery rate) 수정된 q-값을 계산하였다. 대사체와 생화학적 특징 중에서의 상관관계를 시각화하여 평가하기 위하여 히트 맵을 생성하였다.

SIMCA-P+ 소프트웨어 버전 12.0(Umetrics)을 사용하여 다변량 통계분석을 실시하였다. 첫 번째 또는 두 번째 PLS 요소를 사용하는 스코어 플롯 또는 S-플롯을 가시화하는 PLS-DA(Partial least-squares discriminant analysis)를 IFG 또는 T2D를 갖는 환자군과 건강한 대조군 사이의 차이를 모델링하는 분류 방법으로 사용하였다. 모델의 타당성을 검사하기 위하여, 7배 검정(seven-fold validation)을 PLS-DA 모델에 적용하고, 모델의 신뢰성을 순열검정(n=200)으로 엄격히 검정하였다. 카이 제곱 적합도(goodness-of-fit)를 R ² Y로 정량하고, 예측능력은 Q ² Y로 정량하였다. 일반적으로, R ² Y는 트레이닝 세트에서 데이터가 수학적으로 얼마나 잘 생성되었는지를 보여주고, 0-1 사이에서 변화한다(1은 모델이 완벽하게 합치함을 의미한다). Q ² Y ≥ 0.5인 모델을 우수한 예측능력을 가지는 것으로 간주하였다.

실험결과

임상적 특징 및 영양분 섭취

정상적인 공복 혈당 수치를 갖는 건강한 대조군, 및 IFG 또는 T2D로 새롭게 진단받은 환자군의 임상적 특징과 생화학적 특징을 표 1에 나타내었다. 남녀비율(25/40 vs. 25/40), 교육수준, 흡연, 음주, 총 칼로리 및 다량영양분 섭취와 같은 임상적 특징에서 두 그룹 간에 유의성 있는 차이는 없었다. 환자군은 대조군에 비해 나이가 많고 몸무게가 많이 나갔으며, 높은 이완기 혈압, 혈청 중성지방 및 FFA를 가지고 있었다. 나이, BMI, 혈압 및 혈청 지질 프로파일로 보정한 후 대조군과 비교한 결과, 환자군은 높은 혈당, HbA_1C, 인슐린, HOMA-IR, hs-CRP, 순환성 혈장(circulating plasma)과 PBMC Lp-PLA₂ 활성, ox-LDL, 8-epi-PGF_2α, MDA, 및 TNF-α 수준을 보였다. 또한, 환자군은 대조군에 비하여 작은 LDL 입자크기를 나타내었다(표 1).

각 값들은 평균±표준오차임.

^∮는 대수 변환을 통하여 테스트함.

P 값은 독립 t-테스트(independent t-test)로부터 도출함.

P ₁ 은 나이, BMI, WHR, 흡연, 음주, 혈압, 중성지방, 총 콜레스테롤, HDL, LDL 및 FFA로 보정한 값.

UPLC - LTQ - Orbitrap 질량분석기를 사용한 PBMC 및 혈장 대사체 프로파일

비타겟 대사 패턴 분석(Nontargeted Metabolic Pattern Analysis)

PBMC 대사체의 질량분석(MS) 데이터를 PLS-DA 스코어 플롯을 사용하여 분석하였다(도 1의 A). PBMC 대사체의 두 요소 PLS-DA 스코어 플롯은 건강한 대조군각각이 환자군으로부터 구별된다는 명확한 클러스터링과 뚜렷한 분리를 보여주었다. 두 그룹은 0.256의 R ² X(cum)와 0.682의 R ² Y(cum)를 갖는 모델을 기초로 제1요소 t(1) 또는 제2요소 t(2)에 의하여 서로로부터 명확하게 구별될 수 있었으며, 이는 데이터가 잘 들어맞고 있음을 보여준다. 0.608의 Q ² Y(cum) 값은 본 모델의 예측능력의 추정치를 제공한다. PLS-DA 모델은 순열검정을 사용하여 검증하였고, 이는 0.258의 R ² Y 절편 값과 -0.185의 Q ² Y 절편 값을 나타내었다.

혈장 대사체의 MS 데이터를 PLS-DA 스코어 플롯을 사용하여 분석하였다(도 1의 B). 혈장 대사체의 두 요소 PLS-DA 스코어 플롯은 건강한 대조군 각각이 환자군으로부터 구별된다는 명확한 클러스터링과 뚜렷한 분리를 보여주었다. 두 그룹은 0.12의 R ² X(cum)와 0.708의 R ² Y(cum)를 갖는 모델을 기초로 제1요소 t(1) 또는 제2요소 t(2)에 의하여 서로로부터 명확하게 구별될 수 있었으며, 이는 데이터가 잘 들어맞고 있음을 보여준다. 0.414의 Q ² Y(cum) 값은 본 모델의 예측능력의 추정치를 제공한다. PLS-DA 모델은 순열검정을 사용하여 검증하였고, 이는 0.486의 R ² Y 절편 값과 -0.0496의 Q ² Y 절편 값을 나타내었다. 정상 대조군과 환자군 사이의 차이에 기여하는 대사체를 동정하기 위하여, p(1)와 p(corr)(1)의 S-플롯을 중심 크기조정(centroid scaling)을 사용하여 도출하였다(도 1의 C 및 D). 상기 S-플롯은 보다 높거나 낮은 p(corr) 값을 갖는 대사체가 두 그룹을 구별하는데 더 적절함을 보여주었다.

PBMC 대사체의 동정

변수중요도척도(VIP, variable important in the projection) 파라미터에 따라, 1,948종의 PBMC 대사체 중에서 그룹 간의 구분에 중요한 역할을 하는 대사체를 선별하였다. > 1.0의 VIP 값을 그룹 간의 차이에 보다 더 관련되어 있는 것으로 판단하였다. > 1.0의 VIP 값을 토대로 36종의 대사체를 선별하였으며, 이중에서 11종의 대사체는 이전에 동정된 것이고, 25종의 대사체는 알려지지 않은 것이었다. 11종의 PBMC 대사체(VIP > 1.0)를 표 2에 나타내었다. 6종의 아미노산(발린, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판)의 정규화된 피크 강도는 대조군에 비하여 환자군의 PBMC에서 유의성 있게 높았다(q값 < 0.001). 피로글루탐산(L-pyroglutamic acid), 두 지방산 아미드(팔미틱 아미드, 올레아미드), 및 두 라이소포스파티딜콜린(lysoPC 16:0, lysoPC 18:0)은 대조군에 비하여 환자군의 PBMC에서 유의성 있게 높았다(표 2).

각 값들은 평균±표준오차임.

혈장 대사체의 동정

변수중요도척도(VIP) 파라미터에 따라, 4,164종의 혈장 대사체 중에서 그룹 간의 구분에 중요한 역할을 하는 대사체를 선별하였다. > 1.0의 VIP 값을 그룹 간의 차이를 발생시키는데 보다 더 관련되어 있는 것으로 판단하였다. > 1.0의 VIP 값을 토대로 81종의 대사체를 선별하였으며, 이중에서 12종의 대사체와 PC는 이전에 동정된 것이고, 69종의 대사체는 알려지지 않은 것이었다. 12종의 혈장 대사체와 PCs를 표 3에 나타내었다. 2종의 아미노산(프롤린, 발린)의 정규화된 피크 강도는 대조군에 비하여 환자군의 혈장에서 유의성 있게 높았다(q값 < 0.001). 5종의 lysoPC(C16:0, C17:0, C18:2, C18:1, C18:0)은 대조군에 비하여 환자군의 혈장에서 유의성 있게 낮았다(표 3).

각 값들은 평균±표준오차임.

¹PCs는 본 연구에서 C18-UPLC에 의하여 성공적으로 분리되지 않았으나, 오비트랩 MS에 의하여 검출됨. 따라서, 모든 검출된 PCs의 양은 서로 결합되었다.

공복 혈당, 혈장과 PBMC Lp-PLA ₂ 활성, 생화학적 파라미터, 및 주요 PBMC 대사체 사이의 상관관계

공복 혈당, 혈장과 PBMC Lp-PLA₂ 활성, 생화학적 파라미터, 및 PBMC와 혈장의 주요 대사체의 상관관계 행렬을 모든 실험참가자(n=130)에 대하여 계산하였다(도 2). 모든 실험참가자에서, 공복 혈당, 혈장과 PBMC Lp-PLA₂ 활성, 생화학적 파라미터, 및 PBMC와 혈장의 주요 대사체는 높은 수준으로 상관관계를 보였다. 예를 들어, 공복 혈당은 HOMA-IR, ox-LDL, 혈장과 PBMC Lp-PLA₂, hs-CRP, TNF-α, 8-epi-PGF_2α, PBMC의 발린, 피로글루탐산, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌 및 티로신; 혈장의 프롤린, 발린, 류신 및 페닐알라닌과 양의 상관관계를 보였다. 공복 혈당은 LDL 입자크기 및 혈장 lysoPC(C17:0, C18:2)와 음의 상관관계를 보였다.

대조군에서는, 공복 혈당은 PBMC 발린과 트립토판과 양의 상관관계를 보였다. 혈장 Lp-PLA₂ 활성은 PBMC Lp-PLA₂(r = 0.273, P = 0.032), 페닐알라닌, 티로신 및 lysoPC 18:0(r = 0.251, P = 0.048)과 양의 상관관계를 보였다. PBMC Lp-PLA₂ 활성은 HOMA-IR, hs-CRP, PBMC의 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 팔미틱 아미드, 올레아미드, lysoPC 16:0(r = 0.273, P = 0.030), lysoPC 18:0(r = 0.266, P = 0.035); 혈장의 발린, 류신, 페닐알라닌, 올레아미드, lysoPC (C16:0, C17:0, C18:2, C18:0, C20:4)와 양의 상관관계를 보였다. 공복 혈당은 LDL 입자크기와 음의 상관관계를 보였다.

환자군에서는, 혈장 Lp-PLA₂ 활성은 ox-LDL(r = 0.464, P < 0.001), 8-epi-PGF_2α(r = 0.500, P < 0.001), TNF-α 및 PBMC Lp-PLA₂(r = 0.518, P < 0.001)와 강력하게 양의 상관관계를 보였다. PBMC Lp-PLA₂ 활성은 hs-CRP, TNF-α, ox-LDL(r = 0.445, P < 0.001), PBMC의 페닐알라닌, 팔미틱 아미드, 올레아미드, lysoPC 16:0(r = 0.421, P < 0.001), 및 lysoPC 18:0(r = 0.415, P < 0.001)과 양의 상관관계를 보였다(도 2).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

류신, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 발린, 트립토판, 올레아미드, 피로글루탐산(L-pyroglutamic acid), 팔미틱 아미드, lysoPC (16:0) 및 lysoPC (18:0)으로 구성된 군으로부터 선택된 말초혈액 단핵세포(PBMC) 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 당뇨병 진단용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 프롤린, 발린, lysoPC (16:0), lysoPC (17:0), lysoPC (18:2), lysoPC (18:1) 및 lysoPC (18:0)으로 구성된 군으로부터 선택된 혈장 대사체에 대한 정량장치를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 당뇨병은 전당뇨병(prediabetes)인 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 정량장치는 크로마토그래피/질량분석기인 것을 특징으로 하는 키트.
다음의 단계를 포함하는 당뇨병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법:
(a) 대상체로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC) 내의 대사체 수준을 측정하는 단계로서, 상기 대사체는 류신, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 발린, 트립토판, 올레아미드, 피로글루탐산(L-pyroglutamic acid), 팔미틱 아미드, lysoPC (16:0) 및 lysoPC (18:0)으로 구성된 군으로부터 선택되고;
(b) 상기 측정된 PBMC 대사체의 수준을 정상 대조군 시료에서의 측정값과 비교하는 단계.
제 6 항에 있어서, 상기 PBMC 대사체의 수준이 정상 대조군 시료에서의 측정값 보다 높은 경우, 당뇨병으로 진단하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서는 프롤린, 발린, lysoPC (16:0), lysoPC (17:0), lysoPC (18:2), lysoPC (18:1) 및 lysoPC (18:0)으로 구성된 군으로부터 선택된 혈장 대사체의 수준을 추가적으로 측정하고, 단계 (b)에서는 측정된 혈장 대사체의 수준을 정상 대조군 시료에서의 측정값과 비교하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 프롤린과 발린의 수준이 정상 대조군 시료에서의 측정값 보다 높은 경우, 당뇨병으로 진단하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 lysoPC의 수준이 정상 대조군 시료에서의 측정값 보다 낮은 경우, 당뇨병으로 진단하는 것을 특징으로 하는 방법.