CN108508106A - 生活习惯病的生物标志物及其用途、和存储介质 - Google Patents

生活习惯病的生物标志物及其用途、和存储介质 Download PDF

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柴田贵广
石川健治
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Abstract

本发明涉及生活习惯病的生物标志物及其用途、和存储介质。提供生活习惯病的新型的诊断方法等。本发明提供的生活习惯病的诊断方法包括：从受试者采集生物体试样的工序；测定生物体试样中所含的脂肪酸酰胺的浓度的工序；和判断从受试者得到的脂肪酸酰胺的浓度的测定值低于从健康的正常人得到的测定结果的情况下，是否已患有生活习惯病或者生活习惯病正在恶化的工序。

Description

生活习惯病的生物标志物及其用途、和存储介质
技术领域
本发明涉及生活习惯病的生物标志物及其用途、和存储介质。
本申请基于2017年2月28日申请的日本专利申请2017-036997号要求优先权。该申请的全部内容作为参照并入本说明书中。
背景技术
随着生活习惯、社会环境的变化，生活习惯病的患者逐年增加。生活习惯病是指“饮食习惯、运动习惯、休养、吸烟、饮酒等生活习惯参与其发病·恶化的疾病群”，作为代表性的疾病，例如可列举出非胰岛素依赖型糖尿病(以下简称糖尿病。)、脂质异常症(也称为高脂血症。)、高血压、炎症性疾病等。现在的生活习惯病的治疗中，对症疗法为主体。但是，由于生活习惯病几乎没有自觉症状，因此还没注意到时疾病就恶化，对脑、心脏、血管等造成损伤。例如，糖尿病一旦发病，就会引起视网膜症等并发症，或者促进缺血性心脏病、脑中风等心血管疾病的发展。因此，认为在更早的阶段诊断生活习惯病和预防生活习惯病的恶化是很大的课题。作为生活习惯病的诊断相关的现有技术，例如可列举出专利文献1～2。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利申请公开2010-151800号公报
专利文献2：日本专利申请公开2003-130868号公报
发明内容
发明要解决的课题
近年来的医疗领域，并不限于生活习惯病，逐渐希望结合各个患者的症状来可靠地选择治疗方法。另外，从提高QOL(生活质量，Quality of life)的观点出发，也要求提供与众人通用的治疗并用，结合各个患者的症状进行适当的治疗的定制医疗(テイラーメイド医療)。因此，例如对于生活习惯病的诊断，也希望提出可反映更多样的因素的诊断方法。作为一个例子，如果在病症恶化前的比较早的阶段就能够进行疾病的诊断，则特别优选。
本发明鉴于这点而完成，其目的在于提供生活习惯病的新型的诊断(筛查)方法等。另外，另一目的在于提供在生活习惯病的诊断中有用的新型的生物标志物。
用于解决课题的手段
本发明人对于生物体内所含有的、由于具有多种生理活性而作为新型脂质介质受到关注的长链脂肪酸的酰化物进行了锐意研究。其结果获知：长链脂肪酸酰化物中脂肪酸酰胺在高脂血症患者的生物体内，以比健康的正常人低的浓度存在，完成了本发明。
即，在此公开的发明提供生活习惯病的诊断方法。该生活习惯病的诊断方法包括：从受试者采集生物体试样的工序；测定生物体试样中所含的脂肪酸酰胺的浓度的工序；和从受试者得到的脂肪酸酰胺的浓度的测定值低于从健康的正常人得到的测定结果情况下判断是否已患有生活习惯病或者生活习惯病正在恶化的工序。
根据上述构成，测定受试者的生物体试样中的脂肪酸酰胺的浓度。然后，基于其油酰胺的浓度的测定值，能够判断该受试者是否已患有生活习惯病或者生活习惯病正在恶化。由此提供以脂肪酸酰胺这样的生物体化合物作为生活习惯病的生物标志物的、新型的生活习惯病的诊断方法。
予以说明，作为生活习惯病的生物标志物的脂肪酸酰胺的用途并不仅限于生活习惯病的诊断。例如，脂肪酸酰胺可适用于用于检测生活习惯病的试剂盒的制造。另外，脂肪酸酰胺可适用于制造用于评价生活习惯病的风险的试剂盒。此外，脂肪酸酰胺可适用于制造生活习惯病的检测标记物和生活习惯病的预防剂。
进而，生物体内存在脂肪酸酰胺仅表示生物体具有脂肪酸酰胺，并不是所有的生物体都与生活习惯病有关。鉴于此，本文公开的技术着眼于这种生物体样品中脂肪酸酰胺的浓度特性，提供不是以诊断为目的的方法，而是以得到中间结果为直接目的的、取得脂肪酸酰胺的浓度数据的方法。这对选择(筛查)患有生活习惯病或疑似患有、或存在风险的对象者很有用。
并且，关于该数据的收集，本文公开的技术提供计算机可读取的存储介质，其使计算机执行以下步骤：
存储从受试者采集的生物体试样中所含的脂肪酸酰胺的浓度；和
判断从所述受试者得到的所述脂肪酸酰胺的浓度是否低于从健康的正常人得到的生物体试样中所含的所述脂肪酸酰胺的浓度测定结果的工序。
在此所公开的诊断方法的优选的一实施方式中，上述生物体试样为脏器或血液。血液能够比较容易地采集，另外，容易随着其他的检查而获得，因此关于脂肪酸酰胺的浓度测定，能够不带给患者多余的负担地进行诊断。但是，就上述脂肪酸酰胺的浓度而言，不必将送检样本限定于血液，例如，将脏器等作为送检样本的情况下也能够进行测定。由此，能够采用多种检查方法进行生活习惯病的诊断。
在此所公开的诊断方法的优选的一实施方式中，上述脂肪酸酰胺的浓度测定采用液相色谱质量分析法实施。该液相色谱质量分析法优选包括：用液相色谱将上述生物体试样中所含的2种以上的成分分离，将分离的上述成分离子化，用四极型质量分析器选择特定质量成分，使上述特定质量成分解离，用质量分析器检测上述解离的成分。通过该构成，能够高精度地测定脂肪酸酰胺的浓度。进而能够高精度地进行生活习惯病的诊断。
在此所公开的诊断方法的优选的一实施方式中，上述生活习惯病为选自肥胖、脂质异常症、糖尿病和耐糖能力异常中的至少1种。脂肪酸酰胺的浓度显示出例如与葡萄糖浓度比较高的相关性。因此，该诊断方法在生活习惯病中，能够特别优选地用于肥胖、脂质异常症、糖尿病和耐糖能力异常等的诊断。
在此所公开的诊断方法的优选的一实施方式中，上述脂肪酸酰胺为油酰胺。由此，利用其浓度能够精度更高地反映生活习惯病的存在、恶化程度，能够使生活习惯病的诊断更为可靠。
附图说明
图1是说明生物体内脂肪酸酰胺的生成的图。
图2是分为健康的正常人组和高脂血症患者组来示出血清中的油酰胺浓度的测定结果的直方图。
图3A是分为血中葡萄糖浓度为80mg/dL以上且不到110mg/dL(对照)、110mg/dL以上且不到125mg/dL(I组)、125mg/dL以上且不到200mg/dL(II组)、200mg/dL以上(III组)这4组来表示糖尿病患者组的血清中的油酰胺浓度的测定结果的直方图。
图3B是示出图3A的数据的散布图。
图4是对于肥胖小鼠组和正常小鼠组示出血浆中的油酰胺浓度的测定结果的直方图。
具体实施方式
以下对本发明的优选的实施方式进行说明。应予说明，本说明书中特别提及的事项以外的事情且对本发明的实施而言必要的事情可作为基于该领域中的现有技术的本领域技术人员的设计事项来把握。本发明能够基于本说明书和附图中所公开的内容和该领域中的技术常识来实施。
[生物标志物]
脂质是细胞膜的主要构成成分，同时是与蛋白质、糖类并列的三大营养成分之一，是具有作为效率良好的能量源的功能能和作为信号分子的功能的重要的生物体分子。而且，脂质中，将具有生理活性的脂质称为脂质介质。关于作为脂质介质发挥功能的脂肪酸酰胺，作为一个例子，已知花生四烯酰丝氨酸(アラキドニルセリン)、花生油烯酸酰胺、油酸酰胺等多种脂肪酸酰胺。在此，关于油酸酰胺，只报道了表现出(1)睡眠诱导分子、(2)经由CB1受体的食欲调节功能、(3)血清素2C受体的正的变构调节功能、(4)β-淀粉状蛋白沉积的抑制功能等。与此相对，在此所公开的技术发现脂肪酸酰胺可作为生活习惯病的生物标志物发挥功能，示出了作为显现新功能的脂质介质的脂肪酸酰胺及其利用。
[脂肪酸酰胺]
在包含人的动物、植物、微生物的体内，利用脂肪酸合酶由乙酰基CoA(辅酶A)和丙二酰基CoA制作直链的饱和脂肪酸。该脂肪酸在小胞体等中使碳数增加，例如如果脂肪酸合成达到碳数18(硬脂酸)，则在硬脂酸的中央(ω-9位)生成双键，在体内生成作为一价不饱和脂肪酸的油酸。另外，这些脂肪酸被酰基CoA合成酶(ACS)催化，如图1中所示那样，变换为具有硫酯键的脂肪酸的酰化物(例如，脂肪酸酰基CoA)从而活化。认为该脂肪酸酰化物与体内的氨基酸发生酶促反应，成为酰基化氨基酸，进而通过酶促反应，形成酰胺型的脂肪酸酰胺。作为生物标志物的脂肪酸酰胺能够广泛地以来自该生物体内的脂质的脂肪酸酰胺及其衍生物为对象。
应予说明，图1中所示的脂肪酸酰胺的酰胺部分(-NH2)只要在其化学结构中具有从氨、伯胺或仲胺中去除了氢的1价的官能团(即，图中的-NH2或-NHR、-NRR’。其中，式中的R、R’为氢以外的烃基。)，则对其他具体的结构并无特别限定。
另外，脂肪酸酰胺的脂肪酸部分可为生物体细胞中常见的碳数为14-20(以下简单地表示为“C14～C20”。)的长链脂肪酸。采用IUPAC生物化学命名法用碳数和双键的个数的组合来表示这些脂肪酸部分时，典型地，例如可为C14：0(肉豆蔻酸)、16：0(棕榈酸)、16：1(棕榈烯酸)、18：0(硬脂酸)、18：1(9)(油酸)、18：2(9，12)(亚油酸)、18：3(Δ9，Δ12，Δ15))(亚麻酸)等。而且，作为具有该脂肪酸部分的脂肪酸酰胺，典型地，可列举出下述所示的脂肪酸酰胺。
【化1】
作为在此所公开的脂肪酸酰胺，只要是上述的由油酸构成的脂肪酸部分与酰胺部分结合而成，则可以是各种的化合物。就这种脂肪酸酰胺而言，根据本发明人的试验，确认了其在生物体中的浓度均可随着生活习惯病的症状的恶化程度有意地变化。其中，上述脂肪酸酰胺中，细胞中更为常见的C16和C18的长链脂肪酸酰胺显示出与生活习惯病的症状的恶化程度更为明显的相关性，因此认为特别适合作为生物标志物等。作为该长链脂肪酸酰胺的具体例，例如可列举出油酸酰胺、亚油酸酰胺、棕榈烯酸酰胺、棕榈酸酰胺等。更优选地，可为油酸酰胺(油酰胺)。
[脂肪酸酰胺的生物体内浓度和诊断方法]
就脂肪酸酰胺而言，虽然详细情况不确定，但更具体地，在生活习惯病患者的生物体内，其浓度表现出与葡萄糖(血糖)浓度的负相关性。因此，例如，慢性地血中的葡萄糖浓度高的人与葡萄糖浓度正常的人相比，生物体内的上述脂肪酸酰胺的浓度慢性地降低。另外，对于通常血中的葡萄糖浓度正常的人，即使一时地血中的葡萄糖浓度升高，生物体内的脂肪酸酰胺的浓度也不会降低。进而，慢性地血中的葡萄糖浓度高的人即使一时地摄取含有脂肪酸酰胺的食物等而使生物体中的脂肪酸酰胺的浓度上升，在其后数小时(例如1小时后、典型地约4小时后)，生物体内的脂肪酸酰胺的浓度再次稳定在低的值。应予说明，这种倾向并不限定于生物体中的血液，在脏器等中也能同样看到。因此，利用该特性，生物体内的脂肪酸酰胺的浓度低的情况下，能够推测该生物体慢性地血中的葡萄糖浓度高。
再有，诊断时，能够基于对于健康的正常人测定的生物体内的脂肪酸酰胺的浓度，预先设定用于区别健康的正常人和生活习惯病患者的脂肪酸酰胺的浓度的阈值。而且，例如，在受试者的生物体内的脂肪酸酰胺的浓度不到该阈值的情况下，能够诊断为该受试者已患有生活习惯病。
再有，如后述那样，即使是医学上可判断为完全未患有生活习惯病的受试者，对于生活习惯病的症状不断形成的受试者，与健康的正常人相比，也发现生物体内的脂肪酸酰胺的浓度降低的倾向。因此，例如考虑利用生物体内的脂肪酸酰胺的浓度来评价生活习惯病的康复比较容易的初期阶段。
再有，关于脂肪酸酰胺的浓度测定等，例如，“生物体内的脂肪酸酰胺”包含“从生物体采集的试样中的脂肪酸酰胺”的含义。
因此，在此所公开的技术中，例如，在与健康的正常人相比的情况下能够判断为生物体内的脂肪酸酰胺的浓度有意地低的范围内，能够将尽可能高的脂肪酸酰胺的浓度设定为阈值。由此，例如，对于脂肪酸酰胺的浓度有意地低的受试者，将其诊断或筛查为可预见生活习惯病的形成的生活习惯病预备军，能够促进对患上生活习惯病的预防。或者，通过诊断或筛查为能够有效地防止·改善生活习惯病的恶化的生活习惯病集中治疗对象组，从而能够优先地治疗可康复的生活习惯病患者。
[脂肪酸酰胺的生物体内浓度测定]
再有，用于脂肪酸酰胺的浓度测定而从受试者采集的生物体材料只要是含有体液的生物体部分即可，例如可以为血液、组织液、淋巴液等体液、脏器等。优选为血液(例如血浆、血清)。这些生物体材料优选将体液中存在的全部蛋白质除去后供于脂肪酸酰胺的浓度测定。
脂肪酸酰胺例如能够采用比色定量、气相色谱(GC)法、气相色谱质量分析(GC/MS)法、液相色谱质量分析(LC/MS)法、高速液相色谱质量分析(HPLC/MS)法、薄层色谱(TLC)凝胶图像解析法、毛细管电泳-飞行时间型质量分析(CE-TOFMS)法、核磁共振分光(NMR)法等进行定量。其中，优选采用将试样中所含的成分用色谱分离后用四极型质量分析器选择特定质量、进而用飞行时间型或四极型等的质量分析器进行检测的LC-MS/MS法。根据LC-MS/MS法，能够通过一次分析(例如，1次注射)完整地高精度地对8种脂肪酸进行定量，因此优选。另外，或者，脂肪酸酰胺的定量优选使用作为后述的生活习惯病检测试剂盒的脂肪酸酰胺定量试剂盒。
采集血液等液体试样作为生物体材料的情况下，例如，通过相对于液体试样(例如，血清或血浆等)以约2倍左右的比例加入作为蛋白质沉淀剂的丙酮，能够从生物体材料中将蛋白质沉淀除去。蛋白质的亲水性部分通过与血液中的水分相接而溶解，但通过加入作为水溶性有机溶剂的丙酮，蛋白质与水分子的结合被切断，溶解度降低。由此，生物体材料的脂质等可溶性物质仍在血液中残留，只有蛋白质成分凝聚而在液体中沉淀。应予说明，蛋白质的沉淀方法并不限定于此，例如，能够适当地采用公知的硫酸铵(盐析)沉淀法、三氯醋酸(TCA)沉淀法、TCA/丙酮沉淀法、采用含有醋酸铵的甲醇的沉淀法等。
另外，游离糖和氨基酸这样的非脂质成分混入液体试样中是不优选的。因此，例如，能够采用FOLCH法等从液体试样中将总脂质分离、提取。液体试样中的氢键·疏水键在醚、氯仿、苯、己烷等非极性溶剂中能够减弱，离子键的情况下，在极性高的甲醇、乙醇等极性溶剂中能够减弱。因此，例如，具体地，对于上述的除去了蛋白质的血液，加入氯仿和甲醇的混合溶液(2：1)并充分搅拌后，通过离心分离使其分离成2层，回收含有氯仿、脂质等脂溶性的成分的上清液部分，能够制成测定试样。
另一方面，采集脏器等的组织试样作为生物体材料的情况下，例如，将采集的组织试样用破碎装置等制成均匀的糊状，对于糊状的组织试样，能够进行上述的蛋白质的分离·除去、脂质的分离·提取。再有，脂质的分离·提取方法并不限定于上述的例子，能够采用Bligh-Dyer法等公知的各种方法。
如由上述的生物体试样的前处理方法也可知地那样，根据以上的测定，脂肪酸酰胺作为油酸(脂肪酸)被检测出。LC-MS/MS法中使用的柱和其他的分析条件能够根据所使用的装置适当地设定。例如，参考后述的实施例中公开的LC-MS/MS分析条件时，能够适宜地实施对于测定试样中可含有的上述例示的8种脂肪酸酰胺的定量。
再有，上述脂肪酸酰胺的生物体内浓度测定可以不以诊断为目的地实施。提供这样的方法作为测定脂肪酸酰胺的浓度的方法，或者作为收集脂肪酸酰胺的浓度数据的方法。另外，这种不以诊断为目的的方法的实施也可以通过使脂肪酸酰胺的生物体内浓度测定装置等处理装置(计算机)执行存储了计算机程序的计算机可读取的存储介质来实施。因此，在此所公开的技术提供脂肪酸酰胺的生物体内浓度测定装置和存储了计算机程序的计算机可读取的存储介质。
脂肪酸酰胺的生物体内浓度测定装置具备：存储从受试者采集的生物体试样中所含的脂肪酸酰胺的浓度的第一存储部；存储从健康的正常人得到的生物体试样中所含的脂肪酸酰胺的浓度的第二存储部；判定从所述受试者得到的脂肪酸酰胺的浓度是否低于从健康的正常人得到的脂肪酸酰胺的浓度测定结果的判定部。典型地，这些各个部件包含于控制部。控制部的构成没有特别限定，例如是微型计算机。微型计算机的硬件构成没有特别限定，例如具备：分析装置、电子终端，主计算机，接收来自外部存储介质等外部设备的脂肪酸酰胺的浓度数据、程序等的接口(I/F)，执行控制程序的指令的中央处理装置(CPU)，存储由CPU执行的程序的ROM(只读存储器)，作为开发程序的工作区的RAM(随机存取存储器)，和存储上述控制程序等各种数据的存储部。存储部例如包括上述的第一存储部和第二存储部。判断部可以由硬件(例如电路)、处理器构成，或者可以构成为由CPU执行计算机程序从而实现功能。
在此所公开的存储介质存储用于使计算机作为上述各个部(例如，第一存储部，第二存储部和判断部)发挥功能的程序。即，在此所公开的存储介质的特征在于，当处理设备执行计算机程序时，使计算机执行以下步骤：存储从受试者采集的生物体试样中所含的脂肪酸酰胺的浓度的工序，和判定从受试者得到的上述脂肪酸酰胺的浓度是否低于从健康的正常人得到的生物体试样中所含的上述脂肪酸酰胺的浓度测定结果的工序。计算机执行的步骤也可以包括存储从健康的正常人得到的生物体试样所含的脂肪酸酰胺的浓度的工序。作为一个例子，存储介质是例如以CD(光盘)，DVD(数字多功能光盘)，USB存储器等为代表的计算机可读取的存储介质。通过CPU执行存储于存储介质中的程序，在生物体浓度测定装置中，例如将从受试者采集的生物体试样中所含的脂肪酸酰胺的浓度存储在第一存储部，将从健康的正常人得到的生物体试样中所含的脂肪酸酰胺的浓度存储在第二存储部，在判定部中，判定从受试者得到的上述脂肪酸酰胺的浓度是否低于从健康的正常人得到的生物体试样中所含的上述脂肪酸酰胺的浓度测定结果。
[利用]
即，根据在此所公开的技术，例如使以下的内容成为可能。
■提供生物标志物，其为用于诊断生活习惯病的生物标志物，包含生物体中的脂肪酸酰胺。
■脂肪酸酰胺例如可以是油酰胺。
■在患有生活习惯病的受试者和不能说患有生活习惯病但其症状在不断形成的受试者中，生物体内的脂肪酸酰胺的浓度与健康的正常人相比有意地减少(例如p＜0.05)。因此，通过确认生物体内的脂肪酸酰胺的浓度与健康的正常人相比有意地减少，从而能够诊断该生物体是否患有生活习惯病，或者生活习惯病的症状是否恶化。换言之，不仅是生活习惯病的患病者，而且能够对认为是生活习惯病的患病预备军的人进行诊断，能够有效地实现生活习惯病的应对和预防。
■生物体内的脂肪酸酰胺的浓度例如与血中的总胆固醇(T-Cho)、低密度脂蛋白(LDL)、葡萄糖(血糖)等的浓度具有相关性。特别地，与葡萄糖具有比较高的相关性。由此，作为生活习惯病，能够将肥胖、脂质异常症、脂肪肝、糖尿病、耐糖能力异常症中的至少1个疾病作为对象。特别是对于糖尿病、脂质异常症，能够以高精度进行诊断。
[生活习惯病诊断试剂盒]
生活习惯病诊断试剂盒可以定量脂肪酸酰胺的浓度。该生活习惯病诊断试剂盒至少包含检测所期望的脂肪酸酰胺的检测试剂和固定该检测试剂的载体。
如上所述，检测试剂可以是例如特异性检测所期望的脂肪酸酰胺的抗体，酶，酶标识抗体等。作为载体，只要是固定检测试剂的固相材料则没有特别限制。载体优选为对所使用的试剂(例如，表面活性剂、缓冲液等)具有不溶性的材料。这样的载体可以是例如聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚乙烯基甲苯，聚丙烯，聚乙烯，聚氯乙烯，尼龙，聚甲基丙烯酸酯，乳胶，明胶，琼脂糖，纤维素，琼脂糖(Sepharose)等树脂材料，玻璃材料，金属材料，陶瓷材料，磁性材料等构成的载体。对载体的形状没有特别限定，例如可以是实心或空心的球状、珠状、板状、微板状、阵列、试管状、棒状等。
予以说明，脂肪酸酰胺可以包含在食物中。因此，例如一时地摄入含有脂肪酸酰胺的食物而使生物体内的脂肪酸酰胺的浓度上升的情况下，数小时后(例如1小时以上，更安全地为4小时以上)再测量生物体内的脂肪酸酰胺的浓度即可。
实施例
以下对关于本发明的几个实施例进行说明，但并不意在将本发明限定于该实施例中所示的内容。
1.人体血液中的脂肪酸酰胺浓度的测定(高血糖)
对于由于某些原因来医院的81名患者，在得到手术同意书后，空腹时采血，得到了人体血液试样(名古屋大学医学部附属医院采集)。从这些血液试样提取血清，使用(株)日立高新技术会社制的临床化学自动分析装置LABOSPECT008，测定了血清中的总胆固醇(T-Cho)、中性脂肪(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和葡萄糖的浓度(mg/dL)。由这些测定结果，将血中的葡萄糖浓度不到125mg/dL的受试者规定为健康的正常人，将其他人规定为高血糖患者，对于健康的正常人和高血糖患者分别算出各自的测定值的平均，示于下述的表1中。再有，总计81名的受试者中健康的正常人为55人，高血糖患者为26人。
另外，对于相同的血液试样，进行了脂肪酸酰胺的定量。具体地，将采集的血液供于离心分离，得到了血浆。向得到的血浆中加入冰冷丙酮2倍量(体积)，在-20℃下培育30分钟后，进行离心分离，回收上清液，由此将蛋白质除去。接着，加入回收的上清液的10倍量(体积)的氯仿：甲醇＝2：1的溶液，充分地搅拌后，进行离心分离，回收上清液。将其作为测定试样，供于超高性能液相色谱(LC-MS/MS)系统，进行了脂肪酸酰胺的鉴定和定量。
再有，LC-MS/MS的测定条件如以下所述。另外，作为脂肪酸酰胺，对肉豆蔻酸酰胺(C14：0)、棕榈酸酰胺(C16：0)、棕榈烯酸酰胺(C16：1)、硬脂酸酰胺(C18：0)、油酸酰胺(C18：1)、亚油酸酰胺(C18：2)、α-亚麻酸酰胺(C18：3)、花生油烯酸酰胺(C20：4)进行了定量。这种情况下，例如油酰胺在LC的保持时间7.2分钟的位置、以质谱的质量电荷比(m/z)为282被检测出。再有，定量时，采用分别使用稳定同位素标识的脂肪酸酰胺作为内部标准物质的稳定同位素稀释法作成校正曲线，算出了浓度(μM)。得到的结果分成健康的正常人组和高血糖患者组，在图2中作为直方图示出。
装置：ACQUITY UPLC-Xevo-TQD(Waters会社制造)
移动相流量：0.3ml/分钟
移动相：(A)含有0.1％甲酸的水(H2O)
(B)含有0.1％甲酸的水乙腈
柱：Develosil HB C30-UG-3(2.0/100mm)(野村化学株式会社制造)
柱加热器温度：40℃
离子化模式：ESI-Positive、Cone 25V,Collision 12V
分析时间：15分钟
【表1】
表1
如表1中所示那样，能够确认在测定的全部的项目(T-Cho，TG，LDL，葡萄糖)中，高血糖患者组的测定平均值有意地高于健康的正常人组的测定平均值。
另一方面，就血中的脂肪酸酰胺而言，确认了高血糖患者组的测定平均值比健康的正常人组的测定平均值低。另外，在测定的8种脂肪酸酰胺中，特别是对于油酰胺，可知与健康的正常人组的血中的油酰胺浓度相比，高血糖患者组的油酰胺浓度大幅地减少。在图2中，在健康的正常人组与高血糖患者组之间作为散布图示出了油酰胺的血中浓度。
由以上确认了：在高脂血症患者的血清中脂肪酸酰胺(例如油酰胺)的浓度有意地降低。因此，可知能够利用该脂肪酸酰胺作为例如用于作出生活习惯病的诊断的新型生物标志物。
2.人体血液中的油酰胺浓度的测定(糖尿病患者)
对于20名糖尿病患者，得到了手术同意书后在空腹时采血，得到了人体血液试样(名古屋大学医学部附属医院采集)。从这些血液试样提取血清，与上述同样地测定了血清中的葡萄糖(血糖)、低密度脂蛋白(LDL)、中性脂肪(TG)和总胆固醇(T-Cho)的浓度(mg/dL)以及油酰胺的浓度(μM)。其结果，能够确认在糖尿病患者组的血清的葡萄糖浓度与油酰胺浓度之间可见负相关性。
在此，将得到的测定结果分成血中葡萄糖浓度为80mg/dL以上且不到110mg/dL的组(对照)、110mg/dL以上且不到125mg/dL的组(I组)、125mg/dL以上且200mg/dL以下的组(II组)、超过200mg/dL的组(III组)这4组，在图3A中作为直方图示出，在图3B中作为散布图示出。
“对照”是由空腹时血糖值不到110mg/dL、医学上判断为正常型的患者组成的组。“I组”是由空腹时血糖为110mg/dL以上且不到125mg/dL、医学上判断为处于边界型的患者组成的组。而且，“II组”和“III组”是由空腹时血糖为125mg/dL以上、医学上判断为大致处于糖尿病型的患者组成的组。即，本试验中，将被分类为糖尿病型的空腹时血糖分类为糖尿病的初期阶段即“II组”和比较重度的糖尿病(空腹时血糖超过200mg/dL)即“III组”。
如图3A和图3B中所示那样，可知随着血中的葡萄糖浓度增加，整体上油酰胺浓度倾向于减少。而且如图3B中所示那样，能够确认葡萄糖浓度增加到进入II组时，油酰胺浓度急剧地减少。II组中减少后的油酰胺浓度与III组中的油酰胺浓度相比没有明显的变化。
由此，例如，即使是诊断为糖尿病的II组的患者，对于油酰胺浓度比较高(例如1.5μM以上)患者，可以判断为从糖尿病的改善·康复比较容易，能够促进重点治疗。
或者，通过短期住院体检等定期诊查中的油酰胺浓度的测定，在油酰胺浓度有意地降低时，即使血糖值比较低(例如空腹时血糖为180mg/dL以下、特别是150mg/dL以下)，也能够认为糖尿病已经开始恶化，能够促进早期的应对和预防。
3.肥胖模型小鼠的血液中的油酰胺浓度的测定
作为肥胖的模型小鼠，将6周龄的雄性的ob/ob小鼠5只作为肥胖小鼠组。另外，作为比较对照的小鼠，将6周龄的雄性的BALB/c正常小鼠5只作为正常小鼠组。将这些小鼠饲养1周后，7周龄时采血。
然后，与上述同样地，将采集的血液离心分离而得到了血浆后，加入血浆的2倍量的冰冷丙酮，在-20℃下培育30分钟后，进行离心分离，回收上清液，由此将蛋白质除去。接着，加入血浆的10倍量的氯仿：甲醇＝2：1的溶液，充分地搅拌后，进行离心分离，回收上清液。将其作为测定试样，供于LC-MS/MS，进行了脂肪酸酰胺的鉴定和定量。此时，将稳定同位素标识的油酰胺用作内部标准物质。应予说明，LC-MS/MS的测定条件与上述相同。将油酰胺浓度的测定结果分为肥胖小鼠组和正常小鼠组，示于图4中。
如图4中所示那样，可知在肥胖模型小鼠中油酰胺的浓度有意地减少了。由此，关于油酰胺的作用，能够确认将小鼠作为人体疾病的模型动物使用是有效的。另外，肥胖模型小鼠中的油酰胺量在样品间波动小，可以说通过有效利用模型小鼠，能够开发出与油酰胺的作用相关的对于糖尿病等生活习惯病的新的预防·诊断·治疗法。
以上详细地说明了本发明的具体例，但这些只不过是例示，并不限定专利权利要求的范围。在此所公开的发明中可包含对上述的具体例进行了各种变形、改变的产物。

Claims (10)

1.用于诊断生活习惯病的生物标志物，其包含生物体中的脂肪酸酰胺。
2.根据权利要求1所述的生活习惯病的生物标志物，其中，所述生活习惯病为选自肥胖、脂质异常症、糖尿病和耐糖能力异常中的至少1种。
3.脂肪酸酰胺的浓度测定方法，其不是以诊断为目的的方法，包括：
从受试者采集生物体试样的工序；
测定所述生物体试样中所含的脂肪酸酰胺的浓度的工序；和
判断从所述受试者得到的所述脂肪酸酰胺的浓度的所述测定值是否低于从健康的正常人得到的生物体试样中所含的所述脂肪酸酰胺的浓度测定结果的工序。
4.收集脂肪酸酰胺的浓度数据的方法，其不是以诊断为目的的方法，包括：
从受试者采集生物体试样的工序；
测定所述生物体试样中所含的脂肪酸酰胺的浓度的工序；和
判定从所述受试者得到的所述脂肪酸酰胺的浓度的所述测定值是否低于从健康的正常人得到的生物体试样中所含的所述脂肪酸酰胺的浓度测定结果的工序。
5.计算机可读取的存储介质，其存储计算机程序，特征在于，处理装置执行该计算机程序时，使计算机执行以下步骤：
存储从受试者采集的生物体试样中所含的脂肪酸酰胺的浓度的工序；和
判定从所述受试者得到的所述脂肪酸酰胺的浓度是否低于从健康的正常人得到的生物体试样中所含的所述脂肪酸酰胺的浓度测定结果的工序。
6.脂肪酸酰胺或检测所述脂肪酸酰胺的检测试剂的用途，其用于检测生活习惯病的试剂盒的制造。
7.脂肪酸酰胺或检测所述脂肪酸酰胺的检测试剂的用途，其用于制造评价生活习惯病的风险的试剂盒。
8.脂肪酸酰胺或检测所述脂肪酸酰胺的检测试剂的用途，其用于制造生活习惯病的检测标志物。
9.脂肪酸酰胺的用途，其用于生活习惯病的预防剂的制造。
10.检测生活习惯病的试剂盒，其包含：检测脂肪酸酰胺的检测试剂，和固定所述检测试剂的载体。
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