KR101652737B1 - 대건중탕의 생물학적 검정 방법 및 이것을 사용하는 품질관리 방법 - Google Patents

대건중탕의 생물학적 검정 방법 및 이것을 사용하는 품질관리 방법 Download PDF

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Abstract

대건중탕에 대하여 간편한 시험관내 시험에 의한 생물학적 검정 방법을 제공하고, 더욱 이것을 이용한 대건중탕의 보다 정확성이 높은 품질관리 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 당해 방법은, 배양 세로토닌 생산 세포에, 대건중탕을 함유하는 피검 시료를 첨가하고, 이어서 배양 상청액 중의 세로토닌 함량을 측정하는 것을 특징으로 하는 대건중탕의 약리 활성의 생물학적 검정 방법 및 이 생물학적 검정 방법에 의해, 대건중탕으로서 임상적으로 약리효과가 확인된 기준 제제와 피검 제제를 동일 조건에서 약리 활성을 평가하고, 기준 제제와 피검 제제의 동등성을 평가하는 대건중탕 제제의 품질관리 방법이다.

Description

대건중탕의 생물학적 검정 방법 및 이것을 사용하는 품질관리 방법{DAIKENCHUTO BIOASSAY METHOD AND QUALITY MANAGEMENT METHOD USING SAME}
본 발명은 대건중탕(大建中湯)의 생물학적 검정 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 배양한 세로토닌 생산 세포를 사용하여, 한방 제제인 대건중탕의 약리 활성값(세로토닌 방출 활성)을 정량적으로 평가할 수 있는 생물학적 검정 방법 및 이것을 사용한 대건중탕의 품질관리 방법에 관한 것이다.
한방약은 생약을 블렌드한 의약품으로, 그 활성 성분이 모두 특정되어 있는 것은 아니다. 또한 단일 활성 성분만으로 효과를 발휘하는 것이 아니라, 다성분에 의해 복합적으로 작용하는 것이기 때문에, 그 품질을 보증하기 위해서는, 그 제제 전체로서 평가를 할 수 있는 측정방법이 필요한 것으로 되어 있다. 실제로, 미국 FDA의 식물약 가이던스에서는, 한방약 등의 제품에 관하여 생물학적 검정 등에 의한 품질관리를 요구하고 있다.
이 품질관리 방법에는, 약효에 관계된다고 생각되는 성분을 모두 측정하고, 그것들을 종합적으로 평가하는 방법과, 생물 재료를 사용하여 생리 활성을 평가하는 생물학적 검정이 있다. 전자의 경우, 측정에 걸리는 비용이나 측정방법의 확립의 점에서 문제가 있다. 한편, 생물학적 검정에는, 생체내(in vivo) 시험과, 시험관내(in vitro) 시험이 있지만, 생체내 시험의 계는 시험 시설, 시험 동물, 처리 능력 등의 점에서 여러 제약이 있어, 한방약의 품질을 평가하기는 곤란했다.
한편, 시험관내 시험의 계에서는, 특수한 시설을 필요로 하지 않고, 안정한 시험결과가 단기간에 얻어지기 때문에, 이 계에서 생물학적 검정법을 확립하는 것이 요구되고 있다. 그러나, 그것 자신이 복수의 유효성분을 포함하는 생약을 조합한 한방약에 대해서는, 항상 적절한 생물학적 검정계가 발견되고 있는 것이 아니어서, 그 확립이 기대되고 있다.
종래, 한방약인 대건중탕의 약리효과에 관한 품질관리를 위한 생물학적 검정 방법으로서 이미 대건중탕 투여에 의한 장평활근 수축을 직접 측정하는 방법(마그누스법)이 구축되어 있다(비특허문헌 1).
그러나, 이 마그누스법은 래트로부터 적출한 장관을 사용하기 위해, 품질 평가의 루틴 시험으로서 실시하는 생물학적 검정 방법으로서는 사용성이 나쁘고, 또한 감도, 재현성 등에서도 불충분했다.
「일의대의회지」, 제6권 (3), 제127-129쪽(2010), 칸 하야토 및 우치다 에이지
따라서 본 발명의 과제는 대건중탕에 대하여 간편한 시험관내 시험에 의한 생물학적 검정 방법을 제공하고, 또한 이것을 이용한 대건중탕의 보다 정확성이 높은 품질관리 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 대건중탕의 장관운동 항진 작용이나 장관 혈액순환 증가 작용이나, 이들 작용과 세로토닌의 관여에 대한 보고(비특허문헌 1)에 주목하고, 대건중탕과 세로토닌의 관계에 관하여 예의 연구를 행했다. 그리고 그 결과, 대건중탕이 세로토닌 생산 세포에 대하여, 세로토닌 방출 촉진 작용을 갖는 것, 및 방출되는 세로토닌의 양을 측정함으로써, 대건중탕의 약리 활성값을 측정하는 것이 가능한 것, 및 이 생물학적 검정계를 이용함으로써 적절하게 대건중탕의 품질관리를 행할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉 본 발명은 배양 세로토닌 생산 세포에 대건중탕을 함유하는 피검 시료를 첨가하고, 이어서 배양 상청액 중의 세로토닌 함량을 측정하는 것을 특징으로 하는 대건중탕의 약리 활성의 생물학적 검정 방법이다.
또한 본 발명은, 상기의 대건중탕의 약리 활성의 생물학적 검정 방법에 의해, 대건중탕으로서 임상적으로 약리 효과가 확인된 기준 제제와 피검 제제를 동일 조건에서 약리 활성을 평가하고, 기준 제제와 피검 제제의 동등성을 평가하는 것을 특징으로 하는 대건중탕 제제의 품질관리 방법이다.
본 발명의 생물학적 검정 방법에 의하면, 시험 시설, 시험 동물, 처리 능력 등의 제약 없이, 간단한 시험관내 시험에 의해, 대건중탕의 약리 활성값(세로토닌 방출 활성)을 측정하는 것이 가능함과 아울러, 품질을 평가하기 위하여 적절한 농도범위에서 본 시험을 행함으로써, 대건중탕에 대하여 정확성이 높은 품질관리를 행할 수 있다.
도 1은 대건중탕 농도와 세로토닌(5-HT) 방출량의 관계를 도시하는 도면이다.
도 2는 HPLC에 의한 배양 시료액 중의 세로토닌의 측정결과를 도시하는 도면이다. 도면 중 (a)는 대건중탕을 첨가하지 않은 경우의 세로토닌(5-HT) 방출을, (b)는 대건중탕을 900μg/ml 첨가한 경우의 세로토닌(5-HT) 방출을 나타낸다.
대건중탕은 일반적으로 표 1의 조성의 혼합 생약의 추출 엑스를 분말화한 것(무교이 대건중탕이라고 불리는 경우가 있다.)에, 추출 엑스의 8배량 정도의 분말엿(교이(膠飴) 영어명: maltose)을 배합한 것이다.
이름 (영어명) 배합
일본산 건생강 (JP Processed Ginger) 5.0g
일본산 인삼 (JP Ginseng) 3.0g
일본산 산초열매 (JP Zanthoxylum Fruit) 2.0g
그리고, 본 발명의 생물학적 검정법의 대상이 되는 대건중탕으로서는 대건중탕에 의약품 첨가물로서 첨가가 인정되어 있는 성분을 더 첨가하여 과립 등으로 제제화한 대건중탕 제제도 포함된다. 이러한 제제화한 대건중탕 제제로서는, 예를 들면, 츠무라 대건중탕 엑스 과립(의료용)과 같은 의료용 의약품으로서 시판되고 있는 것을 들 수 있다.
또한, 상기의 의약품 첨가물로서 첨가가 인정되어 있는 성분은 전분, 유당, 백당, 만니톨, 카르복시메틸셀룰로오스, 옥수수 전분, 무기염 등의 부형제, 붕괴제, 계면활성제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제, 착색제, 향료 등을 들 수 있다.
본 발명의 대건중탕의 생물학적 검정 방법은 배양 세로토닌 생산 세포에 대건중탕을 함유하는 피검 시료를 첨가하고, 첨가 후의 세로토닌 생산 세포에 있어서의 세로토닌 방출량으로부터 대건중탕의 약리 활성값을 평가하는 것이다.
본 발명에서 사용하는 세로토닌 생산 세포의 예로서 장크롬친화 세포를 들 수 있다. 이 장크롬친화 세포는 내분비 세포이며, 생체내에 존재하는 세로토닌을 대량으로 생산, 분비할 수 있는 세포이다. 그리고, 생체내에 존재하는 세로토닌의 90%가 장관의 장크롬친화 세포 내에 존재하고 있다고 하는 사실로부터 장관의 장크롬친화 세포를 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 상기 세로토닌 생산 세포로서는 일정한 안정한 세로토닌을 생산할 수 있는 장크롬친화 유사 세포주를 사용할 수도 있다. 장크롬친화 유사 세포주는, 예를 들면, 래트 췌장암 유래의 RIN-14B 세포, 인간 췌장암 유래의 QGP-1 세포, 인간 소장 카르시노이드 유래의 KRJ-I 세포 등을 들 수 있다. 이 중, 특히 바람직한 세포주로서는 증식성이 우수한 점에서 RIN-14B 세포를 들 수 있다.
본 발명의 대건중탕의 생물학적 검정 방법은 우선 세로토닌 생산 세포를 그 생육에 적합한 배지, 예를 들면, 항생 물질, 혈청 등을 포함하는 RPMI1640 등의 배지에서, 예를 들면, 1일간 내지 3일간, 37℃에서 배양한 후, 인산 완충액 등으로 치환하고, 이것에 소정량의 피검 시료를 첨가한 후, 동일 온도에서, 20분부터 3시간 더 배양한 후, 배지 중으로의 세로토닌 방출량을 측정함으로써 행해진다.
대건중탕을 함유하는 피검 시료는, 일반적으로는, 디메틸술폭시드(DMSO)와 같은 용매에 용해 내지 현탁되어, 상기 배지 중에 가해진다.
또한 세로토닌 방출량을 측정하는 방법으로서는 세로토닌 방출량을 측정할 수 있는 방법이면 특별히 제약 없이 공지방법을 이용할 수 있지만, 바람직한 방법으로서는 효소 면역 측정법(EIA법)이나, HPLC법을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 EIA법은 특이적인 항원항체 반응을 하는 항원 또는 항체에 효소를 부착시키고, 효소의 활성을 측정함으로써 항원항체 반응의 결합량을 측정하는 방법이며, 구체적으로는, 예를 들면, EIA 세로토닌·키트(EIA serotonin kit; 베크만·콜터사제) 등의 시판의 키트를 사용하여 행할 수 있다.
또한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)법에 의해 세로토닌 방출량을 측정함에 있어서는, 시료의 장입량, 분석용 컬럼의 종류, 분석용 컬럼의 직경 및 길이, 분석용 컬럼의 온도, 이동상의 조성, 이동상 유량 등의 조건은 적당히 선택할 수 있고, 세로토닌의 분리에 가장 적합한 조건을 선택하면 된다. 이러한 조건으로서는 세로토닌의 리텐션 타임(유지시간)이 다른 검출물과 겹치지 않는 것과 같은 조건이 바람직하다. 또한, 분석용 컬럼으로서는 통상 사용되는 컬럼, 예를 들면, ODS 등을 충전한 컬럼 등, 또한 검출기로서는 일반적으로 범용되는 전기화학 검출기(ECD) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 생물학적 검정 방법에서는, 실시예 1의 결과에 볼 수 있는 것과 같이 농도에 의존한 반응이 얻어지는 농도범위(0∼900μg/mL)에서, 더욱 바람직하게는 통계학적으로 유의한 반응이 얻어지는 농도범위(90∼900μg/mL)에서, 동시에 복수, 바람직하게는 3점 이상 측정하고, 이것으로부터 피검 시료 중의 대건중탕의 약리 활성값(세로토닌 방출 활성)을 정량하는 것이 바람직하지만, 조건이 거의 바뀌지 않는 것이라면, 상기 농도범위의 농도의 대건중탕을 포함하는 시료로 미리 제작된 검량선을 사용하여 측정해도 된다.
본 발명의 생물학적 검정 방법에 의해 제품인 대건중탕의 품질 평가를 행하는 경우에는, 우선, 임상적으로 약리 효과가 확인된 대건중탕의 복수 로트에 대하여, 그 약리 활성값(세로토닌 방출활성)을 측정하고, 그 값에 기초하여 규격 범위를 설정한다. 이어서, 동일한 방법에 의해, 평가해야할 대건중탕의 품질시험용 샘플에 대하여 약리 활성값(세로토닌 방출 활성)을 측정한다. 그리고, 이 샘플의 약리 활성값이 설정한 규격의 범위내인지의 여부로 동등성을 평가하고, 동등이라고 인정되는 것을 합격품으로 함으로써 품질관리를 행하면 된다.
(실시예)
다음에 실시예를 들어, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 조금도 제약되는 것은 아니다.
실시예 1
대건중탕의 생물학적 검정 시험:
(1) 피검 시료의 조제:
표 1의 배합비율의 생약 혼합물을 그 혼합물 중량의 10배량의 정제수로 1시간, 100℃에서 가열 추출하고, 분말화함으로써 무교이 대건중탕 엑스 분말을 얻었다. 이 무교이 대건중탕 엑스 분말을 100mg/mL 농도의 DMSO 현탁액으로 하고, 이것을 88.8mg/mL 농도의 교이 수용액에 대하여 1:9의 비율로 혼화하여, 90mg/mL 농도의 대건중탕 용액을 조제했다. 이것을 0.1% BSA-Hanks 완충액*으로 희석하여 9mg/mL 농도로 한 뒤 15분간의 초음파 처리를 행하여, 대건중탕 피검 시료를 조제했다.
또한 양성 대조 시료로서 알릴이소티오시아네이트(AITC, 와코쥰야쿠고교)를 DMSO에 가하고, 100mmol/L AITC의 DMSO 용액을 조제했다.
* 0.1% BSA-Hanks 완충액
1리터의 증류수에 1g 소 혈청 알부민, 1g 포도당, 8g 염화나트륨, 400mg 염화칼륨, 47.9mg 인산1수소나트륨(무수), 60mg 인산2수소칼륨(무수), 46.8mg 염화마그네슘(무수), 48.8mg 황산마그네슘(무수), 140mg 염화칼슘(무수)을 용해하고, pH 7.2∼7.4로 조제했다.
(2) 세로토닌 생산 세포(RIN-14B 세포)의 배양:
래트 췌장암 세포주 RIN-14B(DS 파마바이오메디칼사제)를, 10% 소 태아 혈청(FBS)을 첨가한 RPMI1640 배지(10mmol/L HEPES, 1.5g/L NaHCO3, 100U/mL 페니실린 G 및 100μg/mL 스트렙토마이신) 중에서 계대배양하여, 세로토닌 생산 세포로 했다. 또한, 세포의 회수 시에는, 트립신-EDTA액을 사용했다.
(3) 세로토닌(5-HT) 방출 시험:
상기 (2)에서 얻어진 세로토닌 생산 세포를 96웰 평바닥 플레이트에 3×104cells/100μL/well로 나누어 넣었다. 72시간의 전배양을 행한 후, 배양 상청액을 상기 (1)에서 얻은 각 피검 시료를 포함하는 0.1% BSA-Hanks 완충액에 치환하고, 5% 탄산 가스 인큐베이터 속에서 1시간 더 배양했다.
피검 시료는 1% DMSO를 포함하는 0.1% BSA-Hanks 완충액으로 단계 희석하여 배양계 중에서 최종 농도 27, 90, 270, 900μg/mL가 되도록 첨가하고, 배양계에서의 DMSO의 최종 농도는 0.1%로 했다. 또한 양성 대조군에서는, 피검 시료로 바꾸고, 상기 (1)에서 얻은 양성 대조 시료를 배양계 중에서 최종 농도 100μmol/L, DMSO의 최종 농도가 0.1%가 되도록 가했다.
최후에, 배양 상청액을 320g으로, 5분간, 4℃에서 원심 처리하고, 그 상청액을 5-HT 농도 측정용 시료(이하, 「측정용 시료」라고 함)으로 했다.
(4) EIA법에 의한 세로토닌(5-HT) 측정:
EIA법에 의한 5-HT 방출 측정은 EIA 세로토닌·키트(베크만·콜터사제)를 사용하고, 제품의 첨부 프로토콜에 준하여 행했다.
즉, 아실화 시약이 들어간 튜브에, 상기 (3)에서 얻은 측정용 시료를 가하고, 또한 아실화 버퍼 50μL를 첨가하여 시약이 용해될 때까지 와류로 교반했다. 실온, 차광 조건하에서 30분간 반응을 행하여, 아실화 반응액을 얻었다. 측정 시료를 가하지 않은 계에서도 상기와 동일하게 처리하고, 컨트롤로 했다.
다음에 항5-HT 항체가 코트된 96웰 플레이트의 적당한 웰에, 각 아실화 반응액 20μL를 옮기고, 아세틸콜린에스테라제(ACE)-5-HT 결합체 200μL를 가하고, 실온, 차광 조건하에, 플레이트 믹서로 진탕하면서 3시간, 경합적으로 인큐베이트 했다.
키트에 첨부된 워시 버퍼를 사용하여, 300μL/well로 3회 플레이트를 세정하고, 미결합의 것을 제외한 후, ACE 기질을 200μL/well 가하고 15∼20분 방치했다. 발색을 확인한 후, 반응정지제 50μL를 가하여 반응을 정지하고, 405nm의 흡광도를 측정했다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.
도 1의 결과에 나타내는 바와 같이, 27, 90, 270, 900μg/mL 농도의 대건중탕을 첨가한 측정 시료에서는, 무첨가의 컨트롤에 비해, 명확하게 상청액 중의 5-HT량이 많고, 게다가 농도 의존적으로, 검량선을 형성할 수 있는 것이었다. 또한 양대조의 AITC를 가한 측정 시료도, 컨트롤에 비해, 명확하게 높은 5-HT 농도를 보이고, 대건중탕이 세로토닌 생산 세포에 작용한 것에 의한 5-HT인 것을 보였다.
(5) HPLC에 의한 세로토닌(5-HT) 측정:
다음에 (3)에서 얻어진 측정용 시료 중, 900μg/mL 대건중탕의 것과, 컨트롤인 배양 시료액에 대하여, HPLC를 사용하여, 이것에 포함되는 5-HT를 검출했다. 그 결과를 도 2의 (a) 및 (b)에 나타낸다(5-HT의 유지시간은 (a)에서 16.27분, (b)에서 16.11분임).
또한, HPLC에 의한 5-HT 분석은 이하의 조건으로 행했다. 또한 5-HT 표준액은 마지막 농도 100mg/L 농도가 되도록 EDTA를 첨가한 0.1mol/L 아세트산 수용액으로 조제했다.
HPLC 분석 조건
미량 생체 시료분석 시스템: HTEC-500(EICOM)
데이터 처리 장치: EPC-300(EICOM)
데이터 해석 소프트웨어: PowerChrom version
2.5.7(eDAQ)
분석 컬럼: EICOMPAK CA-5ODS
2.1mmΦ×150mm
프레 컬럼: EICOM PREPAKSET-CA
3.0mmΦ×4mm
이동상: 80% 0.1M 인산 완충액(Na+) pH6
20% 메탄올
500mg/L 1-옥탄술폰산소다(SDS)
50mg/L EDTA·2Na+
유속: 230μL/min
분석온도: 25℃
설정 가전압: +450mV(+400∼+450mV) vs
Ag/AgCl
작용 전극: 그래파이트 전극 WE-3G
개스킷: GS-25
분석 컬럼: 80%
도 2의 결과로부터, HPLC에 의한 측정에서도 세로토닌 방출 활성을 측정할 수 있는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 의하면, 대건중탕의 품질 평가를 행할 때에, 시험 시설, 시험 동물, 처리 능력 등의 제약이 거의 없이, 시험이 가능하고, 또한 적절한 농도범위에서 시험을 행함으로써, 대건중탕에 대하여 정확성이 높은 품질평가를 행할 수 있다.
따라서 본 발명은 종래의 대건중탕의 생물학적 검정 방법에 비해, 경제성이 높고, 간단하게 품질평가를 행할 수 있으므로, 한방 제제의 품질관리에 있어서 대단히 유리한 것이다.

Claims (5)

  1. 배양 세로토닌 생산 세포에, 대건중탕의 농도로서 27~900μg/mL의 범위에서 대건중탕을 함유하는 피검 시료를 첨가하고, 이어서 배양 상청액 중의 세로토닌 함량을 측정하는 대건중탕의 약리 활성의 생물학적 검정 방법에 의해, 대건중탕으로서 임상적으로 약리효과가 인정된 기준 제제와 피검 제제를 동일 조건에서 약리 활성을 평가하여, 기준 제제와 피검 제제의 동등성을 평가하는 것을 특징으로 하는 대건중탕 제제의 품질관리 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 세로토닌 생산 세포가 장크롬친화 유사 세포인 것을 특징으로 하는 대건중탕 제제의 품질관리 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 세로토닌 생산 세포가 RIN-14B 세포, QGP-1 세포 및 KRJ-I 세포로부터 선택되는 세포주인 것을 특징으로 하는 대건중탕 제제의 품질관리 방법.
  4. 삭제
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 대건중탕의 농도로서 90∼900μg/mL의 범위에서 생물학적 검정 방법을 행하는 것을 특징으로 하는 대건중탕 제제의 품질관리 방법.
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