CN103884846B - 一种利拉鲁肽生物学活性的检测方法 - Google Patents

一种利拉鲁肽生物学活性的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明以细胞内3’,5’-环腺苷酸（cAMP）水平的变化作为检测指标，采用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法测定利拉鲁肽生物学活性。通过培养大鼠胰岛瘤细胞RIN-m5F，分别加入稀释后的利拉鲁肽对照品溶液和供试品溶液，用试剂盒检测刺激后细胞内cAMP水平变化，用多功能酶标仪的超灵敏化学发光检测模块读取相对化学发光单位（RLU）,然后利用统计软件拟合实验数据，通过公式计算供试品的生物学活性。该方法能简便、快速、准确地检测利拉鲁肽生物学活性的变化，其准确性和重复性符合生物制品生物学活性测定方法的要求。

Description

一种利拉鲁肽生物学活性的检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利拉鲁肽生物学活性的测定方法。
发明背景
糖尿病在世界范围内日益严重威胁人类健康。胰高血糖素样肽-1（glucagon-likepeptide-1），简称GLP-1，是肠道L细胞分泌的一种多肽类激素，具有促进胰岛素分泌、促进胰岛β细胞增殖和分化的功能。它通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空发挥降血糖的作用。由于它对胰岛素的刺激具有葡萄糖依赖性，因此不引发低血糖症状。
天然GLP-1因半衰期短（仅1～2分钟）不适合临床应用。利拉鲁肽与GLP-1有97%的同源性，在临床上用于成人2型糖尿病患者控制血糖。其分子结构与天然人GLP-1分子的不同之处是：第34位的赖氨酸被精氨酸取代，第26位的赖氨酸上增加了一个由谷氨酸介导的16碳脂肪酸侧链。利拉鲁肽半衰期长达13小时，每日只需皮下注射1次，即可有效控制血糖24小时。
生物制品的生物学活性是生物制品质量评价的重要指标，因此利拉鲁肽的生物学活性测定方法是利拉鲁肽质量研究的重点之一。目前利拉鲁肽生物学活性欠缺简便、快速、准确的测定方法。
利拉鲁肽属于GLP-1类似物，它与细胞膜上GLP-1受体（G蛋白偶联受体）相互作用后，细胞内腺苷酸环化酶(adenylatecyclase)被激活，导致胞内cAMP水平升高。胞内cAMP水平检测法被广泛用于定量测定GLP-1及其类似物的体外生物学活性，属于细胞基础的受体结合法。利拉鲁肽原研厂为novonordisk公司。在该公司专利CN97198413.1中为检测GLP-1衍生物的生物活性，测定了它们在表达人胰腺GLP-1受体的细胞系内刺激cAMP形成的能力，使用了幼仓鼠肾细胞（BHK）和闪烁亲近测定法（说明书第61/62页）。由于表达人胰腺GLP-1受体的幼仓鼠肾细胞难以获得；而且闪烁亲近测定法使用了放射性同位素，对人体有危害，因此需要开发一种操作简单、安全可靠的利拉鲁肽生物活性测定方法。
发明内容
本发明提供了一种利用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法测定利拉鲁肽生物学活性的新方法，从而解决了利拉鲁肽生物学活性测定的难题。
目前实验中，大多数使用的是放射性同位素测定法和cAMP酶联免疫反应分析法来测定胞内cAMP水平。但是放射性同位素对人体有危害，实验操作不方便。而cAMP酶联免疫反应分析法通过ELISA方法测定，该方法步骤繁琐，整个实验过程周期较长，而且实验误差相对较大，因而结果不是非常理想。
本申请发明通过大量实验和对比研究后，第一次创造性地将cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法原理应用于利拉鲁肽的生物学活性测定。cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法原理是：裂解细胞释放出胞内cAMP，cAMP激活蛋白激酶A催化蛋白质磷酸化反应而消耗ATP。ATP的减少反映为化学发光信号的减弱。cAMP水平越高，蛋白激酶A的活性就越高，消耗ATP更多，从而化学发光信号越弱。
发明人发现相比于cAMP酶联免疫反应分析法，cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法更为方便，实验步骤少，试验结果更为精确，误差相对较小，因而是一种比较理想的测定胞内cAMP水平的方法。
因而，本发明建立了一种利拉鲁肽生物学活性的检测方法，所述方法包括如下步骤：
（1）分别制备利拉鲁肽对照品溶液和供试品溶液，设置稀释浓度梯度；
（2）培养大鼠胰岛瘤细胞RIN-m5F后，加入步骤（1）中制备的对照品及供试品溶液刺激细胞；
（3）用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒检测利拉鲁肽刺激后细胞内cAMP水平变化，用酶标仪的化学发光检测模块读取相对化学发光单位（RLU）。
（4）以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以相对化学发光单位为纵坐标，利用统计软件拟合实验数据，得到利拉鲁肽的剂量效应曲线，计算出供试品和对照品的半效稀释倍数，按照以下公式计算供试品的生物学活性：
供试品生物学活性 ( U / ml ) = Pr × Ds × Es Dr × Er
式中Pr为对照品生物学活性，单位为U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为对照品预稀释倍数；
Es为供试品相当于对照品半效量的稀释倍数；
Er为对照品半效量的稀释倍数。
本发明步骤（1）中，利拉鲁肽对照品溶液及供试品溶液根据其初始浓度进行预稀释，以使预稀释后得到利拉鲁肽对照品和供试品的浓度接近或相同，由利拉鲁肽对照品溶液及供试品溶液的初始浓度和最后设定的预稀释浓度确定利拉鲁肽对照品溶液的预稀释倍数（Dr）和供试品溶液的预稀释倍数（Ds）。优选稀释后的利拉鲁肽的浓度范围为0.0001～1mg/ml，更优选为0.001-0.5mg/ml，更优选为0.001～0.02mg/ml。
在预稀释的基础上，对利拉鲁肽对照品和供试品进行进一步的稀释，制备得到系列浓度梯度的拉鲁肽对照品和供试品，稀释倍数范围为1倍至200万倍，在此范围内根据实验情况选择稀释的倍数。根据实验设计，可制备具有5至15个稀释浓度的利拉鲁肽对照品溶液及供试品溶液，优选制备具有7至12个稀释浓度的利拉鲁肽对照品溶液及供试品溶液。
在本发明的一个实施方案中，优选8个稀释浓度梯度，稀释倍数分别为32倍、64倍、128倍、256倍、1280倍、6400倍、32000倍和80万倍。
在本发明的另一个实施方案中，优选的7个稀释浓度梯度的稀释倍数分别为4倍，8倍，16倍，40倍，80倍，160倍，1600倍和10倍，20倍，40倍，80倍，160倍，320倍，1600倍。
本发明步骤（1）稀释溶液为能维持pH范围7.2-9.5的、浓度为1-100mM的缓冲溶液，优选PBS、DPBS、磷酸氢二钠缓冲液等磷酸盐缓冲液，更优选pH范围为7.2-8.5的、浓度为5-30mM的DPBS或磷酸氢二钠缓冲液，最优选为pH为7.2的DPBS溶液或pH为8.2、10mM的或磷酸氢二钠缓冲液。
本发明步骤（2）所使用的动物细胞类型为对利拉鲁肽的刺激有生理响应的大鼠胰岛瘤细胞RIN-m5F。RIN-m5F细胞为贴壁生长，其培养可选择预先铺在细胞培养板中，置25℃-45℃、1％-10％二氧化碳培养箱中静置培养2-5天。更优选为预先铺在平底96孔细胞培养板中，置37℃、5％二氧化碳培养箱中静置培养3天。在细胞培养板中铺细胞数量为1000-10000个细胞/孔，优选为5000-8000个细胞/孔。
步骤（2）中，RIN-m5F细胞在细胞培养器中培养后，吸去培养孔中上清，然后加入利拉鲁肽药物刺激细胞，将细胞培养容器在25-45℃放置1-30分钟；优选将细胞培养容器在37℃放置5-10分钟。
发明步骤（2）中，RIN-m5F细胞的培养可以在步骤（1）所述的利拉鲁肽对照品和供试品溶液的配制之前、与其同时或者在其之后均可以，优选RIN-m5F细胞的培养在利拉鲁肽对照品和供试品溶液的配制之前。在细胞培养好之后，再选择加入利拉鲁肽样品进行刺激。
本发明步骤（3）中，cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒可选择市场有售的相关试剂盒，优选Promega公司的cAMP-GloTMMaxAssay试剂盒。所用的检测仪中，优选用多功能酶标仪的超灵敏化学发光检测模块读取相对化学发光单位（RLU）。
本发明步骤（4）中，所用的统计软件可选择SPSS、Matlab、Origin、GraphpadPrism等，优选GraphpadPrism软件。进行实验数据拟合时，优选用四参数方程拟合实验数据。四参数方程的公式可表示为Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))。拟合出利拉鲁肽剂量效应曲线的四个参数Top，Bottom，LogEC50和HillSlope，可得到供试品和对照品的半效稀释倍数或半效浓度（EC50），然后计算供试品的相对活性和生物学活性。
本发明所述方法简便、快速、准确，可检测利拉鲁肽生物学活性的变化。酶联免疫反应分析法的检测耗时三至五个小时，该方法的检测耗时仅一小时。该方法的准确性和重复性符合生物制品生物学活性测定方法的要求。测试结果的回收率范围为70%～120%，平均值为102%，RSD为20%，说明该方法的准确性和重复性较好。
附图说明
图1：利拉鲁肽剂量效应曲线
图2：实施例1检测加热处理后利拉鲁肽生物学活性的变化
图3：实施例2利拉鲁肽供试品的生物学活性
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中的RIN-m5F细胞购自美国标准生物品保藏中心（ATCC），白色平底96孔细胞培养板购自Costar，cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒采用Promega公司的cAMP-GloTMMaxAssay试剂盒，实验过程参照该试剂盒说明书进行。
所述利拉鲁肽原研制剂购自诺和诺德公司，利拉鲁肽原粉根据cn97198413.1所述方法制备。
所述试剂如无特别说明，均为市售产品。实施例中采用的方法如无特别说明，均采用本领域常规方法。
生物学活性按照以下公式计算：
供试品生物学活性 ( U / ml ) = Pr × Ds × Es Dr × Er
式中Pr为对照品生物学活性，U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为对照品预稀释倍数；
Es为供试品相当于对照品半效量的稀释倍数；
Er为对照品半效量的稀释倍数。
实施例1
（1）取生长状态良好的RIN-m5F细胞，铺在白色平底96孔细胞培养板中，7000个细胞/孔，置37℃5％二氧化碳培养箱中静置培养三天。
（2）称取若干利拉鲁肽原粉，用10mM磷酸氢二钠溶液（pH8.2）溶解，置80℃水浴锅加热47小时。再称取若干利拉鲁肽原粉，用10mM磷酸氢二钠溶液（pH8.2）溶解。将加热处理过的利拉鲁肽溶液、未处理的利拉鲁肽溶液和利拉鲁肽原研制剂分别进行预稀释，配制成浓度为0.006mg/ml的稀释液。然后分成两组配制浓度梯度，设置7个浓度点。组1为利拉鲁肽原研制剂和未处理的利拉鲁肽溶液。组2为加热处理过的利拉鲁肽溶液和未处理的利拉鲁肽溶液。组1的稀释倍数为4倍，8倍，16倍，40倍，80倍，160倍，1600倍。组2稀释倍数为10倍，20倍，40倍，80倍，160倍，320倍，1600倍。
（3）吸去（1）步骤细胞孔中上清，加入利拉鲁肽的浓度梯度刺激细胞，将细胞板在37℃放置5分钟。
（4）用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒检测（3）步骤的利拉鲁肽刺激后细胞内cAMP水平变化，用多功能酶标仪的超灵敏化学发光检测模块读取相对化学发光单位（RLU）。
（5）以药物浓度为横坐标，以相对化学发光单位为纵坐标，用四参数方程拟合（4）步骤的实验数据，得到利拉鲁肽的剂量效应曲线，组1的剂量效应曲线见图1，组2的剂量效应曲线见图2。图1说明该方法可检测利拉鲁肽的生物学活性。在图2中，相比于未处理的利拉鲁肽原粉，热处理的利拉鲁肽的剂量效应曲线明显右移，其半效浓度（EC50值）显著增大，说明热处理后的利拉鲁肽生物学活性明显降低，该方法可检测利拉鲁肽活性的变化。
实施例2
（1）取生长状态良好的RIN-m5F细胞，铺在白色平底96孔细胞培养板中，7000个细胞/孔，置37℃、5％二氧化碳培养箱中静置培养三天。
（2）称取若干利拉鲁肽供试品和对照品，用10mM磷酸氢二钠溶液（pH8.2）溶解。根据称取量，将供试品预稀释156倍，对照品预稀释135倍，配制相同的浓度梯度，浓度为0.006mg/ml，设置8个浓度点，稀释倍数为32倍，64倍，128倍，256倍，1280倍，6400倍，32000倍，80万倍。
（3）吸去（1）步骤细胞孔中上清，加入利拉鲁肽的浓度梯度刺激细胞，将细胞板在37℃放置5分钟。
（4）用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒检测（3）步骤的利拉鲁肽刺激后细胞内cAMP水平变化，用多功能酶标仪的超灵敏化学发光检测模块读取相对化学发光单位（RLU）。
（5）以稀释倍数为横坐标，以相对化学发光单位为纵坐标，用四参数方程拟合（4）步骤的实验数据，得到利拉鲁肽的剂量效应曲线，见图3，供试品的半效稀释倍数为1439，对照品的半效稀释倍数为1956，对照品的生物学活性为4.06万U/ml，根据供试品生物学活性计算公式，算得供试品生物学活性为3.45万U/ml。
实施例3
实验步骤与实施例2相同。已知供试品的活性为3.95万U/ml，测试该供试品的生物学活性五次，测试结果见表1。测试结果的回收率范围为70%～120%，平均值为102%，RSD为20%，说明该方法的准确性和重复性较好。
表1准确性和重复性的验证

Claims (9)

1.一种利拉鲁肽生物学活性的检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)分别制备利拉鲁肽对照品溶液和供试品溶液，设置稀释浓度梯度；
(2)培养大鼠胰岛瘤细胞RIN-m5F后，加入步骤(1)中制备的对照品及供试品溶液刺激细胞；其中，RIN-m5F细胞的培养选择预先铺在细胞培养板中，置25℃-45℃、1％-10％二氧化碳培养箱中静置培养2-5天；
(3)用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒检测利拉鲁肽刺激后细胞内cAMP水平变化，用酶标仪的化学发光检测模块读取相对化学发光单位(RLU)；
(4)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以相对化学发光单位为纵坐标，利用统计软件拟合实验数据，得到利拉鲁肽的剂量效应曲线，计算出供试品和对照品的半效稀释倍数，按照以下公式计算供试品的生物学活性：
供试品生物学活性 ( U / m l ) = Pr × D s × E s D r × E r
式中Pr为对照品生物学活性，单位为U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为对照品预稀释倍数；
Es为供试品相当于对照品半效量的稀释倍数；
Er为对照品半效量的稀释倍数。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中，利拉鲁肽对照品溶液及供试品溶液根据其初始浓度进行预稀释，以使预稀释后得到利拉鲁肽对照品和供试品的浓度接近或相同；由利拉鲁肽对照品溶液及供试品溶液的初始浓度和最后设定的预稀释浓度确定利拉鲁肽对照品溶液的预稀释倍数(Dr)和供试品溶液的预稀释倍数(Ds)。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中，预稀释后的利拉鲁肽对照品溶液及供试品溶液的浓度范围为0.0001～1mg/ml。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中，在预稀释的基础上，对利拉鲁肽对照品和供试品进行进一步的稀释，制备得到系列浓度梯度的拉鲁肽对照品和供试品，稀释倍数范围为1倍至200万倍，在此范围内根据实验情况选择稀释的倍数。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中，稀释溶液为pH范围7.2-9.5的、浓度为1-100mM的缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中，RIN-m5F细胞在细胞培养器中培养后，吸去培养孔中上清，然后加入利拉鲁肽药物刺激细胞，将细胞培养容器在25-45℃放置1-30分钟。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中，RIN-m5F细胞的培养在步骤(1)所述的利拉鲁肽对照品和供试品溶液的配制之前、与其同时或者在其之后；在细胞培养好之后，再选择加入利拉鲁肽样品进行刺激。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述方法步骤(3)中，cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒为Promega公司的cAMP-GloTMMaxAssay试剂盒。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述方法步骤(4)中，利用统计软件进行实验数据拟合时，利用四参数方程拟合实验数据，四参数方程的公式表示为：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))；
拟合出利拉鲁肽剂量效应曲线的四个参数Top，Bottom，LogEC50和HillSlope，得到供试品和对照品的半效稀释倍数或半效浓度(EC50)，然后计算供试品的相对活性和生物学活性。
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