CN105987897A - 一种血管内皮抑制素生物学活性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定血管内皮抑制素的生物学活性测定方法。更进一步的，本发明公开了一种血管内皮抑制素抑制bFGF促人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖活性检测方法。本方法是将倍比稀释后的血管内皮抑制素与bFGF溶液预混后同时与HUVEC细胞孵育，加入细胞计数染色试剂Cell titer-Glo，用酶标读数仪测定化学发光值，试验数据采用计算机程序处理，计算血管内皮抑制素样品的生物学活性。该方法测定的生物学活性与临床疗效相关，符合CFDA相关的技术要求。

Description

一种血管内皮抑制素生物学活性的检测方法

技术领域

本发明涉及生物制品生物学活性检测技术领域，更具体的说涉及血管内皮抑制素生物学活性检测方法。

背景技术

血管内皮抑制素(Endostatin)是O’Reilly于1997年从小鼠内皮细胞系EOMAD的培养液中分离得到的一种具有抑制血管内皮细胞作用的物质(O’Relly，M.S.，et al.Cell.88：277-285，1997)。氨基酸序列分析该物质为胶原蛋白XVIII的羧基末端的降解片段，分子量为20kD左右。血管内皮抑制素能够显著地抑制小鼠多种原发性肿瘤的生长。重复使用可使小鼠肿瘤处于持久的休眠状态，并且不会产生耐药性(Boehm，T.et al.Nature.390：404-407，1997)。

重组人血管内皮抑制素(rhEndostatin)与重组鼠血管内皮抑制素在氨基酸序列上有85％的同源性。1996年美国Entremed公司采用酵母作为表达体系生产了重组人血管内皮抑制素。Folkman报道采用连续皮下给药方式能够使rhEndostatin对小鼠Lewis肺癌的抑制率达到99％。Entremed公司于1998年10月进行了I期临床试验，研究表明，即使剂量高达600mg/m2也未发现剂量限制毒性。

以重组DNA技术生产，以大肠杆菌为表达系统，表达出的重组人血管内皮抑制素与先前的Endostatin相比较，表达水平更高，疗效更强，并且没有因为附加N端序列而导致体内免疫原性。它通过阻断肿瘤新生血管生成，从而阻断肿瘤的营养供给，逐步减小肿瘤体积，达到抗肿瘤作用。目前已经获得国家药品食品监督管理局的批准，进行市场销售。

利用传统的大肠杆菌表达方法得到的重组人血管内皮抑制素难以复性并且易于形成沉淀，而用巴斯德毕赤酵母表达系统所耗费的生产成本巨大，两种方法均未能解决将重组人血管内皮抑制素进行工业生产的问题。为此相关研发人员通过修饰人血管内皮抑制素的核苷酸编码序列，生产出N末端带有附加氨基酸序列的重组人血管内皮抑制素(rhEndostatin，商品名中文商品名：恩度)，大大简化了纯化步骤，提高了产物的纯度(ZL00107569.1)。所生产的重组人血管内皮抑制素由192个氨基酸构成，其氨基酸序列为：MGGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK。

作为一种蛋白质药物，恩度不可避免地具有一般蛋白类药物的缺陷，比如易被蛋白酶降解、体内半衰期短、用药次数较为频繁等。为了克服蛋白质药物的上述缺陷，蛋白质的化学修饰研究逐渐成为热点，聚乙二醇[poly(ethylene glyco1),PEG]是其中应用最为成功的可溶性聚合物。常用的聚乙二醇修饰剂有单甲氧基聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇丙醛和单甲氧基聚乙二醇丁醛等等。聚乙二醇修饰药物可以有效增加药物溶解性、降低蛋白质的免疫原性，降低肾小球滤过率，延长体内保留时间。聚乙二醇化还能保护蛋白质免受蛋白酶降解从而增强蛋白质的稳定性。聚乙二醇化的重组人血管内皮抑制素在不改变恩度蛋白质结构的前提下，可以提高恩度的体外稳定性并且不影响其体外生物学活性。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是FGF超家族成员，为重要的血管生成因子之一，它可以直接刺激内皮细胞的增生，促进内皮细胞的迁移，从而促进肿瘤血管生成。bFGF的作用机制是通过与靶细胞上的受体结合而发生作用，激活受体从而引起一系列信号传递。诱导Myc和Fos等原癌基因的转录，导致细胞产生多种多样的生物学效应。有研究表明(Renata C.M.Reis.等，Biochemical and Biophysical Research Communications.333:976–983(2005))血管内皮抑制素可以通过与bFGF竞争性地结合到其肝素样受体从而起到抑制血管内皮细胞增殖的作用。本发明进一步研究了聚乙二醇重组人血管内皮抑制素抑制通过与bFGF竞争性抑制血管内皮细胞增殖的作用的相关机制，研究结果显示聚乙二醇重组人血管内皮抑制素可以有效抑制bFGF对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)中ERK的磷酸化(见图2)，而相关文献报道ERK是bFGF促进血管内皮细胞增殖的通路之一(Tanaka K.等，Jpn J CancerRes.90:647-654(1999))。

Cell titer-Glo^TM试剂盒可以定量活细胞中的ATP，确定培养物中活细胞数目。化学发光细胞活性检测是高通量筛选(HTS)、细胞增殖和毒性分析的理想选择。均质分析步骤仅包括直接向培养细胞的血清培养基中加入一种试剂这一个步骤，不需要洗涤细胞、去除培养基或多步吸取步骤。该系统可在加入试剂并混合后10分钟内，检测出384孔板上少至15个细胞/孔的活细胞。均质的“加入-混合-测量”形式使得细胞裂解产生的化学发光信号与存在的ATP量成正比。该方法具有操作简单，反应快速，检测灵敏和信号稳定等优点。

目前通用的重组人血管内皮抑制素测定方法为采用微量酶反应比色法(如，MTT或MTS)测定重组人血管内皮抑制素抑制混合生长因子对HUVEC细胞的增殖作用(专利公开号：CN101256139)。具体的测定方法为：

(1)细胞培养及接种：HUVEC细胞复苏后，用ECM(内皮细胞基础培养基)，按照说明书向ECM培养基中加入FBS(胎牛血清)、ECGS(内皮细胞生长因子)，培养于37℃，5％CO₂的培养箱中，第二天更换培养基；长至对数生长期后用胰酶消化细胞，1200rpm离心5分钟，弃上清，进行接种，余下细胞按照一定比例传代。胰酶消化细胞，调整细胞密度为5000个/ml，96孔板每孔加入160μL细胞悬液。将96孔板放入CO₂培养箱，37℃，5％CO₂条件下饥饿培养过夜。

(2)加药：将重组人血管内皮抑制素标准品加注射水充分溶解，然后用2ml缓冲液预稀释至5mg/ml，将重组人血管内皮抑制素待检样品直接用上述缓冲液预稀释至5mg/ml，按培养孔中重组人血管内皮抑制素终浓度为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.3μg/ml、15.6μg/ml、7.8μg/ml，向每个有细胞悬液的培养孔中加入40μL药物体积，每个药物浓度做2个平行孔，然后在37℃，5％CO₂的培养箱中培养96h。

(3)检测：加入5mg/ml MTT工作液，每孔加入20μL，置37℃5％CO₂培养箱中培养4小时后使用酶标仪490nm波长下测定OD值(630nm波长校正)。

上述方法的缺陷在于：①所采用的ECGS为牛脑垂体提取物，其是一种包含多种促内皮细胞生长因子的混合物，提取纯度低，质量不稳定，进而导致方法存在不稳定性；②该方法针对的是多种促内皮细胞生长的因子，不具有针对性，受到多种非特异作用细胞因子的干扰，导致方法的灵敏度差；③所采用的显色方法为MTT，操作繁琐。

发明人出人意料的发现，通过将生长因子对牛脑垂体中的多种促内皮细胞生长因子进行筛选研究发现，血管内皮抑制素对其中的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor，bFGF)具有很好的抑制活性，且通过酶标仪上用化学发光检测模块测定吸光值发现该方法具有预料不到的效果：①血管内皮抑制素所作用的是单一细胞因子bFGF，而bFGF可以通过重组表达的方式获得，提取纯度更高，质量更稳定，进而方法的稳定性也有了保障；②特异性地针对单一的细胞因子bFGF进行作用，排除了其他细胞因子的干扰，可以有效地提高方法测定灵敏度；③本发明所采用的单一细胞因子bFGF相较于已经报道的ECGS成分单一，可以更好地控制方法重复性；④该方法所用的显色剂受到细胞碎片的干扰更小，而且在显色过程中不需要进行任何洗涤过程，加入检测液后可以在不同的时间检测结果，显色结果稳定，质量更可控；⑤可以定量的测定血管内皮抑制素对bFGF的抑制活性。其中血管内皮抑制素为聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素，优选CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-CH₂-Endostar。该方法测定的生物学活性与临床疗效相关，符合中国食品药品监督管理局(CFDA)相关的技术要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种血管内皮抑制素生物学活性的测定方法。进一步的，本发明的目的在于提供一种血管内皮抑制素抑制bFGF促HUVEC增殖活性检测方法。更进一步的，本发明的目的在于提供一种不同浓度的血管内皮抑制素与特定浓度的bFGF竞争性抑制HUVEC细胞增殖的活性检测方法。

具体的，本发明提供的血管内皮抑制素生物学活性的测定方法，所述方法包括：将倍比稀释后的血管内皮抑制素与bFGF溶液等体积预混后同时与HUVEC细胞孵育，加入细胞计数染色试剂Cell titer-Glo，用酶标读数仪测定化学发光值，试验数据采用计算机程序处理，计算血管内皮抑制素样品的生物学活性。

所述倍比稀释后的血管内皮抑制素为复溶后浓度为15mg/ml，其配制所用稀释液为含0.5％FBS的ECM培养基，血管内皮抑制素起始终浓度为1mg/ml，按照2倍倍比稀释，10个梯度的血管内皮抑制素。

所述的bFGF溶液的浓度范围为0.05-2ng/ml中的任一浓度，优选终浓度为1ng/ml，其配制所用稀释液为含肝素+Zn²⁺+0.5％FBS的ECM培养基，其中肝素浓度为0.5～100μg/ml，优选浓度为2～20μg/ml，Zn²⁺浓度为10～200μM，优选浓度为100μM。

所述的HUVEC细胞孵育条件为ECM培养基含5％FBS、1％ECGS；实验所用HUVEC细胞为传代至第3-5代，处于对数生长期的细胞；制备悬液所用培养基为含1％FBS的ECM饥饿培养基；铺板密度为1000-5000个/孔，优选密度为2000个/孔；使用细胞板为96孔板。

所述的酶标仪为PHERASTAR；试验数据采用四参数回归进行计算机程序处理，计算血管内皮抑制素的IC₅₀。

更具体的，本发明提供的一种血管内皮抑制素生物学活性的测定方法，其特征在于，该方法包含如下步骤：

(1)细胞培养及接种：传代培养至对数生长期的人脐静脉血管内皮细胞HUVEC，胰酶消化后制备HUVEC细胞悬液，按照相同体积相同数量的细胞进行铺板，饥饿过夜；

(2)样品稀释：按照倍比稀释法制备血管内皮抑制素溶液；

(3)bFGF稀释：制备碱性成纤维生长因子bFGF溶液；

(4)加药：将血管内皮抑制素与bFGF溶液加入相应的细胞孔孵育68-72小时；

(5)检测：每孔加入化学发光检测试剂盒(Cell titer-Glo)，一种发光法细胞活力检测试剂盒，震荡混匀5-10min；

(6)结果计算：在酶标仪上通过化学发光检测模块测定吸光值，按照四参数回归法计算血管内皮抑制素抑制bFGF对HUVEC细胞的促增殖作用(IC₅₀)。

所述步骤(1)HUVEC细胞培养条件为ECM培养基含5％FBS、1％ECGS。实验所用HUVEC细胞为传代至第3-5代，处于对数生长期的细胞。制备悬液所用培养基为含1％FBS的ECM饥饿培养基，铺板密度为1000-5000个/孔，优选密度为2000个/孔；使用细胞板为96孔板(Corning，货号3610)。更具体的，步骤(1)细胞培养及接种的条件为：HUVEC细胞(P3代)复苏后，用含5％FBS、1％ECGS的ECM培养基培养于37℃，5％CO₂的培养箱中，第二天更换培养基；长至对数生长期后用胰酶消化细胞，1200rpm离心5分钟，弃上清，进行接种，余下细胞按照一定比例传代；用含1％FBS的ECM饥饿培养基重新混悬，显微镜下用血细胞计数板计数活细胞，调整细胞密度为1000-5000个/孔，优选密度为2000个/孔，96孔板每孔加入100μL细胞悬液，第一行和最后一行加200μL/孔的PBS液；将96孔板放入CO₂培养箱，37℃，5％CO₂条件下饥饿培养过夜。

所述步骤(2)中的血管内皮抑制素复溶后浓度为15mg/ml，所用稀释液为含0.5％FBS的ECM培养基，起始终浓度为1000μg/ml，按照2倍倍比稀释，10个梯度。

所述步骤(3)中bFGF溶液为其浓度范围为0.05-2ng/ml中的任一浓度，优选终浓度为1ng/ml，其配制所用稀释液为含肝素+Zn²⁺+0.5％FBS的ECM培养基，其中肝素浓度为0.5～100μg/ml，优选浓度为2～20μg/mL，Zn²⁺浓度为10～200μM，优选浓度为100μM。

所述步骤(4)中不同浓度的血管内皮抑制素与特定浓度的bFGF预先混合，然后吸掉细胞板孔内培养基，加入血管内皮抑制素与bFGF的混合物与HUVEC细胞进行共孵育。

所述步骤(6)中所用酶标仪为PHERASTAR，使用的是化学发光检测模块。数据处理为利用GraphPad Prism软件的四参数回归进行处理，计算血管内皮抑制素的IC₅₀。四参数方程为Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。

本发明提供了一种血管内皮抑制素生物学活性的检测方法，其特征在于所述生物活性为抑制bFGF促HUVEC细胞增殖活性。

本发明所述的血管内皮抑制素为聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素，优选CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-CH₂-Endostar。

本发明的创新性在于：

本发明的血管内皮抑制素的活性检测方法是将倍比稀释后的血管内皮抑制素与特定浓度的bFGF等体积预混后同时与HUVEC细胞孵育，从而起到与bFGF竞争性抑制HUVEC细胞增殖的效果。

本发明在检测方法上也优于微量酶反应比色法(如，MTT或MTS)，本发明采用的是化学发光法细胞活力检测试剂盒(Cell titer-Glo)，通过对ATP进行定量测定来检测培养物中活细胞数目的一种均质检测方法。均质的"加样-混合-检测"方案极大地简化了操作步骤，而且发光信号稳定，半衰期长，便于实现高通量筛选的需要。并且具有细胞用量少的优势，96孔板最低检测细胞数可少至50个，极大的提高了检测灵敏度。

本发明所用HUVEC细胞为保存在液氮罐的P3代细胞，复苏后长至对数生长期用于检测，P3-P5代的细胞用于实验，细胞状态稳定，检测结果更加稳定可靠。

附图说明

图1为实施例1中聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素样品抑制bFGF促进的HUVEC细胞增殖的抑制型S-形曲线；

图2为实施例2中聚乙二醇重组人血管内皮抑制素抑制bFGF对HUVEC ERK磷酸化作用结果图。

具体实施方式

本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。然而，应当理解，本发明的实施方案不限于这些实施例的特定细节，对于本领域的普通技术人员来说根据直接公开的内容和附属的权利要求是显而易见的。因此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本文引用的参考文献以其全文通过引用并入本文。

实施例1：聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素抑制bFGF促人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖活性检测方法

实验步骤如下：

(1)细胞培养及接种：HUVEC细胞(P3代，购自Sciencell)复苏后，用内皮细胞基础培养基ECM(购自Sciencell)，加5％FBS(购自Sciencell)和1％ECGS(购自Sciencell，一种提取自牛脑垂体的包含多种促内皮细胞生长的因子的混合物)培养于37℃，5％CO₂的培养箱中，第二天更换培养基；长至对数生长期后用胰酶消化细胞，1200rpm离心5分钟，弃上清，进行接种，余下细胞按照一定比例传代。用饥饿培养基(ECM+1％FBS)重新混悬，显微镜下用血细胞计数板计数活细胞。调整细胞密度为20,000个/ml，96孔板(Corning，货号3610)每孔加入100μL细胞悬液，第一行和最后一行加200μL/孔的PBS液，以避免边缘效应。将96孔板放入CO₂培养箱，37℃，5％CO₂条件下饥饿培养过夜。

(2)样品稀释：聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素(H₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-CH₂-Endostar，CN101381413A实施例1制备后处理所得)复溶后的浓度为15mg/ml，用ECM+0.5％FBS培养基按照1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml….(2倍倍比稀释)稀释10个浓度点；

配制ECM+0.5％FBS+2μg/ml肝素+100μM Zn2+培养基；

配制ECM+0.5％FBS+2ng/mlbFGF(购自上海普欣生物技术有限公司)+2μg/ml肝素(购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)+100μM Zn²⁺(ZnCl₂，购自国药集团化学试剂有限公司)。

(3)加药：将上述的不同浓度的聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素与上述配制的bFGF溶液进行预先混合，然后吸掉细胞板孔内培养基，加入聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素与bFGF的混合物与HUVEC细胞进行共孵育。5％CO₂培养箱中湿盒中培养72h。

(4)检测：每孔加入100μl Cell titer-Glo检测试剂(购自Promega)，震荡混匀5-10min，用PHERASTAR检测。

(5)结果计算：实验数据采用GraphPad Prism软件进行四参数回归分析，根据软件拟合出的IC₅₀值计算样品活性。四参数方程为Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。结果可见附图1。

所述步骤1中细胞培养所用培养基为ECM培养基，成分简单，可以实现小体积现用现配，避免了长期放置带来的细胞因子或生长因子不稳定的影响。

所述步骤2中bFGF的浓度经过探索，最佳浓度为1ng/ml，bFGF的储液浓度为100μg/ml，分装10μl/支储存于-80℃冰箱，现用现取，避免了反复冻融带来的实验误差，也更好的增加了实验稳定性。聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素通过与bFGF竞争性结合肝素样受体，从而起到抑制HUVEC增殖的作用。

所述步骤2中肝素和锌离子的加入使聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素产生更好的效价，聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素的IC₅₀从150μg/ml降到约80μg/ml，结果如表1所示，同时二者的加入也大大增加了实验的稳定性。通过肝素和Zn²⁺外加实验及其最佳浓度的探索，我们得出2μg/ml肝素+100μM Zn²⁺可以获得更好的活性(IC₅₀)和窗口(Top/Bottom)，使聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素保持更好的生物学活性。

表1肝素和Zn²⁺对实验的影响

所述步骤3中聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素和bFGF与HUVEC预孵的先后顺序及预孵时间对其IC₅₀基本上没有影响，根据下面表2的结果，三种方法的IC₅₀变异系数(CV)约为9.8％，为了简化操作，本方案采用共孵育的方法。

表2聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素/bFGF与HUVEC细胞预孵时间不同的四参数回归结果

所述步骤4中所用检测试剂为Cell titer-Glo是一种发光法细胞活力检测试剂盒，通过对ATP定量来检测活细胞数目的一种均质检测方法。具有操作步骤简单，发光信号稳定，半衰期长，细胞用量少的优势，极大的提高了检测灵敏性。

本发明中的方法重复性好，经过多天间，多人间，板间，板内不同位置的重复实验，如表3，其变异系数<30％，符合可接受的标准。因此可用作为一种生物学活性检测方法用于样品检测。

表3重复性验证

实施例2：聚乙二醇重组人血管内皮抑制素抑制bFGF对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)ERK磷酸化作用

(1)HUVEC细胞铺板：使用ECM(sciencell)+5％FBS+1％ECGS培养基，按照5×10⁵个/ml密度将HUVEC细胞铺到10cm培养皿(corning)中。

(2)刺激液体配制：按照表4所示配制1ml刺激液，其中bFGF购自上海普欣生物技术有限公司。

表4刺激液配制方案

(3)使用ECM+0.5％FBS培养基饥饿2h后，吸去培养基，并使用平衡至室温的PBS洗2次，然后加入刺激液，于37℃，5％CO₂下刺激8min。刺激结束后，加入5ml冰冷的PBS终止刺激，置于冰上，并用细胞刮刀将细胞收集到15ml离心管中，3,000rmp，4℃离心5min，去上清，将沉淀用残留的液体重悬起来并收集到1.5mlEP管中，5,000rmp，4℃离心5min，去上清。

(4)用150μl加有蛋白酶抑制剂的裂解液(抑制剂为1/100PMSF、1/100cocktail、1/100Sodium orthovanadate)于冰上裂解30min，中间不时振摇；并用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，将所有样品稀释至最低浓度相同的样品。

(5)采用7％SDS-PAGE电泳，并进行western鉴定。

电泳条件：恒压100V 20min，150V 60min；

转膜条件：恒压60V，冰水浴2h；

封闭：1％BSA/PBS 1.5h；

一抗：4抗孵育过夜(Cell signaling technology，1:1,000)；

洗涤：PBS振摇洗涤3次，每次5min；

二抗：室温孵育2h(Cell signaling technology，1:10,000)；

洗涤：PBS振摇洗涤3次，每次5min；

ECL显色。

研究结果显示，聚乙二醇重组人血管内皮抑制素可以有效抑制bFGF对HUVEC细胞中ERK的磷酸化，其结果与本发明公开的一种聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素抑制bFGF促人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖活性检测方法一致。

Claims (11)

1.一种血管内皮抑制素生物学活性的测定方法，所述方法包括：将稀释后的血管内皮抑制素与bFGF溶液预混后同时与HUVEC细胞孵育，加入细胞计数染色试剂Cell titer-Glo，用酶标读数仪测定化学发光值，试验数据采用计算机程序处理，计算血管内皮抑制素样品的生物学活性。

2.根据权利要求1所述的方法，所述稀释的血管内皮抑制素为复溶后浓度为15mg/ml，其配制所用稀释液为含0.5％FBS的ECM培养基，起始终浓度为1000μg/ml，按照2倍倍比稀释，10个梯度稀释的血管内皮抑制素。

3.根据权利要求1所述的方法，所述bFGF溶液的浓度范围为0.05-2ng/ml中的任一浓度，优选终浓度为1ng/ml，其配制所用的稀释液为含肝素+Zn²⁺+0.5％FBS的ECM培养基，其中肝素浓度为0.5～100μg/ml，优选浓度为2～20μg/mL，Zn²⁺浓度为10～200μM，优选浓度为100μM。

4.一种血管内皮抑制素生物学活性的测定方法，其特征在于，该方法包含如下步骤：

(1)细胞培养及接种：传代培养至对数生长期的HUVEC，胰酶消化后制备HUVEC细胞悬液，按照相同体积相同数量的细胞进行铺板，饥饿过夜；

(2)样品稀释：按照倍比稀释法制备血管内皮抑制素溶液；

(3)bFGF稀释：制备bFGF溶液；

(4)加药：将血管内皮抑制素与bFGF溶液加入相应的细胞孔孵育68-76小时；

(5)检测：每孔加入Cell titer-Glo，震荡混匀5-10min；

(6)结果计算：在酶标仪上通过化学发光检测模块测定吸光值，按照四参数回归法计算血管内皮抑制素抑制bFGF促进HUVEC细胞增殖作用的IC₅₀。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)HUVEC细胞培养条件为ECM培养基含5％FBS、1％ECGS；实验所用HUVEC细胞为传代至第3-5代，处于对数生长期的细胞；制备悬液所用培养基为含1％FBS的ECM饥饿培养基；铺板密度为1000-5000个/孔，优选密度为2000个/孔；使用细胞板为96孔板。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的血管内皮抑制素复溶后的浓度为15mg/ml，所用稀释液为含0.5％FBS的ECM培养基，血管内皮抑制素起始终浓度为1mg/ml，按照2倍倍比稀释，10个梯度。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中bFGF溶液的浓度范围为0.05-2ng/ml中的任一浓度，优选终浓度为1ng/ml，其配制所用的稀释液为含肝素+Zn²⁺+0.5％FBS的ECM培养基，其中肝素浓度为0.5～100μg/ml，优选浓度为2～20μg/ml，Zn²⁺浓度为10～200μM，优选浓度为100μM。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中血管内皮抑制素与bFGF溶液预先混合，然后吸掉细胞板孔内培养基，加入血管内皮抑制素与bFGF的混合物与HUVEC细胞进行共孵育。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中所用酶标仪为PHERASTAR，使用的是化学发光检测模块；数据处理为利用四参数回归进行处理，计算血管内皮抑制素的IC₅₀。

10.根据权利要求1、2、4、6、8任一项所述的方法，其中血管内皮抑制素为聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素，优选CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂-CH₂-Endostar。

11.权利要求1-8所述的方法在血管内皮抑制素或聚乙二醇化重组人血管内皮抑制素的质控中的应用。