CN101256139A

CN101256139A - 一种血管内皮抑制素生物活性的检测方法

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Publication number: CN101256139A
Application number: CNA2008100875900A
Authority: CN
Inventors: 王鸿梅; 陈倩洁; 姜静; 刘武
Original assignee: SHANDONG XIANSHENG MAIDEJIN BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANDONG XIANSHENG MAIDEJIN BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2008-04-18
Filing date: 2008-04-18
Publication date: 2008-09-03

Abstract

本发明公开了一种血管内皮抑制素生物活性的检测方法，该方法分别利用相同浓度梯度的倍比稀释后的血管内皮抑制素标准品和样品抑制HUVEC细胞增殖，并采用微量酶反应比色法测定血管内皮抑制素对HUVEC细胞的增殖抑制活性，进而分析血管内皮抑制素对血管生成抑制的生物活性。该方法采用血管内皮抑制素标准品校正不同批次血管内皮抑制素样品的检测误差，使得血管内皮抑制素的细胞增殖抑制活性检测结果具有特异性和重复性，克服了现有血管内皮抑制素活性检测方法的重复性差、方法难统一以及不能满足大规模生产、多批次产品质量控制的缺陷。

Description

一种血管内皮抑制素生物活性的检测方法

技术领域

本发明涉及生物制品活性检测技术领域，具体涉及血管内皮抑制素生物活性的检测方法。

背景技术

血管生成抑制剂种类很多，其中针对血管内皮细胞增殖的血管生成抑制剂是重要的一类，它们以血管抑素(angiostatin)、血管内皮抑制素(endostatin)等为代表。血管内皮抑制素是胶原XVIII羧基端的一段分子量大小为20kDa的酶切产物，具有抑制血管内皮细胞增殖、迁移和体内血管生成的活性，是目前已知最强的内源性血管形成抑制因子。

目前血管内皮抑制素(endostatin)主要是利用DNA重组工程技术制备重组血管内皮抑制素，以原核或真核表达系统，将血管内皮抑制素基因经克隆、表达和纯化得到具有细胞增殖抑制活性形式的重组蛋白质。

现有技术中检测endostatin的细胞增殖抑制活性的方法主要是根据endostatin可能的作用机制，采用endostatin抑制HUVEC、HDVEC、HMEC、ECV304等不同细胞增殖、迁移来检测其细胞增殖抑制活性，但所选择实验材料及检测结果差异非常大，其中很多检测结果重复性差。

另外，从中国生物制品检定所了解到，国内也有厂家采用endostatin抑制小鼠肿瘤生长来评价其生物学活性，但由于小鼠肿瘤大小差异非常大，因此体内测活方法缺少规律性，具有误差大、重复性差且操作难度较大等缺点。

以HMEC细胞迁移抑制法为例，重组人血管内皮抑制素(rhEndostatin)细胞增殖抑制活性检测存在以下缺点：(1)在实验中没有采用活性标准品进行误差的校正，另外实验中影响因素较多，造成实验误差较大，重复性差；(2)由于实验中采用在显微镜下人工计数染色的迁移细胞的方法，所以在选择计数的视野，以及细胞的判定上受人为影响因素较大；(3)实验结果的计算方法存在不科学的地方；(4)在规程附录中提供的方法存在描述不清，并且多处与实际操作不一致的缺点。由于存在上述缺陷，HMEC细胞迁移抑制法在评价endostatin的生物学活性时不够客观，具有误差大和重复性差的缺点。

鉴于上述方法存在上述缺点，endostatin的细胞增殖抑制活性难以被统一地进行客观评价，不能满足生产大规模、多批次产品质量控制的需要，所以客观上需要提供一种具有特异性强和重复性好的血管内皮抑制素活性检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的检测血管内皮抑制素(endostatin)细胞增殖抑制活性的方法，该检测方法特异性强，重复性好，能客观评价血管内皮抑制素的血管生成抑制的生物学活性。

为实现上述发明目的，发明人经过反复大量试验，引进了血管内皮抑制素标准品用以校正不同批次血管内皮抑制素样品的检测误差，利用血管内皮抑制素对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的增殖抑制作用，用微量酶反应比色法反映活细胞数量，客观评价血管内皮抑制素的抑制或杀死HUVEC的效果，得到了一种特异性强、重复性好的检测血管内皮抑制素细胞增殖抑制活性的新方法。

为了实现发明目的，本发明的技术方案如下：

一种血管内皮抑制素生物活性的检测方法，包括如下步骤：

a、人脐静脉血管内皮细胞HUVEC传代培养至对数生长期，胰酶消化后均匀悬浮，向培养孔中接种相同体积的细胞悬液；

b、将血管内皮抑制素标准品和待测样品在步骤a所述的培养孔中分别进行相同浓度梯度的倍比稀释，培养孔中细胞悬液继续细胞培养；

c、微量酶反应比色法测定培养孔中的OD值；

d、将血管内皮抑制素标准品和待测样品的倍比稀释浓度分别与对应的OD值采用四参数origin拟合，分别得到血管内皮抑制素标准品和待测样品抑制型S-形曲线，所述四参数为最大光吸收值、最小光吸收值、半效量浓度和斜率；

e、按下式计算试验结果：

样品生物学活性(U/ml)＝Pr×Ds×Es/(Dr×Er)，其中，Pr为标准品生物学活性；Ds为样品稀释倍数；Dr为标准品稀释倍数；Es为样品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效量的稀释倍数。

其中，所述培养具体为：在37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

其中，步骤a中所述人脐静脉血管内皮细胞HUVEC传代培养至对数生长期，具体为：人脐静脉血管内皮细胞HUVEC传代至第2-6代，并培养至对数生长期。

其中，步骤b中所述培养孔中细胞悬液继续细胞培养，具体为培养孔中细胞悬液继续细胞培养3-5天。

其中，步骤a中所述向培养孔中接种相同体积的细胞悬液，具体为：向培养孔中接种160-180μl细胞密度为750-5000个/ml的细胞悬液。

其中，步骤b中所述相同浓度梯度的倍比稀释，具体为：按终浓度为1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8μg/ml进行稀释。

其中，所述步骤d中所述微量酶反应比色法测定培养孔中的OD值具体为采用MTT法或MTS法测定培养孔中的OD值，可使用酶联免疫检测仪测定培养孔中细胞OD值，检测OD值的波长为490nm或570nm。

其中，所述血管内皮抑制素标准品采用重组人血管内皮抑制素冻干制剂，该冻干制剂为山东先声麦得津生物制药有限公司生产，详见实施例1。

其中，所述血管内皮抑制素生物活性为细胞增殖抑制活性。

本发明的有益效果如下：

本发明的血管内皮抑制素生物活性的检测方法是分别利用相同浓度梯度的倍比稀释后的血管内皮抑制素标准品和样品抑制HUVEC细胞增殖，并采用微量酶反应比色法测定血管内皮抑制素对HUVEC细胞的增殖抑制活性，进而分析血管内皮抑制素对血管生成抑制的生物活性。本方法引进了血管内皮抑制素标准品用以校正不同批次血管内皮抑制素样品的检测误差，使得血管内皮抑制素的细胞增殖抑制活性检测结果具有特异性和重复性，能客观反映并评价血管内皮抑制素的血管生成抑制的生物学活性，克服了现有血管内皮抑制素活性检测方法的重复性差、方法难统一以及不能满足生产大规模、多批次产品质量控制的缺陷。

本方法能够使得不同批次产品，甚至不同来源的血管内皮抑制素都具有生物学活性的可比性，该方法操作简便，可控性好。本方法采用微量酶反应比色法检测光吸收值OD，结果客观，量效关系明显，实验误差可以控制在相对标准差(RSD)在45.0％以内，检测时受人为影响因素很少。

本方法采用山东先声麦得津生物制药有限公司生产的重组人血管内皮抑制素冻干制剂作为标准品，其制剂稳定，生物活性能够长期保持稳定。

本方法采用接种HUVEC第2-6代细胞，细胞稳定，检测结果更加稳定可靠。

附图说明

图1为实施例2中重组人血管内皮抑制素冻干标准品抑制第5代HUVEC生长的抑制型S-形曲线。

图2为实施例2中重组人血管内皮抑制素待检样品抑制第5代HUVEC生长的抑制型S-形曲线。

具体实施方式

下面结合实施例具体说明本发明。如无特殊说明，下文中所涉及的实验用材料均可通过商业途径获得或按照常规方法制备。在下文的实施例中所使用的重组人血管内皮抑制素的氨基酸序列同中国发明专利(专利公开号为CN1324818A)公开的SEQ ID NO：2，其表达与纯化的方法也相同，具体见上述公开文献的制备实施例。

本方法引进了血管内皮抑制素标准品用以校正不同批次血管内皮抑制素样品的检测误差，并采用微量酶反应比色法测定血管内皮抑制素对HUVEC细胞的增殖抑制活性，进而分析血管内皮抑制素对血管生成抑制的生物活性。

其中微量酶反应比色法可以是四甲基偶氮唑盐法(MTT法)或MTS法。MTT法的原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的噻唑兰还原为难溶于水的蓝紫色Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物被二甲基亚砜溶解，用酶联免疫检测仪在490nm(或570nm)处测定光吸收值，可以反映活细胞数量和细胞代谢活性。MTS法与MTT法原理相同。MTS是一种新合成的四唑类化合物，能被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成各自有色的甲瓒结晶。与MTT法比较，MTS比色法产物颜色更深，光吸收值范围更宽，测量值更准确；产物为水溶性，不需要促溶；产物稳定，室温存放18h后光吸收值无明显改变。MTS法更加敏感准确，快速安全。实施例1重组人血管内皮抑制素标准品的制备

使用30mM pH5.5±0.5左右的醋酸-醋酸钠缓冲体系对纯化后的重组人血管内皮抑制素蛋白溶液进行超滤透析，配制成90.9ml浓度为9.9mg/ml的重组人血管内皮抑制素溶液，加入20％甘露醇60ml，补加1.5MpH5.5左右的醋酸-醋酸钠缓冲液4.20ml，加入注射水至300ml。经0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装于西林瓶中，液面高度距离瓶底1-1.5cm高，加丁基胶塞，药液置于冻干箱内，制品温度下降至-40℃，保持3-4小时，抽真空，隔板加热，使制品温度升高至-20℃，保持8小时，继续加热升高温度至25℃，保持6小时，至真空度变化不大时，真空压塞后取出，轧盖。制剂规格：重组人血管内皮抑制素10mg/支。

实施例2样品检测

2.1检测步骤

2.1.1细胞培养：HUVEC细胞购自Sciencell公司，相应培养基也购自该公司。按照说明书向ECM培养基中添加FBS(中文名称胎牛血清)、ECGS(提取自牛脑垂体的包含多种促内皮细胞生长的因子的混合物)、P/OSolution(青霉素和链霉素混合液)，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养HUVEC细胞并传代至第5代，待细胞状态良好并进入对数生长期后准备接种。

2.1.2接种：细胞用0.25％胰酶消化，1000rpm离心5分钟，弃上清，用培养基重新混悬，显微镜下用血细胞计数板计数活细胞。调细胞密度为5000个/ml，每孔加入160μl细胞悬液。

2.1.3加药：将重组人血管内皮抑制素标准品(10mg/支)加注射水充分溶解，然后用2ml缓冲液(30mM NaAc、4％甘露醇)预稀释至5mg/ml，将重组人血管内皮抑制素待检样品直接用上述缓冲液预稀释至5mg/ml，按培养孔中重组人血管内皮抑制素终浓度为1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8μg/ml，向每个有细胞悬液的培养孔中加入40μl药物体积，每个药物浓度做2个平行孔，然后，在37℃5％CO₂培养箱中培养96hr。

2.1.4检测：加入5mg/ml MTT工作液，每孔20μl，置37℃5％CO₂培养箱中培养4hr，用取样器轻轻吸去细胞上清后，每孔加入DMSO 200μl。放置5min，使用酶标仪490nm波长下测定OD值。或者，使用MTS代替MTT进行检测：-20℃保存的MTS在室温下融化，每孔加入20μl MTS，培养4hr，直接检测OD值。

检测结果如下表所示：

表1重组人血管内皮抑制素标准品和待检样品的活性MTT检测结果

表注：

A1：最大光吸收值，A2：最小光吸收值，x₀(或EC₅₀)：半效量浓度，P斜率

2.2结果分析

按照2005年中国药典(第三部)，试验数据采用origin软件四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果：

样品生物学活性(U/ml)＝Pr×Ds×Es/(Dr×Er)

Pr为标准品生物学活性，U/ml；

Ds为样品稀释倍数；

Dr为标准品稀释倍数；

Es为样品相当于标准品半效量的稀释倍数；

Er为标准品半效量的稀释倍数。

比活性＝样品生物学活性/样品浓度

在本实施方案中，标准品标识生物学活性Pr为160000U/10mg/支，加注射水2ml溶解为5mg/ml，即为80000U/ml，按倍比稀释的最高浓度1000ug/ml计Ds为5倍，Dr为5倍，Es为样品的1/x₀，Er为标准品的1/x₀，待测样品浓度为5mg/ml。

因此可进行如下计算：

待测样品生物学活性(U/ml)＝80000×5×(1/90.88)/〔5×(1/101.25)〕＝89128.5U/ml

待测样品比活性＝89128.5/5＝17825.7U/mg

根据表1检测结果，将梯度稀释浓度与对应的OD值采用四参数origin拟合，得到图1和图2所示的重组人血管内皮抑制素标准品和样品的抑制型S-形曲线。所述四参数为最大光吸收值A1、最小光吸收值A2、半效量浓度EC₅₀或X₀和斜率P。图1中用origin拟合四参数的结果为：A1：0.26696、A2：O.09745、X0：101.2527、p：2.25982。图2中用origin拟合四参数的结果为：A1：0.27856、A2：0.06372、X0：90.88479、p：1.39611。根据图1可以看出，重组人血管内皮抑制素标准品抑制HUVEC第5代增殖作用最低有效浓度62.5ug/ml或以上。

本方法可以方便的检测不同批次的重组人血管内皮抑制素的细胞增殖抑制活性，使不同批次甚至不同来源的血管内皮抑制素都具有生物学活性的可比性，能反应出每批生物学活性的高低(如下表2)。采用上述方法检测加热失活处理后的样品，如将样品在沸水进行加热0.5小时，检测不出其生物学活性。

表2不同批次重组人血管内皮抑制素样品检测结果

实施例3检测方法的重复性评价

检测方法的重复性评价采用批内重复性和批间重复性进行评价。批内重复性：是指一个样品在同一天同一块96孔板平行试验5次结果；批间重复性：是指一个样品在不同天试验5次结果。

结果显示，重组人血管内皮抑制素样品半效量浓度(EC₅₀)的批内相对标准差(RSD)为37.8％(见表3)，重组人血管内皮抑制素半效量浓度(EC₅₀)的批间相对标准差(RSD)为45.0％(见表4)。批内和批间重组人血管内皮抑制素样品重复性较好，误差控制在45.0％以下。

表3重组人血管内皮抑制素样品生物活性批内重复性检测

表注：

A1：最大光吸收值，A2：最小光吸收值，EC₅₀(或x₀)：半效量浓度，P斜率。

表4重组人血管内皮抑制素样品生物活性批间重复性检测

表注：

Claims

1、一种血管内皮抑制素生物活性的检测方法，包括如下步骤：

c、微量酶反应比色法测定培养孔中的OD值；

e、按下式计算试验结果：

2、权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述培养具体为：在37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

3、权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤a中所述人脐静脉血管内皮细胞HUVEC传代培养至对数生长期，具体为：人脐静脉血管内皮细胞HUVEC传代至第2-6代，并培养至对数生长期。

4、权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤b中所述培养孔中细胞悬液继续细胞培养，具体为培养孔中细胞悬液继续细胞培养3-5天。

5、权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤a中所述向培养孔中接种相同体积的细胞悬液，具体为：向培养孔中接种160-180μl细胞密度为750-5000个/ml的细胞悬液。

6、权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤b中所述相同浓度梯度的倍比稀释，具体为：按终浓度为1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8μg/ml进行稀释。

7、权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤c中所述微量酶反应比色法测定培养孔中的OD值，具体为：采用MTT法或MTS法测定培养孔中的细胞OD值。

8、权利要求7所述的检测方法，其特征在于所述测定培养孔中的细胞OD值，具体为490nm或570nm波长测定培养孔中的细胞OD值。

9、权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述血管内皮抑制素标准品采用重组人血管内皮抑制素冻干制剂。

10、权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述生物活性为细胞增殖抑制活性。