CN102422157A

CN102422157A - 内皮抑制素作为心力衰竭标记的应用

Info

Publication number: CN102422157A
Application number: CN2010800193358A
Authority: CN
Inventors: U-H·温许斯-特伦; D·布洛克; H·许迪希
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2009-04-27
Filing date: 2010-04-23
Publication date: 2012-04-18
Anticipated expiration: 2030-04-23
Also published as: CA2756120A1; ES2607491T3; EP2425245A1; US20120009610A1; CA2756120C; JP2012524282A; EP2425245B1; WO2010124821A1; CN102422157B; HK1165547A1

Abstract

本发明涉及用于评价个体心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤：a)测定得自所述个体的样品中标记内皮抑制素的浓度，b)任选测定所述样品中心力衰竭的一种或多种其它标记的浓度，并且通过将步骤(a)中所测浓度和任选步骤(b)中所测浓度与对照样品中建立的该标记或这些标记的浓度进行比较，评价心力衰竭。本发明还公开的是内皮抑制素作为标记蛋白在心力衰竭评价中的应用、包含内皮抑制素的标记组合和用于测定内皮抑制素的试剂盒。

Description

内皮抑制素作为心力衰竭标记的应用

发明领域

发明背景

心力衰竭(HF)是一种严重且不断加重的公共健康问题。例如在美国，每年大约500万患者罹患HF并且超过55万患者是经初次诊断患有HF(载于：American Heart Association，Heart Disease and StrokeStatistics：2008年更新，Dallas，Texas，American Heart Association(2008))。类似的美国统计显示HF是每年1200万至1500万人就诊和650万人留医的主要原因。从1990年至1999年，每年以HP为主要诊断的住院人数已从大约81万上升至超过100万，而以HP为主要或次要诊断的住院人数从240万上升至360万。在2001年，接近53000个患者以HF为主要原因而死亡。心力衰竭主要是长者的一种病症，因此公知的“人口老化”也促使HF发病率上升。在65岁以上人群中每千人的HF发病率接近10人。在2005年，仅在美国，总体估计HF的直接和间接费用就约为279亿美元并且每年还要花费大约29亿美元用于HF的药物治疗(参见以上引用的AHA统计)。

心力衰竭

心力衰竭的特征在于心脏泵送身体所需量的血液的能力丧失。衰竭并非意味着心脏已经停止泵送，而是不能正常有效地泵送血液。

NYHA[纽约心脏协会(New York Heart Association)]和ACC/AHA[美国心脏病学协会/美国心脏协会(American Associationof Cardiology/American Heart Association)]已经确定了度量疾病进程的HF功能分类。NYHA分类方案分为4类疾病状态：第1类是在任何活动水平上都无症状。第2类是在加重活动时有症状，第III类和第IV类分别是在轻微活动和不活动时都有症状。

在四期ACC/AHA方案中，A期无症状但处于发展HF的危险之中。B期则有证据显示心功能障碍但无症状。在C期，有证据显示心功能障碍并有症状。在D期，患者具有HF的症状，尽管有最大治疗。

HF的病因学

从医学上说，必须将心力衰竭(HF)作为一种复杂疾病。它可因触发事件例如心肌梗塞(心脏病发作)的发生而导致或者它可继发于其它病因例如高血压、糖尿病或心脏畸形例如瓣膜病。心肌梗塞或HF的其它原因通过例如破坏心肌而导致心脏泵送能力开始下降。这种泵送能力的下降可能并非立即显现出来，因为一种或多种补偿机制被激活。然而，已经发现HF进程独立于患者的血液动力学状态。因此，疾病所致的破坏性变化是存在并发展的，甚至当患者仍无症状时。事实上，在HF早期维持正常心血管功能的补偿机制实际上可能在长时间内促进疾病进程，例如通过对心脏及其维持足够的循环血流水平的能力发挥有害效应。

在HF中发生的一些更重要的病理生理变化是(i)下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活，(ii)系统性内皮功能障碍和(iii)心肌重塑。

(i)专一性针对阻碍下丘脑-垂体-肾上腺轴激活的治疗包括β-肾上腺素能阻滞剂(β-阻滞剂)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、某些钙通道阻滞剂、硝酸酯类和内皮素-1阻滞剂。钙通道阻滞剂和硝酸酯类，在产生临床改善的同时，并未明确显示出能延长生存期，而β-阻滞剂和ACE抑制剂则显示出能显著延长寿命，正如醛甾酮拮抗剂一样。使用内皮素-1阻滞剂的实验研究显示有益效应。

(ii)系统性内皮功能障碍是HF的公认特征并在左心室功能障碍体征出现时清楚地显现出来。内皮功能障碍对于心肌微循环与心肌细胞的密切关系而言是重要的。证据表明微血管功能障碍明显促使肌细胞功能障碍和形态学变化，其导致进行性心肌衰竭。

根据基础病理生理学，证据表明内皮功能障碍可由NO的相对缺失而导致，其可通过NADH-依赖性氧化酶而促使血管O₂-形成增加并随之过量清除NO。增加O₂-产量的潜在贡献因素包括增加交感紧张、去甲肾上腺素、血管紧张素II、内皮素-1和TNF-α。另外，IL-10(一种关键的抗炎细胞因子)的水平相对于TNF-α水平而言不恰当地低。现在据信TNF-α水平的升高，以及相关促炎细胞因子(包括IL-6和可溶性TNF-α受体)水平的升高，通过导致心肌收缩性降低，双室扩张和低血压而在HF发展中起到重要作用并且可能参与内皮激活和功能障碍。也据信TNF-α在严重HF患者中发生的迄今为止无法解释的肌肉消耗中可能起作用。根据生活质量指数测量，在经可溶性TNF-受体治疗的少数患者中进行的初步研究已经显示出在NYHA功能分类上的改善和患者良好状态上的改善。

(iii)心肌重塑是一个复杂过程，伴随着从无症状到有症状的心力衰竭的转换，并且可描述为心肌内的一系列适应性变化，例如心室形状、质量和体积的变化(Piano，M.R.等，J.Cardiovasc.Nurs.14(2000)1-23；Molkentin，J.D.，Ann.Rev.Physiol.63(2001)391-426)。心肌重塑的主要特征是肌细胞生物学的改变，例如肌细胞肥大，肌细胞因坏死或细胞凋亡而损失，胞外基质改变和左心室几何学变化。尚不清楚心肌重塑是否只是在暴露于长期神经激素刺激的毒性效应多年之后发生的末梢器官反应，或者心肌重塑是否独立促进心力衰竭进程。迄今为止的证据表明合适的治疗可延缓或中止心肌重塑进程。

标记和疾病状态

如上所述，肌细胞肥大可能是通向HF的最先步骤之一。肌细胞肥大的特征在于通过增加细胞大小并通过细胞骨架的改变而使编码收缩蛋白(例如p-肌球蛋白重链和肌原蛋白T(TnT))的某些基因表达增加，以及某些非收缩蛋白(例如A型和B型利尿钠肽)的某些基因表达增加(Piano，M.R.等，J.Cardiovasc.Nurs.14(2000)1-23；Molkentin，J.D.，Ann.Rev.Physiol.63(2001)391-426)。

对人和动物的心力衰竭模型的研究表明，在心力衰竭晚期肌细胞功能降低。肌细胞功能障碍的基础机制已经表明涉及钙处理网络、肌丝和细胞骨架的改变(de Tombe，P.P.，Cardiovasc.Res.37(1998)367-380)。例如，在人和动物的心力衰竭模型中，肌质网钙-ATP酶活性降低，而肌膜Na+/Ca2+交换器的mRNA和蛋白质水平却增加。此外，在人和动物的心力衰竭模型中都存在着TnT的同种型转换，肌原蛋白I(TnI)磷酸化的降低，肌原纤维肌动球蛋白ATP酶活性下降和微管形成增多。

最初导致心肌重塑的心脏变化意味着补偿心肌患病部分以便维持机体对氧和营养的需求。然而，心力衰竭的补偿期是有限的，并且最终衰竭的心脏不能维持足以满足机体需求的心输出量。因此，就存在着从补偿期到失补偿期的转换。在失补偿期内，心脏变化级联持续发生，但不再是有益的，使患者的心力衰竭进程达到慢性状态并最终死亡。

根据“ACC/AHA 2005成人慢性心力衰竭的诊断和处置最新指南(ACC/AHA 2005Guideline Updatefor the Diagnosis and Management ofChronic Heart Failure in the Adult)”(S.Hunt等，www.acc.org＝ACC/AHA实施指南)，在心力衰竭领域中疾病连续谱目前可如上所述地分为4期。在A期和B期，个体处于发展心力衰竭的危险之中，而C期和D期则表示患者组表现出心力衰竭体征和症状。以上参考文献给出的A期至D期的不同时期的详细定义都通过引用结合到本文中。

心力衰竭的诊断方法

评价HF患者的最有用的诊断测试就是结合多普勒血流研究的综合2维超声心动图(comprehensive 2-dimensional echocardiogramcoupled with Doppler flow studies)，以判定心肌、心脏瓣膜或心包是否存在异常以及涉及哪些房室。必须搞清3个基本问题：1)是LVEF保留还是降低，2)是LV结构正常还是异常，和3)是有无可解释临床表现的其它结构异常，例如瓣膜、心包或右心室异常？该信息应当量化为EF的数值估计值，心室尺寸和/或体积的度量，壁厚度的度量，以及房室几何学的测量和局部心壁运动。应当测量右心室大小和收缩表现。也应半定量地测定心房大小并测定左心房尺寸和/或体积。

在超声心动术进行之时获取的无创性血液动力学数据对于具有保留或降低EF的患者是重要的额外相关数据。二尖瓣流入模式、肺静脉流入模式和二尖瓣环运动速度的组合量化提供了有关LV充盈和左心房压力特征的数据。三尖瓣回流梯度评价结合下腔静脉尺寸的度量及其在呼吸期间的反应提供了收缩肺动脉压力和中央静脉压力的估计值。

可结合LV流出道的尺寸测量和脉冲多普勒来测量每搏量(strokevolume)。然而，在没有HF时，这些参数中的任一个都可存在异常。这些参数中并无一个是特异性地与HF必然相关的；然而，总体正常充盈模式否定临床HF。

从临床来看，该病在补偿期和失补偿期早期在临床上是无症状的(在A期完全无症状，而在B期具有结构性心脏病但无HF的体征和症状，参见ACC/AHA实施指南)。该病的外在体征(例如呼吸短促)并不出现，直到进入失补偿期(即ACC/AHA指南中的C期和D期)。目前的诊断是根据C期和D期患者的外在症状。

通常，心力衰竭患者接受能影响参与心力衰竭的特定机制的药物的标准治疗。并没有能够可信地反映出这些特定机制并有助于医生为合适患者选择合适药物(例如ACE抑制剂、AT II、β-阻滞剂等)(和剂量)的诊断测试。

用标记对HF患者进行早期评价

因为处于发展心力衰竭危险之中的个体在早期尚无临床HF症状，所以对处于心力衰竭危险之中的患者的早期评价看来仅可通过生化标记。目前并没有已确定的生化标记可用于该病在症状发生之前的可信的评价。当确诊HF之时，该病其实早已在发展之中。

近年来已经证明利尿钠肽家族，尤其是心房钠尿肽家族和脑利尿钠肽家族在评价HF时具有重要价值。

HF的预后和需要

至少部分因为诊断晚，所以50％HF患者在诊断的两年之内死亡。其5年生存率小于30％。迫切需要新的生化标记来辅助对心力衰竭的早期诊断。

证明了对处于心力衰竭危险之中的个体(即在临床上无心力衰竭症状的个体)的早期评价的改善。

近年来已经确定B型利尿钠肽标记是监测HF患者的疾病进程并评价其心血管并发症例如心脏病发作的危险的良好工具。

然而，正如许多其它诊断领域一样，单一标记并不足够。

鉴于低值NT-proBNP对排除HF或LVD而言具有非常高的阴性预测价值，在以上和其它研究(参见Triepels R.H.等，Clin.Chem.49，增刊A(2003)37-38)中已经发现对心力衰竭的阳性预测价值的范围在50-60％。因此，可用于评价处于心力衰竭危险之中的个体的标记在临床/实践上具有高度重要性，所述标记单独使用例如具有高的阳性HF预测价值；或者与NT-proBNP组合具有与单独NT-proBNP相比改善的阳性HF预测价值。

有助于评价心力衰竭患者的标记对在这一临床上非常重要和必要的诊断领域中达到进一步技术进步而言也是非常重要的。

发明概述

现已发现并确定标记内皮抑制素可有助于评价心力衰竭。在一个实施方案中，它可有助于评价个体是否处于发展心力衰竭的危险之中。在另一方面，它可有助于评价疾病进程。在另一实施方案中，它可有助于预测心力衰竭的发作。在另一个实施方案中，它可有助于评价和选择预防和治疗心力衰竭的合适治疗方案。

本文所公开的是用于评价个体心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤：测定得自所述个体的样品中标记内皮抑制素浓度，任选测定所述样品中心力衰竭的一种或多种其它标记的浓度，并且通过将该内皮抑制素浓度和任选一种或多种其它标记的浓度与对照样品中建立的该标记或这些标记的浓度进行比较，评价心力衰竭。

本发明也涉及蛋白内皮抑制素作为标记分子在心力衰竭评价中的应用。

进一步公开的是包含内皮抑制素和心力衰竭的一种或多种其它标记在内的标记组合在心力衰竭评价中的应用。

还提供的是用于在体外评价心力衰竭的方法的试剂盒，所述方法包括以下步骤：测定样品中标记内皮抑制素的浓度，任选测定所述样品中心力衰竭的一种或多种其它标记的浓度，并且通过将内皮抑制素浓度和任选一种或多种其它标记的浓度与参考群体中确定的该标记或这些标记的浓度进行比较，评价心力衰竭；所述试剂盒包含特异性测定内皮抑制素和任选心力衰竭的一种或多种其它标记所需的试剂。

根据以下描述，本发明的额外方面和优势将会是显而易见的。然而，应当理解，仅以说明性方式给出发明详述和具体实施例，同时表明本发明的优选实施方案，因为根据该发明详述，在本发明精神和范围之内的各种变动和修改对本领域技术人员来说将会是显而易见的。

发明详述

在第一实施方案中，本发明涉及用于评价个体心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤：a)测定得自所述个体的样品中标记内皮抑制素浓度，b)任选测定所述样品中心力衰竭的一种或多种其它标记的浓度，和c)通过将步骤(a)中所测浓度和任选步骤(b)中所测浓度与对照样品中建立的该标记或这些标记的浓度进行比较，评价心力衰竭。

如本文所用，以下术语中的每一个都具有本小节相关的含义。

本文所用的术语前未加数词限定时包括该术语的单数形式和复数形式。举例说明，“抗体”是指一种抗体或不止一种抗体。

术语“一个(种)或多个(种)”是指1-50，优选1-20，也优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15。

本文所用的术语“标记”或“生化标记”是指用作分析患者的试验样品的靶标的分子。在一个实施方案中，这类分子靶标的实例是蛋白质或多肽。考虑用作本发明标记的蛋白质或多肽包括所述蛋白质的天然存在片段，尤其是免疫可检测片段。免疫可检测片段优选包括所述标记多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个邻接氨基酸。本领域技术人员将会知道，细胞所释放的或存在于胞外基质中的蛋白质可被破坏，例如在炎症期间，并且可降解或切割成这样的片段。某些标记以无活性形式合成，其随后通过蛋白酶水解而活化。正如技术人员将会理解的那样，蛋白质或其片段也可以复合物的一部分而存在。这样的复合物也可用作本发明意义上的标记。另外，或任选，标记多肽可携带翻译后修饰。翻译后修饰的实例是糖基化、酰基化和/或磷酸化。

术语“评价心力衰竭”用于表示本发明的方法将会有助于例如医生评价个体是否处于发展心力衰竭的危险之中，或者有助于医生在一个或若干诊断HF相关性的其它领域中评价HF患者。评价HF个体的诊断相关性的优选领域是心力衰竭的分期，急性和慢性心力衰竭的鉴别诊断，判断疾病进程的危险，指导选择合适药物，监测对治疗的反应，并进行HF患者的随访。

本发明意义上的“心力衰竭标记”是这样的标记：其如果与标记内皮抑制素联用，则在评价HF中能为所调查的诊断问题增加相关信息。在评价HF时，如果分别在指定特异性时的灵敏度，或者在指定灵敏度时的特异性可通过将所述标记包括到已经包含标记内皮抑制素的标记组合中而得以改善，就认为所述信息是相关的或者是具有额外价值的。优选在灵敏度或特异性上的改善分别具有统计学显著性，显著性水平为p＝0.05、0.02、0.01或更低。优选地，心力衰竭的一种或多种其它标记选自利尿钠肽标记、心肌原蛋白标记和炎症标记。

本文所用的术语“样品”是指为进行体外评价目的而获取的生物样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选可包括任何体液。优选的试验样品包括血、血清、血浆、尿、唾液和滑液。优选的样品是全血、血清、血浆或滑液，其中血浆或血清代表最方便的样品类型。正如技术人员将会理解的那样，任何这样的评价都在体外进行。随后弃去患者样品。患者样品仅用于本发明的体外方法并且患者样品材料不回输到患者体内。通常，样品是液体样品，例如全血、血清或血浆。

术语“将所述浓度与对照样品中建立的浓度进行比较”仅用于进一步说明技术人员而言显而易见的那些。对照样品可以是内部或外部的对照样品。在一个实施方案中，使用内部对照样品，即在试验样品中以及在一种或多种采自同一受试者的其它样品中评价标记水平，以确定所述标记水平是否有任何变化。在另一实施方案中，使用外部对照样品。对于外部对照样品，将来自个体的样品中标记的存在或数量与已知罹患给定病症或已知处于给定病症的危险之中的个体中的其存在或数量进行比较；或者与已知未患给定病症的个体(即“正常个体”)进行比较。例如，可将患者样品中的标记水平与已知和HF的特定疾病进程相关的水平进行比较。通常，样品的标记水平与诊断直接或间接相关并且所述标记水平可用于例如确定个体是否处于HF的危险之中。或者，可将样品的标记水平例如与已知以下相关的标记水平进行比较：在HF患者中对治疗的反应，急性和慢性心力衰竭的鉴别诊断，指导选择治疗HF的合适药物，判断疾病进程的危险或HF患者的随访。根据预期诊断用途，选择合适的对照样品并在其中建立标记的对照或参考值。技术人员将会理解，在一个实施方案中，这样的对照样品得自年龄相当且无相混淆的疾病的参考群体。技术人员也明白，对照样品中建立的绝对标记值将会取决于所用的测定。优选采用来自合适参考群体的100位充分表征的个体的样品来建立对照(参考)值。也优选可选择参考群体，使之包含20、30、50、200、500或1000位个体。健康个体代表优选的参考群体，用于建立对照值。

内皮抑制素

内皮抑制素最初分离自鼠血管内皮瘤，是XVIII型胶原的一种20kDA蛋白水解片段(O′Reilly，M.S.等，Cell 88(1997)277-285)。

胶原代表具有特征性三螺旋构象构成超分子聚集体的胞外基质蛋白家族，其在维持组织结构完整性中起到重要作用。过量的胶原沉积导致纤维化，破坏周围组织的正常功能。

胶原XVIII(COL18A1、FLJ27325、FLJ34914、KNO、KNO1、MGC74745、gxHOMSA10749、胶原XVIII型、α1)是胶原Multiplexin家族的成员，其在中央三螺旋结构域中具有多个中断并且主要在基底膜内的C端具有独特的非三螺旋结构域。胶原XVIII的人型α1-链的短同种型序列(SwissProt：P39060)示于SEQ ID NO：1。

内皮抑制素是通过各种蛋白水解酶的作用而从胶原XVIII的α1链释放出来(详情参见Ortega，N.和Werb，Z.，Journal of Cell Science 115(2002)4201-4214—该论文的全部公开内容都通过引用结合到本文中)。内皮抑制素本质上表示为跨越SEQ ID NO：1的氨基酸位置1337至氨基酸位置1519的胶原XVIII片段。胶原XVIIIα链C端铰链区含有若干蛋白酶敏感位点，已知多种酶，包括嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶和基质金属蛋白酶，可通过裂解该区域的胶原链而产生内皮抑制素。这些蛋白酶并非只释放内皮抑制素，而是也可释放含有内皮抑制素序列的其它大片段。技术人员显而易见的是，这样的大片段也可通过内皮抑制素的免疫测定来检测。

单体内皮抑制素(抗血管生成剂、多功能蛋白MFP)的生理性血清水平在刺激不同细胞类型的迁移、增殖、细胞凋亡或生存中以及在抑制多种形态发生事件(眼的形态发生和血管成熟)中起作用。

内皮抑制素是血管生成和血管生长的强效抑制剂。内皮抑制素与细胞因子网络间的关系尚不确定，但已经知道内皮抑制素能改变宽范围基因的表达(Abdollahi，A.等，Mol.Cell 13(2004)649-663)。

通过VEGF和内皮抑制素的不平衡产生所致的对血管生成的干扰导致血管生成相关疾病(系统性硬化、动脉粥样血栓性血管病(atherothrombotic vascular disease)、先兆子痫)的发病机理。

已知内皮抑制素能抑制内皮增殖并可抑制肿瘤生长。内皮抑制素循环水平升高与许多类型的癌症相关(Dubois，S.等，Cancer 109(2007)814-819)。

另外，在特发性肺纤维化患者肺泡腔中发现内皮抑制素水平升高(Richter，A.G.等，Thorax 64(2009)156-161)。

对于内皮抑制素在心脏病中的病理生理学了解甚少。初步数据报道了在响应心肌局部缺血/再灌注时，内皮抑制素血清水平的变化与VEGF血清水平变化平行(Seko，Y.等，Clinical Science 106(2004)439-442)。EP 1 719 779涉及心肌梗塞之后内皮抑制素的治疗应用。急性左心室心力衰竭被描述为用重组人内皮抑制素治疗癌症患者的心脏副作用(Jing，Q.等，Clin.Oncol.20(2008)268)。

在罹患子宫内膜异位症的患者中测定了胶原XVIII mRNA的差异表达(US 2003/0077589)。

若干专利申请涉及胶原XVIII或内皮抑制素多肽作为多种疾病的诊断试剂、预防药和治疗药的潜在应用。例如EP 1 925 940声称内皮抑制素是预测抗肿瘤治疗成功的若干血清标记之一，而WO1998/056399提出在肝脏纤维化或肝细胞癌相关血清中对胶原XVIII的免疫学检测。

看来，在现有技术中，尚不知道蛋白内皮抑制素在体液中的存在或水平在心力衰竭评价中具有诊断应用，并且也没有任何提示。

本发明的发明人目前已经发现并可确定，根据对来自表现出心力衰竭的个体的体液样品的测定，内皮抑制素的值升高。

在对照组或对照群体中测定的内皮抑制素的值可用于例如确定截止值或参考范围。超出这样的截止值或在参考范围外侧及其更高末端的值就被认为是升高的值。

在一个实施方案中，确定了固定的截止值。选择这样的截止值以匹配目标诊断问题。

在一个实施方案中，在对照组或对照群体中测定的内皮抑制素的值可用于确定参考范围。在一个优选的实施方案中，如果所测内皮抑制素浓度值超出90％的参考值时，就认为该值是升高的。在进一步优选的实施方案中，如果所测内皮抑制素浓度值超出95％、96％、97％或97.5％的参考值时，就认为该值是升高的。

在一个实施方案中，对照样品可以是内部对照样品。在该实施方案中，系列样品得自所研究的个体并比较标记水平。这可用于例如评价治疗功效。

本发明的方法是基于得自个体的液体样品并基于对所述样品中内皮抑制素的测定。本文所用的“个体”是指一个人或一个非人类生物体。因此，本文所述的方法和组合物可同时用于人类疾病和兽医疾病。优选的个体是人类。

优选通过使用特异性结合剂特异性测定来自液体样品的标记内皮抑制素。

特异性结合剂是例如内皮抑制素的受体、与内皮抑制素结合的凝集素或内皮抑制素的抗体。特异性结合剂与其相应靶分子的亲和力至少为10⁷l/mol。优选特异性结合剂与其靶分子的亲和力为10⁸l/mol或甚至更优选为10⁹l/mol。正如技术人员所知，术语特异性用于表示样品中存在的其它生物分子与对内皮抑制素具有特异性的结合剂并不会显著结合。优选地，与并非靶分子的生物分子的结合水平导致结合亲和力仅分别为与靶分子的亲和力的10％以下，更优选仅5％以下。优选的特异性结合剂将满足以上有关亲和力以及特异性的最低标准。

优选特异性结合剂是与内皮抑制素具有反应性的抗体。术语抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体、所述抗体的抗原结合片段、单链抗体以及包含抗体结合结构域的遗传构建体。

可使用保留特异性结合剂的上述标准的任何抗体片段。可通过例如以下文献所述的现有技术方法产生抗体：Tijssen(Tijssen，P.，Practiceand theory of enzyme immunoassays，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam(1990)，全书，尤其是第43-78页)。另外，技术人员非常了解基于免疫吸附的方法，所述方法可用于抗体的特异性分离。通过这些方式，可提高多克隆抗体的品质及其在免疫测定中的表现(Tijssen，P.，出处同上，第108-115页)。

为了达到本发明所公开的成果，可使用山羊产生的多克隆抗体。然而，显然也可使用来自不同物种(例如大鼠、兔或豚鼠)的多克隆抗体，以及单克隆抗体。因为可以任何所需量产生具有稳定特性的单克隆抗体，所以它们成为开发临床常规测定的理想工具。

在本发明的方法中，针对内皮抑制素的单克隆抗体的产生和应用分别代表了再一些优选的实施方案。

从天然来源纯化内皮抑制素并非容易之事。重组产生内皮抑制素是一种选择方法，以获得更高数量的内皮抑制素。在一个优选的实施方案中，使用真核表达系统，通过重组表达而产生内皮抑制素。真核表达系统的实例是杆状病毒表达、在酵母中的表达和在哺乳动物表达系统中表达。在一个优选的实施方案中，内皮抑制素的表达将会在哺乳动物表达系统中进行。哺乳动物表达系统的实例是CHO细胞、HEK细胞、骨髓瘤细胞等。在进一步优选的实施方案中，在针对内皮抑制素的多克隆抗体或单克隆抗体的生产中，重组产生的内皮抑制素用作抗原。也可优选通过免疫吸附到内皮抑制素免疫吸附剂上，使用上文所述的重组产生的内皮抑制素，来纯化多克隆抗体。

正如技术人员目前理解的那样，内皮抑制素已被鉴定为可用于评价HF的标记，可使用替代方式以达到与本发明所获得的成果相当的结果。例如可使用产生抗体的替代策略。这样的策略包括使用具有内皮抑制素临床相关表位的合成肽或重组肽，用于免疫。或者，可使用DNA免疫，也称为DNA接种。

为了进行测定，在适合形成结合剂内皮抑制素复合物的条件下，将得自个体的液体样品与内皮抑制素的特异性结合剂一起孵育。这样的条件无需指定，因为技术人员无需任何创造性努力就能容易地确定这样的合适孵育条件。测定结合剂内皮抑制素复合物的量并用于评价HF。正如技术人员将会理解的那样，有大量方法用于测定特异性结合剂内皮抑制素复合物的量，所述方法详见相关教科书(参见例如TijssenP.，出处同上，或Diamandis，E.P.和Christopoulos，T.K.(编著)，Immunoassay，Academic Press，Boston(1996))。

优选以夹心型测定模式来测定内皮抑制素。在这样的测定中，使用第一特异性结合剂来捕获一侧的内皮抑制素，并且在另一侧使用第二特异性结合剂(其已标记为可直接或间接测定)。优选在定性(内皮抑制素存在或不存在)或定量(测定内皮抑制素的量)免疫测定中使用针对内皮抑制素的抗体。

令人惊喜的是，本发明的发明人能够检测体液样品中的蛋白内皮抑制素。甚至更令人惊喜的是，他们能够证明得自个体的所述液体样品中内皮抑制素的存在与HF相关。使用标记内皮抑制素评价HF不需要组织和活检样品。测定蛋白内皮抑制素的水平被认为在HF领域是非常有利的。

在一个优选的实施方案中，用血清作为液体样品材料来实施本发明方法。在进一步优选的实施方案中，用血浆作为液体样品材料来实施本发明方法。在进一步优选的实施方案中，用全血作为液体样品材料来实施本发明方法。

在一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及内皮抑制素作为标记分子在得自个体的液体样品的心力衰竭评价中的应用。

理想的诊断状况应当是这样的状况：其中由单一事件或过程引起相应疾病，例如在感染性疾病的情况下。在所有其它情况下，正确诊断可是非常困难的，尤其是当疾病的病因学尚未完全清楚时，正如在HF的情况下。正如技术人员将会理解的那样，在HF领域中，对某个诊断问题而言，并没有哪种生化标记在诊断上在具有100％特异性的同时又具有100％灵敏度。倒不如说，生化标记是用于评价潜在诊断问题的某种可能性或预测价值。技术人员非常熟悉常规用于计算相对危险或可能性的数学/统计学方法，用于诊断所评价的问题。在常规临床实践中，医生在诊断、治疗和处置潜在疾病时通常都会同时考虑不同临床症状和生物标记。

优选在本发明的进一步优选实施方案中，通过测定内皮抑制素浓度和一种或多种其它标记的浓度并且通过在HF评价中使用内皮抑制素浓度和一种或多种其它标记的浓度，进行评价HF的方法。

在HF的评价中，标记内皮抑制素将在以下一个或多个方面有助于医生：评价个体罹患心力衰竭的危险或评价患有心力衰竭的患者，例如目的在于鉴定心力衰竭的分期，鉴别急性和慢性心力衰竭，判断疾病进程的危险，为选择合适治疗而提供指导，监测患者对治疗的反应，并监测病程，即在HF患者的随访中。

筛查(评价个体是否处于发展心力衰竭的危险之中)

在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于评价个体是否处于发展心力衰竭的危险之中的体外方法，所述方法包括以下步骤：测定样品中标记内皮抑制素的浓度，任选测定所述样品中心力衰竭的一种或多种其它标记的浓度，并且通过将内皮抑制素浓度和任选一种或多种其它标记的所测浓度与对应于参考值的该标记或这些标记的浓度进行比较，评价所述个体发展心力衰竭的危险。

本发明意义上的筛查涉及无偏倚地评价个体发展心力衰竭的危险。尽管理论上可在任何样品上进行这样的筛查，但在临床实践中，通常将会对在某种程度上处于发展心力衰竭的危险之中的个体选择进行这样的筛查。如上所述，这样的个体可能在临床上无症状，即他们没有HF体征或症状。在一个优选的实施方案种，对处于发展心力衰竭的危险(例如落入ACC/AHA实施指南所定义的A期或B期内)之中的个体将会进行HF的筛查。

如上所述，心力衰竭在发达国家是一种最普遍、耗费金钱和致命的疾病。因为它具有高的普遍性以及长期无症状期，对处于发展HF的危险之中的个体的鉴别就是至关重要的，从而可干预和如可能的话中断疾病病程。在没有很早期的危险评价的情况下，要想阻止疾病从无症状期发展到HF症状期看来是不可能的。

通过技术人员完全知晓和理解的数学/统计学方法评价心力衰竭的危险。优选地，将个体心力衰竭危险用相对项来表示并给出所谓的相对危险性(＝RR)。为了计算这种心力衰竭的RR，将个体的内皮抑制素值与参考群体(优选没有心力衰竭的健康个体)中建立的内皮抑制素值进行比较。还优选这种心力衰竭的RR的评价是基于研究期内(优选在1年内或也优选在2年内)已经发展心力衰竭的个体组，和在同样的研究期内未发展心力衰竭的个体组。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及标记内皮抑制素在筛查心力衰竭中的应用。正如技术人员所知，术语“作为标记的应用”是指通过合适方式定量测定标记分子的浓度，然后将所述标记的所测值用于指示即表明疾病的存在与否或临床病症。定量测定的合适方式例如是特异性结合剂，例如抗体。

优选地，HF的筛查可在怀疑处于心力衰竭的未来危险之中的个体中进行。在此意义上的处于心力衰竭的未来危险之中的患者是经诊断患有高血压、动脉粥样硬化病、糖尿病、肥胖症和代谢综合征的患者。优选地，对患有高血压、动脉粥样硬化疾病、糖尿病和/或代谢综合征的个体进行心力衰竭的未来危险的评价。

还优选的是标记内皮抑制素在评价处于ACC/AHA实施指南中的B期的个体心力衰竭的未来危险中的应用，所述个体就是表现出心脏的结构性改变、但没有心力衰竭症状的个体。

在一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及内皮抑制素作为HF标记组合的标记之一的应用，用于HF筛查目的。

在筛查设定中，内皮抑制素水平升高是个体发展心力衰竭的危险增高的阳性标志。

患者的分期

在一个优选的实施方案中，本发明涉及有助于对心力衰竭患者进行分期的体外方法，所述方法包括以下步骤：a)测定样品中标记内皮抑制素的浓度，b)任选测定所述样品中心力衰竭的一种或多种其它标记的浓度，并且通过将步骤(a)中所测浓度和任选步骤(b)中所测浓度与对应于参考值的该标记或这些标记的浓度进行比较，对心力衰竭进行分期。优选标记内皮抑制素的水平可用于有助于将研究个体分为以下个体组：临床上“正常”的个体(即处于ACA/ACC分类中的A期的个体)、具有结构性心脏病的无症状患者(ACA/ACC分类中的B期)和具有心力衰竭的患者组(即处于ACA/ACC分类中的C期和D期的患者)。

急性心脏事件和慢性心脏病的鉴别

在一个优选的实施方案中，本发明涉及有助于急性心脏事件和慢性心脏病之间的鉴别诊断的体外方法，所述方法包括以下步骤：测定样品中标记内皮抑制素的浓度，任选测定所述样品中心力衰竭的一种或多种其它标记的浓度，并且通过将步骤(a)中所测浓度和任选步骤(b)中所测浓度与对应于参考值的该标记或这些标记的浓度进行比较，建立急性心脏事件和慢性心脏病之间的鉴别诊断。

本领域技术人员熟知“急性心脏事件”和“慢性心脏病”的含义。

优选地，“急性心脏事件”是指心脏的急性病症、疾病或功能障碍，尤其是急性心力衰竭，例如心肌梗塞(MI)或心律失常。根据MI的程度不同，随后可继发LVD和CHF。

优选地，“慢性心脏病”是心脏功能弱化，例如因为心脏缺血、冠状动脉病或先前的特别小的心肌梗塞(可能继发进行性LVD)。它也可因以下原因而弱化：炎性疾病、心脏瓣膜缺损(例如二尖瓣缺损)、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、心律缺陷(心律失常)和慢性阻塞性肺病。因此，显然慢性心脏病也可包括已经罹患急性冠状综合征例如MI、但当前并未罹患急性心脏事件的患者。

鉴别急性心脏事件和慢性心脏病是重要的，因为急性心脏事件和慢性心脏病可能需要不同的治疗方案。例如，对于出现急性心肌梗塞的患者而言，再灌注的早期治疗可能是至关重要的。而对慢性心力衰竭患者进行的再灌注治疗，充其量也不过是对该患者无害或仅有很少的伤害。

在本发明的进一步优选实施方案中，标记内皮抑制素用于急性和慢性心力衰竭的鉴别诊断。

评价疾病进程的危险

在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于评价HF患者疾病进程的危险的体外方法，所述方法包括以下步骤：测定样品中标记内皮抑制素的浓度，任选测定所述样品中心力衰竭的一种或多种其它标记的浓度，并且通过将内皮抑制素浓度和任选一种或多种其它标记的所测浓度与对应于参考值的该标记或这些标记的浓度进行比较，确定所述个体疾病进程的危险。

目前，以合理可能性来评价或者甚至预测经诊断患有HF的患者是否具有或多或少的稳定状态或者疾病是否会发展以及患者的最终健康状况是否可能会恶化，是非常困难的。在临床上通常通过评价临床症状或通过使用成像技术(例如超声心动术)鉴别不利变化，来确定心力衰竭的严重程度和发展。在一个实施方案中，通过监测左心室射血分数(LVEF)确定心力衰竭的恶化。LVEF衰退达5％以上就认为疾病在发展。

在一个进一步优选的实施方案中，本发明因此涉及标记内皮抑制素在评价罹患HF的患者的疾病进程的危险中的应用。在HF患者疾病进程的评价中，内皮抑制素水平升高是疾病进程的危险增加的标志。

选择合适HF治疗的指南

在一个优选的实施方案中，本发明涉及有助于选择合适HF治疗的体外方法，所述方法包括以下步骤：测定样品中标记内皮抑制素的浓度，任选测定所述样品中心力衰竭的一种或多种其它标记的浓度，并且通过将内皮抑制素浓度和任选一种或多种其它标记的所测浓度与对应于参考值的该标记或这些标记的浓度进行比较，选择合适的治疗。

预期标记内皮抑制素将会有助于医生在心力衰竭领域从手头上的多种治疗方案中选择最合适的治疗方案。因此，在一个进一步优选的实施方案中，涉及标记内皮抑制素在选择用于罹患HF的患者的治疗方案中的应用。

监测患者对治疗的反应

在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于监测患者对HF治疗的反应的体外方法，所述方法包括以下步骤：a)测定样品中标记内皮抑制素的浓度，b)任选测定所述样品中心力衰竭的一种或多种其它标记的浓度，并且通过将步骤(a)中所测浓度和任选步骤(b)中所测浓度与对应于参考值的该标记或这些标记的浓度进行比较，监测患者对HF-治疗的反应。

或者，可通过建立治疗前后内皮抑制素和任选一种或多种其它标记的标记水平并且通过比较治疗前后的标记水平，实施上述用于监测患者对治疗的反应的方法。

在临床上确立对心力衰竭的诊断。依照本发明，如果患者满足ACC/AHA实施指南所定义的C期或D期的标准，就可在临床上确诊HF。依据这些指南，C期是指患者具有结构性心脏病并且先前或当前具有心力衰竭症状。D期患者是具有难治性心力衰竭并且需要特定干预的患者。

如上进一步所述，NT-proBNP的所测值与心力衰竭的严重程度高度相关。然而，BNP和NT-proBNP看来在监测患者对治疗的反应中都不理想，参见例如Beck-da-Silva，L.等，Congest.Heart Fail.11(2005)248-253，quiz 254-255。

标记内皮抑制素看来对于监测患者对治疗的反应而言是合适的。本发明因此也涉及内皮抑制素在监测患者对治疗的反应中的应用。在该诊断领域中，标记内皮抑制素也可用于确定治疗前的基线并用于在治疗后的一个时间点或若干时间点测定内皮抑制素。在HF患者的随访中，内皮抑制素水平降低是HF治疗有效的阳性标志。

标记组合

可单个测定生化标记，或者，在本发明的一个优选实施方案中，可使用基于芯片或基于珠的阵列技术同时测定它们。然后可使用每种标记的单个截止值来独立解释生物标记的浓度或者将其组合在一起来解释，即它们构成标记组合。

正如技术人员将会理解的那样，可以不同方式进行并完成使标记水平与某种可能性或危险相关联的步骤。优选地，标记内皮抑制素和一种或多种其它标记的所测值经数学组合并使组合值与潜在诊断问题相关联。可通过任何合适的现有技术的数学方法，将标记值与内皮抑制素的测定组合在一起。

优选地，用于标记组合的数学算法是逻辑斯蒂函数。应用所述数学算法或所述逻辑斯蒂函数的结果优选是单一值。根据潜在诊断问题，可以容易地使这样的数值与例如个体心力衰竭的危险或有助于评价HF患者的其它预期诊断应用相关联。在一个优选的方式中，这样的逻辑斯蒂函数是通过以下方法而获得：a)将个体分组，例如分为正常、处于心力衰竭危险之中的个体、患有急性或慢性心力衰竭的患者等，b)通过单变量分析对这些组之间具有显著不同的标记进行鉴定，c)逻辑斯蒂回归分析以评价用于评价这些不同组的标记的独立判别值(independent discriminative value)，和d)构建逻辑斯蒂函数，以组合独立判别值。在这类分析中，标记不再是独立的，而是表现出标记组合。

在一个优选的实施方案中，用于组合内皮抑制素的值和至少一种额外标记的值的逻辑斯蒂函数是通过以下方式而获得：a)分别将个体分为正常组和处于心力衰竭危险之中的个体组，b)测定内皮抑制素的值和至少一种额外标记的值，c)进行逻辑斯蒂回归分析，和d)构建逻辑斯蒂函数，以组合内皮抑制素的标记值和至少一种额外标记的值。

使标记组合与疾病相关联的逻辑斯蒂函数优选使用通过应用统计学方法开发并获得的算法。合适的统计学方法例如为判别分析(DA)(即线性DA、二次DA、正则化DA)、核方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻分类)、PLS(偏最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、Boosting/Bagging方法)、广义线性模型(即逻辑斯蒂回归)、基于主成分的方法(即SIMCA)、广义加法模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。技术人员在选择合适统计学方法以评价本发明标记组合并由此获取合适数学算法中是没有问题的。优选地，用于获得评价心力衰竭所用的数学算法的统计学方法选自DA(即线性判别分析、二次判别分析、正则化判别分析)、核方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻分类)、PLS(偏最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、Boosting方法)或广义线性模型(即逻辑斯蒂回归)。这些统计学方法的有关详情可参见以下参考文献：Ruczinski，I.等，J.of Computational and Graphical Statistics 12(2003)475-511；Friedman，J.H.，J.of the American Statistical Association84(1989)165-175；Hastie，T.等，The Elements of Statistical Learning，Springer Verlag(2001)；Breiman，L.等，Classification and regression trees，Wadsworth International Group，California(1984)；Breiman，L.，MachineLearning 45(2001)5-32；Pepe，M.S.，The Statistical Evaluation ofMedical Tests for Classification and Prediction，Oxford Statistical ScienceSeries，28，Oxford University Press(2003)；和Duda，R.O.等，PatternClassification，John Wiley & Sons，Inc.，第2版(2001)。

本发明的一个优选实施方案使用优化的多变量截止，用于生物标记的基本组合，并分别区分A期与B期(例如正常和处于心力衰竭危险之中的个体)，对治疗有反应的HF患者与治疗失败，急性心力衰竭患者与慢性心力衰竭的HF患者，表现出疾病进程的HF患者与未表现出疾病进程的HF患者。

接受者操作曲线下面积(＝AUC)是诊断过程的表现或准确性的标志。诊断方法的准确性最好用其接受者操作特征(ROC)来描述(尤其参见Zweig，M.H.和Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC曲线是在所观察数据的全范围内不断改变决策阈值(decisionthresh-hold)而得到的所有灵敏度/特异性对的曲线。

实验室试验的临床表现取决于其诊断准确性，或将受试者正确分为临床上相关亚组的能力。诊断准确性衡量的是能正确区分所研究受试者的两类不同情况的试验能力。这样的情况是例如健康与疾病或者疾病发展与疾病无发展。

在各种情况下，ROC曲线通过在决策阈值的全范围内将灵敏度对1-特异性作图，描绘了两个分布之间的重叠。y轴上是灵敏度，或真阳性分数[定义为(真阳性试验结果数)/(真阳性试验结果数+假阴性试验结果数)]。这也被认为是疾病或病症的存在阳性。它仅根据受影响的亚组而计算。在x轴上是假阳性分数，或1-特异性[定义为(假阳性结果数)/(真阴性结果数+假阳性结果数)]。它是特异性指标并可完全根据未受影响的亚组而计算。因为真假阳性分数完全是通过使用来自两个不同亚组的试验结果而分别计算出来的，所以ROC曲线与样品中疾病流行无关。ROC曲线上的各点代表对应于特定决策阈值的灵敏度/1-特异性对。完全区分开的试验(两个结果分布无重叠)具有穿过左上角的ROC曲线，其中真阳性分数是1.0，或100％(最佳灵敏度)，而假阳性分数是0(最佳特异性)。未区分开的试验的理论曲线(两组结果的分布相同)是从左下角到右上角的45°对角线。大部分曲线落入这两个极限之间。(如果ROC曲线完全落入45°对角线之下，则这很容易通过将“阳性”标准从“大于”反转为“小于”就可矫正或者反之亦然)。定性地看，曲线离左上角越近，试验的总准确性就越高。

量化实验室试验的诊断准确性的一个方便目标是用一个数值表示其表现。最常用的总体度量是ROC曲线下面积(AUC)。按照惯例，该面积通常≥0.5(如果不是这样的话，则可反转决策规则，使其变为是这样)。数值范围介于1.0(两组的试验数值完全分开)和0.5(两组的试验数值没有明显分布差异)之间。该面积并非仅取决于曲线的特定部分例如距离对角线最近的点或在90％特异性时的灵敏度，而是取决于整个曲线。这是ROC曲线距离完美曲线(面积＝1.0)有多接近的定量描述的表达。

总体测定灵敏度将取决于实施本文所公开方法所需的特异性。在某些优选的设定中，75％特异性可能就足够并且统计学方法和所得算法可基于该特异性需求。在一个优选的实施方案中，用于评价处于心力衰竭危险之中的个体的方法是基于80％、85％特异性，或者也优选90％或95％特异性。

如上所述，标记内皮抑制素有助于评价个体发展心力衰竭的危险以及有助于进一步体外诊断评价心力衰竭患者。因此一个优选的实施方案是内皮抑制素作为标记分子在心力衰竭评价中的应用。

包含内皮抑制素和HF的一种或多种其它标记在内的标记组合在评价HF患者或评价处于HF危险之中的个体中的应用代表了本发明进一步优选的实施方案。在这样的标记组合中，一种或多种其它标记优选选自利尿钠肽标记、心脏肌原蛋白标记和炎症标记。

可与内皮抑制素测定组合的一种或多种优选的所选其它HF标记优选选自利尿钠肽标记、心脏肌原蛋白标记和炎症标记。优选与内皮抑制素测定组合或者构成包含内皮抑制素在内的HF标记组合的组成部分的这些优选的其它标记，详细讨论如下。

利尿钠肽标记

本发明意义上的利尿钠肽标记是选自心房利尿钠肽(ANP)家族的标记或选自脑利尿钠肽(BNP)家族的标记。

心房利尿钠肽家族或脑利尿钠肽家族中的多肽标记是源自相应的活性激素的前原形式(preproform)。

本发明优选的利尿钠肽标记是NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP及其免疫可检测的生理片段。技术人员容易理解，免疫可检测片段必须包含至少一个表位，允许对所述生理片段进行特异性检测。生理片段是如同天然存在于个体循环系统中的片段。

这两个利尿钠肽家族中的标记代表了分别对应于激素原(即proANP和proBNP)的片段。因为对这两个家族有类似考虑，所以仅详细描述BNP标记家族。BNP家族的激素原，即proBNP由108个氨基酸组成。proBNP被切割为代表生物活性激素BNP的32个C端氨基酸(77-108)和N端氨基酸1-76，称为N端proBNP(或NT-proBNP)。BNP、N端proBNP(1-76)以及进一步分解的产物(Hunt，P.J.等，Biochem.Biophys.Res.Com.214(1995)1175-1183)在血液中循环。完整前体分子(proBNP 1-108)是否也存在于血浆中，尚未完全了解。然而参考文献(Hunt，P.J.等，Peptides 18(1997)1475-1481)描述了proBNP(1-108)在血浆中少量释放是可检测的，但因在N端的非常快速的部分分解，所以某些氨基酸缺失。目前普遍接受的是例如对于NT-proBNP，分子的中央部分，位于氨基酸10到50之间，代表生理上相当稳定的部分。可在体液中可靠地检测包含NT-proBNP的这个中央部分的NT-proBNP分子。有关基于NT-proBNP分子的该中央部分的免疫学检测方法的详细公开内容可参见WO 00/45176，读者可从中了解详情。更有利的是仅测定NT-proBNP某一亚部分(subfraction)，对此已经提出术语天然NT-proBNP。有关NT-proBNP的这个亚部分的详细公开内容可参见WO 2004/099253。技术人员从中将会发现所有必要指导。优选地，根据用Elecsys

NT-proBNP测定法(Roche Diagnostics，Germany)的测定，所测NT-proBNP是或对应于NT-proBNP。

对NT-proBNP的前期分析(Preanalytics)是有效的，允许将样品容易地转移至中心实验室(Mueller，T.等，Clin.Chem.Lab.Med.42(2004)942-944)。可将血液样品在室温贮存几天或者可邮寄或货运，而不会损失回收率。相比之下，BNP在室温或在4°摄氏度贮存48小时则会导致浓度损失至少20％(Mueller，T.等，出处同上；Wu，A.H.等，Clin.Chem.50(2004)867-873)。

在筛查某些HF群体时，已经充分研究了脑衍生的利尿钠肽家族(尤其是BNP和NT-proBNP)。发现这些标记，尤其是NT-proBNP非常鼓舞人心。甚至在无症状“患者”中NT-proBNP值的升高都清楚表明有“心脏问题”(Gremmler，B.等，Exp.Clin.Cardiol.8(2003)91-94)。这些作者证明NT-proBNP升高表示存在“心-肾问题”并且应当迅速安排进一步研究。与若干其它研究组(Gremmler等)一致的是，也发现异常NT-proBNP浓度对于在群体中排除HF和在呼吸困难患者中排除左心室功能障碍(＝LVD)而言都是准确的诊断试验。在排除HF或LVD中的阴性BNP或NT-proBNP值的作用被其它研究组所证实，参见例如McDonagh，T.A.等，Eur.J.Heart Fail.6(2004)269-273；和Gustafsson，F.等，J.Card.Fail.11，增刊5(2005)S15-20。

BNP主要产生(虽然并非是排它的)于心室并在壁张力增加时释放。因此，BNP的释放增加主要反映出心室功能障碍或起源于心房、但影响到心室的功能障碍，例如通过流入减少或血液体积超负荷。与BNP相反，ANP主要从心房产生并释放。因此，ANP水平主要可反映出心房功能。

ANP和BNP都是活性激素并具有比其各自无活性的对应物NT-proANP和NT-proBNP更短的半衰期。BNP在血液中代谢，而NT-proBNP以完整分子形式在血液中循环并通过肾脏原样排出。NT-proBNP的体内半衰期为120分钟，比BNP(半衰期20分钟)更长(Smith，M.W.等，J.Endocrinol.167(2000)239-246)。

因此，根据时间进程或目标性能，无论是测定利尿钠肽的活性形式还是无活性形式都是有利的。

在处于心力衰竭危险之中的个体的评价中，优选将内皮抑制素的所测值与NT-proANP和/或NT-proBNP的值组合起来。优选将NT-proBNP的值与内皮抑制素的值组合起来。类似考虑用于选择合适的治疗，判断疾病进程的危险并监测疾病病程。

在将内皮抑制素用于评价患者对治疗的反应的情况下，其测定优选与ANP或BNP的测定组合。

在将内皮抑制素用于鉴别急性和慢性心力衰竭的情况下，优选的标记组合包括内皮抑制素、ANP或proANP和BNP或proBNP。

心脏肌原蛋白标记

术语心脏肌原蛋白涉及肌原蛋白I和肌原蛋白T的心脏同种型。如上所述，术语标记也涉及标记分子的生理变体，例如生理片段或复合物。对于心脏肌原蛋白标记，它们的生理上存在的复合物已知具有诊断相关性并因此明确地包括在内。

肌原蛋白T的分子量约为37.000Da。在心脏组织中发现的肌原蛋白T同种型(cTnT)与骨骼肌TnT有足够大的差异，允许产生能区分这两种TnT同种型的抗体。认为TnT是急性心肌损害的标记；参见Katus，H.A.等，J.Mol.Cell.Cardiol.21(1989)1349-1353；Hamm，C.W.等，N.Engl.J.Med.327(1992)146-150；Ohman，E.M.等，N.Engl.J.Med.335(1996)1333-1341；Christenson，R.H.等，Clin.Chem.44(1998)494-501；和EP 0 394 819。

肌原蛋白I(TnI)是25kDa的肌原蛋白复合物的抑制性成分，存在于肌肉组织中。在Ca²⁺不存在时，TnI与肌动蛋白结合，抑制肌动球蛋白的ATP酶活性。在心脏组织中发现的TnI同种型(cTnI)与骨骼肌TnI具有40％的差异，允许通过免疫学方法区分这两种同种型。cTnI的正常血浆浓度为＜0.1ng/ml(4pM)。在心脏细胞死亡后cTnI被释放到血流中；因此，急性心肌梗塞患者的血浆cTnI浓度升高(Benamer，H.等，Am.J.Cardiol.82(1998)845-850)。

肌原蛋白I和T的独特心脏同种型允许经免疫学方法将它们与骨骼肌的其它肌原蛋白区分开来。因此，肌原蛋白I和T从受损心肌向血液中释放，与心脏组织的损害明确相关。目前技术人员也理解，可从循环中检测呈游离形式或呈复合物组成部分的形式的心脏肌原蛋白(参见例如US 6,333,397、US 6,376,206和US 6,174,686)。

在处于心力衰竭危险之中的个体的评价中以及在罹患心力衰竭的患者的评价中，将内皮抑制素所测值优选与肌原蛋白T和/或肌原蛋白I的心脏同种型的值组合。优选用于与标记内皮抑制素组合的心脏肌原蛋白是心脏肌原蛋白T。

炎症标记

技术人员熟知术语炎症标记。优选的炎症标记是白介素-6、C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A和S100蛋白。

白介素-6(IL-6)是21kDa分泌蛋白，其具有多种生物活性，可分为参与造血作用和参与先天免疫应答的激活。IL-6是急性期反应物并刺激合成多种蛋白质，包括粘附分子。其主要功能是介导急性期肝脏蛋白的产生，其合成受到细胞因子IL-1和TNF-α的诱导。IL-6通常是由巨噬细胞和T淋巴细胞产生的。IL-6的正常血清浓度为＜5pg/ml。

C反应蛋白(CRP)是具有21kDa亚基的同型五聚体Ca²⁺-结合的急性期蛋白，其参与宿主的防御。CRP合成是由IL-6诱导并间接由IL-1诱导的，因为IL-1可触发肝窦中的肝巨噬细胞合成IL-6。在90％的健康群体中，CRP的正常血浆浓度为＜3μg/ml(30nM)，而在99％的健康个体，其浓度＜10μg/ml(100nM)。血浆CRP浓度可通过例如血清淀粉样蛋白A(＝SAA)来测定，所述蛋白是11.7kDa的低分子量急性期蛋白。它主要是由肝脏在响应IL-1、IL-6或TNF-α刺激时合成的并参与调节T细胞依赖性免疫应答。一旦有急性事件，SAA的浓度增至1000倍，达到每毫升1毫克。它可用于监测例如以下疾病中的炎症：囊性纤维化、肾移植排斥、创伤或感染。在类风湿性关节炎中，在某些情况下，其用于替代CRP，但是，SAA尚未被广泛接受。

S100-蛋白构成持续增加的Ca²⁺结合蛋白家族，其目前包括超过20个成员。S100-蛋白的生理相关结构是同型二聚体，但某些也可构成彼此异型二聚体，例如S100A8和S100A9。胞内功能范围从调节蛋白质磷酸化、调节酶活性或调节细胞骨架动力学到参与细胞增殖和分化。因为某些S100-蛋白也从细胞中释放出来，所以也已描述了胞外功能，例如神经元生存、星形细胞增殖、细胞凋亡的诱导和炎性过程的调节。已经在炎症中发现S100A8、S100A9、异型二聚体S100A8/A9和S100A12，其中S100A8响应慢性炎症，而S100A9、S100A8/A9和S100A12则在急性炎症中增加。S100A8、S100A9、S100A8/A9和S100A12与具有炎性特征的不同疾病有关，包括某些癌症、肾同种移植排斥、结肠炎和最主要的是与RA有关(Burmeister，G.和Gallacchi，G.，Inflammopharmacology 3(1995)221-230；Foell，D.等，Rheumathology42(2003)1383-1389)。例如用于本发明标记组合的用于评价处于HF危险之中的个体或患有HF的患者的最优选的S100标记是S100A8、S100A9、S100A8/A9异型二聚体和S100A12。

sE-选择蛋白(可溶性内皮白细胞粘附分子-1、ELAM-1)是115kDa的I型跨膜蛋白糖蛋白，其仅在内皮细胞上表达并且仅在受到炎性细胞因子(IL-1β、TNF-α)或内毒素激活之后才表达。细胞表面E-选择蛋白是白细胞向内皮滚动附着(rolling attachment)的介导物，所述滚动附着是白细胞进入(extravasion)炎症部位的必要步骤，因此在局部炎症反应中起到重要作用。可溶性E-选择蛋白在健康个体的血液中存在，可能产生自表面表达的分子的蛋白水解切割。已在各种病理性条件中报道了血清sE-选择蛋白水平升高(Gearing，A.J.和Hemingway，I.，Ann.N.Y.Acad.Sci.667(1992)324-331)。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及内皮抑制素作为HF的标记分子与HF的一种或多种标记分子组合在得自个体的液体样品的HF评价中的应用。

如上所示，在本发明的一个优选方法中，至少将内皮抑制素的所测值与选自利尿钠肽标记、心脏肌原蛋白标记和炎症标记的至少一种额外标记的值组合。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及标记组合内皮抑制素和NT-proBNP在心力衰竭评价中的应用。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及标记组合内皮抑制素和肌原蛋白T在心力衰竭评价中的应用。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及标记组合内皮抑制素和CRP在心力衰竭评价中的应用。

在一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及包含标记内皮抑制素、肌原蛋白T、NT-proBNP和CRP在内的标记组合。

在再一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及用于通过生化标记评价HF的方法的标记组，所述方法包括测定样品中内皮抑制素浓度和HF的一种或多种其它标记浓度并使用所测浓度用于HF的评价。

本发明的标记组优选使用蛋白质阵列技术来测定。阵列是可寻址的单个标记的集合。这样的标记可在空间上寻址，例如在微量滴定板内含有阵列或将其印刷在平板表面上，其中各标记在不同的X和Y坐标上存在。或者，标记可根据标签、珠、纳米粒或物理性能来寻址。可按照普通技术人员已知方法制备微阵列(参见例如US 5,807,522；Robinson，W.H.等，Nat.Med.8(2002)295-301；Robinson，W.H.等，Arthritis Rheum.46(2002)885-893)。本文所用的阵列是指具有多个可寻址标记的任何免疫学测定。在一个实施方案中，可寻址标记是抗原。在另一个实施方案中，可寻址元件是自身抗体。微阵列是阵列的小型化形式。本文所用的抗原是指可与抗体特异性结合的任何分子。术语自身抗体在本领域中定义明确。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及包含标记内皮抑制素和任选HF的一种或多种其它标记的蛋白质阵列。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及包含标记内皮抑制素和NT-proBNP的蛋白质阵列。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及包含标记内皮抑制素和肌原蛋白T的蛋白质阵列。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及包含标记内皮抑制素和CRP的蛋白质阵列。

在一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及包含标记内皮抑制素、肌原蛋白T、NT-proBNP和CRP的蛋白质阵列。

在再一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及包含特异性测定内皮抑制素所需试剂的试剂盒。还优选的是包含特异性测定内皮抑制素所需试剂和测定心力衰竭的一种或多种其它标记所需的试剂的试剂盒，所述一种或多种其它标记一起用于HF标记组合。

提供以下实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求书中提出。可以理解，只要不偏离本发明的精神，可以在所给出的方法中进行修改。

序列表描述

SEQ ID NO：1人胶原XVIII型α1链短同种型的氨基酸序列。

附图描述

图1分别在来自37个HF患者的样品和38个对照样品中测定内皮抑制素。浓度(ng/ml)在y轴上给出。分别将来自心力衰竭患者的样品记为HF(HF＝方形)，而健康对照(正常人血清＝NHS＝菱形)记为NHS。

图2分别在来自37个HF患者的样品和38个对照样品中测定内皮抑制素。分别根据来源于心力衰竭患者的样品(记为HF(HF＝方形))和来自健康对照样品(正常人血清＝NHS＝菱形)的浓度(ng/ml)计算四分位数(quartile)。框-线图(box-and-whisker-blot)显示低位四分位数和高位四分位数(框)以及最高值和最低值(线)。

实施例1

1.1用于测定人血清和血浆样品中内皮抑制素的ELISA

为了测定人血清或血浆中的内皮抑制素，使用市售夹心ELISA(Quantikine人内皮抑制素免疫测定，目录号DNST0，R&D Systems)。根据制造商提供的使用说明进行测定。

1.2分别用临床常规获取的HF患者血清和表观健康供体的血清进行内皮抑制素ELISA

在常规临床条件下，为了进一步评价内皮抑制素测定的效用，研究了一组来自HF患者的血清(n＝37-参见表1)和38份来自表观健康对照患者的血清(参见表2)。

表1显示心力衰竭患者的结果.

表1：

内皮抑制素ELISA结果(一组来自临床常规的HF样品)

心力衰竭样品

心力衰竭样品

表2显示健康志愿者的内皮抑制素结果。

表2：

内皮抑制素ELISA结果(来自健康对照的样品)

NHS(健康对照)

NHS(健康对照)

NHS(健康对照)

分别概括于表1和表2的数据也在图1中用图表形式显示。这些表格的数据也已用于计算图2所示的框图。图1和图2证明当将心力衰竭患者的血清所测平均内皮抑制素值与表观健康对照个体的血清所测内皮抑制素值进行比较时，平均内皮抑制素值具有相当大的差异。

实施例2

在心力衰竭的评价中包含标记内皮抑制素的标记组合

实施例2.1

标记组合NT-proBNP和内皮抑制素

评价标记组合NT-proBNP和内皮抑制素关于鉴别分别处于B期和C期加上D期的患者。通过分析得自充分表征的个体组(即依据ACA/ACC HF分类标准处于B期的50位个体以及罹患HF并依据ACA/ACC HF分类标准处于C期的50位患者)的单个液体样品，评价诊断准确性。在得自这些个体的每一位的血清样品中，定量测定经市售测定法(Roche Diagnostics，NT-proBNP-测定(目录号03 121 640 160，用于Elecsys

系统免疫测定分析仪)测定的NT-proBNP和如上所述测定的内皮抑制素。按照以下参考文献进行ROC-分析：Zweig，M.H.和Campbell，G.，出处同上。内皮抑制素通过正则化判别分析，计算内皮抑制素与已建立的标记NT-proBNP的组合对判别C期患者与B期个体的判别力(Discriminatory power)(Friedman，J.H.，RegularizedDiscriminant Analysis，Journal of the American Statistical Association 84(1989)165-175)。

实施例2.2

标记组合肌原蛋白T和内皮抑制素

评价标记组合肌原蛋白T和内皮抑制素关于鉴别分别罹患急性心脏事件的患者与罹患慢性心脏病的患者。通过分析得自充分表征的个体组别(即诊断为患有急性心脏事件的50位个体和诊断为患有慢性心脏病的50位个体)的单个液体样品，评价诊断准确性。在得自这些个体的每一位的血清样品中，定量测定经市售测定法(RocheDiagnostics，肌原蛋白T-测定(目录号201 76 44，用于Elecsys系统免疫测定分析仪)测定的肌原蛋白T和如上所述测定的内皮抑制素。按照以下参考文献进行ROC-分析：Zweig，M.H.和Campbell，G.，出处同上。内皮抑制素通过正则化判别分析，计算内皮抑制素与已建立的标记肌原蛋白T的组合对判别C期患者与B期个体的判别力(Friedman，J.H.，J.of the American Statistical Association 84(1989)165-175)。

实施例2.3

标记组合内皮抑制素和CRP

评价标记组合C反应蛋白和内皮抑制素关于鉴别分别诊断为患有心肌病的患者和未罹患任何相混淆的心脏病的对照。通过分析得自充分表征组(即50位患有心肌病的个体和50位健康对照个体)的单个液体样品，评价诊断准确性。在得自这些个体的每一位的血清样品中，定量测定经市售测定法(Roche Diagnostics，CRP-测定(Tina-quant C反应蛋白(乳胶)高灵敏测定-Roche目录号11972855 216)测定的CRP和如上所述测定的内皮抑制素。按照以下参考文献进行ROC-分析：Zweig，M.H.和Campbell，G.，出处同上。内皮抑制素通过正则化判别分析，计算内皮抑制素与已建立的标记CRP的组合对判别C期患者与B期个体的判别力(Friedman，J.H.，J.of the American StatisticalAssociation 84(1989)165-175)。

尽管为了清楚和便于理解的目的略微详细地描述了以上发明，但是本领域技术人员将会理解，根据说明书的内容，在不偏离所附权利要求书中的本发明真正范围的前提下，可以在形式和细节上作出各种改动。

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