JP5592487B2 - 心不全の評価におけるミメカンの使用 - Google Patents
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Description
心不全は、体が必要とするのと同量の血液をポンピングするための心臓の能力が減少することによって特徴付けられる。不全は、心臓がポンピングを停止するだけでなく、それがすべき効率で血液をポンピングするように機能しなくなることを意味する。NYHA[ニューヨーク心臓協会]及びACC/AHA[米国心臓病協会(American Association of Cardiology)/米国心臓協会]は、双方とも、疾患の進行を評価するために、HFの機能的クラスを確立している。NYHAの分類スキームには、4つのクラスの疾患状態があり:クラス1は任意レベルの労作で無症候性である。クラス2は重度の労作で症候性であり、クラスIII及びクラスIVは、それぞれ軽度及び無労作で症候性である。
医学的に、心不全(HF)は、複雑な病気であると理解されなくてはならない。心不全は、心筋梗塞(心臓発作)等の引き金となる事象の発生により引き起こされるか、又は他の原因、例えば高血圧、糖尿病、又は心奇形、例えば弁膜症に対する二次性のものである可能性がある。心筋梗塞又はHFの他の原因により、例えば心筋がダメージを受けることによる、心臓のポンピング能力の最初の低減に帰する。ポンピング能力におけるこの低減は、一又は複数の代償機構の活性化のため、直ちに顕著になることはない。しかしながら、HFの進行は、患者の血液動態の状態と無関係であることが見出されている。よって、疾患に起因するダメージの変化は存在し、進行しているが、患者は無症候性のままである。事実、HFの初期段階中、正常な心血管系機能を維持する代償機構は、実際のところ、心臓、及び循環において十分なレベルの血量を維持するためのその能力に悪影響を及ぼすことにより、長期にわたる疾患の進行の一因となっている可能性がある。
上述したように、筋肥大はHFに至る最初の工程の一つを表すと思われる。筋肥大は、p-ミオシン重鎖及びトロポニンT(TnT)等の収縮タンパク質をコードするいくつかの遺伝子、及びA-型及びB-型ナトリウム利尿ペプチド等のいくつかの非収縮タンパク質の発現増加により、さらに細胞骨格変化により特徴付けられる(Piano, M.Rら, J. Cardiovasc. Nurs. 14 (2000) 1-23; Molkentin, J.D., Ann. Rev. Physiol. 63 (2001) 391-426)。
HFを患っている患者の評価において、単一の最も有用な診断検査は、心筋、心臓弁、又は心膜の以上が存在するかどうか、チャンバーは含まれることを測定するために、ドップラー血流検査と合わせた、包括的2次元心エコー図である。取り組まなければならない3つの根本的問題は:1)LVEFの保存又は低減、2)LVの構造の正常性又は異常性、及び3)臨床所見の原因となり得る、他の構造体の異常性、弁、心膜、又は右心室の異常性の存在である。この情報は、EFの数値予測、心室の寸法及び/又は容量の測定、壁厚の測定、チャンバーの形状及び局部的壁運動の評価を用いて定量化されるべきである。右心室のサイズ及び収縮期機能は評価すべきである。また心房のサイズも半定量的に測定されるべきであり、左心房の大きさ及び/又は容量も測定されるべきである。
その段階で心不全を発症する危険性のある患者が、臨床的なHFの症状がまだない場合、心不全の危険性がある患者の事前評価は、生化学的マーカーによってのみ可能であると思われる。現在、疾患の確実なプレ-症候性評価に有効な生化学的マーカーは確立されていない。今日では、HFであることが証明される診断時までに、疾患は既にかなり進行している。
後期診断のため、少なくとも部分的に、HFを患っている患者の50%が、診断の2年以内に死亡している。5年生存率は30%未満である。心不全の早期診断を補助する新規の生化学的マーカーについて、かなりの必要性がある。
しかしながら、多くの他の診断領域にとって、単一マーカーは十分なものではない。
ミメカンは、ロイシンリッチ反復を有する小プロテオグリカンであり、298のアミノ酸(参照:配列番号:1)からなる前駆体である。ミメカンの他の名称はOGN、オステオグリシン、DKFZp586P2421、OG、OIF、SLRR3Aである。
好ましい実施態様において、本発明は、試料における、マーカーであるミメカンの濃度を測定し、場合によっては、試料における、心不全の一又は複数の他のマーカー(類)の濃度を測定し、このマーカー又はこれらのマーカーの濃度、それ又はそれらの参照値に対して、ミメカンの濃度、及び場合によっては一又は複数の他のマーカー(類)で測定された濃度を比較することにより、心不全を発症する個体の危険性を評価する工程を含む、個体が心不全を発症する危険性にあるかどうかを評価するインビトロ法に関する。
好ましい実施態様において、本発明は、a)試料における、マーカーであるミメカンの濃度を測定し、b)場合によっては、試料における心不全の一又は複数の他のマーカー(類)の濃度を測定し、このマーカー又はこれらのマーカーの濃度、それ又はそれらの参照値に対して、工程(a)で測定された濃度、及び場合によっては工程(b)で測定された濃度を比較する工程を含む、心不全の患者のステージ分類において補助となるインビトロ法に関する。好ましくは、マーカーであるミメカンのレベルは、臨床的に「正常」な個体の群(すなわち、ACA/ACC分類に従いステージAの個体)、構造的心疾患を有する無症候性の患者(ACA/ACC分類に従いステージB)、及び心不全を患っている患者(すなわち、ACA/ACC分類に従いステージC又はステージDの患者)の群への、研究した個体の分類の補助に使用される。
好ましい実施態様において、本発明は、試料における、マーカーであるミメカンの濃度を測定し、場合によっては、試料における心不全の一又は複数の他のマーカー(類)の濃度を測定し、このマーカー又はこれらのマーカーの濃度、それ又はそれらの参照値に対して、工程(a)で測定された濃度、及び場合によっては工程(b)で測定された濃度を比較することにより、急性心臓事象と慢性心臓病との間の識別診断において補助となるインビトロ法に関する。
好ましい実施態様において、本発明は、試料における、マーカーであるミメカンの濃度を測定し、場合によっては、試料における心不全の一又は複数の他のマーカー(類)の濃度を測定し、このマーカー又はこれらのマーカーの濃度、それ又はそれらの参照値に対して、ミメカンの濃度、及び場合によっては一又は複数の他のマーカー(類)で測定された濃度を比較することにより、疾患進行に対する個体の危険性を確立する工程を含む、疾患進行に対するHF患者の危険性の評価のためのインビトロ法に関する。
好ましい実施態様において、本発明は、試料における、マーカーであるミメカンの濃度を測定し、場合によっては、試料における心不全の一又は複数の他のマーカー(類)の濃度を測定し、このマーカー又はこれらのマーカーの濃度、それ又はそれらの参照値に対して、ミメカンの濃度、及び場合によっては一又は複数の他のマーカー(類)で測定された濃度を比較することにより、適切な治療を選択する工程を含む、適切なHF-治療の選択において補助となるインビトロ法に関する。
好ましい実施態様において、本発明は、a)試料における、マーカーであるミメカンの濃度を測定し、b)場合によっては、試料における心不全の一又は複数の他のマーカー(類)の濃度を測定し、このマーカー又はこれらのマーカーの濃度、それ又はそれらの参照値に対して、工程(a)で測定された濃度、及び場合によっては工程(b)で測定された濃度を比較することにより、HF-治療に対する患者の反応をモニタリングする工程を含む、HF-治療に対する患者の反応をモニタリングするインビトロ法に関する。
生化学マーカーは、個体的又は本発明の好ましい実施態様で測定することができ、それらは、チップ又はビーズべースアレイ技術を使用し、同時に測定することができる。ついで、バイオマーカーの濃度は、例えば各マーカーに対する個別カットオフを使用して、独立して解釈されるか、又は解釈のために組合せられる、すなわち、それらはマーカー組合せを形成する。
本発明の趣意において、ナトリウム利尿ペプチドマーカーは、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)ファミリーから選択されるマーカー、又は脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)ファミリーから選択されるマーカーである。
心臓トロポニンなる用語は、心臓トロポニンI及びトロポニンTのアイソフォームに関する。既に上述しているように、マーカーなる用語は、マーカー分子の生理学的変異体、例えば生理学的フラクション又は複合体に関する。心臓トロポニンマーカーについて、それらの生理学的に生じる複合体は、診断関連であり、このようにして明確に含まれることが知られている。
当業者は、炎症マーカーなる用語に精通している。好ましい炎症マーカーは、インターロイキン-6、C-反応性タンパク質、血清アミロイドA、及びS100タンパク質である。
心不全のマウスモデル
1.1 R9Cマウスモデル
遺伝性ヒト拡張型心筋症は、ヒトホスホランバン(PNL)遺伝子(PLN-R9C)におPける、Arg9からCysへの転換に起因することが報告されている(Schmitt, J.Pら, Science 299 (2003) 1410-1413)。典型的には、罹患した患者における拡張型心筋症の発症は青年期に発症し、急性発症及び死亡率に至る、心機能における進行性の悪化が続く。この変異のトランスジェニックマウスモデルには、罹患した患者と同様の心臓表現型を示し、拡張型心筋症、心収縮力の低減、及び時期尚早の死となることが示された(上掲のSchmittら, 2003)。
このマウスモデルにおいて、大動脈結紮(AB)により引き起こされる圧負荷により、心肥大及び心不全が誘発される。
肥大反応を検査するために、結紮された動物及び偽手術コントロール体を、治療介入の1、2、4、及び8週間後に屠殺する。心機能及び肥大の発症は心エコー分析により評価され、組織診断を検査することにより、死後に確認される。表2には、心エコー検査による、種々の時点で評価された、心機能上の要約を示す。表2に付与された心エコーパラメーターにおける詳細は当業者には公知であり、例えばAsahi, Mら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 9199-9204, 及びOudit, G.Yら, Nat. Med. 9 (2003) 1187-1194に見出すことができる。
マイクロアレイ分析
粗組織調製物を、細胞小器官をさらに単離することなく、マイクロアレイ分析に使用する。マイクロアレイデータ分析法は文献に記載されている(例えば、US 5,807,522; Robinson, W.Hら, Nat. Med. 8 (2002) 295-301; Robinson, W.Hら, Arthritis Rheum. 46 (2002) 885-893)。
心臓を単離し、心房を取り除き、心室を注意深くカミソリで掘り、氷冷されたPBS(リン酸緩衝食塩水)で広範囲にすすぎ、過度の血液を除去する。10mlの溶解バッファー(250mMのスクロース、50mMのTris-HCl、pH7.6、1mMのMgCl2、1mMのDDT(ジチオスレイトール)、及び1mMのPMSF(フッ化フェニルメチルスルホニル)において、ルースフィッティングハンドヘルドガラスホモジナイザーを使用し、組織を30秒ホモジナイズする。全ての後続の工程を4℃で実施する。可溶化液を、800xgで15分、ベンチトップ型遠心分離器において、遠心分離にかける;サイトゾル、ミトコンドリア、及びミクロソームフラクションの供給源として、上清を供給する。核を含有するペレットを、8mlの溶解バッファーで希釈し、4mlの0.9Mスクロースバッファー(0.9Mのスクロース、50mMのTris-HCl、pH7.6、1mMのMgCl2、1mMのDDT、及び1mMのPMSF)上に層状にし、1000xgで20分、4℃で遠心分離した。得られたペレットを8mlの2Mスクロースバッファー(2Mのスクロース、50mMのTris-HCl、pH7.4、5mMのMgCl2、1mMのDTT、及び1mMのPMSF)に再懸濁させ、4mlの2Mスクロースバッファー上に層状にし、150000xgで1時間、超遠心分離によりペレット状にした(Beckman SW40.1 rotor)。ペレットとして核を回収する。7500xgで20分、4℃で再遠心分離することにより、上清からミトコンドリアを単離し;得られたペレットを溶解バッファーで2回洗浄する。100000xgで1時間、Beckman SW41 rotorで、ポスト-ミトコンドリア細胞質を超遠心分離することにより、ミクロソームをペレット状にする。上清をサイトゾルフラクションとして供給する。
可溶性ミトコンドリアタンパク質を、氷上で30分、低張性溶解バッファー(10mMのHEPES、pH7.9、1mMのDTT、1mMのPMSF)において、ミトコンドリアをインキュベートすることにより抽出する。懸濁液を簡単に超音波処理し、13000xgで30分、遠心分離によりデブリを除去する。上清を「ミト1」フラクションとして供給する。得られた不溶性ペレットを膜洗浄抽出バッファー(20mMのTris-HCl、pH7.8、0.4MのNaCl、15%のグリセロール、1mMのDTT、1mMのPMSF、1.5%のトリトン-X-100)に再懸濁させ、穏やかに30分振揺させ、13000xgで30分、遠心分離をし;上清を「ミト2」フラクションとして供給する。
各フラクションからの100μgの全タンパク質(ブラッドフォードアッセイにより測定した場合)のアリコートを、約20℃で、5容量の氷冷アセトンを用いて、一晩沈殿させ、続いて、13000xgで15分、遠心分離をする。タンパク質ペレットを37℃で1時間、少量の8Mの尿素、50mMのTris-HCl、pH8.5、1mMのDTTに可溶化させ、続いて暗所、37℃で1時間、、5mMのヨードアセタミドを用いてカルボキシアミドメチル化する。ついで、試料を、同量の100mMの重炭酸アンモニウム、pH8.5と、4Mの尿素に希釈し、37℃で一晩、1:150倍の比率のエンドプロテイナーゼLys-C(Roche Diagnostics, Laval, Quebec, Canada)で消化させる。次の日、試料を、同量の50mMの重炭酸アンモニウム、pH8.5と、2Mの尿素に希釈し、最終濃度が1mMになるまでCaCl2を補足し、回転させつつ30℃で、Poroszymeトリプシンビーズ(Applied Biosystems, Streetsville, Ontario, Canada)と共に、一晩インキュベートする。得られたペプチド混合物を、製造者の使用説明書に従い、SPEC-Plus PT C18カートリッジ(Ansys Diagnostics, Lake Forest, CA)固相抽出し、さらに使用するまで−80℃で保管する。全自動の20時間長の12工程マルチサイクルMudPIT手順を記載したようにセットアップする(Kislinger, Tら, Mol. Cell Proteom. 2 (2003) 96-106)。簡単には、HPLC4次ポンプをLCQ DECA XP イオントラップ質量分析計(Thermo Finnigan, San Jose, CA)と接続させる。内径100-μmの石英ガラスキャピラリーマイクロカラム(Polymicro Technologies, Phoenix, AZ)を、P-2000レーザープラー(Sutter Instruments, Novato, CA)を使用し、ファインチップまで引き、5μmのZorbax Eclipse XDB-C18樹脂(Agilent Technologies, Mississauga, Ontario, Canada)、8cm、ついで5μmのPartisphere強カチオン交換樹脂(Whatman, Clifton, NJ)、6cmを包装する。圧力容器を使用し、個々の試料をカラムに別々に手作業で充填する。クロマトグラフィー溶媒条件は、正確に、Kislinger, Tら, Mol. Cell Proteom. 2 (2003) 96-106に記載されたようにする。
SEQUESTデータベース検索アルゴリズムを、Swiss-Prot/TrEMBL及びIPIデータベースから得られた、マウス及びヒトタンパク質配列が追加され、局所的にメンテナンスされた最小冗長FASTAフォーマットデータベースにおけるペプチド配列に対して、ペプチドタンデム質量スペクトルを適合させるために使用する。統計的に評価するために、コントロール体に対する実験的な偽-発見比率(empirical False-Discovery Rate)、ここでは偽陽性同定を最小にするために、全てのスペクトルを、正常(順方向)及び反転(逆方向)アミノ酸方向の双方において、タンパク質配列に対して検索する。(Kislinger, Tら, Mol. Cell Proteom. 2 (2003) 96-106)。ついで、STATQUESTフィルタリングアルゴリズムを、全ての推定検索結果に適用し、各候補同定に対する統計的信頼性(信頼スコア)の測定値を得る(カットオフp-値≦.15、正確な適合の85%以上の尤度に相当)。高信頼適合を、Perl-ベーススクリプトを使用し、組織内SQL-型データベースにおいて解析する。データベースを、試料名、実験数、MudPIT工程、細胞小器官源、アミノ酸配列、分子量、等電点、電荷、及び信頼レベルに関する情報と共に、付与されたタンパク質に対して適合する複数のペプチドについてのデーターベース検索結果及びスペクトル情報(走査ヘッド)に適応するように設計する。95%以上の予測信頼p値を有し、少なくとも2つのスペクトルが集合的に検出されるするそれらのタンパク質のみを、さらなる分析用に保持する。
モデルシステムにおいて得られるデータの統計的評価
3.1 R9Cマウスモデルついての差次的発現のp-値を生じさせるために使用される統計的方法
実施例2に記載の方法を用いて得られた生データは、スペクトル計測がなされた6190のタンパク質からなり、全てのスペクトルの合計はタンパク質に関連しており、それぞれ137の種々の実験を行う。生データ、タンパク質の6190のサブセットを包括的正規化にかけ、ここで、まず、それぞれ実施されたデータを同数のグループに分け、それらのスペクトル計測に基づき、分析用に100をセットする。ついで、LOESS(Cleveland, W.S.及び Devlin, S.J., Journal of the American Statistical Association 83 (1988) 596-610)を、同じスペクトル計測を有する遺伝子セットにわたって、スペクトル計測に対する差異を調整する各グループにおいて実施する。
実施計測=β0+β1時+β2時2+β3位置+β4コントロール体 (1)
を使用して記載する。
実施計測=β0+β1時+β2時2+β3位置 (2)
を使用して記載され、ここでβ0は切片項であり、β1、β2、β3及びβ4は、可変時間、時間の二乗、位置、及びコントロール体/疾患ついての勾配評価である。
大動脈結紮マウスモデルにおいて実施された68の実験から、スペクトル計測を用い、3152のタンパク質を同定する。同様のデータ分析を、R9Cマウスモデルについて上述したように、大動脈結紮マウスモデルについてのデータベースに適用する。
4.1. ヒトの血清及び血漿試料におけるミメカンを測定するためのELISA
ヒトの血清及び血漿においてミメカンを検出するために、サンドイッチELISAが開発されている。抗原の補足及び検出のために、R&D Systemsからの抗-ミメカンポリクローナル抗体のアリコート(カタログ番号:AF 2660)を、それぞれビオチン及びジゴキシゲニンとコンジュゲートさせる。
常套的な臨床状態下におけるミメカンアッセイの有用性をさらに評価するために、HF患者からの血清(n=241)及び健康そうなコントロール患者からの146の血清のパネルを検査する。上述したように、血清を1xPBS+1%のBSAで1:5に希釈する。これらの拡張パネルについての結果を、表3に示す:
心不全の評価におけるマーカーであるミメカンを含有するマーカーの組合せ
実施例5.1.. NT-proBNPとミメカンのマーカーの組合せ
NT-proBNPとミメカンのマーカーの組合せを、それぞれステージB及びステージCとDにおいて、患者の差別化において評価する。診断の正確度を、十分に特徴付けられたグループの個体、すなわちHFの分類についてのACA/ACC基準に従い、ステージBの50人の個体、及びHFの分類についてのACA/ACC基準に従い、HFを患っている及びステージCの50人の個体から得られた液状試料を分析することにより評価する。商業的に入手可能なアッセイにより測定されたNT-proBNP(Roche Diagnostics, NT-proBNP-assay(Elecsys(登録商標) Systems immunoassay analyzer用のカタログ番号. 03 121 640 160)及び上述したように測定されたミメカンを、これらの個体それぞれから得られた血清試料において定量する。Zweig, M.H., 及び Campbell, G., 上掲に従い、ROC-分析を実施する。確立されたマーカーNT-proBNPとミメカンとの組合せについて、ステージBの個体から、ステージCの患者を差別化するための識別力を、正規化された識別分析により算出する(Friedman, J. H., Regularized Discriminant Analysis, Journal of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175)。
トロポニンTとミメカンのマーカーの組合せを、慢性心疾患に罹患している患者から、急性心臓事象に罹患している患者を差別化するために評価する。診断の正確度を、十分に特徴付けられているグループの個体、すなわち、急性心臓事象を患っていると診断された50人の個体、及び慢性心疾患を患っている診断されている50人の個体から得られた液状試料を分析することにより評価する。商業的に入手可能なアッセイにより測定されたトロポニンT(Roche Diagnostics, トロポニンT-assay(Elecsys(登録商標) Systems immunoassay analyzer用のカタログ番号. 201 76 44)、及び上述したように測定されたミメカンを、これらの個体それぞれから得られた血清試料において定量する。Zweig, M.H.,及び Campbell, G., 上掲に従い、ROC-分析を実施する。確立されたマーカートロポニンTとミメカンとの組合せについて、ステージBの個体から、ステージCの患者を差別化するための識別力を、正規化された識別分析により算出する(Friedman, J.H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175)。
C-反応性タンパク質とミメカンのマーカーの組合せを、心筋症を患っていると診断された患者、任意の交絡心疾患に罹患していないコントロール体を差別化するために評価する。診断の正確度を、心筋症を患っている十分に特徴付けられたグループの50人の個体、及び健康なコントロール個体の50人から得られた液状試料を分析することにより評価する。商業的に入手可能なアッセイにより測定されたCRP(Roche Diagnostics, CRP-assay(Tina-quant C-反応性タンパク質(ラテックス)高感度アッセイ- Rocheカタログ番号. 11972855 216)、及び上述したように測定されたミメカンを、これらの個体それぞれから得られた血清試料において定量する。Zweig, M.H.,及び Campbell, G., 上掲に従い、ROC-分析を実施する。確立されたマーカーCRPとミメカンとの組合せについて、ステージBの個体から、ステージCの患者を差別化するための識別力を、正規化された識別分析により算出する(Friedman, J.H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175)。
Claims (10)
- 個体における心不全をインビトロで評価する方法において、
a)個体から得られた試料において、マーカーであるミメカンの濃度を測定する工程、
b)コントロール試料において確立されているこのマーカーの濃度と、工程(a)で測定された濃度を比較することにより、心不全を評価し、ここでミメカン濃度の増加が心不全を示す工程
を含んでなる方法。 - 工程(a)の後に、試料において、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群から選択される心不全の一又は複数の他のマーカーの濃度を測定する追加の工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において、コントロール試料において確立されているこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と、前記追加の工程で測定された一又は複数の他のマーカーの濃度を比較する工程をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記試料が、血清、血漿、及び全血からなる群から選択されることをさらに特徴とする請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記一又は複数の他のマーカーがNT-proBNPであることをさらに特徴とする請求項2又は3に記載の方法。
- 前記一又は複数の他のマーカーがトロポニンTであることをさらに特徴とする請求項2又は3に記載の方法。
- 心不全の評価におけるマーカー分子としてのタンパク質ミメカンの使用であって、該評価がインビトロでなされる使用。
- 心不全の評価における、ミメカンと、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群から選択される心不全の一又は複数の他のマーカーとを含むマーカーの組合せの使用であって、該評価がインビトロでなされる使用。
- 少なくともミメカンとNT-proBNPを含む請求項8に記載のマーカーの組合せの使用。
- マーカーであるミメカンが、心不全の危険性がある個体から得られた試料において測定される請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
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EP09009666 | 2009-07-27 | ||
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