CN1951967A - 抗人骨生成诱导因子单克隆抗体及其制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗人骨生成诱导因子(osteoinductive factor OIF)蛋白的特异性单克隆抗体OIF－KG4。本发明还公开了OIF－KG4免疫球蛋白、其片段和免疫偶联物以及含有上述免疫球蛋白、片段或免疫偶联物的药物组合物。本发明还提供了一种可用于检测肿瘤、肥胖疾病、糖尿病、高血压或高血脂的试剂盒。

Description

抗人骨生成诱导因子单克隆抗体及其制备和用途

技术领域

本发明属于免疫学领域，涉及一种单克隆抗体，更具体的，本发明涉及一种抗人骨生成诱导因子单克隆抗体及其制备方法和药物组合物。

背景技术

骨生成诱导因子(osteoinductive factor OIF)，又称Osteoglycin或Mimecan，是一种分泌蛋白，最早是从牛的骨基质中分离出的一12kDa的蛋白质(Bentz H等，J Biol Chem 1989；264(34)：20805-10)，通过氨基酸测序，获得了其氨基酸序列(Bentz H等，J Biol Chem 1990；265(9)：5024-9)。随后人们从成骨细胞的cDNA文库中克隆到人的OIF基因(Madisen L等，DNA Cell Biol1990；9(5)：303-9)，但未公开发表其cDNA序列。人的OIF基因编码一298个氨基酸的分泌蛋白前肽，与牛的OIF同源性达86％，其第1-19位为信号肽结构，20-193位为前肽，成熟区在194-298位，由105个氨基酸残基组成；在124-260位有6个重复的亮氨酸富集区；在255和280位为二硫键位点，214和258位有两个糖基化位点(Swissport号p20774)。但最近的研究发现，在牛的角膜等结缔组织中，OIF表达较高，其成熟蛋白由羧基端233个氨基酸组成，分子量为25kDa。该成熟蛋白与硫酸角质素结合，是角膜基质的组成成份；而在非结缔组织内该蛋白主要以非糖基化形式存在，以12kDa的成熟蛋白为主。Northern分析发现，OIF在小鼠的肺、骨骼肌、睾丸中表达，而脑、肝、平滑肌、胰腺中不表达(Ujita M等，Gene 1995；158(2)：237-40)。除了翻译后蛋白质有不同的水解和加工过程外，最近人们在牛的组织内发现因不同的剪接或Poly A位点不同形成的多种OIF异形体，但在这些不同长度的OIF基因异形体中，其编码的蛋白质结构却完全相同，而且该基因在不同物种之间，结构也是高度保守的，这提示OIF蛋白在生物体内具有重要的功能。以前的研究发现，将OIF和转化生长因子β1(TGFβ1)或TGFβ2一起注入小鼠的皮下，可在注射部位引起异位骨形成，体外研究发现，OIF可抑制破骨细胞样细胞的形成及破骨细胞的活性。但最近在OIF基因剔除的小鼠模型中发现，剔除后的小鼠能正常发育，不影响小鼠的生育。与野生型小鼠相比，其骨骼发育无明显异常。提示OIF在骨代谢调节中可能不起重要的作用。在OIF基因剔除的小鼠，仅发现角膜和皮肤的胶原纤维的直径增粗，皮肤的抗张力的能力下降。那么，作为重要的分泌蛋白，OIF在人体的生理过程中发挥什么样的作用是值得深入研究的课题。与此同时，国际上一些研究组对OIF基因的转录调控机制进行了深入的研究，2002年Tasheva对OIF基因的转录调控区进行了研究，发现在OIF基因上游296bp，含有3个起始元件，一个E盒(E-box)和Oct-1、NF-nB、金属反应元件(MRE)结合位点，而在该基因的第一个内含子中，含有该基因转录调控的增强子和沉默子序列(Tasheva ES等，Biochim Biophys Acta 2001；1517(3)：333-8)。进一步研究发现，在OIF基因第一个内含子区含有P⁵³基因的结合位点，而且P⁵³可以增强OIF基因的转录活性(Ren-ming Hu等，Proc Natl Acad Sci USA.2000；97：9543-9548)。最近，人们发现OIF启动子区域含有紫外线反应元件，其表达受UV的调控(Tasheva ES等，Molecular Vision 2003；9：1-9)。

本发明人用大规模EST技术对垂体基因表达谱进行研究时，发现了一个与牛OIF基因有高度同源性的克隆，并通过生物信息学手段，结合RACE PCR技术，从垂体中克隆到人OIF的全长cDNA序列，并首次在GenBank中公布(GenBank登录号为AF100758)(Ren-ming Hu，Ze-guang Han，Huai-dong Song等，Proc NatlAcad Sci USA.2000；97：9543-9548)。但是，目前现有技术中还没有人获得抗人OIF的特异性的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种OIF抗原特异性的单克隆抗体。

在本发明的一个方面，提供了一种免疫球蛋白，它特异性地结合于人骨生成诱导因子蛋白。

在本发明的一个优选例中，所述的人骨生成诱导因子蛋白具有GenBank登录号AF100758所示的序列。

在本发明的一个优选例中，所述的OIF抗原特异性的单克隆抗体是单克隆抗体，它由小鼠杂交瘤细胞系OIF-KG4，CCTCC No.C200409所产生。

在本发明的第二方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有特异性地结合于骨生成诱导因子蛋白的免疫球蛋白和选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶。

在本发明的第三方面，提供了一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是小鼠杂交瘤细胞系OIF-KG4，CCTCC No.C200409。

在本发明的第四方面，提供了一种检测肿瘤、肥胖疾病、糖尿病、高血压或高血脂的试剂盒，它含有所述的免疫球蛋白或所述的免疫偶联物。在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤选自：垂体瘤、肺癌、肾上腺肿瘤、皮质或髓质肿瘤。

在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有所述的免疫球蛋白或所述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。

在本发明的第六方面，提供了一种抗人骨生成诱导因子蛋白的单克隆抗体在制备检测肿瘤、肥胖疾病、糖尿病、高血压或高血脂的试剂中的应用。在本发明的优选例中，所述的抗人骨生成诱导因子蛋白的单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系OIF-KG4，CCTCC No.C200409所产生。

附图说明

图1显示了OIF的Northern印迹分析结果，其中，1为肾上腺，2为下丘脑，3为脑，4为肝脏，5为心脏，6为肾脏，7为肺，8为垂体，9为脂肪的Northern印迹。结果显示，在肺、脂肪、肾上腺表达较高，垂体和心脏有表达。

图2通过原位杂交和免疫组化证实OIF在垂体组织的表达情况。其中，A和B表示垂体OIF基因原位杂交结果，A为用地高辛(DIG)标记OIF mRNA反义链，OIF主要表达在垂体前叶(箭头所示的为阳性细胞)；B为用DIG标记OIF基因的正义链，作为阴性对照，在垂体前叶无阳性杂交信号；C为人垂体OIF免疫组化检测结果，箭头所指处为免疫组化阳性细胞；D为相邻切面用HE染色结果。

图3显示了OIF的调控区序列，在其上游有两个垂体特异性转录因子的结合位点，加下划线部位为Pit-1反应元件。

图4通过Gel shift分析显示OIF上两个Pit-1反应元件可与体外翻译的Pit-1转录因子结合。其中，泳道1、2、3和泳道4、5、6分别为OIF启动子区域两个不同的Pit-1反应元件探针，1、4泳道为不加Pit-1体外翻译蛋白，只加标记探针；2、5泳道为即有标记的特异探针，又有体外翻译的Pit-1蛋白，箭头所示为与Pit-1转录因子特异结合的条带；3、6泳道用非标记的特异探针竞争抑制标记探针与Pit-1特异结合后的结果；泳道7是用标记的非Pit-1反应元件探针与Pit-1转录因子体外翻译产物反应，无特异性结合条带。

图5显示了本发明中使用的人mimecan启动子/荧光素酶受体构造的示意图，指示了用于启动子/受体构建的转录因子结合位点和引物的位置。Hm-1350：表示转录起始位点上游1350个碱基，Hm-789：表示转录起始位点上游789个碱基，Hm-468：表示转录起始位点上游468个碱基，Hm1072：表示转录起始位点下游1072个碱基。

图6显示了在SMMC-7721细胞内，垂体特异表达Pit-1转录因子增强OIF报告基因的转录活性。P-1350/1072表示构建从转录起始位点上游1350个碱基到表示转录起始位点下游1072个碱基这段转录调控区，含两个Pit1。P-789/1072表示构建从转录起始位点上游789个碱基到表示转录起始位点下游1072个碱基这段转录调控区，含一个Pit1。P-468/1072表示构建从转录起始位点上游468个碱基到表示转录起始位点下游1072个碱基这段转录调控区，不含Pit1。

图7通过原位杂交证实OIF仅表达在肾上腺髓质，皮质不表达。

图8显示了OIF在组织中表达的电泳图，其中，泳道1、2为正常和应激后的脂肪组织，泳道3、4为正常和应激后的肾上腺组织。烫伤应激后肾上腺OIF表达下降，而脂肪组织OIF表达不变。

图9显示了ACTH和地塞米松对OIF表达的影响。其中，a：静脉注射ACTH后，肾上腺OIF表达明显下降，N为注射生理盐水小鼠的肾上腺组织，A为注射ACTH小鼠的肾上腺组织。b：注射地塞米松对小鼠肾上腺组织OIF表达无影响，N为注射生理盐水小鼠的肾上腺组织，D40、D80、D160非别为注射40mg、80mg和160mg小鼠的肾上腺组织。c图、d图：注射地塞米松和ACTH对小鼠脂肪和肺组织OIF的表达无影响；c图为注射地塞米松和ACTH后对脂肪组织OIF表达影响的结果；d图为注射地塞米松和ACTH后对小鼠肺组织OIF表达影响的结果。

图10显示了用ELSA法检测单抗的特异性。

图11显示了本发明的抗体的亲和纯化。其中，M：蛋白分子量Marker；1：偶联在Chitin beads上的OIF-CBD蛋白；2：OIF单抗腹水；3：洗脱过后Chitinbeads上的OIF-CBD蛋白；4：纯化的OIF单抗(箭头由上至下分别为IgM重链约75kDa，IgM轻链约25kDa)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，从垂体中克隆到了人OIF的全长cDNA序列(已公布于GenBank，GenBank登录号：AF100758)。本发明人的进一步深入研究发现，OIF基因在多种组织器官中有不同的表达，并且在不同的疾病中有也表达各异，可以作为鉴别疾病的良好标志。尤其是OIF在垂体瘤中有特异性表达，因此OIF将可作为垂体瘤的病理分型和临床诊断的新的标记。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人采用Northern印迹研究发现，OIF基因在小鼠肺、脂肪、肾上腺等组织表达较高，垂体中也有表达(图1)。原位杂交和免疫组化均证实其在垂体细胞内有表达(图2)。

本发明人用PCR技术克隆了人OIF的启动子区域3.5kb DNA序列，发现在其第二个转录起始位点上游700-1000bp的范围内有两个Pit-1反应元件，且两个反应元件之间相距仅250bp(图3)。提示OIF基因的表达受垂体特异性转录因子Pit-1的调控。同时，本发明人用Gel-Shift技术在体外证实OIF基因启动子区域的两个Pit-1反应元件能够与Pit-1转录因子特异性结合(表1，图4)；

表1

缓冲液标记的探针1非标记的探针1标记的探针2非标记的探针2Pit-1翻译产物非特异探针

+    +    ++    +    +-    -    --    -    --    -    --    +    +-    -    -

+    +    +-    -    --    -    -+    +    +-    -    +-    +    +-    -    -

+----++

在另一优选例中，本发明人构建了含有一个pit-1、两个pit-1和不含pit-1结合位点的OIF转录调控区域的报告基因载体，将它们分别转染到pit-1稳定表达的SMMC-7721细胞内。本发明中使用的人mimecan启动子/荧光素酶受体构造的示意图见图5，指示了用于启动子/受体构建的转录因子结合位点和引物的位置。结果显示见图6，分别转染了包含两个Pit-1 RE(Response Elements反应元件)、一个Pit-1 RE和有Pit-1 RE的pGL3-mimecan(2.4-kb)、GL3-mimecan(1.8-kb)和GL3-mimecan(1.5-kb)的SMMC-7721细胞，各孔中，300ngpcDNA-Pit-1表达载体用各自的试验质粒共转染。荧光素酶活性以pRL-SV40为内参照，空载体(pGL3-basic)的荧光素酶活性设置为1.0，测各组相关的荧光素酶活性，以观察表达差异。显示的结果是重复进行的四个独立实验的平均，竖线表示标准误差。结果表明，pit-1能增加OIF基因的转录活性。这首次证实OIF在垂体组织内表达，且受垂体特异的转录因子Pit-1的调控。由于发现OIF在垂体组织内表达，且受Pit-1的转录调节，提示OIF为垂体分泌的一种新的受pit-1调控的细胞因子，由垂体特异的细胞分泌；若如此，垂体瘤中将存在新的分泌OIF的肿瘤。

在另一优选例中，本发明人用免疫兔子获得的OIF多抗，对20例不同类型的垂体瘤组织进行免疫组化分析，发现20例垂体瘤组织中12例(60％)患者阳性，与ACTH、PRL、GH、TSH等经典激素的免疫组化结果均不完全相同(表2)。有意义的是，在8例无功能腺瘤的病人瘤组织内，4例OIF阳性，其中1例强阳性。这些初步结果提示在垂体组织内，存在一种新的能够分泌OIF蛋白的细胞类型，在垂体瘤患者中，存在一种新的分泌OIF蛋白的垂体瘤新类型(图2)。这些结果提示OIF将可作为垂体瘤的病理分型和临床诊断的新的标记。

表2.免疫组化分析OIF在20例不同垂体瘤组织内表达

		PRL(11/18)		ACTH(6/19)		GH(6/15)		TSH(4/16)		LH(7/16)		FSH(7/16)
														+	-	+	-	+	-	+	-	+	-	+	-
		OIF(12/20)	+	7	1	4	5	4	3	2	6	5	3													5	3
-	3													5	2	6	2	6	2	6	2	6	2	6

本发明人的Northern分析发现OIF在肺、脂肪和肾上腺组织中表达很高，提示这些组织是OIF的分泌器官，本发明人针对OIF在这些组织中表达分泌的生理功能进行了研究。

肾上腺是重要的内分泌器官，在应激反应中起重要的作用。肾上腺由皮质和髓质组成，皮质分为束状带、球状带和网状带，可分泌合成糖皮质激素、盐皮质激素和性激素；肾上腺髓质主要合成去甲肾上腺素和肾上腺素；人体内只有肾上腺髓质才能合成肾上腺素，这主要是因为从去甲肾上腺素合成肾上腺素过程中的一个甲基转移酶(phenylethanolamine-N methyl transferase(PNMT))，只有在大剂量糖皮质激素的作用下才能具有酶的活性；糖皮质激素在肾上腺皮质合成后进入髓质，发挥旁分泌的作用，使去甲肾上腺素转化为肾上腺素。由于其是通过旁分泌起作用，因此局部糖皮质激素的浓度才足够大，而在能合成儿茶酚胺类激素的交感神经节等部位，糖皮质激素的浓度较低，因而这些部位仅能合成去甲肾上腺素，而不能合成肾上腺素。肾上腺髓质嗜铬细胞按其功能分为两大类，一类是合成去甲肾上腺素的细胞，另一类能够合成肾上腺素的细胞；这两类细胞都有儿茶酚胺合成过程的关键酶如酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺羟化酶(DBH)的表达，但在释放去甲肾上腺素的细胞内，则不表达将去甲肾上腺素转化为肾上腺素的甲基转移酶(PNMT)。虽然用敏感的RT-PCR方法发现肾上腺髓质有一些细胞因子的表达，但表达量很低，一般不能分泌入血，仅在局部发挥旁分泌或邻分泌的作用；1993年日本的一个研究组发现肾上腺髓质分泌一种52个氨基酸组成的小肽，命名为肾上腺髓质素(Adrenomedullin，简称AM)。其主要的生理功能是扩张血管，降低血压。但后来发现，该分泌蛋白在人体内表达广泛，其降血压作用主要是由血管内皮细胞分泌的AM发挥作用。体外研究发现，一些炎症介质如TNFα、IL-1、脂多糖(LPS)，以及糖皮质激素等均能促进血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和成纤维细胞AM的分泌，而在高血压、心功能衰竭、败血症等疾病状态下，血中AM浓度增加；AM对ACTH分泌的作用尚有争议，体外实验发现，AM可抑制垂体细胞分泌ACTH，静脉注射AM后，羊体内ACTH和考的松浓度均明显下降；但脑室注射AM后，血中ACTH和考的松浓度却升高，但有些研究脑室注射AM后，对血中ACTH和考的松无影响。虽然如此，这是人们发现的第一个在肾上腺髓质高表达并能分泌入血的激素。

令人兴奋的是，本发明人的研究发现OIF基因在肾上腺表达较高(图1)，并且仅表达在肾上腺髓质(图7)，更重要的是，在烫伤应激状态下肾上腺髓质OIF表达水平明显下降，但肺和脂肪组织不变(图8)；注射ACTH可使肾上腺OIF表达减少，但地塞米松不影响其表达(图9)。

肺组织是OIF表达的一个重要的器官，本发明人的研究发现，OIF在肺鳞癌和腺癌中表达，而在小细胞肺癌(SCLC)的组织中不表达，提示OIF可以作为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)鉴别诊断的分子标志。同时，测定外周血中OIF的浓度，将有利于小细胞肺癌和非小细胞肺癌的鉴别诊断。有意义的是，OIF在肺鳞癌组织的表达与其肿瘤的分化程度密切相关，鳞癌的分化程度越低，OIF的表达量越少，表明OIF将可以作为肺鳞癌预后的新的指标。

脂肪组织是OIF分泌的另一个重要的器官。近年来，脂肪组织作为一个内分泌器官引起了人们的广泛注意。脂肪组织通过其内分泌功能，参与食欲和能量平衡的调节，同时还与胰岛素抵抗的发生密切相关；在肥胖、高血压、2型糖尿病、高血脂等的发生中起重要的作用。OIF在脂肪组织高表达，这是目前从脂肪组织发现的少数几种激素的一种。本发明人在体外表达OIF蛋白，经初步的动物试验，发现OIF可以使动物的血糖下降30-40％。但不如胰岛素(一种用于治疗糖尿病的激素)强。同时，OIF在3T3-L1细胞的分化过程中有明显的表达水平的变化，表明OIF在胰岛素抵抗和脂肪细胞的分化过程中起重要的作用，提示OIF在肥胖、2型糖尿病、高血脂等的诊断治疗中有潜在的应用价值。

在上述研究基础上，本发明人利用杂交瘤技术制备了抗人OIF的单克隆抗体OIF-KG4。生产抗人OIF的单克隆抗体，以此为基础建立OIF外周血测定方法对这些肿瘤和及某些危重病人、肥胖等疾病的诊断具有重要的意义。OIF单克隆抗体还可以用于肺癌、肾上腺肿瘤(皮质和髓质肿瘤)的病理诊断的分子标志及预后指标。

本发明包括：具有OIF-KG4单抗的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有OIF-KG4单抗可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与OIF-KG4单抗或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与OIF-KG4单抗或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

如本文所用，“免疫毒素”指对靶细胞有特异性亲和力和杀伤力的物质，例如免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子、放射性核素或其他治疗分子与OIF-KG4单抗或其片段结合的而形成的偶联物。具体的例子有例如131I-OIF-KG4，MTX-OIF-KG4偶联物等。

对于本发明OIF-KG4单抗重链和轻链序列，可以用常规方法测定。OIF-KG4单抗V链的超变区或互补决定区(complementarity determining region，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与OIF-KG4单抗CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab′)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的OIF-KG4单抗的抗原的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据OIF的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，按本领域技术人员已知的常规方法制备模板，通过扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以如上用常规技术，利用小鼠杂交瘤细胞系OIF-KG4(CCTCC No.：C200409)获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

此外，本发明还提供了一种检测试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段，所述的检测试剂盒可用于检测肿瘤、肥胖疾病、糖尿病、高血压或高血脂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的OIF-KG4免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

单克隆抗体的制备

在本实施例中，本发明人应用大肠杆菌系统对OIF进行表达和纯化，并进一步制备了OIF特异性的单克隆抗体OIF-KG4，为进一步建立血中OIF的检测方法提供方便，为OIF抗体诊断特殊类型肿瘤提供可能，为进一步深入研究OIF的生理功能奠定了基础。具体过程如下：

1.材料

(1)质粒、菌株及主要制剂

大肠杆菌BL21、Top10购于Amersham biosciences公司。据AF100758设计引物Forward 5′-atc  gga tcc cct gtc aac gca act ctg g-3′(SEQ ID NO：5)，Reverse5′-atg  ctc gag cat tgg ttg agt cct ggg ac-3′(SEQ ID NO：6)，PCR扩增OIF编码序列，用BamH I和Xho I进行酶切，克隆入由原核表达载体pGEX-5X-2(购于PharmaciaBiotech)，构建得pGEX-5X-2-OIF质粒，表达GST-OIF融合蛋白。Taq、Pfu DNA聚合酶购自Sangon公司。限制性内切酶、T4DNA连接酶均为PROMEGA公司产品。QIAquick Gel Extraction Kit、DNA纯化试剂盒为Qiagen公司产品。GST融合蛋白纯化树脂Glutathione Sepharose 4B为Pharmacia公司产品。镍螯和亲和纯化树脂Probond为Invitrogen公司产品。CBD融合蛋白纯化树脂Chitin beads和MBP融合蛋白纯化树脂Amylose Resin为NEB公司产品。完全福氏佐剂、不完全福氏佐剂、PEG、HAT、HT、RPMI-1640培养液、DMEM、胎牛血清均为Gibco BRL公司产品。HRP标记的兔抗鼠Ig二抗购自DAKO公司。

(2)动物与细胞株

动物：8-12周龄雌性Balb/c小鼠10只，有孕产史的Balb/c小鼠10只(购自中科院上海动物实验中心)

细胞株：小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0(上海市免疫研究所提供)，哺乳动物细胞系COS(中科院生化所S212组提供)

2.方法

(1)OIF融合表达质粒的构建

设计特异性引物(下划线部分为限制性内切酶识别位点)，

OIF NdeI/+：5’-CAC CATATGGCAAAATACAACAAAATCAAGAG-3’(SEQ ID NO：1)；

OIF XhoI/-：5’-GTT CTCGAGAAAGTATGACCCTATCGGTAATC-3’(SEQ ID NO：2)；

以pGEX-5X-2-OIF质粒为模板，PCR扩增OIF片段，用Nde I和Xho I进行酶切，接入pTXB1载体(购于New England BioLab)的Nde I和Xho I之间，构建融合表达质粒pTXB1-OIF，表达CBD-OIF融合蛋白。

根据pTXB1质粒中intein编码序列设计反向引物：intein/Hind III：5’-GC AAGCTTTGAGTTCAGACCGGTGAGGC-3’(SEQ ID NO：3)；以T7启动子通用序列5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’(SEQ ID NO：4)为正向引物，以pGEX-5X-2-OIF质粒为模板，扩增OIF-intein编码序列，产物经Xba I和HindIII酶切后与pET28a(+)质粒(购于Pharmacia Biotech)连接，并转化BL 21感受态菌株，构建获得OIF-intein-His融合表达质粒，表达OIF-intein-His融合蛋白。

同样由PCR特异性扩增OIF编码序列并克隆至原核表达载体pMAL-c2x(购于New England BioLab)的BamH I和Pst I位点，构建质粒即pMAL-c2x-OIF，表达MBP-OIF融合蛋白。

(2)OIF融合蛋白的表达与纯化

BL21(DE3)菌株用于MBP-OIF、GST-OIF、OIF-CBD以及OIF-intein-His的表达。表达菌在含100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基(0.5％NaCl，1.6％Tryptone，1％Yeast Extract)中培养，至OD值为0.5-0.8时，加入0.5mMIPTG室温下诱导融合蛋白的表达(4小时)。菌液离心收集沉淀重悬后，超声破碎菌体离心分离表达产物的上清和沉淀。

GST-OIF融合表达产物的上清与Glutathione Sepharose 4B结合1-2小时，用1×PBS洗涤结合有蛋白的树脂3次后，加入洗脱液(50mM Tris-Cl，10mM谷胱甘肽(Glutathione)，PH8.0)洗脱目的蛋白。OIF-intein-His融合表达产物的沉淀用Buffer B(100mM NaH₂PO₄，10mM Tris-Cl，8M尿素(Urea)，PH8.0)重悬后，室温振荡1-2小时至澄清，离心后上清与Probond(已用BufferB平衡)室温结合1-2小时后装入亲和层析柱中，用Buffer C(100 mM NaH2PO4，10mM Tris-Cl，8M尿素(Urea)，PH6.3)洗涤柱子3次后，加入Buffer E(100mM NaH₂PO₄，10mM Tris-Cl，8M Urea，PH4.5)洗脱蛋白3次。

应用Chitin beads和Amylose Resin对OIF-CBD及MBP-OIF蛋白的表达产物分别进行亲和纯化，操作步骤参照NEB公司产品操作手册。各步留样作SDS-PAGE分析，纯化蛋白用Bradford法定量。

OIF-INTEIN-HIS融合蛋白进行变性纯化，GST-OIF、MBP-OIF融合蛋白、单纯GST和MBP蛋白进行非变性纯化，经SDS-PAGE电泳，分子量正确，后利用免疫小鼠血清对OIF融合蛋白进行Western印迹鉴定证实融合蛋白正确。

(3)动物免疫

将纯化的OIF-Intein-His融合蛋白与等体积完全福氏佐剂乳化后，以每只鼠50μg OIH的剂量于足垫、背部多点注射8-12周龄雌性Balb/c小鼠。间隔两周后将OIH与等体积不完全福氏佐剂乳化后，同等剂量同法注射小鼠一次。十天后再同法免疫小鼠。融合前三天腹腔注射50μg OIH加强免疫一次。融合前1天取小鼠尾静脉血行间接ELISA法检测抗体呈阳性后，即处死小鼠取其脾细胞作融合。

(4)细胞融合、筛选及克隆化

将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞悬液以10∶1混合，按《免疫学常用实验方法》(朱立平，人民军医出版社，2000，3)中的过程进行细胞融合。融合后的细胞在HAT培养基中培养7天后换用HT培养，当杂交瘤细胞生长良好，占孔底25-50％左右时，选择纯化的GST-OIF包被酶标板(0.5μg/孔)，采用间接ELISA法筛选阳性克隆。采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化，同法亚克隆3次，阳性细胞株加入冻存液-80℃保存后移入液氮中。

杂交瘤细胞经间接ELISA法检测及亚克隆3次，最后筛选出2株能稳定分泌抗OIF McAb的杂交瘤细胞株，分别为G₄(OIF-KG4)和C₆。检测该2株阳性杂交瘤细胞的培养上清液Ig亚型均为IgMκ。选择纯化的GST-OIF、MBP-OIF、GST、MBP包被酶标板(0.5μg/孔)，采用间接ELISA法检测。KG4腹水与GST-OIF、MBP-OIF反应，效价为10⁵，但不与GST、MBP反应，进一步证实单抗的特异性，结果见图10，其中X轴：从1∶50开始对比稀释的抗OIF单抗腹水，Y轴：495nm处的吸光值。

(5)腹水的制备和鉴定

将杂交瘤细胞(2×10⁶个/只)，腹腔注射经降植烷预先致敏的有孕产史的Balb/c小鼠，10-14天后抽取腹水，离心后上清加入0.02％叠氮钠4℃保存。利用罗氏公司Ig亚类测定试剂盒，检测2株阳性杂交瘤细胞的培养上清液，选择纯化的GST-OIF、MBP-OIF、GST、MBP蛋白包被酶标板(0.5μg/孔)，采用间接ELISA法检测腹水效价。

(6)抗OIF单抗的亲和纯化

应用E.coli表达融合蛋白OIF-CBD对腹水中mAb进行亲和纯化。过量的OIF-CBD表达产物裂解液与几丁质树脂充分偶联，以10倍柱床体积1×PBS洗涤3次。腹水1∶5稀释于1×PBS中，与OIF-CBD蛋白偶联的Chitin beads混匀结合1小时，并以1×PBS洗涤。结合抗体以2倍体积甘氨酸/盐酸缓冲液(0.2M甘氨酸，以盐酸调节pH至2.0)洗脱，迅速以2M Tris碱中和。纯度用SDS-PAGE分析，浓度由Bradford法测定。

应用抗原抗体结合反应的特异性，利用偶联在Chitin beads上但很难洗脱的过量的OIF-CBD蛋白对单抗进行亲和纯化，得到高纯度的OIF单抗，纯化抗体浓度为0.1mg/ml。

上述产生抗OIF单克隆抗体的抗OIF单抗细胞株OIF-KG4于2004年9月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC No.C200409。

实施例2

OIF的检测

用免疫组化方法进行检测。具体的，用GST-OIF蛋白免疫新西兰大白兔，取其血清作为抗OIF的多抗血清，作为一抗。二抗envision试剂购自DAKO公司。用DAB显色(DAKO公司)。

对178例肺癌组织中OIF的表达情况进行检测，结果发现：OIF的表达和分化程度相关：分化高者，表达程度也高。在鳞癌组织中，OIF的表达几乎达100％(表3)，分化程度低的SCLC阳性率最低(表4)。可见OIF作为肺癌的一个肿瘤标记物，能有效的鉴别小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。有助于临床病理分型。

                表3 NSCLC组间OIF表达情况

	阴性	阳性
				鳞癌	2(2.7％)	73(97.3％)	75
非鳞癌	13(27.7％)	34(72.3％)	47
				X2＝16.73	15	107	122

            表4SCL与NSCLC间OIF表达的比较

	阴性	阳性
				SCLC	51(91.1％)	5(8.9％)	56
NSCLC	15(12.3％)	107(87.7％)	122
				X2＝102.09	66	112	178

实施例3

用单克隆抗体OIF-KG4检测OIF的表达

本发明人用制得的单克隆抗体OIF-KG4检测OIF的表达，重复实施例2的方法，不同点在于用单克隆抗体OIF-KG4替换实施例2中的多抗作为一抗。

结果表明，单抗OIF-KG4同样能够有效的鉴别小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。并且，单抗OIF-KG4比实施例2的多抗特异性有大幅度提高，亲和力也显著加强。

实施例4

检测的试剂盒

本发明人制备了一种检测小细胞肺癌和非小细胞肺癌的试剂盒，它含有上述实施例2制备获得的OIF-KG4、实施例2中已经列出的免疫组化检测试剂、以及使用方法说明书。

目前，使用该种试剂盒，已完成临床实验200多例。

菌株保藏

本发明的产生抗OIF单克隆抗体的抗OIF单抗细胞株OIF-KG4于2004年9月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC No.C200409。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海市第二医科大学附属瑞金医院

<120>抗人骨生成诱导因子单克隆抗体及其制备和用途

<130>054238

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>32

<212>DNA

<213>引物

<400>1

caccatatgg caaaatacaa caaaatcaag ag    32

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>引物

<400>2

gttctcgaga aagtatgacc ctatcggtaa tc    32

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>3

gcaagctttg agttcagacc ggtgaggc         28

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>引物

<400>4

taatacgact cactataggg aga              23

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>5

atcggatccc ctgtcaacgc aactctgg         28

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>引物

<400>6

atgctcgagc attggttgag tcctgggac    29

Claims (10)

1.一种免疫球蛋白，其特征在于，它特异性地结合于人骨生成诱导因子蛋白。

2.如权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的人骨生成诱导因子蛋白具有GenBank登录号AF100758所示的序列。

3.如权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它由小鼠杂交瘤细胞系OIF-KG4，CCTCC No.C200409所产生。

4.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有特异性地结合于骨生成诱导因子蛋白的免疫球蛋白和选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶。

5.一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是小鼠杂交瘤细胞系OIF-KG4，CCTCC No.C200409。

6.一种检测肿瘤、肥胖疾病、糖尿病、高血压或高血脂的试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的免疫球蛋白或权利要求4所述的免疫偶联物。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤选自：垂体瘤、肺癌、肾上腺肿瘤、皮质或髓质肿瘤。

8.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的免疫球蛋白或权利要求4所述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。

9.抗人骨生成诱导因子蛋白的单克隆抗体在制备检测肿瘤、肥胖疾病、糖尿病、高血压或高血脂的试剂中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的抗人骨生成诱导因子蛋白的单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系OIF-KG4，CCTCC No.C200409所产生。

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