CN102276721A - 一种用于肝癌血清学诊断的单克隆抗体及其用途 - Google Patents
一种用于肝癌血清学诊断的单克隆抗体及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于肝癌血清学诊断的单克隆抗体及其用途。具体地，本发明提供了一种抗人肝癌的特异性单克隆抗体7C8。该单克隆抗体具有稳定性好和与肝癌抗原结合的特异性强的特点。本发明还提供了7C8免疫球蛋白、及其片段和免疫偶联物以及含有上述免疫球蛋白、片段或免疫偶联物的药物组合物。本发明还提供了一种检测肝癌的检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤学和医学领域。更具体地，本发明涉及一种用于肝癌血清学诊断的单克隆抗体及其用途。
背景技术
原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见恶性肿瘤之一，占居民肿瘤死亡第二位。肝癌出现症状时多属中晚期，切除后复发、转移率高。因此，肝癌的早期诊断对延长患者的生存时间和降低肝癌死亡率具有重要意义。
目前肝癌的诊断主要依靠影像学检查、肝穿刺组织学检查以及实验室检查。影像学诊断在肝癌诊断中起重要的作用，但是在诊断小肝癌及区分良恶性结节中均具有一定的局限性。肝硬化基础上肝内再生结节和发育不良的结节等良性病变较为常见，与肝癌的影像学特征有一定的重叠，放射学检查对肝内小的良恶性病变鉴别仍很困难。与肝脏病理对比，CT诊断肝癌的敏感度59％～80％。有创的组织病理学检查是诊断肝癌的金标准，即使是很好的细针穿刺仍因取材有限而有较高的假阴性率，并且有使肿瘤扩散和针道种植的危险。因此，临床仍需要高度敏感的血清肝癌特异标志物来鉴别肝脏良恶性病变，或在高危人群进行随访提高肝癌的早期诊断率。
血清甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是目前唯一广泛应用的HCC标志物。但是近年研究报道，以AFP诊断HCC的阳性率仅为50％，在直径＜3cm的小肝癌中敏感性显著降低，其阳性率不足40％，容易造成漏诊；其次在一些良性肝病、生殖性畸胎瘤、肺癌等患者中也可有升高，容易造成误诊。如何运用已知的肿瘤标志物来联合诊断HCC或者探索新的肿瘤分子标志物，以及建立相应的易于推广的检测方法，仍是当今肝癌研究领域的重要课题之一。
此外，癌症的血清学检测技术一直是研究的重点。然而，目前现有的针对癌症(如HCC)标志物的抗体的亲和性和特异性差异很大，大多数难以满足实际应用的需要。例如，以GPC3为例，国外有报道称，GPC3外周血中含量较低，肝癌患者中GPC3浓度升高幅度较小，不易与正常对照尤其是肝硬化对照区分。
由于目前仍然没有检测和或治疗肝癌的有效方法，因此，本领域迫切需要开发高特异性抗人肝癌单克隆抗体，以及相应的检测肝癌的有效方法。
发明内容
本发明的目的提供一种特异性抗人肝癌单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供一种特异性检测人肝癌的试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种特异性治疗人肝癌的治疗剂。
在本发明的第一方面，提供了一种免疫球蛋白VH链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：6所示的CDR1，
SEQ ID NO：8所示的CDR2，
SEQ ID NO：10所示的CDR3。
较佳地，所述的免疫球蛋白VH链具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种免疫球蛋白VL链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：12所示的CDR1，
SEQ ID NO：14所示的CDR2，
SEQ ID NO：16所示的CDR3。
较佳地，所述的免疫球蛋白VL链，它具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种免疫球蛋白，其VH链和VL链分别具有SEQID NO：2和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。较佳地，所述的免疫球蛋白是单克隆抗体。
在本发明的第四方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物具有VH链，该VH链的CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：6所示的CDR1，
SEQ ID NO：8所示的CDR2，
SEQ ID NO：10所示的CDR3，或者，
该免疫偶联物具有VL链，该VL链的CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：12所示的CDR1，
SEQ ID NO：14所示的CDR2，
SEQ ID NO：16所示的CDR3。
较佳地，所述的免疫偶联物是免疫毒素。
在本发明的第五方面，提供了一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是抗人肝癌杂交瘤GPC3-7C8，CCTCC No.：C201009。
在本发明的第六方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：
上述的免疫球蛋白VH链；
上述的免疫球蛋白VL链；
上述的免疫球蛋白。
较佳地，所述的DNA分子具有或含有选自下组的核酸序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15。
在本发明的第七方面，提供了一种检测肝癌的试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。
在另一优选例中，所述的检测是血清检测。
在另一优选例中，所述的血清检测是ELISA法、或双抗夹心时间分辨免疫荧光法(TRFIA法)。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：用于检测血清甲胎蛋白(AFP)的试剂(如抗AFP的单体)。
在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，它含有上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。
附图说明
图1显示了GPC3-ELISA测定标准曲线。
图2显示了ELISA测定血清GPC3含量。
图3显示了GPC3受试者ROC曲线(ELISA)。
图4显示了GPC3-TRFIA测定标准曲线。
图5显示了CH组和HCC组的血清GPC3-ROC曲线。
图6显示了GPC3和AFP相关性分析。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，利用人肝癌相关膜分子GPC3(第350-364位)偶联多肽为免疫原，经多年研究研制成功一种杂交瘤单克隆抗体，即抗人肝癌单抗7C8。此抗体经多年研究证实稳定性好，和肝癌抗原结合的特异性强。在此基础上完成了本发明。
本发明的单克隆抗体及其检测方法，对于肝癌高危人群普查、肝癌的早期诊断、肝癌疗效随访、以及预后判断等方面也有广泛的应用价值。本发明成果具有积极的社会效益。
抗体及其编码序列
本发明的7C8单抗或其片段可用于肝癌的检测(如放射性定位的诊断成像和血清学检测)，还可用于免疫治疗，例如通过直接或间接地将7C8单抗或其片段与化学治疗剂、或放疗剂相连从而使其能直接导向肿瘤细胞。
本发明还提供了编码7C8单抗的可变区的轻链和重链的cDNA序列。本发明包括相应的氨基酸序列和具有所述特征的可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与7C8单抗或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与本发明的7C8单抗或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，“免疫毒素”指对靶细胞有特异性亲和力和杀伤力的物质，例如免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素或其他治疗分子与7C8单抗或其片段结合的而形成的偶联物。具体的例子有例如131I-7C8，MTX-7C8偶联物等。
此处鉴定的V链的超变区或互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体；或人源化抗体。
本发明还提供了编码上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。本发明的7C8单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，按本领域技术人员已知的常规方法制备模板，通过扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
检测方法
利用本发明抗体的特异性强、效价高的GPC3的特点，本发明还提供了检测肝癌的方法，尤其是血清学检测方法。
在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测血清GPC3的时间分辨免疫荧光法(TRFIA)。
此外，在本发明方法中，可将单克隆抗体7C8与其他肿瘤标志物(如AFP)联合应用，这样不仅可提高肝癌早期诊断的阳性率，而且可对临床上为数众多的AFP低度或中度增高患者的良恶性病变进行鉴别诊断。
检测试剂盒
本发明还提供了一种检测肝癌的试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。一种人肝癌诊断试剂盒，已完成临床实验207例，检测阳性率高达41％，与AFP联合应用检测阳性率可进一步提高至75％。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于肝癌的治疗。此外，还可同时使用其他治疗剂，如IFN-α、IFN-β、TNF-α等。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的7C8免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明具有广泛的应用，其中包括(但并不限于)：
1.与影像学检查和AFP检测等结合应用于肝癌的诊断。
2.应用于甲胎蛋白增高肝病的良恶性鉴别诊断。
3.应用于治疗前GPC3阳性肝癌的预后监测指标。
4.应用于肝癌高危人群的筛查。
5.应用于肝癌相关的基础研究。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明单抗7C8仅以针对GPC3蛋白中段的15肽350-364位多肽所制备，其特异性识别GPC3蛋白的能力较强。
(b)本发明单抗7C8具有高亲和力，并且抗体的氨基酸序列组成(尤其是CDR区)不同于现有技术。
(c)本发明首次将ELISA和TRFIA同时应用于GPC3的检测。TRFIA与ELISA方法相比，最低检测浓度并未见提高，但前者阴性标本的本底较易控制，因而出现假阳性的机会较少，且重复性好，批内和批间变异系数均能够控制在13％以内。全自动测定仪的使用，也极大地提高了检验效率，同时降低了人为误差，使结果更为可靠。两种方法的联合使用，使得GPC3检测敏感性和特异性更为提高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
7C8单抗的制备和纯化
(1).多肽合成
对全长GPC3蛋白抗原性进行分析，基于蛋白的抗原性和可及性，最终选择多肽抗原GPC3350-364位氨基酸作为免疫原，该短肽被命名为GPC3-Ag2。采用人工合成方法制备短肽GPC3-Ag2，其序列为AHSQQRQYRSAYYPE(SEQ ID NO：17)。
表1
| 名称 | GPC3-Ag2 |
| 起始位置 | 350-364 |
| 分子量 | 1884.01Da |
| 质量 | 14.3mg |
| 纯度 | 97.70％ |
合成后，采用戊二醛法将合成的短肽与KLH进行偶联，获得偶联多肽作为免疫原。
(2)杂交瘤的制备
取6-8周龄BALB/c小鼠，初次免疫用合成的偶联多肽与等体积的福氏完全佐剂混合后，于背部及腹股沟多点皮下免疫，以后每隔2周免疫一次，用同剂量的抗原与福氏不完全佐剂混匀后于背部多点皮下免疫。第3次免疫7天后，鼠尾静脉采血，用间接ELISA法测定特异性抗体的产生。融合前3天，再用同样剂量的不加佐剂的抗原腹腔加强免疫1次。
加强免疫三天后，断颈处死小鼠，在无菌条件下取出脾脏，用注射器注入约0.2-0.5ml无血清培养液使其胀大，再用弯曲的注射针头多点刺破脾膜，用挤压的方法使淋巴细胞从中逸出，制备免疫脾细胞悬液后计数，用不完全培养液洗涤2次。取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm离心8分钟。弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。在室温下融合：①30秒内加入预热的1ml 45％PEG1000含5％DMSO，边加边搅拌；②作用90秒；③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。离心，800rpm，6分钟。弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI 1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO2温箱培养。一般一块96孔板含有1×107脾细胞。在融合24小时后加HAT选择培养液。HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。当杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体。用包被液将获得的GPC3多肽Ag2稀释为2μg/ml，以每孔100μl包被酶标板，置于4℃过夜后弃上清，用洗涤液将包被好的酶标板洗涤3次，每次5分钟，然后每孔加入200μl封闭液(3％BSA-PBST)，37℃放置2小时，倾去封闭液，同上洗涤，每孔加入100μl培液上清，37℃孵育1.5小时，弃上清，同上洗涤后每孔加入1∶4000稀释的羊抗鼠IgG-HRP 100μl，37℃孵育30分钟，将孔内上清弃去，同上洗涤，每孔加入100μl的显色液(TMB)，室温避光显色10-20分钟后，每孔加入50μl的终止液终止反应，酶标仪读出A450nm值。OD值高于阴性对照2倍以上者可视为阳性。
接着，阳性克隆按有限稀释法进行克隆化，经三次克隆化后筛选出所需要的能够稳定产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并且冻存保种，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上。
以获得的GPC3(350-364)偶联多肽为抗原制备获得10株杂交瘤细胞株，分别命名为2G7，3D4，3F5，3G1，3G6，4B9，5H10，6H10，7C8和9D9。这些杂交瘤制备的单克隆抗体阳性腹水1∶40000稀释后直接ELISA结果见表2。
表2杂交瘤细胞株腹水效价
| 2G7 | 3D4 | 3F5 | 3G1 | 3G6 | 4B9 | 5H10 | 6H10 | 7C8 | 9D9 |
| 1.459 | 2.456 | 1.824 | 2.142 | 2.56 | 1.500 | 1.124 | 1.443 | 2.39 | 1.112 |
(2)7C8单抗的制备和纯化
腹腔注射液体降植烷于F1代小鼠，7-10天后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7-10d后产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中。
取腹水与等体积的PBS(0.01mol/L，pH 7.4，含0.15mol/L的NaCl)稀释后，再加与上面等体积的饱和硫酸铵(90g硫酸铵加到100ml蒸馏水中，80℃溶解，趁热过滤，降至室温后即有结晶析出，用硫酸调至pH7.0)，置4℃，4h，然后10000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀用1-5ml PBS溶解，移入透析袋，在PBS(0.01mol/L，pH 7.4，含0.15mol/L的NaCl)中4℃透析过夜，将透析袋中的蛋白液移入Protein A Sepharose CL-4B柱循环数次，用Tris-HCl(0.05mol/L，pH 8.0，含0.15mol/L的NaCl)清洗已经上样的Protein A柱，至在紫外色谱仪记录纸上显示没有蛋白再洗脱下来，然后用解离液(0.01mol/L，甘氨酸-HCl，pH 3.0，含0.15mol/L的NaCl)洗脱抗体，洗脱液立即用1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)调pH至7.2，在PBS(0.01mol/L，pH 7.4，含0.15mol/L的NaCl)中4℃透析过夜后进行蛋白定量和特异性验证。
实施例2
抗GPC3(350-364aa)单克隆抗体7C8的鉴定和分型
挑选腹水效价OD值较高的3株杂交瘤3D4，3G6，7C8，分别将腹水纯化后的3株单克隆抗体3D4，3G6，7C8作1∶10000稀释后与GPC3标准品蛋白以及阴性对照蛋白(IL-15)进行直接ELISA检测，结果见表3。
表3单克隆抗体与GPC3标准品蛋白的反应(OD值)
| GPC3标准品 | IL-15 | |
| 3D4 | 0.149 | 0.135 |
| 3G6 | 2.622 | 1.013 |
| 7C8 | 2.839 | 0.102 |
结果表明，单克隆抗体7C8较3D4和3G6能更特异性的识别GPC3标准品蛋白，而与IL-15没有明显反应。进一步鉴定7C8其亚型为IgG1。
产生高效价单克隆抗体7C8的杂交瘤细胞GPC3-7C8，于2010年3月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为CCTCCNo.C201009。
实施例3
ELISA法检测
1.HRP标记第二抗体
本实施例中所用的第二抗体是HRP标记的抗GPC3(GPC3蛋白25-358aa)单克隆抗体GP9(制法参照CN 200710039562.7实施例中所述的方法)，称取HRP0.6mg溶于120μl水中；加入NaIO4(12.8mg/ml)120μl，4℃30分钟；加入乙二醇(9μl in 1ml)120μl室温30分钟；1mg/ml的抗体240μl混匀后装入透析袋对碳酸盐缓冲液(0.05M pH9.6)缓慢搅拌透析过夜，使之结合；第二天加NaBH4(5mg/ml)24μl，4℃2小时；装透析袋，4℃对0.05M/L PBS(pH7.2)透析过夜4℃离心，取上清检测效价。
2.ELISA检测方法的线性关系
以实施例1中制备的抗GPC3-Ag2单抗7C8包板，以HRP标记抗GPC3(GPC3蛋白25-358aa)单克隆抗体GP9(见步骤1)作为第二抗体，建立的夹心ELISA法，对稀释于25％正常人血清中的GPC3重组蛋白进行检测。
结果最低检测浓度为1.5ng/ml，在3.125ng-50ng的范围内GPC3含量和O.D.值呈良好的线性关系。见图1。
3.ELISA方法进行血清检测
利用如上建立的ELISA方法，对40例正常人、33例肝炎肝硬化及49例肝癌病人的血清进行了GPC3检测。
结果：正常人平均值为8.14±10.76ng/ml，肝炎肝硬化为15.67±44.40ng/ml。肝癌患者平均均值为79.53±98.02ng/ml，其中有大于200ng/ml的有9人，最高者为275ng/ml。
三组血清GPC3浓度呈偏态分布，正常人、肝炎肝硬化于肝癌间GPC3差异具有极显著性(P＜0.0001)，正常人和肝炎肝硬化之间的差异无显著性(图2)。
根据对肝癌和肝炎肝硬化两组病人所作的受试者工作曲线(图3)，当阳性值取19.12ng/ml时，诊断的敏感性和特异性分别为57.1％和90.9％；当阳性值取47.55ng/ml时，诊断的敏感性和特异性分别为42.9％和93.9％。
实施例4
TRFIA法检测
1.铕(Eu3+)标记第二抗体
本实施例中所用的第二抗体是铕(Eu3+)标记抗GPC3(GPC3蛋白第25-358位氨基酸)单克隆抗体GP9。制法如下：
取0.2mg抗GPC3蛋白25-358aa单克隆抗体GP9，经PD-10柱将缓冲液换成50mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 8.5)，加入含0.2mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三氨四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/L Tri s-HCl缓冲液(PH 7.8)平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)层析，A280监测收集第一洗脱峰，稀释分装备用。Eu3+-GP9经Sepharose CL-6B层析，收集第一洗脱峰。以EG&G Wal lac提供的Eu3+含量为0.02μmol/L，抗体GP9含量为0.85mg/mL，即平均每个GP9上连接了3.25个Eu3+。GP9参考标准高点(50ng/mL)与零点的取代比为21.42。说明Eu3+-GP9免疫反应性基本无损失，定量分辨率较好，被测物浓度和反应发光强度基本成算术级正比关系。
2.TRFIA方法测定血清GPC3浓度
将纯化的鼠抗GPC3单克隆抗体7C8用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3包被缓冲液(pH 9.6)稀释至3μg/mL，96孔板中每孔加100μL，4℃包被过夜。次日弃包被液，每孔加150μL 3％BSA/PBST，37℃封闭2h。弃封闭液，每孔加入100μL参考标准液或1∶5稀释后的待检血清，37℃振荡孵育1.5h后，PBST洗4次，再加入Eu3+-GP9(1∶100稀释)100μL，37℃孵育1h后，洗孔6次。每孔中加200μL增强液[1L pH 3.2邻苯二甲酸氢钾-冰醋酸缓冲液含15μmol β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)，50μmol三正辛基氧化膦(TOPO)，1mL Triton X-100]，25℃振荡反应5分钟，读取荧光值。检测过程在AutoDELFIA-1235上完成，双抗夹心TRFIA标准曲线由AutoDELFIA-1235自带的双对数函数数学模型自动处理。
以实施例1制备的抗GPC3-Ag2(350-364aa)单抗7C8及Eu3+标记抗GPC3(25-358aa)单抗GP9进行TRFIA法，对稀释于25％正常人血清中的GPC3进行检测，经双对数法函数数据处理程序处理得到GPC3-TRFIA的标准曲线，如图4所示。
从图中分析，GPC3蛋白浓度为0ng/mL～50ng/mL时，其浓度与荧光计数值呈线性关系，相关系数为0.991。该方法线性可测范围为3.125ng/mL～600ng/mL。
3.血清GPC3检测结果
血清标本来源：41例肝癌和44例慢性乙肝血清收集自2003年1月至2008年12月间上海市大华医院肝脏病科。肝癌的诊断符合2001年全国肝癌学术会议上正式通过的《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》。肝炎的诊断符合2005年中华医学会肝病学分会和感染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南标准》。患者血清分离后于-70℃分装保存至检测。
利用TRFIA方法对上述样本检测，统计学分析采用MedCalc 10.0.2软件进行ROC曲线制作，SPSS 12.0软件进行非参秩和检验，以P＜0.05为差异有显著性统计学意义。
结果表明：41份HCC血清GPC3浓度为86.68±110.39ng/mL，其中有6例高于150ng/mL；44份肝炎血清GPC3浓度为14.77±29.48ng/mL。各组中GPC3浓度均呈非正态分布。经非参秩和检验，HCC组和肝炎组之间的差异显著(P＜0.001)。
为更好地评价血清GPC3在HCC诊断中的应用价值，对肝炎组和肝癌组进行受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析(图5)，结果曲线下面积为0.809。根据ROC曲线结果，当取42.94ng/mL为诊断界值时，血清GPC3诊断HCC的敏感性和特异性分别为58.5％和95.5％。
实施例5
血清GPC3与AFP的联合诊断
在本实施例中，同时对这41例HCC病人血清进行AFP检测，其中AFP放射免疫检测试剂盒购自上海生物制品研究所。
结果如图6所示，AFP与GPC3之间无相关性(R2＝0.0174)。当AFP取20ng/mL为诊断界值时，诊断敏感性为78.1％(32/41)，特异性为77.7％(34/44)；联合GPC3检测，在特异性不变的前提下，可将诊断敏感性提高至92.7％；当AFP取200ng/mL为诊断界值时，诊断敏感性仅为46.3％，联合GPC3检测，可将敏感性提高至78.0％，同时特异性也能达90.9％(表4)。
表4GPC3、AFP及联合检测在诊断肝癌中的敏感性和特异性分析
| HCC和CH | 灵敏度(％) | 特异性(％) |
| GPC3 | 58.5(24/41) | 93.2(41/44) |
| AFP20 | 78.1(32/41) | 77.7(34/44) |
| AFP200 | 46.3(19/41) | 97.7(43/44) |
| GPC3和AFP20 | 92.7(38/41) | 77.3(34/44) |
| GPC3和AFP200 | 78.0(32/41) | 90.9(40/44) |
注：AFP20，AFP诊断界值20ng/mL；AFP200，AFP诊断界值200ng/mL；GPC3诊断界值42.94ng/mL。
1.灵敏度比较计数为最高浓度点计数的20％、50％、80％时效应点对应的浓度(ED20、ED50、ED80)，以零标准点荧光强度均值加2s后的荧光强度在标准曲线上得到的相应值为2.06ng/mL。8条不同时间进行测定的GPC3-TRFIA的效点均值ED20、ED50、ED80，分别为32.25ng/mL、74.08ng/mL、156.15ng/mL。
2.精密度本方法的批内和批间CV值分别为12.25％、12.91％。4批标准曲线的ABCV均小于12.38％。
3.方法的特异性将人甲胎蛋白分别稀释成1～80ng/mL等一系列不同浓度，代替标准曲线的GPC3参考标准，在上述浓度范围内，甲胎蛋白对GPC3-TRFIA均无交叉反应。
实施例6
抗GPC3(350-364aa)单克隆抗体7C8的氨基酸序列
提取GPC3-7C8杂交瘤细胞的总RNA，采用cDNA合成逆转录试剂盒，以RNA为模板合成第一条链cDNA，再以cDNA为模板，扩增单克隆抗体7C8可变区基因。对可变区PCR产物序列进行T/A克隆，后挑选阳性菌落进行测序，并对测序结果进行氨基酸翻译分析。
结果表明，7C8单抗重链可变区的CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO：6、8和10，对应的编码核酸序列分别列于SEQ ID NO：5、7和9。此外，包含上述可变区的部分重链可变区基因及编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和2所示。
7C8单抗轻链可变区的CDR1、CDR2、和CDR3的氨基酸序列分别列于SEQID NO：12、14和16，对应的编码核酸序列分别列于SEQID NO：11、13和15。此外，包含上述可变区的部分轻链可变区基因及编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3和4所示。
应理解，给出上述核苷酸和氨基酸序列是为了更清楚地描述本发明抗体的结构，然而测序有时可能会存在个别核苷酸(或氨基酸)的误读，因此7C8单抗重链和轻链的完整的核苷酸序列和氨基酸序列，以保藏的杂交瘤细胞GPC3-7C8(保藏号为CCTCC No.C201009)的实际序列为准。
单克隆抗体7C8轻链和重链高变区(互补性决定区CDR)的氨基酸序列如下：
实施例7
131I标记7C8单抗
在本实施例中，通过氯醛甲酰胺(Iodogen)固相法制备131I标记7C8单抗。
取氯醛甲酰胺1mg，溶于5ml二氯甲烷内，分装于一系列清洁玻璃管中，每管50ul，用氮气吹干，置于冰箱内保存待用。标记时在上述氯醛甲酰胺涂膜管内依此加入7C80.5-1mg，131I370MBq，0.5mol/1PH7.4磷酸缓冲液50ul，室温反应10min。然后吸取反应液加样到Sephadex G50淋洗柱上，收集131I标记结合峰，所得的131I-7C8比放射性200MBq/mg左右，放化纯度＞95％。
实施例8
7C8单克隆抗体作为放疗中的导向分子
将131I标记7C8单抗作为导向药物，尾静脉注射荷人SMMC-7721肝癌细胞的裸鼠，治疗组给药数天后肿瘤生长抑制，一周后肿瘤体积逐渐缩小，外观呈萎缩状，平均存活期明显延长。
这表明，7C8单克隆抗体可以作为放疗中的导向分子，将放疗剂有效地导向肝癌细胞。
实施例9
7C8单克隆抗体作为化疗中的导向分子
以人血清白蛋白(Human Albumen Serum，HAS)作为中间载体，将肿瘤化疗药物甲氨喋呤(MTX)和7C8交联在一起研制成免疫药物7C8-HAS-MTX偶联物，对荷人SMMC-7721肝癌的裸鼠体内导向药物治疗。
结果显示，此免疫药物具有明显的肿瘤生长抑制作用，这表明，7C8单克隆抗体可以作为化疗中的导向分子，将化疗剂有效地导向肝癌细胞。
讨论
硫酸肝素蛋白多糖3
硫酸肝素蛋白多糖3(Glypican-3，GPC3)是一种HCC标志物。GPC3位于细胞膜表面，由核心蛋白和糖胺聚糖(肝素及硫酸乙酰肝素)侧链构成，可结合肝素结合型蛋白如生长因子、细胞外基质、细胞-细胞粘附分子和与降解通路有关分子，在细胞的生长、发育、分化和迁移中发挥重要功能。
GPC3在生物体内的分布有明显的组织特异性和组织分化的时相特异性。研究表明在人体的胚胎期.胎盘和胎儿组织中富含GPC3mRNA，胃肠道和其他中胚层来源的组织都有GPC3的高度表达，特别是在肝、肾和肺中。而在成人，除胎盘组织有GPC3的高表达外，仅在肺脏、肾脏、心脏、卵巢等少数组织有低水平表达，在正常肝脏组织未见GPC3表达。最近多家实验室相继报道了GPC3在HCC组织中阳性表达，但在癌旁或肝炎/肝硬化组织中无表达，即在HCC组织中被证实具有70％阳性率和100％特异性。迄今为止，所有研究均支持GPC3为一种新型的肝癌相关分子。
GPC3蛋白包含580个氨基酸，分子量大小约为66kDa。在第358位精氨酸和359位丝氨酸处可以被切割酶分成两个亚基：40kDa的氨基末端蛋白(可溶性蛋白片段)和30kDa的羧基末端蛋白(与包膜结合的蛋白片断)。研究表明，GPC3可作为一种肿瘤标志物蛋白在外周血中被检测到。已发现肝癌病人血清中GPC3含量升高，然而GPC3的血清学检测仍不成熟，且报道的血清浓度相差甚远。此外，肝癌患者中GPC3浓度升高幅度较小，不易与正常对照尤其是肝硬化对照区分。这为ELISA检测带来了一定的技术难度。因此，寻找并建立一种更为有效的血清学检测方法十分重要。
本发明的TRFIA法与其他报道的检测方法不同之处在于：
1.本发明所采用的单抗7C8针对GPC3蛋白中段的第350-364位氨基酸，而另一抗体针对GPC3的N端。虽然GPC3的C端529-554aa抗原性最强，但这部分抗原通常锚定在肝癌细胞膜上，并不脱落至外周血中。针对C端的抗体应用于细胞或组织的免疫检测效果较好，但用于检测外周血清中GPC3含量时结果却并不理想。
2.首次将TRFIA应用于GPC3的检测，克服了ELISA方法学上的一些局限性。时间分辨免疫检测法是近年兴起的一种非放射性免疫检测方法，具有灵敏度高、可测浓度范围宽、重复性好等优点。ELISA法检测血清GPC3的缺点之一为重复性较差，即使以完全相同的抗体进行夹心检测，在不同实验室所得结果可有数百倍之差，在本发明人的研究中也发现，虽然TRFIA与ELISA方法相比，最低检测浓度并未见提高，但前者阴性标本的本底较易控制，因而出现假阳性的机会较少，且重复性好，批内和批间变异系数均能够控制在13％以内。以TRFIA方法诊断HCC的阳性率达到了58.5％，明显高于本发明人先前建立的ELISA方法(40.0％)。此外，全自动测定仪的使用，也极大地提高了检验效率，同时降低了人为误差，使结果更为可靠。
AFP是目前唯一广泛应用的HCC标志物。但是近年文献报道，以AFP诊断HCC的阳性率仅为50％，在直径＜3cm的小肝癌中其阳性率不足40％。本发明实施例涉及的肝癌患者均为中晚期，因此AFP的阳性率相对较高。当AFP的截断值取20ng/mL时，有78.1％的阳性率，但此时的特异性仅为77.7％；而当截断值取200ng/mL时，在特异性提高至97.7％的同时，阳性率也下降至46.3％。当联合GPC3检测时，可将AFP诊断的灵敏度由46.3％提高至78.0％，表明GPC3与AFP在诊断上有很大的互补作用。从上述结果可以看出，GPC3和AFP的浓度在肝癌患者中无任何相关性。这一结果反映了两种蛋白在肝癌细胞中的产生机制及所起作用的不同。AFP是胎儿时期肝脏合成的一种胚胎蛋白，孕后第8周开始合成，到第16周时达到高峰，出生后一年左右恢复到基础水平。当肝细胞发生癌变时，细胞中合成AFP的基因重新被激活，导致HCC患者外周血中AFP浓度逐渐上升。而GPC3是一种定位于细胞膜上的糖蛋白，可作为IGF-II等细胞因子的共同受体，可通过Wnt通路等引起肝癌相关基因的高表达，导致肝细胞增生失控而发生癌变。因此，联合AFP和GPC3检测，有助于提高HCC诊断的阳性率和特异性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海市肿瘤研究所
<120>一种用于肝癌血清学诊断的单克隆抗体及其用途
<130>101813
<160>17
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>246
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(246)
<400>1
ggt tat acc ttc tca gac tat tca atg cac tgg gtg aag cag gct cca 48
Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro
1 5 10 15
gga aag gat tta aag tgg atg ggc tgg ata aac act gag act ggt gag 96
Gly Lys Asp Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu
20 25 30
cca aca tat tca gat gac ttc aag gga cga ttt gcc ttc tct ttg gat 144
Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp
35 40 45
acc tct gcc agc act gcc tat ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag 192
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu
50 55 60
gac acg gct aca tat ttc tgt gct aga gac tgg gac gag ggt gct atg 240
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Trp Asp Glu Gly Ala Met
65 70 75 80
gac tac 246
Asp Tyr
<210>2
<211>82
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>2
Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro
1 5 10 15
Gly Lys Asp Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu
20 25 30
Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp
35 40 45
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu
50 55 60
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Trp Asp Glu Gly Ala Met
65 70 75 80
Asp Tyr
<210>3
<211>237
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(237)
<400>3
agg gcc agc aaa agt gtc agt aca tct ggc tat agt tat atg cac tgg 48
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp
1 5 10 15
aac caa cag aaa cca gga cag cca ccc aga ctc ctc atc tat ctt gta 96
Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val
20 25 30
tcc aac cta gaa tct ggg gtc cct gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct 144
Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
35 40 45
ggg aca gac ttc acc ctc aac atc cat cct gtg gag gag gag gat gct 192
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala
50 55 60
gca acc tat tac tgt cag cac att agg gag ctt aca cgt tcg gag 237
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu
65 70 75
<210>4
<211>79
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>4
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp
1 5 10 15
Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val
20 25 30
Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala
50 55 60
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu
65 70 75
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>VH CDR1编码序列
<400>5
ggttatacct tctcagacta ttcaatgcac 30
<210>6
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>VH CDR1
<400>6
Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr Ser Met His
1 5 10
<210>7
<211>51
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>VH CDR2编码序列
<400>7
tggataaaca ctgagactgg tgagccaaca tattcagatg acttcaaggg a 51
<210>8
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>VH CDR2
<400>8
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ser Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>VH CDR3编码序列
<400>9
gactgggacg agggtgctat ggactac 27
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>VH CDR3
<400>10
Asp Trp Asp Glu Gly Ala Met Asp Tyr
1 5
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>VL CDR1编码序列
<400>11
agggccagca aaagtgtcag tacatctggc tat 33
<210>12
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>VL CDR1
<400>12
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr
1 5 10
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>VL CDR2编码序列
<400>13
cttgtatcca acctagaatc t 21
<210>14
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>VL CDR2
<400>14
Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210>15
<211>30
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>VL CDR3编码序列
<400>15
cagcacatta gggagcttac acgttcggag 30
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>VL CDR3
<400>16
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu
1 5 10
<210>17
<211>15
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>17
Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu
1 5 10 15
Claims (10)
1.一种免疫球蛋白VH链，其特征在于，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：6所示的CDR1，
SEQ ID NO：8所示的CDR2，
SEQ ID NO：10所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的免疫球蛋白VH链，其特征在于，它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3.一种免疫球蛋白VL链，其特征在于，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：12所示的CDR1，
SEQ ID NO：14所示的CDR2，
SEQ ID NO：16所示的CDR3。
4.如权利要求2所述的免疫球蛋白VL链，其特征在于，它具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
5.一种免疫球蛋白，其特征在于，其VH链和VL链分别具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是单克隆抗体。
7.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物具有VH链，该VH链的CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：6所示的CDR1，
SEQ ID NO：8所示的CDR2，
SEQ ID NO：10所示的CDR3，或者，
该免疫偶联物具有VL链，该VL链的CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：12所示的CDR1，
SEQ ID NO：14所示的CDR2，
SEQ ID NO：16所示的CDR3。
8.一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是抗人肝癌杂交瘤GPC3-7C8，CCTCC No.：C201009。
9.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：
权利要求1所述的免疫球蛋白VH链；
权利要求3所述的免疫球蛋白VL链；或
权利要求5所述的免疫球蛋白。
10.一种检测肝癌的试剂盒，其特征在于，它含有权利要求5所述的免疫球蛋白或权利要求7所述的免疫偶联物；
更佳地，所述的试剂盒还包括：用于检测血清甲胎蛋白(AFP)的试剂。
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