ES2607491T3 - Uso de endostatina como marcador de la insuficiencia cardíaca - Google Patents

Abstract

Un método para el diagnóstico de la insuficiencia cardíaca en un individuo que comprende las etapas de a) medir en una muestra obtenida del individuo la concentración de la endostatina marcadora, b) medir opcionalmente en la muestra la concentración de uno o más marcadores diferentes de insuficiencia cardíaca, en el que dicho uno o más marcadores se selecciona del grupo que consiste en un marcador de péptido natriurético, un marcador de troponina cardiaca y un marcador de inflamación y c) diagnosticar la insuficiencia cardíaca comparando la concentración determinada en la etapa (a) y opcionalmente la concentración o concentraciones determinadas en la etapa (b) respecto a la concentración de este marcador o de estos marcadores como se establece en una muestra control, en donde dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en suero, plasma y sangre completa.

Description

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preferida la endostatina producida de forma recombinante se utiliza como antígeno en la fabricación de anticuerpos poli o monoclonales contra la endostatina. También puede ser preferible purificar anticuerpos policlonales mediante inmunoadsorción sobre un inmunosorbente de endostatina utilizando una endostatina producida de forma recombinante tal como se ha descrito anteriormente.

Tal como apreciarán los expertos, ahora que la endostatina se ha identificado como un marcador útil en la evaluación de la IC, se pueden utilizar caminos alternativos para llegar a un resultado comparable a los logros de la presente invención. Por ejemplo, pueden utilizarse estrategias alternativas para generar anticuerpos. Estas estrategias comprenden, entre otros, el uso de péptidos sintéticos o recombinantes, que representan un epítopo clínicamente relevante para la inmunización de endostatina. Alternativamente, puede utilizarse la inmunización con DNA también conocida como vacunación con DNA.

Para la medición de la muestra de líquido obtenida a partir de un individuo, esta se incuba con el agente de unión específico para endostatina bajo condiciones apropiadas para la formación de un complejo-agente de unión a endostatina. Tales condiciones no necesitan ser especificadas, ya que los expertos podrán identificar fácilmente sin ningún esfuerzo las condiciones de incubación apropiadas. La cantidad de complejo-agente de unión a endostatina se mide y se utiliza en la evaluación de la IC. Como apreciarán los expertos, existen numerosos métodos para medir la cantidad de complejo-agente de unión a endostatina descritos en detalle en los libros de texto pertinentes (cf., por ejemplo, Tijssen P., supra, o Diamandis, E.P. y Christopoulos, T.K. (eds.), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996).

Se detecta endostatina preferentemente en un formato de ensayo de tipo sándwich. En dicho ensayo un primer agente de unión específico se utiliza para capturar endostatina, por un lado, y un segundo agente de unión específico, que se etiqueta para ser directamente o indirectamente detectable, se utiliza en el otro lado. Preferiblemente, un anticuerpo para endostatina se utiliza en un inmunoensayo cualitativo (endostatina presente o ausente) o cuantitativa (se determina la cantidad de endostatina).

Los inventores de la presente invención, sorprendentemente, son capaces de detectar proteínas endostatina en una muestra de líquido corporal. Más sorprendente aún es que son capaces de demostrar que la presencia de endostatina en dicha muestra de líquido obtenida de un individuo puede correlacionarse con la IC. No es necesaria ninguna muestra de biopsia ni de tejido para hacer uso del marcador endostatina en la evaluación de la IC. Medir el nivel de proteína endostatina se considera muy ventajoso en el campo de la IC.

En una realización preferida el método de acuerdo con la presente invención se practica con suero líquido como material de muestra. En una realización más preferida el método de acuerdo con la presente invención se practica con plasma como material de muestra líquida. En una realización aún más preferida el método de acuerdo con la presente invención se practica con sangre completa como material de muestra líquida.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere a la utilización de la proteína endostatina como molécula marcadora en la evaluación de la insuficiencia cardiaca a partir de una muestra de líquido obtenido a partir de un individuo.

El escenario ideal para el diagnóstico sería una situación en que un único evento o proceso podría causar la correspondiente enfermedad como, por ejemplo, en las enfermedades infecciosas. En todos los demás casos, el diagnóstico correcto puede ser muy difícil, especialmente cuando la etiología de la enfermedad no se entiende por completo como es el caso de la IC. Como apreciarán los expertos, ningún marcador bioquímico en el campo de la IC sirve de diagnóstico con un 100% de especificidad y, al mismo tiempo, 100% de sensibilidad para el diagnóstico de una determinada cuestión. Más bien, los marcadores bioquímicos son utilizados para evaluar con cierta probabilidad

o valor predictivo una cuestión diagnóstica subyacente. Los expertos están completamente familiarizados con los métodos estadísticos y matemáticos que habitualmente se utilizan para calcular el riesgo relativo o la probabilidad para la pregunta diagnóstico a evaluar. En la práctica clínica rutinaria generalmente un médico considera conjuntamente diversos síntomas clínicos y marcadores biológicos en el diagnóstico, el tratamiento y la gestión de la enfermedad subyacente.

Preferiblemente, en otra realización preferida de la presente invención, el método para la evaluación de la IC se lleva a cabo midiendo la concentración de endostatina y de uno o más marcadores diferentes y utilizando la concentración de endostatina y de uno o más marcadores diferentes en la evaluación de la IC.

En la evaluación de la IC, el marcador endostatina ayudará al médico en uno o más de los siguientes aspectos: evaluar el riesgo de un individuo para insuficiencia cardíaca o evaluar un paciente con insuficiencia cardíaca, por ejemplo, con la intención de identificar el estadio de la insuficiencia cardíaca, diferenciar entre la insuficiencia cardíaca aguda y crónica, juzgar el riesgo de progresión de la enfermedad, proporcionar orientación en la selección de una terapia apropiada, monitorizar la respuesta del paciente a la terapia y monitorizar el curso de la enfermedad, es decir, en el seguimiento de pacientes con IC.

Cribado (evaluación si los individuos están en riesgo de desarrollar insuficiencia cardíaca)

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Diferenciación entre un evento cardíaco agudo y una enfermedad cardíaca crónica

Se describe un método in vitro que ayuda en el diagnóstico diferencial entre un evento cardíaco agudo y una enfermedad cardiaca crónica, que comprende las etapas de medir en una muestra la concentración del marcador endostatina, de medir opcionalmente en la muestra la concentración de uno o más marcadores diferentes de insuficiencia cardiaca y establecer un diagnóstico diferencial entre un evento cardíaco agudo y una enfermedad cardíaca crónica comparando la concentración determinada en la etapa (a) y opcionalmente las concentraciónes determinadas en la etapa (b) con la concentración de este marcador o de estos marcadores respecto sus valores de referencia.

El experto en la materia conoce los significados de "evento cardiaco agudo" y de "enfermedad cardiaca crónica".

Preferiblemente, un "evento cardíaco agudo" se refiere a una condición aguda, enfermedad o mal funcionamiento del corazón, particularmente a insuficiencia cardíaca aguda, por ejemplo, infarto de miocardio (IM) o arritmia. Dependiendo de la extensión de un IM, puede ser seguido por DVI y ICC.

Preferiblemente, una "enfermedad cardiaca crónica" es un debilitamiento de la función cardíaca, por ejemplo, debido a isquemia del corazón, enfermedad de las arterias coronarias, o infarto previo del miocardio, posiblemente seguido de DVI progresiva. También puede ser un debilitamiento debido a enfermedades inflamatorias, defectos de la válvula cardíaca (por ejemplo, defectos de la válvula mitral), cardiomiopatía dilatativa, cardiomiopatía hipertrófica, defectos del ritmo cardíaco (arritmias) y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Por lo tanto, está claro que una enfermedad cardiaca crónica también puede incluir pacientes que habían sufrido de un síndrome coronario agudo, por ejemplo, IM, pero que actualmente no padecen un evento cardíaco agudo.

Es importante diferenciar entre un evento cardiaco agudo y una enfermedad cardiaca crónica, porque un evento cardiaco agudo y una enfermedad cardiaca crónica pueden requerir regímenes de tratamiento muy diferentes. Por ejemplo, para un paciente que presenta un infarto agudo de miocardio, el tratamiento temprano para la reperfusión puede ser de suma importancia. Mientras que un tratamiento para la reperfusión realizada en un paciente con insuficiencia cardiaca crónica en el mejor de los casos es de ningún o poco daño a este paciente.

La endostatina marcadora se utiliza en el diagnóstico diferencial de insuficiencia cardiaca aguda y crónica.

Evaluación del riesgo de progresión de la enfermedad

Se describe un método in vitro para evaluar el riesgo de progresión de la enfermedad de un paciente con IC, que comprende las etapas de medir en una muestra la concentración del marcador endostatina, de medir opcionalmente en la muestra la concentración de uno o más marcadores diferentes de la insuficiencia cardíaca, y de establecer el riesgo de progresión de la enfermedad de dicho individuo comparando la concentración de endostatina y opcionalmente las concentraciones determinadas opcionalmente de uno o más marcadores respecto a la concentración de estos marcadores respecto a su valor de referencia.

En la actualidad es muy difícil evaluar o incluso predecir con una probabilidad razonable si un paciente diagnosticado con IC tiene un estado más o menos estable o si la enfermedad progresará y el estado de salud del paciente como resultado es probable que empeore. La gravedad y progresión de la insuficiencia cardíaca se establece clínicamente por medio de la evaluación de los síntomas clínicos o por la identificación de los cambios adversos mediante el uso de tecnologías de imagen como la ecocardiografía. El empeoramiento de la insuficiencia cardíaca se establece mediante el seguimiento de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI). Un deterioro de la FEVI en un 5% o más se considera progresión de la enfermedad.

La presente descripción se refiere por lo tanto al uso de la endostatina como marcador en la evaluación del riesgo de progresión de la enfermedad para un paciente que sufre de IC. En la evaluación de la progresión de la enfermedad para los pacientes que sufren de IC, un nivel elevado de endostatina es un indicador de un mayor riesgo de progresión de la enfermedad.

Orientación en la selección de una terapia adecuada para la IC

Se describe un método in Vitro que ayuda en la selección de una terapia apropiada para la IC, que comprende las etapas de medir en una muestra la concentración de la endostatina marcadora, de medir opcionalmente en la muestra la concentración de uno o más marcadores diferentes de insuficiencia cardíaca y de seleccionar una terapia apropiada comparando la concentración para la endostatina y opcionalmente la concentración o concentraciones determinadas para los marcadores opcionales a la concentración de este marcador o de estos marcadores respecto a sus valores de referencia.

Se espera que la endostatina marcadora sea de ayuda para ayudar al médico a seleccionar el régimen de tratamiento más apropiado de los diferentes regímenes de tratamiento disponibles en el área de la insuficiencia

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cardíaca. Por lo tanto, la presente descripción se refiere al uso de la endostatina marcadora en la selección de un régimen de tratamiento para un paciente que sufre de IC.

Monitorización de la respuesta de un paciente a la terapia

La presente descripción se refiere a un método in vitro para monitorizar la respuesta de un paciente a la terapia de IC, que comprende las etapas de: a) medir en una muestra la concentración del marcador endostatina, b) opcionalmente medir en la muestra la concentración de uno o más marcadores diferentes de insuficiencia cardíaca, y de monitorizar la respuesta de un paciente a la terapia de IC comparando la concentración determinada en la etapa (a) y opcionalmente las concentraciones determinadas en la etapa (b) con la concentración de este marcador

o estos marcadores respecto a su valor de referencia.

Alternativamente, el método anterior para motorizar la respuesta de un paciente a la terapia se puede practicar estableciendo el nivel pre y post-terapéutico para la endostatina marcadora y para los otros marcadores opcionales y comparando el nivel pre y post-terapéutico del marcador.

El diagnóstico de insuficiencia cardíaca se establece clínicamente. De acuerdo con la presente invención, la IC se considera establecida clínicamente si un paciente cumple los criterios de los estadios C o D según se definen en las guías de práctica de ACC/AHA. De acuerdo con estas guías, el estadio C se refiere a pacientes con cardiopatía estructural y con síntomas previos o actuales de insuficiencia cardíaca. Los pacientes en estadio D son aquellos pacientes con insuficiencia cardíaca refractaria que requieren intervenciones especializadas.

Como se indica más arriba, los valores medidos para NT-proBNP están altamente correlacionados con la gravedad de la insuficiencia cardíaca. Sin embargo, tanto BNP como NT-proBNP parecen no ser ideales en el seguimiento de la respuesta de un paciente a la terapia, cf. por ejemplo, Beck-da-Silva, L., et al., Congest. Heart Fail. 11 (2005) 248253, cuestionario 254-255.

La endostatina marcadora parece apropiada para monitorizar la respuesta de un paciente a la terapia. En ese área de diagnóstico, la endostatina marcadora también puede usarse para establecer un valor basal antes de la terapia y para medir la endostatina en un punto de tiempo o varios puntos de tiempo después de la terapia. En el seguimiento de los pacientes con IC, un nivel reducido de endostatina es un indicador positivo para un tratamiento eficaz de la IC.

Combinación de marcadores

Los marcadores bioquímicos se pueden determinar individualmente o, en una realización preferida de la invención, se pueden medir simultáneamente usando una tecnología de matriz basada en chip o en una cuenta. Las concentraciones de los biomarcadores se interpretan entonces independientemente usando un punto de corte individual para cada marcador o se combinan para la interpretación, es decir, forman una combinación de marcadores.

Como apreciará el experto en la técnica la etapa de correlacionar un nivel de marcador con una cierta probabilidad o riesgo se puede realizar y conseguir de diferentes maneras. Preferiblemente, los valores medidos para la endostatina marcadora y uno o más marcadores diferentes se combinan matemáticamente y el valor combinado se correlaciona con la pregunta diagnóstica subyacente. Los valores de marcador pueden combinarse con la medición de la endostatina por cualquier método matemático apropiado del estado de la técnica.

Preferiblemente, el algoritmo matemático aplicado en la combinación de marcadores es una función logística. El resultado de aplicar tal algoritmo matemático o tal función logística preferiblemente es un valor único. Dependiendo de la pregunta diagnóstica subyacente, dicho valor puede correlacionarse fácilmente, por ejemplo, con el riesgo de que un individuo sufra insuficiencia cardíaca o con otros usos diagnósticos previstos útiles en la evaluación de pacientes con IC. De una manera preferida tal función logística se obtiene mediante a) la clasificación de los individuos en los grupos, por ejemplo, en individuos normales, individuos en riesgo de insuficiencia cardíaca, pacientes con insuficiencia cardiaca aguda o crónica, etc. b) la identificación de marcadores que difieren significativamente entre estos grupos por análisis univariante, c) análisis de regresión logística para evaluar los valores discriminatorios independientes de los marcadores útiles en la evaluación de estos diferentes grupos y d) construcción de la función logística para combinar los valores discriminativos independientes. En este tipo de análisis, los marcadores ya no son independientes, sino que representan una combinación de marcadores.

En una realización preferida, la función logística utilizada para combinar los valores de endostatina y el valor de al menos un marcador adicional se obtiene por a) clasificación de individuos en los grupos de individuos normales y en riesgo de insuficiencia cardíaca, respectivamente, b) establecer los valores para la endostatina y el valor de al menos otro marcador adicional, c) realizar el análisis de regresión logística y d) construir la función logística para combinar los valores de marcador para la endostatina y el valor de al menos otro marcador.

Una función logística para correlacionar una combinación de marcadores con una enfermedad emplea preferiblemente un algoritmo desarrollado y obtenido aplicando métodos estadísticos. Métodos estadísticos

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toda la gráfica. Se trata de una expresión cuantitativa y descriptiva de lo cerca que está la gráfica ROC de la gráfica perfecta (área = 1.0).

La sensibilidad global del ensayo dependerá de la especificidad requerida para practicar el método descrito aquí. En ciertas configuraciones preferidas una especificidad del 75% puede ser suficiente y los métodos estadísticos y los algoritmos resultantes pueden basarse en este requisito de especificidad. En una realización preferida, el método utilizado para evaluar individuos con riesgo de insuficiencia cardíaca se basa en una especificidad del 80%, del 85%,

o también preferida del 90% o del 95%.

Como se discutió anteriormente, la endostatina marcadora ayuda en la evaluación del riesgo de un individuo de desarrollar insuficiencia cardíaca, así como en la evaluación diagnóstica adicional in vitro de un paciente que tiene insuficiencia cardíaca. Una realización preferida en consecuencia es el uso de endostatina como molécula marcadora en la evaluación de la insuficiencia cardíaca.

El uso de una combinación de marcadores que comprende endostatina y uno o más marcadores diferentes de IC en la evaluación de pacientes con IC o en la evaluación de individuos en riesgo de IC, representa otra realización preferida de la presente invención. En dicha combinación de marcadores, los marcadores adicionales se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en un marcador de péptido natriurético, un marcador de troponina cardiaca y un marcador de inflamación.

El marcador o marcadores adicionales seleccionados de IC preferidos con los que se pueden combinar la medición de endostatina preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en un marcador de péptido natriurético, un marcador de troponina cardiaca y un marcador de inflamación. Estos marcadores adicionales preferidos cuya medición se combina preferiblemente con la medición de endostatina o que forman parte de la combinación de marcadores de IC que comprende endostatina, respectivamente, se discuten con más detalle a continuación.

Marcador de péptido natriurético

Un marcador peptídico natriurético en el sentido de la presente invención es un marcador seleccionado de la familia del péptido natriurético atrial (ANP) o un marcador seleccionado de la familia del péptido natriurético cerebral (BNP).

Los marcadores polipeptídicos en la familia de péptidos natriuréticos atriales o en la familia de péptidos natriuréticos cerebrales derivan de las preproformas de las correspondientes hormonas activas.

Los marcadores de péptidos natriuréticos preferidos de acuerdo con la presente invención son NT-proANP, ANP, NT-proBNP, BNP y fragmentos fisiológicos inmunológicamente detectables de los mismos. Como el experto en la técnica apreciará fácilmente, el fragmento inmunológicamente detectable debe comprender al menos un epítopo que permita la detección específica de tal fragmento fisiológico. Un fragmento fisiológico es un fragmento que está presente naturalmente en la circulación de un individuo.

Los marcadores en ambas familias de péptidos natriuréticos representan fragmentos de las pro-hormonas correspondientes, es decir, proANP y proBNP, respectivamente. Dado que consideraciones similares se aplican a ambas familias, sólo la familia de marcadores BNP se describirá con algún detalle. La pro-hormona de la familia BNP, es decir, proBNP consta de 108 aminoácidos. ProBNP se escinde en los 32 aminoácidos C-terminales (77108) que representan la hormona BNP biológicamente activa y los aminoácidos N-terminal 1-76 llamados proBNP Nterminal (o NT-proBNP). BNP, proBNP N-terminal (1-76), así como otros productos de degradación (Hunt, P.J. et al., Biochem. Biophys Res. Com. 214 (1995) 1175-1183) circulan en sangre. Si la molécula precursora completa (proBNP 1-108) también se produce en el plasma no está completamente aclarado. Sin embargo, se describe (Hunt, PJ, et al., Peptides 18 (1997) 1475-1481) que una baja liberación de proBNP (1-108) en el plasma es detectable pero que debido a la rápida degradación parcial en los N-terminales algunos aminoácidos están ausentes. Actualmente se acepta generalmente que, por ejemplo, para NT-proBNP, la parte central de la molécula, que reside entre los aminoácidos 10 a 50, representa una parte fisiológicamente más estable. Las moléculas de NT-proBNP que comprenden esta parte central de NT-proBNP se pueden medir de forma fiable a partir de fluidos corporales. En el documento WO 00/45176 se da una descripción detallada de los métodos basados en la detección inmunológica de esta parte central de la molécula de NT-proBNP y se hace referencia al lector para conocer los detalles. Puede ser de ventaja adicional medir sólo una cierta subfracción de NT-proBNP para la cual se ha propuesto el término NTproBNP nativo. Se puede encontrar una descripción detallada relacionada con esta sustracción de NT-proBNP en el documento WO 2004/099253. El experto encontrará allí todas las instrucciones necesarias. Preferiblemente, el NTproBNP medido es o corresponde al NT-proBNP medido con el ensayo Elecsys® NT-proBNP de Roche Diagnostics, Alemania.

Las preanalíticas son robustas con NT-proBNP, que permite el transporte fácil de la muestra a un laboratorio central (Mueller, T., y col., Clin. Chem. Lab. Med. 42 (2004) 942-944). Las muestras de sangre pueden almacenarse a temperatura ambiente durante varios días o pueden enviarse por correo. Por el contrario, el almacenamiento de BNP durante 48 horas a temperatura ambiente o a 4ºC produce una pérdida de concentración de al menos el 20% (Mueller, T., et al., Supra, Wu, AH y col., Clin. Chem. 50 (2004) 867 -873).

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La familia de péptidos natriuréticos derivados del cerebro (especialmente BNP y NT-proBNP) ha sido investigada a fondo en el cribado de ciertas poblaciones de IC. Los resultados con estos marcadores, especialmente con NTproBNP son bastante alentadores. Los valores elevados de NT-proBNP incluso en "pacientes" asintomáticos son claramente indicativos de "problemas cardíacos" (Gremmler, B., et al., Exp. Clin. Cardiol. 8 (2003) 91-94). Estos autores demostraron que un NT-proBNP elevado indica la presencia de "malestar cardio-renal" y debería solicitar la derivación para una investigación posterior. De acuerdo con varios otros grupos de investigadores, Gremmler y col. También encuentran que una concentración anormal de NT-proBNP es una prueba diagnóstica precisa tanto para la exclusión de IC en la población como para descartar la disfunción ventricular izquierda asignaturas (=DVI) en sujetos con falta de aliento. El papel de los valores negativos de BNP o NT-proBNP en la exclusión de IC o DVI está corroborado por otros grupos de investigadores, por ejemplo, McDonagh, T.A., et al., Eur. J. Heart Fail. 6 (2004) 269 -273; y Gustafsson, F., et al., J. Card. Fail. 11, Supl. 5 (2005) S15-20.

El BNP se produce predominantemente (aunque no exclusivamente) en el ventrículo y se libera al aumentar la tensión de la pared. Por lo tanto, un aumento de BNP liberado refleja predominantemente disfunciones del ventrículo

o disfunciones que se originan en las aurículas pero que afectan al ventrículo, por ejemplo, a través de la entrada afectada o la sobrecarga del volumen sanguíneo. En contraste con BNP, ANP se produce y se libera predominantemente de la aurícula. Por lo tanto, el nivel de ANP puede reflejar predominantemente la función auricular.

ANP y BNP son las hormonas activas y tienen una semivida más corta que sus respectivas homólogas inactivas, NT-proANP y NT-proBNP. El BNP se metaboliza en la sangre, mientras que el NT-proBNP circula en la sangre como una molécula intacta y como tal se elimina por vía renal. La semivida in vivo de NT-proBNP es 120 min más larga que la de BNP, que es de 20 min (Smith, M.W. et al., J. Endocrinol., 167 (2000) 239-246).

Por lo tanto, dependiendo del curso del tiempo o las propiedades de interés, puede ser ventajosa la medición de las formas activa o inactiva del péptido natriurético.

En la evaluación de un individuo en riesgo de insuficiencia cardiaca, el valor medido para la endostatina se combina preferiblemente con el valor para NT-proANP y/o NT-proBNP. Preferiblemente, el valor de NT-proBNP se combina con el valor de la endostatina. Consideraciones similares se aplican para seleccionar una terapia apropiada, juzgar el riesgo de progresión de la enfermedad y para monitorizar el curso de la enfermedad.

En el caso de que se utilice endostatina para evaluar la respuesta de un paciente a la terapia, su medición se combina preferiblemente con la medición de ANP o BNP.

En el caso de que se utilice endostatina para diferenciar entre insuficiencia cardiaca aguda y crónica, la combinación de marcadores preferida comprende endostatina, ANP o proANP y BNP o proBNP.

Marcador de troponina cardiaca

El término troponina cardiaca se refiere a las isoformas cardiacas de troponina I y troponina T. Como ya se ha indicado anteriormente, el término marcador también se refiere a variantes fisiológicas de la molécula marcadora, como fragmentos o complejos fisiológicos. Para los marcadores de troponina cardiaca se sabe que sus complejos fisiológicos tienen relevancia diagnóstica y se incluyen aquí expresamente.

La troponina T tiene un peso molecular de aproximadamente 37.000 Da. La isoforma troponina T que se encuentra en el tejido cardíaco (cTnT) es suficientemente divergente de TnT del músculo esquelético para permitir la producción de anticuerpos que distinguen ambas isoformas de TnT. TnT se considera un marcador de daño miocárdico agudo; cf. Katus, H.A., et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 21 (1989) 1349 -1353; Hamm, C.W. et al., N. Engl. J. Med. 327 (1992) 146 -150; Ohman, E.M., et al., N. Engl. J. Med. 335 (1996) 1333 -1341; Christenson, R.H., et al., Clin. Chem. 44 (1998) 494 -501; y el documento PE 0 394 819.

La troponina I (TnI) es un elemento inhibidor de 25 kDa del complejo de troponina, que se encuentra en el tejido muscular. TnI se une a la actina en ausencia de Ca2+, inhibiendo la actividad ATPasa de la actomiosina. La isoforma TnI que se encuentra en el tejido cardíaco (cTnI) es divergente en un 40% de TnI del músculo esquelético, permitiendo que ambas isoformas se diferencien inmunológicamente. La concentración plasmática normal de cTnI es <0,1 ng/ml (4 pM). CTnI se libera en el torrente sanguíneo después de la muerte celular cardiaca; Por lo tanto, la concentración plasmática de cTnI está elevada en pacientes con infarto agudo de miocardio (Benamer, H. et al., Am.

J. Cardiol., 82 (1998) 845-850).

Las isoformas cardiacas únicas de troponina I y T permiten diferenciarlas inmunológicamente de las otras troponinas del músculo esquelético. Por lo tanto, la liberación en la sangre de la troponina I y T del músculo cardíaco dañado puede estar específicamente relacionada con el daño del tejido cardíaco. En la actualidad también es apreciado por el experto en la técnica que las troponinas cardiacas puedan detectarse de la circulación ya sea en su forma libre o como parte de un complejo (ver, por ejemplo, US 6 333 397, US 6 376 206 y US 6 174 686).

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En la evaluación de un individuo en riesgo de insuficiencia cardíaca así como en la evaluación de un paciente que sufre de insuficiencia cardiaca, el valor medido para la endostatina se combina preferiblemente con el valor para la isoforma cardiaca de troponina T y/o troponina I .Una troponina cardiaca preferida usada en combinación con el marcador endostatina es la troponina cardiaca T.

Marcador de inflamación

El experto en la técnica está familiarizado con el término marcador de inflamación. Los marcadores preferidos de inflamación son la interleuquina-6, la proteína C reactiva, el amiloide A sérico y una proteína S100.

La interleuquina-6 (IL-6) es una proteína secretada de 21 kDa que tiene numerosas actividades biológicas que se pueden dividir en aquellas implicadas en la hematopoyesis y en aquellas que participan en la activación de la respuesta inmune innata. La IL-6 es un reactivo de fase aguda y estimula la síntesis de una variedad de proteínas, incluyendo moléculas de adhesión. Su principal función es mediar la producción de fase aguda de proteínas hepáticas, y su síntesis es inducida por las citoquinas IL-1 y TNF-. La IL-6 es producida normalmente por los macrófagos y los linfocitos T. La concentración sérica normal de IL-6 es <5 pg/ml.

La proteína C reactiva (CRP) es una proteína homopentamérica de fase aguda de unión a Ca2+ con subunidades de 21 kDa que está implicada en la defensa del huésped. La síntesis de la CRP es inducida por la IL-6, e indirectamente por la IL-1, ya que la IL-1 puede desencadenar la síntesis de IL-6 por las células de Kupffer en los sinusoides hepáticos. La concentración plasmática normal de PCR es <3 g/ml (30 nM) en el 90% de la población sana y <10 g/ml (100 nM) en el 99% de los individuos sanos. Las concentraciones de CRP en plasma pueden, por ejemplo, medirse mediante amiloide A sérica (= SAA) que es una proteína de fase aguda de bajo peso molecular de 11,7 kDa. Se sintetiza predominantemente por el hígado en respuesta a la estimulación de IL-1, IL-6 o TNF-α y está implicada en la regulación de la respuesta inmune dependiente de células T. En los eventos agudos, la concentración de SAA aumenta hasta 1000 veces alcanzando un miligramo por mililitro. Se utiliza para controlar la inflamación en enfermedades como la fibrosis quística, rechazo de injerto renal, traumas o infecciones. En la artritis reumatoide se ha utilizado en algunos casos como un sustituto de la PCR, pero SAA todavía no está tan ampliamente aceptada.

Las proteínas S100 forman una familia en constante aumento de proteínas de unión a Ca2+ que hoy incluye más de 20 miembros. La estructura fisiológicamente relevante de las proteínas S100 es un homodímero, pero algunas también pueden formar heterodímeros entre sí, por ejemplo, S100A8 y S100A9. Las funciones intracelulares van desde la regulación de la fosforilación de proteínas, de las actividades enzimáticas, o de la dinámica del citoesqueleto a la participación en la proliferación y diferenciación celular. Como algunas proteínas S100 también se liberan de las células, se han descrito también funciones extracelulares, por ejemplo, supervivencia neuronal, proliferación de astrocitos, inducción de apoptosis y regulación de procesos inflamatorios. S100A8, S100A9, el heterodímero S100A8/A9 y S100A12 se han encontrado en la inflamación con S100A8 que responde a la inflamación crónica, mientras que S100A9, S100A8/A9 y S100A12 se incrementan en la inflamación aguda. S100A8, S100A9, S100A8/A9 y S100A12 se han relacionado con diferentes enfermedades con componentes inflamatorios incluyendo algunos tipos de cáncer, rechazo de aloinjerto renal, colitis y, lo que es más importante, a la AR (Burmeister, G. y Gallacchi, G., Inflammopharmacology 3 , (1995) 221-230; Foell, D., et al., Reumatology 42 (2003) 1383 -1389). Los marcadores S100 más preferidos para evaluar un individuo en riesgo de IC o un paciente que tiene IC, por ejemplo, para uso en una combinación de marcadores de acuerdo con la presente invención son S100A8, S100A9, el heterodímero S100A8/A9 y S100A12.

La sE-selectina (molécula de adhesión a leucocitos endotelial soluble 1, ELAM-1) es una glicoproteína transmembrana de tipo I de 115 kDa expresada sólo en células endoteliales y sólo después de la activación por citoquinas inflamatorias (IL-1β, TNF-α) o endotoxina. La E-selectina de la superficie celular es un mediador de la unión rodante de los leucocitos al endotelio, un paso esencial en la extravasación de leucocitos en el sitio de la inflamación, desempeñando así un papel importante en la respuesta inflamatoria localizada. La E-selectina soluble se encuentra en la sangre de individuos sanos, probablemente derivada de la escisión proteolítica de la molécula expresada en la superficie. Se han descrito niveles elevados de sE-selectina en suero en una variedad de estados patológicos (Gearing, A.J. y Hemingway, I., Ann. N. Y. Acad. Sci. 667 (1992) 324-331).

En una realización preferida, la presente invención se refiere al uso de endostatina como molécula marcadora para IC en combinación con una o más moléculas marcadoras para IC, en el que dicha una o más moléculas marcadoras se seleccionan del grupo que consiste en un marcador de péptido natriurético, un marcador de troponina cardiaca y un marcador de inflamación, en el diagnóstico de IC a partir de una muestra líquida obtenida de un individuo, donde dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en suero, plasma y sangre completa.

Como se indicó anteriormente, en un método preferido de acuerdo con la presente invención el valor medido para la endostatina se combina al menos con el valor de al menos otro marcador seleccionado del grupo que consiste en un marcador de péptido natriurético, un marcador de troponina cardiaca, y un marcador de inflamación.

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25

35

45

55

65

En una realización preferida, la presente invención se refiere al uso de la combinación de marcadores endostatina y NT-proBNP en el diagnóstico de insuficiencia cardíaca.

En una realización preferida, la presente invención se refiere al uso de la combinación de marcadores endostatina y troponina T en el diagnóstico de insuficiencia cardíaca.

También se describe el uso de la combinación de marcadores endostatina y PCR en la evaluación de la insuficiencia cardíaca.

También se describe una combinación de marcadores que comprende los marcadores endostatina, troponina T, NTproBNP y PCR. En aún otra realización preferida, la presente invención se refiere a un panel marcador utilizado en un método para diagnosticar IC in vitro mediante marcadores bioquímicos, que comprende medir en una muestra la concentración de endostatina y de uno o más marcadores diferentes de IC, en el que dicho marcador o marcadores adicionales se seleccionan del grupo que consiste en un marcador de péptido natriurético, un marcador de troponina cardiaca y un marcador de inflamación, y usando las concentraciones determinadas en el diagnóstico de IC.

Un panel marcador de acuerdo con la presente invención se mide preferiblemente utilizando una técnica de matriz o “array” de proteínas. Una matriz o “array” es una colección de marcadores individuales detectables. Dichos marcadores pueden detectarse espacialmente, tales como las matrices contenidas en placas de microtitulación o impresas en superficies planas donde cada marcador está presente en coordenadas X e Y distintas. Alternativamente, los marcadores pueden detectarse de acuerdo a etiquetas, perlas, nanopartículas o propiedades físicas. Los microarrays se pueden preparar de acuerdo con los métodos conocidos por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, el documento US 5.807.522, Robinson, WH, et al., Nat. Med. 8 (2002) 295-301 y Robinson, WH, et al. , Arthritis Rheum. 46 (2002) 885 -893). El chip como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier ensayo inmunológico con marcadores detectables múltiples. En una realización, los marcadores detectables son antígenos. En otra realización, los elementos detectables son autoanticuerpos. Un microarray es una forma miniaturizada de un “array”. El antígeno, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier molécula que pueda unirse específicamente a un anticuerpo. El término autoanticuerpo está bien definido en la técnica.

Una matriz o “array” de proteínas que comprende el marcador endostatina y opcionalmente uno o más marcadores de IC, en el que se describe dicho marcador se selecciona del grupo que consiste en un marcador de péptido natriurético, un marcador de troponina cardiaca y un marcador de inflamación.

También se describe una matriz de proteínas que comprende los marcadores endostatina y NT-proBNP.

También se describe una matriz de proteínas que comprende los marcadores endostatina y troponina T, una matriz de proteínas que comprende los marcadores endostatina y PRC, y una matriz de proteínas que comprende los marcadores endostatina, troponina T, NT-proBNP y PRC.

También se describe un equipo que comprende los reactivos necesarios para medir específicamente la endostatina. También se prefiere un equipo que comprende los reactivos requeridos para medir específicamente la endostatina y los reactivos necesarios para medir uno o más marcadores diferentes de insuficiencia cardíaca que se usan juntos en una combinación de marcadores de IC.

Los siguientes ejemplos, lista de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción del listado de secuencias

Id. de Sec. Nº: 1 Secuencia de aminoácidos de la isoforma corta de la cadena alfa 1 del colágeno humano de tipo

XVIII.

Descripción de las figuras

Figura 1 Endostatina medida en muestras de 37 pacientes con IC y 38 muestras de control, respectivamente. Las concentraciones en ng/ml se dan en el eje y. Las muestras derivadas de pacientes con insuficiencia cardíaca se denominan IC (IC = cuadrados) y SHN para controles sanos (suero humano normal = SHN = rombos), respectivamente.

Figura 2 La endostatina se midió en muestras de 37 pacientes con IC y 38 muestras de control, respectivamente. Los cuartiles se han calculado basándose en concentraciones en ng/ml, tanto para las muestras derivadas de pacientes con insuficiencia cardíaca, marcadas con IC (IC = cuadrados) y las muestras de controles sanos (suero humano normal = SHN = rombos), respectivamente. Los diagramas de cajas y bigotes muestran los cuartiles inferior y superior (cajas) así como los valores más altos y más bajos (bigotes).

Ejemplo 1

1.1 ELISA para la medición de endostatina en muestras de suero y plasma humano

5 Para la medición de la endostatina en suero o plasma humano, se utiliza un ELISA en sándwich disponible comercialmente (Quantikine Human Endostatin Immunoassay, Número de catálogo DNST0, R & D Systems). Las mediciones se realizan de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

1.2 ELISA de endostatina con sueros de pacientes con IC obtenidos de la rutina clínica y donantes aparentemente 10 sanos, respectivamente

Para evaluar adicionalmente la utilidad de los ensayos de endostatina en condiciones clínicas rutinarias se investiga un panel de sueros de pacientes con IC (n = 37 -ver Tabla 1) y de 38 sueros de pacientes control aparentemente sanos (ver Tabla 2) .

15

La Tabla 1 muestra el resultado para pacientes con insuficiencia cardiaca. Tabla 1:

Resultados de ELISA de endostatina (panel con muestras de IC procedentes de la rutina clínica) Muestras de insuficiencia cardiaca

Nº Muestra

Endostatina-ELISA [ng/ml]

5078

163,8

5084

274,1

5085

243,6

5100

147,6

5101

265,8

5104

200,1

5107

208,0

5112

203,4

5113

262,3

5114

158,3

5301

223,5

5311

355,7

5314

160,2

5328

146,2

5382

198,7

5388

169,1

5397

144,5

5410

142,4

5421

174,1

5423

135,7

5439

167,8

5444

220,2

5449

275,8

5451

253,5

5455

192,7

5464

284,0

5469

164,1

5472

173,8

5474

298,4

5481

281,0

5482

145,2

5483

141,6

5491

119,9

5495

206,6

5502

300,3

5516

252,5

5517

207,6

Media

207,1

La Tabla 2 muestra los resultados de endostatina para voluntarios sanos Tabla 2:

Resultados de ELISA de endostatina (muestras de controles sanos) SHN (controles sanos)

Nº

ELISA Endostatina [ng/ml]

Panel SHN 1

9 120,6

16

123,7

19

85,5

29

128,5

30

133,6

32

149,0

39

116,8

40

151,7

44

109,9

45

142,8

46

142,2

47

139,5

53

121,8

68

129,8

72

131,1

73

125,3

74

153,6

78

117,3

79

144,5

80

166,5

panel SHN 2

1 114,5

2

106,0

3

127,3

4

120,8

5

106,5

6

95,4

7

132,1

8

120,6

9

137,0

10

114,0

11

107,8

13

109,8

14

156,2

16

96,0

17

102,8

18

131,9

19

123,8

20

125,1

Media

125,3

5 Los datos resumidos en las Tablas 1 y 2, respectivamente, se muestran también gráficamente en la Figura 1. Los datos de estas Tablas también se han utilizado para calcular las gráficas en caja mostradas en la Figura 2. Las Figuras 1 y 2 demuestran que existe una diferencia considerable en los valores medios de endostatina, medidos en sueros derivados de pacientes con insuficiencia cardiaca en comparación con los valores de endostatina, medidos en sueros derivados de individuos control aparentemente sanos.

10

Ejemplo 2

Combinaciones de marcadores que comprenden el marcador endostatina en la evaluación de la insuficiencia cardíaca

15

Ejemplo 2.1

Combinación de marcadores NT-proBNP y endostatina

20 La combinación de marcador NT-proBNP y endostatina se evalúa para la diferenciación de pacientes en estadio B y estadios C más D, respectivamente. La precisión diagnóstica se evalúa analizando muestras líquidas individuales obtenidas de grupos de individuos bien caracterizados, es decir, 50 individuos en el estadio B de acuerdo con los

imagen10

Claims (1)

1. imagen1