ES2339284T3 - Utilizacion de nogo-c en la deteccion de la insufuciencia cardiaca. - Google Patents
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Abstract
Un método para valorar la insuficiencia cardíaca en un individuo que comprende los pasos de a) medir en una muestra obtenida del individuo la concentración de la proteína marcador Nogo-C, b) opcionalmente medir en la muestra la concentración de uno o más marcadores diferentes de insuficiencia cardíaca seleccionados de entre el grupo que consiste en un marcador de péptido natriurético, un marcador de troponina cardíaca y un marcador de inflamación, y c) valorar la insuficiencia cardíaca mediante la comparación de la concentración determinada en el paso (a) y opcionalmente las concentraciones determinadas en el paso (b) con la concentración de este marcador o estos marcadores como se ha establecido en una muestra control, en el que un aumento del nivel de proteína Nogo C es indicativo de insuficiencia cardíaca.
Description
Utilización de Nogo-C en la
detección de la insuficiencia cardíaca.
La presente invención está relacionada con un
método para valorar la insuficiencia cardíaca en un individuo que
comprende los pasos de a) medir en una muestra obtenida del
individuo la concentración del marcador Nogo-C, de
b) opcionalmente medir en la muestra la concentración de uno o más
marcadores diferentes de insuficiencia cardíaca, y de valorar la
insuficiencia cardíaca mediante la comparación de la concentración
determinada en el paso (a) y opcionalmente las concentraciones
determinadas en el paso (b) con la concentración de este marcador o
estos marcadores que se han establecido en una muestra control.
También se describe la utilización de Nogo-C como
proteína marcador en la valoración de la insuficiencia cardíaca, una
combinación de marcadores que comprende Nogo-C y un
equipo para la medida de Nogo-C.
La insuficiencia cardíaca (IC) es un importante
problema de salud pública que está en crecimiento. En los Estados
Unidos por ejemplo aproximadamente 5 millones de pacientes tienen IC
y a alrededor de 550.000 pacientes se les diagnostica IC por
primera vez cada año (En: American Heart Association, Heart Disease
and Stroke Statistics: 2005 Update, Dallas, Texas; American Heart
Association (2005)). De forma similar, las estadísticas de los
Estados Unidos muestran que la IC es la razón principal de entre 12
y 15 millones de visitas médicas y 6,5 millones de días de
hospitalización cada año. Entre 1990 y 1999, el número de
hospitalizaciones anuales ha aumentado de aproximadamente 810.000 a
alrededor de 1 millón de IC como diagnóstico principal y de 2,4 a
3,6 millones de IC como diagnóstico principal o secundario. En 2001,
cerca de 53.000 pacientes murieron de IC como causa primaria. La
insuficiencia cardíaca es esencialmente un estado propio de los
ancianos, y por lo tanto el ampliamente conocido "envejecimiento
de la población" también contribuye al aumento de la incidencia
de IC. La incidencia de IC es de alrededor de 10 de cada 1000 en la
población de más de 65 años. Sólo en los Estados Unidos, los costes
totales estimados directos e indirectos de la IC en el 2005 fueron
aproximadamente de 27,9 billones de dólares y se gastan
aproximadamente 2,9 billones de dólares anuales en fármacos para el
tratamiento de la IC (véase la estadística de la AHA citada
anteriormente).
La insuficiencia cardíaca se caracteriza por una
pérdida de la capacidad del corazón de bombear tanta sangre como el
cuerpo necesita. Insuficiencia no significa que el corazón deje de
bombear sino que falla el bombeo de sangre efectivo que sería
necesario.
Tanto la NYHA [New York Heart Association] como
la ACC/AHA [American Association of Cardiology/American Heart
Association] han establecido clases funcionales de IC para medir la
progresión de la enfermedad. El esquema de clasificación de la NYHA
consta de cuatro clases de estadios de enfermedad: la clase 1 es
asintomática a cualquier nivel de esfuerzo. La clase 2 es
sintomática con esfuerzo intenso y las clases III y IV son
sintomáticas con un esfuerzo ligero y sin esfuerzo,
respectivamente.
En el esquema de cuatro fases de la ACC/AHA, La
fase A es asintomática pero en riesgo de desarrollar una IC. En la
fase B existe evidencia de disfunción cardíaca sin síntomas. En la
fase C existe evidencia de disfunción cardíaca con síntomas. En la
fase D, el sujeto tiene síntomas de IC a pesar de una terapia
intensiva.
A nivel médico, la insuficiencia cardíaca (IC)
se debe apreciar como una enfermedad compleja. Puede estar causada
por la aparición de un evento desencadenante como un infarto de
miocardio (ataque al corazón) o ser secundario a otras causas como
la hipertensión, diabetes o malformaciones cardíacas como la
enfermedad valvular. El infarto de miocardio o otras causas de la
IC resultan en una disminución inicial de la capacidad de bombeo
del corazón, por ejemplo al dañarse la musculatura del corazón. Esta
disminución de la capacidad de bombeo puede no ser notoria
inmediatamente, debido a la activación de uno o más mecanismos de
compensación. Sin embargo, se ha descrito que la progresión de la
IC es independiente del estado hemodinámico del paciente. Por lo
tanto, los cambios nocivos causados por la enfermedad están
presentes y progresan incluso mientras el paciente permanece
asintomático. De hecho, los mecanismos de compensación que mantienen
la función cardiovascular normal durante las fases tempranas de la
IC pueden contribuir en realidad a la progresión de la enfermedad a
largo plazo, por ejemplo ejerciendo efectos deletéreos en el corazón
y su capacidad de mantener un nivel suficiente de flujo sanguíneo en
circulación.
Algunos de los cambios patofisiológicos más
importantes que aparecen en la IC son (i) la activación del eje
hipotalámico pituitario-adrenal, (ii) disfunción
endotelial sistémica y (iii) remodelado del miocardio.
(i) Las terapias específicamente dirigidas a
contrarrestar la activación del eje hipotalámico
pituitario-adrenal incluyen los agentes bloqueantes
beta-adrenérgicos
(\beta-bloqueantes), inhibidores de la enzima
convertidora de angiotensina (ACE), ciertos bloqueantes de los
canales de calcio, nitratos y agentes bloqueantes de la
endotelina-1. Los bloqueantes de los canales de
calcio y los nitratos, aunque provocan una mejora clínica no se ha
demostrado claramente que prolonguen la supervivencia, mientras que
se ha demostrado que los \beta-bloqueantes y los
inhibidores de la ACE prolongan significativamente la vida, así como
los antagonistas de la aldosterona. En estudios experimentales que
utilizan agentes bloqueantes de la endotelina-1 se
ha demostrado que éstos tienen un efecto beneficioso.
(ii) La disfunción endotelial sistémica es una
característica conocida de la IC y está claramente presente en el
momento en el que aparecen signos de disfunción ventricular
izquierda. La disfunción endotelial es importante respecto a la
importante relación de la microcirculación del miocardio con los
miocitos cardíacos. Evidencias sugieren que la disfunción
microvascular contribuye significativamente a la disfunción de los
miocitos y los cambios morfológicos que conducen a la insuficiencia
de miocardio progresiva. En términos de la patofisiología
subyacente, las evidencias sugieren que la disfunción endotelial
puede estar causada por una deficiencia relativa de NO, lo que
puede atribuirse a un incremento de la formación de O_{2} vascular
por una oxidasa dependiente de NADH y el subsiguiente exceso de
depuración de NO. Los factores que potencialmente contribuyen al
aumento de producción de O_{2} incluyen el aumento del tono
simpático, la norepinefrina, angiotensina II,
endotelina-1 y TNF-\alpha. Además,
los niveles de IL-10, una citoquina
anti-inflamatoria clave, son inadecuadamente bajos
en relación con los niveles de TNF-\alpha.
Actualmente se cree que los niveles elevados de
TNF-\alpha, con citoquinas proinflamatorias
asociadas, lo que incluye IL-6 y receptores
TNF-\alpha solubles, tienen un papel significativo
en la evolución de la IC al causar una disminución de la
contractilidad del miocardio, dilatación biventricular e
hipotensión, y probablemente están involucrados en la activación y
disfunción endotelial. También se cree que el
TNF-\alpha puede tener un papel en el hasta el
momento inexplicado desgaste muscular que aparece en los pacientes
de IC severo. Estudios preliminares en un bajo número de pacientes
con terapia de receptor del TNF soluble indican mejoras en la
clasificación funcional NYHA y en el bienestar del paciente, medido
mediante índices de calidad de vida.
(iii) El remodelado del miocardio es un proceso
complejo que acompaña la transición de insuficiencia cardíaca
asintomático a sintomático, y que puede describirse como una serie
de cambios adaptativos en el miocardio, como alteraciones en la
forma, masa y volumen ventricular (Piano, M.R., et al. J.
Cardiovasc. Nurs. 14 (2000) 1-23, quiz
119-120; Molkentin, J.D., Ann. Rev. Physiol. 63
(2001) 391-426). Los componentes principales del
remodelado del miocardio son las alteraciones en la biología de los
miocitos, como la hipertrofia de los miocitos, la pérdida de
miocitos por necrosis o apoptosis, alteraciones en la matriz
extracelular y alteraciones en la geometría de la cámara
ventricular. No está claro si el remodelado del miocardio es
simplemente la respuesta final del órgano que aparece tras años de
exposición a los efectos tóxicos de la estimulación neurohormonal a
largo plazo, o si el remodelado del miocardio contribuye
independientemente a la progresión de la insuficiencia cardíaca.
Las evidencias hasta la fecha sugieren que una terapia adecuada
puede ralentizar o detener la progresión del remodelado del
miocardio.
Como se ha indicado anteriormente, la
hipertrofia de los miocitos probablemente representa uno de los
primeros pasos que conducen a la IC. La hipertrofia de los miocitos
se caracteriza por un aumento de la expresión de algunos genes que
codifican proteínas contráctiles, como la cadena pesada de la
p-miosina y la troponina T (TnT), y de algunas
proteínas no contráctiles, como los péptidos natriuréticos de tipo A
y de tipo B, por un aumento del tamaño celular y por una alteración
del citoesqueleto (Piano, M.R., et al. J. Cardiovasc. Nurs.
14 (2000) 1-23, quiz 119-120;
Molkentin, J.D., Ann. Rev. Physiol. 63 (2001)
391-426).
Estudios de modelos humanos y animales de
insuficiencia cardíaca sugieren una función deprimida de los
miocitos en las fases tardías de la insuficiencia cardíaca. Se ha
sugerido que los mecanismos subyacentes a la disfunción de los
miocitos involucran alteraciones en la red de gestión del calcio,
los miofilamentos y el citoesqueleto (de Tombe, P.P., Cardiovasc.
Res. 37 (1998) 367-380). Por ejemplo, en los modelos
humanos y animales de la insuficiencia cardíaca, la actividad de la
enzima ATPasa dependiente de calcio del retículo endoplasmático
está reducida, mientras que tanto los niveles de mRNA como los de
proteína del intercambiador de Na+/Ca2+ sarcolemal están
aumentados. Además, Hay un cambio de isoformas de la TnT, una
fosforilación reducida de la troponina I (TnI), actividad reducida
de la ATPasa de la actomiosina miofibrilar y un aumento de la
formación de microtúbulos tanto en los modelos humanos como
animales de insuficiencia cardíaca.
Inicialmente los cambios en el corazón, que
conducen al remodelado del miocardio ocurren para compensar las
partes enfermas del miocardio para poder mantener la demanda
corporal de oxígeno y nutrientes. Sin embargo, la fase
compensatoria de la insuficiencia cardíaca es limitada, y en última
instancia, el corazón con insuficiencia es incapaz de mantener un
bombeo cardíaco adecuado para alcanzar las necesidades del
organismo. Por lo tanto, hay una transición de la fase
compensatoria a la fase descompensatoria. En la fase
descompensatoria, la cascada de cambios en el corazón continúa pero
ya no es beneficioso, y dirige la progresión de la insuficiencia
cardíaca del paciente hacia un estado crónico y finalmente a la
muerte.
De acuerdo con la "ACC/AHA 2005 Guideline
Update for the Diagnostic and Management of Chronic Cardiac Failure
in the Adult" (S. Hunt et al., www.acc.org = guías de
praxis de la ACC/AHA) el conjunto de enfermedades del área de la
insuficiencia cardíaca se agrupan actualmente en cuatro estadios
como se ha indicado anteriormente. En los estadios A y B se
encuentran los individuos con riesgo de desarrollar insuficiencia
cardíaca, mientras los estadios C y D representan los grupos de
pacientes que muestran signos y síntomas de insuficiencia
cardíaca.
Detalles para la definición de los diferentes
estadios de A a D se proporcionan en las anteriores referencias.
La prueba diagnóstica única más útil en la
evaluación de pacientes con IC es el ecocardiograma bidimensional
completo acoplado con estudios Doppler de flujo para determinar si
hay presentes anomalías del miocardio, válvulas cardíacas o
pericardio y qué cámaras están involucradas. Pueden investigarse
tres cuestiones fundamentales: 1) si la LVEF está conservada o
reducida, 2) si la estructura del LV es normal o anormal, y 3) si
existen otras anomalías estructurales como las anomalías valvulares,
pericárdicas o ventriculares derechas que puedan ser responsables
de la presentación clínica. Esta información debería cuantificarse
con una estimación numérica de la EF, medida de las dimensiones y/o
volúmenes ventriculares, medida del espesor de la pared y la
evaluación de la geometría de la cámara y el movimiento de regiones
de la pared. Deben evaluarse el tamaño del ventrículo derecho y el
funcionamiento sistólico. También debe determinarse el tamaño del
atrio de forma semicuantitativa y medirse las dimensiones y/o
volúmenes del atrio izquierdo.
Los datos hemodinámicos no invasivos adquiridos
en el momento de la ecocardiografía son importantes para una
correlación adicional en pacientes con una EF conservada o reducida.
La cuantificación combinada del patrón de entrada de flujo de la
válvula mitral, el patrón de entrada de flujo venoso pulmonar y la
velocidad anular mitral proporciona datos de las características
del llenado del LV y de la presión del atrio izquierdo. La
evaluación del gradiente regurgitante de la válvula tricúspide
acoplada con la medida de las dimensiones de la vena cava inferior
y su respuesta durante la respiración proporciona una estimación de
la presión arterial pulmonar sistólica y la presión venosa
central.
El volumen del infarto puede determinarse con
una combinación de la medida de la dimensión y Doppler pulsado en
el tracto de salida de flujo del LV. Sin embargo, las anormalidades
pueden presentarse en cualquiera de estos parámetros en ausencia de
IC. Ninguno de ellos se correlaciona necesariamente y
específicamente con la IC, sin embargo un patrón de llenado
totalmente normal no indicaría una IC clínica.
Desde una perspectiva clínica, la enfermedad es
clínicamente asintomática en las fases compensatoria y
descompensatoria temprana (completamente asintomática en la etapa A
y con enfermedad estructural cardíaca pero sin signos y síntomas de
IC en el estadio B, véanse las guías de praxis de la ACC/AHA). Los
signos externos de la enfermedad (como la falta de respiración) no
aparecen hasta que no se encuentra avanzada la fase descompensatoria
(es decir en los estadios C y D de acuerdo con las guías de la
ACC/AHA). Actualmente el diagnóstico se basa en los síntomas
externos de los pacientes en los estadios C y D.
Normalmente los pacientes con insuficiencia
cardíaca reciben un tratamiento estándar con fármacos que
interaccionan con mecanismos específicos involucrados en la
insuficiencia cardíaca. No existen pruebas diagnósticas que
reflejen estos mecanismos específicos de forma fiable y ayuden al
clínico en la elección del fármaco y dosis correctos para el
paciente correcto (por ejemplo, inhibidor de la ACE, AT II,
\beta-bloqueantes, etc).
La evaluación temprana de pacientes con riesgo
de padecer insuficiencia cardíaca parece posible sólo mediante
marcadores bioquímicos ya que los individuos con riesgo de
desarrollar insuficiencia cardíaca en esta etapa todavía no
presentan síntomas de IC clínica. No existen marcadores bioquímicos
establecidos disponibles actualmente para la evaluación fiable
pre-sintomática de la enfermedad. En el momento en
el que actualmente está establecido el diagnóstico de la IC, la
enfermedad ya se encuentra muy avanzada.
En los últimos años, se ha demostrado que la
familia del péptido natriurético, en especial la familia del péptido
natriurético atrial y la familia del péptido natriurético cerebral,
es de gran significación para la valoración de la IC.
Al menos parcialmente debido al diagnóstico
tardío, el 50% de los pacientes con IC mueren en los dos años
siguientes a su diagnóstico. La tasa de supervivencia a los 5 años
es inferior al 30%. Existe una gran necesidad de nuevos marcadores
bioquímicos que ayuden a establecer un diagnóstico temprano de la
insuficiencia cardíaca.
Parece claro que es necesaria una mejora en la
evaluación temprana de los individuos con riesgo de padecer
insuficiencia cardíaca, es decir, de los individuos que son
clínicamente asintomáticos para la insuficiencia cardíaca.
Recientemente se ha establecido que los
marcadores de péptido natriurético de tipo B representan una
herramienta excelente para el seguimiento de la progresión de la
enfermedad en pacientes con IC y para evaluar su riesgo de
complicaciones cardiovasculares, como el ataque al corazón.
Sin embargo, como en muchas otras áreas
diagnósticas un único marcador no es suficiente.
Mientras que los valores bajos de
NT-proBNP tienen un valor predictivo altamente
negativo para excluir una IC o LVD, el valor predictivo positivo de
insuficiencia cardíaca se ha encontrado en el rango del
50-60% en el estudio anterior y en otros (véase
Triepels RH, Busscher S, van der Burgh PH, Vermes I;
N-terminal probrain natriuretic peptide
(NT-proBNP) as screening test for early stage heart
failure; Clin Chem 2003; Vol 49:Nº 6; Supl. A37-8).
Por lo tanto, un marcador útil en la evaluación de los individuos
con riesgo de padecer insuficiencia cardíaca que por sí mismo o en
combinación con el NT-proBNP, y comparado con el
NT-proBNP sólo, posea un valor predictivo positivo
mejorado de la IC será de gran importancia clínica/práctica.
Un marcador que ayude en la valoración de un
paciente con insuficiencia cardíaca también es de gran importancia
para conseguir un progreso técnico adicional en esta área
diagnóstica clínicamente tan importante y exigente.
Se ha descrito y establecido que el marcador
Nogo-C puede ayudar en la valoración de la
insuficiencia cardíaca. En un aspecto, puede ayudar en la
evaluación de la progresión de la enfermedad. En otra realización,
puede ayudar en la predicción de la aparición de la insuficiencia
cardíaca. En otra realización puede ayudar en la evaluación y
selección de un régimen de tratamiento apropiado para prevenir o
tratar la insuficiencia cardíaca.
Aquí se describe un método para valorar la
insuficiencia cardíaca en un individuo que comprende los pasos de
medir en una muestra obtenida del individuo la concentración del
marcador Nogo-C, de medir opcionalmente en la
muestra la concentración de uno o más marcadores diferentes de
insuficiencia cardíaca, y de evaluar la insuficiencia cardíaca
mediante la comparación de la concentración de
Nogo-C y opcionalmente las concentraciones de uno o
más marcadores diferentes con la concentración de este marcador o
estos marcadores establecidas en una muestra control.
La invención también está relacionada con la
utilización de la proteína Nogo-C como molécula
marcador para la valoración de la insuficiencia cardíaca.
También se describe la utilización de una
combinación de marcadores que comprende Nogo-C y uno
o más marcadores diferentes de insuficiencia cardíaca para la
valoración de la insuficiencia cardíaca.
También se proporciona un equipo para realizar
el método para evaluar la insuficiencia cardíaca in vitro,
que comprende los pasos de medir en una muestra la concentración del
marcador Nogo-C, de medir opcionalmente en la
muestra la concentración de uno o más marcadores diferentes de
insuficiencia cardíaca, y de evaluar la insuficiencia cardíaca
mediante la comparación de la concentración de
Nogo-C y opcionalmente las concentraciones de uno o
más marcadores diferentes con la concentración de este marcador o
estos marcadores establecidas en una población de referencia. El
equipo comprende los reactivos necesarios para medir específicamente
Nogo-C y opcionalmente uno o más marcadores
diferentes de insuficiencia cardíaca.
En una primera realización, la presente
invención está relacionada con un método para valorar la
insuficiencia cardíaca en un individuo que comprende los pasos de
a) medir en una muestra obtenida del individuo la concentración del
marcador Nogo-C, b) opcionalmente medir en la
muestra la concentración de uno o más marcadores diferentes de
insuficiencia cardíaca, y c) evaluar la insuficiencia cardíaca
mediante la comparación de la concentración determinada en el paso
(a) y opcionalmente las concentraciones determinadas en el paso (b)
con la concentración de este marcador o estos marcadores
establecidas en una muestra control.
Como se utiliza aquí, cada uno de los siguientes
términos posee el significado que se le asocia en esta sección.
Los artículos "un" y "una" se utilizan
aquí para referirse a uno o más de uno (es decir a al menos uno) del
objeto gramatical del artículo. Por ejemplo, "un anticuerpo"
significa un anticuerpo o más de un anticuerpo.
La expresión "uno o más" indica de 1 a 50,
preferiblemente de 1 a 20, también preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9, 10, 12 o 15.
El término "marcador" o "marcador
bioquímico" como se utiliza aquí se refiere a una molécula que se
va a utilizar como diana para analizar una muestra de prueba de un
paciente. En una realización, ejemplos de tales dianas moleculares
son las proteínas o polipéptidos. Las proteínas o polipéptidos
utilizados como marcador en la presente invención se contempla que
incluyan las variantes que aparecen naturalmente de dicha proteína
así como fragmentos de dicha proteína o dicha variante, en
particular, los fragmentos detectables inmunológicamente. Los
fragmentos detectables inmunológicamente preferiblemente comprenden
al menos 6, 7, 8, 10, 12, 15 o 20 aminoácidos contiguos de dicho
polipéptido marcador. Un experto en la materia reconocerá que las
proteínas que son liberadas por las células o presentes en la
matriz extracelular pueden estar dañadas, por ejemplo, durante la
inflamación, y pueden estar degradadas o escindidas en tales
fragmentos. Ciertos marcadores se sintetizan en forma inactiva, que
subsiguientemente pueden activarse mediante proteólisis. Como el
experto apreciará, las proteínas o fragmentos de las mismas también
pueden estar presentes como parte de un complejo. Tal complejo
también puede utilizarse como marcador en el sentido de la presente
invención. Las variantes de un polipéptido marcador están
codificadas por el mismo gen, pero pueden diferir en su punto
isoeléctrico (= PI) o peso molecular (= PM), o en ambos, por
ejemplo como resultado de un procesado alternativo del mRNA o
pre-mRNA. La secuencia de aminoácidos de una
variante es idéntica en un 95% o más de la secuencia del marcador
correspondiente. Además, alternativamente un polipéptido marcador o
una variante del mismo puede poseer una modificación
post-traduccional. Las modificaciones
post-traduccionales preferibles son la
glucosilación, acilación y/o fosforilación.
El término "evaluar la insuficiencia
cardíaca" se utiliza para indicar que el método de acuerdo con la
presente invención ayudará al clínico a evaluar si un individuo
tiene riesgo de desarrollar una insuficiencia cardíaca, o ayudará
al clínico a evaluar un paciente con IC en una o varias áreas
diferentes de relevancia diagnóstica en la IC. Las áreas
preferibles de relevancia diagnóstica en la evaluación de un
individuo con IC son la determinación del estadio de la
insuficiencia cardíaca, el diagnóstico diferencial de insuficiencia
cardíaca aguda y crónica, juzgar el riesgo de progresión de
enfermedad, las guías para la selección de un fármaco adecuado, la
monitorización de la respuesta a la terapia y el seguimiento de los
pacientes con IC.
Un "marcador de insuficiencia cardíaca" en
el sentido de la presente invención es cualquier marcador que si se
combina con el marcador Nogo-C añade información
relevante para la valoración de la IC a la cuestión diagnóstica que
se investiga. La información se considera relevante o de valor
añadido si a una especificidad dada la sensibilidad, o si a una
sensibilidad dada la especificidad, respectivamente, de la
evaluación de la IC puede mejorarse incluyendo dicho marcador en
una combinación de marcadores que ya comprende el marcador
Nogo-C. Preferiblemente, la mejora de la
sensibilidad o especificidad, respectivamente, es estadísticamente
significativa con un nivel de significación de p = 0,05, 0,02, 0,01
o inferior. Preferiblemente, el o los marcadores diferentes de
insuficiencia cardíaca se seleccionan de entre el grupo que consiste
en un marcador de péptido natriurético, una troponina cardíaca y un
marcador de inflamación.
El término "muestra" como se utiliza aquí
se refiere a una muestra biológica obtenida con el propósito de su
evaluación in vitro. En los métodos de la presente invención,
la muestra o muestra del paciente preferiblemente puede comprender
cualquier fluido corporal. Las muestras de prueba preferibles
incluyen sangre, suero, plasma, orina, saliva y líquido sinovial.
Las muestras preferibles son sangre total, suero, plasma o líquido
sinovial, siendo el plasma o suero el tipo más conveniente de
muestra. Como el experto en la materia apreciará, cualquier
evaluación de este tipo se realiza in vitro. La muestra del
paciente se descarta después de ello. La muestra del paciente
solamente se utiliza para el método in vitro de la invención
y el material de la muestra del paciente no se transfiere de nuevo
al cuerpo del paciente. Normalmente, la muestra es una muestra
líquida, por ejemplo, sangre total, suero o plasma.
La expresión "comparar la concentración... con
la concentración establecida en una muestra control" se utiliza
simplemente para ilustrar más claramente lo que ya es obvio para el
experto en la materia. La muestra control puede ser una muestra
control interno o externo. En una realización se utiliza una muestra
control interno, es decir los niveles de marcador(es) se
evalúan en la muestra de prueba, así como en uno o más de las otras
muestras tomadas del mismo sujeto para determinar si existen cambios
en los niveles de dicho(s) marcador(es). En otra
realización, se utiliza una muestra control externo. Con una muestra
control externo, se compara la presencia o cantidad de un marcador
en una muestra derivada del individuo con su presencia o cantidad en
un individuo que se sabe que padece o que está en riesgo de una
enfermedad determinada; o un individuo que se sabe que no padece
una enfermedad determinada, es decir, un "individuo normal".
Por ejemplo, el nivel de un marcador en una muestra del paciente
puede compararse con un nivel conocido que se asocia con un curso
específico de enfermedad en la IC. Normalmente, el nivel de marcador
en la muestra se correlaciona directamente o indirectamente con un
diagnóstico y el nivel de marcador se utiliza por ejemplo para
determinar si un individuo tiene riesgo de padecer IC.
Alternativamente, el nivel de marcador en la muestra por ejemplo
puede compararse con el nivel de un marcador que se sabe está
asociado con una respuesta a la terapia en los pacientes con IC,
para establecer un diagnóstico diferencial de insuficiencia cardíaca
aguda y crónica, para guiarse en la selección de un fármaco
apropiado para tratar la IC, para juzgar el riesgo de progresión de
la enfermedad, o para el seguimiento de pacientes de IC.
Dependiendo de la utilización diagnóstica que se pretenda aplicar
se escoge una muestra control apropiada y un valor control o
referencia para el marcador establecido. El experto en la materia
apreciará que tal muestra control en una realización se obtendrá de
una población de referencia que tenga el mismo patrón de edad y
esté libre de enfermedades que puedan confundirse. También será
claro para el experto en la materia que los valores absolutos del
marcador establecidos en una muestra control dependerán del ensayo
utilizado. Preferiblemente, se utilizan muestras de 100 individuos
bien caracterizados de la población de referencia apropiada para
establecer un valor control (referencia). También preferiblemente
debe escogerse la población de referencia de forma que consista en
20, 30, 50, 200, 500 o 1000 individuos. Los individuos sanos
representan una población de referencia preferible para establecer
un valor control. En una realización, la muestra control será una
muestra control interno. En esta realización, se obtienen muestras
seriadas del individuo que se está investigando y se comparan los
niveles de marcador.
El método de acuerdo con la presente invención
se basa en una muestra líquida que se obtiene de un individuo y en
la medida de Nogo-C en esta muestra. Un
"individuo" como se utiliza aquí se refiere a un único
organismo humano o no humano. Por lo tanto, los métodos y
composiciones descritas aquí pueden aplicarse tanto a enfermedades
humanas como veterinarias. Preferiblemente, el individuo es un ser
humano.
Los reticulones (RTN) son una familia de
proteínas que primariamente están asociadas con el retículo
endoplasmático. En mamíferos, se han identificado cuatro genes y se
denominan rtn1, 2, 3 y el inhibidor del sobrecrecimiento de las
neuritas rtn4-A/Nogo-A. Estos genes
generan múltiples isoformas que contienen un dominio
C-terminal en común de homología entre reticulones
de 150-200 residuos aminoacídicos. Las regiones
N-terminales de los RTN son altamente variables, y
resultan de un procesado alternativo o de la utilización diferencial
del promotor. Aunque están ampliamente distribuidos, las funciones
de los RTN todavía no están claras.
El m-RNA de
rtn-4 se ha encontrado sobreexpresado en uno de los
dos modelos en ratón de hipertrofia cardíaca (Rajan, S. et
al., Physiol. Genomics 27 (2006) 309-317).
Se conocen tres isoformas diferentes de Rtn4 o
Nogo (A, B y C) que se originan de un único gen, debido tanto a una
utilización alternativa del promotor como a un procesado
alternativo. Nogo-A se identificó por primera vez
como un inhibidor de la regeneración nerviosa que se libera tras una
lesión por la vaina de mielina alrededor del axón y que se denominó
asó por los comandos "go"/"no go" (Savio y Schwab 1990,
P.N.A.S. 87:413).
Existen al menos tres dominios funcionales
diferentes presentes en Nogo-A. La región
N-terminal común entre Nogo-A y B
está involucrada en la inhibición de la expansión de fibroblastos.
Una región central presente sólo en Nogo-A
restringe el sobrecrecimiento de las neuritas, la expansión celular
e induce el colapso del cono de crecimiento. Una región
C-terminal común en todas las variantes de procesado
con la señal de retención en el retículo endoplasmático posee una
función de colapso del cono de crecimiento (Oertle et al.,
2003 J. Neurosci. 23, 5393). Las tres isoformas Nogo comparten dos
tramos hidrofóbicos altamente conservados (de 35 y 36 aminoácidos)
que podrían formar un canal en el RE y/o en la superficie celular
(Dodd et al., 2005 JBC 280 (13): 12494). Las tres variantes
de procesado Nogo muestran diferentes patrones de expresión en
relación al desarrollo y a la morfología (Oertle et al.,
2003 J. Mol. Biol. 325, 299) y, por lo tanto, es probable que tengan
diferentes papeles biológicos o diferentes funciones biológicas.
Nogo-A es uno de los diferentes
componentes inhibitorios del crecimiento de las neuritas presentes
en los oligodendrocitos y las membranas de mielina del sistema
nervioso central. A nivel molecular, se ha demostrado que varias
regiones distintas de Nogo-A disparan la inhibición
del crecimiento de las neuritas (Oertle et al, 2003: J
Neurosci. 2003 23(13):5393-406). La
inactivación in vivo de Nogo-A mediante
anticuerpos neutralizadores da lugar a una regeneración mejorada y
una mayor recuperación funcional tras una lesión en la médula
espinal (Liebscher et al, 2005 Ann Neurol 58: 706).
La US 5.684.133 describe la utilización
terapéutica de los anticuerpos monoclonales IN-1 y
IN-2 (que reconocen Nogo-A) para la
reducción del daño nervioso resultante por ejemplo de un trauma y
los desórdenes degenerativos del sistema nervioso central.
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es la
enfermedad de las neuronas motoras más común en humanos adultos y
causa la degeneración de las neuronas motoras, atrofia progresiva
del músculo esquelético, parálisis y la muerte tras entre
1-5 años de su aparición. Los pacientes con ELA
esporádica expresan grandes cantidades de Nogo-A
(Dupuis et al, 2002 Neurobiol Dis 10: 358). Además, los
niveles de Nogo-A en el músculo en los pacientes de
ELA son superiores en las fibras de contracción lenta atrofiadas y
se correlacionan con la gravedad de la disfunción motora (Jokic
et al, 2005 Ann Neurol 57:553). La WO 2004001069A2 describe
la aplicación diagnóstica de los genes RTN3 y RTN4, las sondas y
anticuerpos específicos de dichas isoformas, y su utilización, en
particular para el diagnóstico y/o la monitorización del desarrollo,
posiblemente durante un tratamiento terapéutico, de un estado
relacionado con un trastorno neuromuscular como la esclerosis
lateral amiotrófica.
Aunque al menos algunas de las funciones
biológicas de Nogo-A se han identificado, los roles
y funciones de las otras dos isoformas Nogo (Nogo-B
y Nogo-C, respectivamente) permanecen virtualmente
desconocidas.
Nogo-B muestra un amplio patrón
de expresión (Huber et al., 2002 J. Neuroscience
22(9):3553). En una aproximación proteómica se descubrió que
Nogo-B se encuentra enriquecido en subfracciones de
la membrana de las células endoteliales. Se ha hipotetizado que
Nogo-B puede funcionar como un regulador de la
migración celular y el remodelado vascular tras una lesión (Acevedo
et al., 2004 Nature Medicine 10 (4):382). Otros informes
discrepantes hablan de un papel opcional
pro-apoptótico de Nogo-B (Oertle
et al., 2003 Oncogene 22: 1390).
Nogo-C está regulado
positivamente en el músculo esquelético tras el nacimiento (Fergani
et al., 2005 Neurodegenerative Dis 2:185). También se ha
descrito que Nogo-C se expresa en cerebro y corazón
(Huber et al., 2002 J. Neuroscience 22(9):3553). Se
ha atribuido un papel pro-apoptótico a
Nogo-C (Chen et al. 2006 BBRC 348:923). La WO
2001/036631 describe la expresión recombinante del polipéptido
Nogo-C.
Preferiblemente, el marcador
Nogo-C se mide específicamente de una muestra
líquida mediante el uso de un agente de unión específico, es decir
el ensayo utilizado para medir Nogo-C comprende al
menos un agente de unión específico que no es reactivo con otras
rnt y no es reactivo con Nogo-B y
Nogo-A, respectivamente. Preferiblemente, tal
ensayo utiliza al menos un agente de unión que se une
específicamente a un epítopo comprendido en el tramo de secuencia
de aminoácidos N-terminal entre el aminoácido 1 y el
11 del Id. de Sec. Nº 1, es decir a un epítopo comprendido en la
secuencia exclusiva de Nogo-C. Como el experto en la
materia apreciará, en algunos ensayos, por ejemplo en un
inmunoensayo de tipo sándwich, tal agente de unión específico puede
combinarse con un anticuerpo que se une a un epítopo en la región de
los aminoácidos de 12 a 209 (todas las posiciones corresponden a
las posiciones que se proporcionan en el Id. de Sec. Nº 1). En
ciertas realizaciones puede ser preferible utilizar dos o más
agentes de unión específicos, cada uno de ellos con una unión
específica a un epítopo comprendido en el tramo de la secuencia de
aminoácidos desde el aminoácido 1 al 11 o con al menos algunos
aminoácidos, por ejemplo los aminoácidos 9, 10 y/o 11 formando parte
de su epítopo, es decir a un epítopo comprendido en la secuencia
exclusiva de Nogo-C. Por supuesto, en este caso al
menos dos epítopos diferentes y mutuamente excluyentes deben estar
unidos a estos agentes de unión específicos.
Un agente de unión específico es, por ejemplo,
un receptor de Nogo-C, una lectina que se une a
Nogo-C o un anticuerpo contra
Nogo-C. Un agente de unión específico posee al menos
una afinidad de 10^{7} l/mol por su correspondiente molécula
diana. El agente de unión específico preferiblemente posee una
afinidad de 10^{8} l/mol o incluso más preferiblemente de
10^{9} l/mol por su molécula diana. Como el experto en la materia
apreciará el término específico se utiliza para indicar que otras
biomoléculas presentes en la muestra no se unen significativamente
al agente de unión específico de Nogo-C.
Preferiblemente, el nivel de unión a una biomolécula diferente de
la molécula diana resulta en una afinidad de unión que es sólo del
10% o inferior, más preferiblemente sólo del 5% o inferior respecto
de la afinidad por la molécula diana, respectivamente. Un agente de
unión específico preferible cumplirá tanto el anterior criterio
mínimo de afinidad como el de especificidad.
Un agente de unión específico preferiblemente es
un anticuerpo reactivo con Nogo-C. El término
anticuerpo se refiere a un anticuerpo policlonal, un anticuerpo
monoclonal, fragmentos de unión del antígeno de tales anticuerpos,
anticuerpos de cadena sencilla así como a construcciones genéticas
que comprenden el dominio de unión de un anticuerpo.
Puede utilizarse cualquier fragmento de
anticuerpo que mantenga los anteriores criterios de un agente de
unión específico. Los anticuerpos se generan mediante
procedimientos técnicos actuales, por ejemplo, como los descritos
en Tijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays,
Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam (1990), el libro
completo, pero en especial las páginas 43-78).
Además, el experto en la materia será consciente de los métodos
basados en inmunosorventes que pueden utilizarse para el aislamiento
específico de anticuerpos. Mediante estos métodos pueden mejorarse
la calidad de los anticuerpos policlonales y por lo tanto puede
mejorarse su funcionamiento en los inmunoensayos (Tijssen, P.,
supra, págs. 108-115).
Pueden utilizarse anticuerpos policlonales
obtenidos a partir de conejos para los resultados descritos en la
presente invención. Sin embargo, claramente también pueden
utilizarse anticuerpos policlonales de diferentes especies, por
ejemplo, ratas o conejillos de indias, así como anticuerpos
monoclonales. Como los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse en
cualquier cantidad necesaria con propiedades constantes, representan
herramientas ideales en el desarrollo de un ensayo para la rutina
clínica. La generación y la utilización de anticuerpos monoclonales
contra Nogo-C en un método de acuerdo con la
presente invención, respectivamente, representan otras realizaciones
adicionales preferibles.
Como el experto en la materia apreciará,
Nogo-C se ha identificado como un marcador que es
útil para la valoración de la IC, pero pueden utilizarse formas
alternativas para conseguir un resultado comparable a los logros de
la presente invención. Por ejemplo, pueden utilizarse estrategias
alternativas para generar anticuerpos. Tales estrategias comprenden
entre otras la utilización de péptidos sintéticos, que representan
un epítopo de Nogo-C para la inmunización.
Alternativamente, puede utilizarse la inmunización con DNA también
conocida como vacunación con DNA.
Para la medida de la muestra líquida obtenida
del individuo, ésta se incuba con el agente de unión específico de
Nogo-C bajo condiciones apropiadas para la formación
de un complejo del agente de unión y Nogo-C. No es
necesario especificar tales condiciones, ya que el experto en la
materia puede identificar fácilmente tales condiciones de
incubación apropiadas sin ningún esfuerzo inventivo. La cantidad de
complejo del agente de unión y Nogo-C se mide y se
utiliza para la valoración de la IC. Como el experto en la materia
apreciará existen numerosos métodos para medir la cantidad del
complejo de agente de unión específico y Nogo-C,
todos ellos descritos en detalle en libros de texto de relevancia
(véase por ejemplo, Tijssen P., supra, o Diamandis, E.P. y
Christopoulos, T.K. (Ed.), Immunoassay, Academic Press, Boston
(1996)).
Preferiblemente Nogo-C se
detecta en un formato de ensayo de tipo sándwich. En tal ensayo se
utiliza, por un lado un primer agente de unión específico para
capturar Nogo, y por otro lado se utiliza un segundo agente de
unión específico, que está marcado para que sea detectable
directamente o indirectamente. Preferiblemente, se utiliza un
anticuerpo contra Nogo-C en un inmunoensayo
cualitativo (presencia o ausencia de Nogo-C) o
cuantitativo (se determina la cantidad de
Nogo-C).
Como se describe en detalle en la sección de
Ejemplos, se han utilizado dos modelos de ratón para identificar
polipéptidos que se encuentran en el tejido del corazón de animales
de laboratorio mediante métodos de proteómica avanzada. Sin embargo
estos modelos dieron lugar al menos parcialmente a datos
contradictorios, y por supuesto, los datos de polipéptidos en los
tejidos no son representativos de la presencia o ausencia de estos
polipéptidos en la circulación. Un marcador que se encontró se
expresaba de forma diferencial en un modelo podía no expresarse de
forma diferencial en un segundo modelo o incluso mostrar datos
contradictorios en otro modelo adicional. Incluso si una proteína
puede expresarse de forma diferencial en un tejido esta proteína en
la mayoría de los casos no tiene ninguna relevancia diagnóstica si
se mide a partir de un fluido corporal, ya que puede no liberarse a
la circulación, puede resultar fragmentada o modificada, por
ejemplo, tras su liberación desde una célula o tejido, puede no ser
estable en la circulación, puede no ser medible en la circulación,
puede no ser específica para una enfermedad dada, etc.
Los inventores de la presente invención, de
forma sorprendente, pueden detectar la proteína
Nogo-C en una muestra de fluido corporal. Incluso
más sorprendentemente pueden demostrar que la presencia de
Nogo-C en tal muestra líquida obtenida de un
individuo puede correlacionarse con la IC. No son necesarias
muestras de tejido o biopsias para poder utilizar el marcador
Nogo-C para la valoración de la IC. La medida del
nivel de proteína Nogo-C se considera muy ventajosa
en el campo de la IC.
En una realización preferible, el método de
acuerdo con la presente invención se lleva a la práctica con suero
como material de muestra líquido. En otra realización preferible, el
método de acuerdo con la presente invención se lleva a la práctica
con plasma como material de muestra líquido. En otra realización
preferible, el método de acuerdo con la presente invención se lleva
a la práctica con sangre total como material de muestra líquido.
En otra realización preferible, la presente
invención está relacionada con la utilización de proteína
Nogo-C como molécula marcadora para la valoración de
la insuficiencia cardíaca a partir de una muestra líquida obtenida
de un individuo.
El escenario ideal para el diagnóstico sería una
situación en la que un único evento o proceso causaría la
respectiva enfermedad como, por ejemplo, en las enfermedades
infecciosas. En el resto de casos un diagnóstico correcto puede ser
muy difícil, especialmente cuando la etiología de la enfermedad no
se comprende completamente como es el caso de la IC. Como el
experto en la materia apreciará, no hay un marcador bioquímico en el
campo de la IC que sea diagnóstico con un 100% de especificidad y
al mismo tiempo con un 100% de sensibilidad para una determinada
cuestión diagnóstica. En lugar de ello, se utilizan los marcadores
bioquímicos para evaluar con cierta probabilidad o valor predictivo
una cuestión diagnóstica subyacente. Los métodos
matemáticos/estadísticos que se utilizan de forma rutinaria para
calcular el riesgo relativo o la probabilidad de una cuestión
diagnóstica a evaluar serán completamente familiares para el
experto en la materia. En la práctica clínica rutinaria,
generalmente varios síntomas clínicos y marcadores biológicos son
considerados en conjunto por el médico al cargo del diagnóstico,
tratamiento y gestión de la enfermedad subyacente.
Preferiblemente, en otra realización preferible
de la presente invención el método de evaluación de la IC se realiza
midiendo la concentración de Nogo-C y de uno o más
marcadores diferentes y utilizando la concentración de
Nogo-C y de uno o más marcadores diferentes para la
valoración de la IC.
Para la valoración de la IC, el marcador
Nogo-C ayudará al médico en uno o más de los
siguientes aspectos: evaluar el riesgo de un individuo de sufrir
insuficiencia cardíaca o evaluar un paciente con insuficiencia
cardíaca, por ejemplo, con la intención de identificar el estadio de
la insuficiencia cardíaca, diferenciar entre una insuficiencia
cardíaca aguda y crónica, juzgar el riesgo de progresión de la
enfermedad, proporcionar una guía en la selección de una terapia
apropiada, monitorizar la respuesta de un paciente a la terapia, y
monitorizar el curso de la enfermedad, es decir, en el seguimiento
de pacientes con IC.
En una realización preferible, la presente
invención está relacionada con un método in vitro para
valorar un individuo con riesgo de padecer insuficiencia cardíaca
que comprende los pasos de medir en una muestra la concentración
del marcador Nogo-C, de medir opcionalmente en la
muestra la concentración de uno o más marcadores diferentes de
insuficiencia cardíaca, y de evaluar el riesgo de dicho individuo de
sufrir insuficiencia cardíaca mediante la comparación de la
concentración de Nogo-C y opcionalmente las
concentraciones determinadas opcionalmente de uno o más marcadores
diferentes con la concentración de este marcador o estos marcadores
en su o sus valores de
referencia.
referencia.
Cribado en el sentido de la presente invención
está relacionado con la evaluación de individuos con riesgo de
padecer insuficiencia cardíaca. Como se ha discutido anteriormente,
estos individuos son clínicamente asintomáticos, es decir no
muestran signos o síntomas de IC. Los individuos con riesgo de
desarrollar una insuficiencia cardíaca se encuentran en los
estadios A o B como se define en las guías de praxis de la
ACC/AHA.
Como se ha mencionado anteriormente, la
insuficiencia cardíaca es una de las enfermedades de mayor
prevalencia, coste y que pone en peligro la vida del paciente en
los países desarrollados. Debido a su elevada prevalencia y su
larga fase asintomática en la identificación de individuos con
riesgo de padecer una IC en desarrollo sería de capital importancia
poder intervenir y si es posible interrumpir el curso de la
enfermedad. Sin una evaluación del riesgo prematura, la prevención
de la progresión de la enfermedad desde el estado asintomático a la
fase sintomática de la IC parece imposible.
El riesgo de insuficiencia cardíaca se valora
mediante métodos matemáticos/estadísticos muy conocidos y
comprensibles para el experto en la materia. Preferiblemente, el
riesgo de un individuo de sufrir insuficiencia cardíaca se expresa
en términos relativos y se proporciona el denominado riesgo relativo
(= RR). Para calcular tal RR de insuficiencia cardíaca, se compara
el valor de un individuo de Nogo-C con los valores
establecidos de Nogo-C en una población de
referencia, preferiblemente individuos sanos que no están
desarrollando insuficiencia cardíaca. También preferible la
evaluación de tal RR de insuficiencia cardíaca se basa en un grupo
de individuos que han desarrollado insuficiencia cardíaca durante
el periodo de estudio, preferiblemente a lo largo de uno o también
preferiblemente a lo largo de dos años, y un grupo de individuos que
no desarrollaron insuficiencia cardíaca en el mismo periodo de
estudio.
En otra realización preferible, la presente
invención está relacionada con la utilización del marcador
Nogo-C en el cribado de la insuficiencia
cardíaca.
\newpage
Preferiblemente, el cribado de la IC se
realizará en individuos de os que se sospecha que están en riesgo
de sufrir una insuficiencia cardíaca en el futuro. Los pacientes con
riesgo de sufrir una insuficiencia cardíaca en el futuro, en este
sentido, son pacientes a los que se ha diagnosticado de
hipertensión, enfermedad aterosclerótica, diabetes, obesidad y
síndrome metabólico. Preferiblemente, el riesgo de sufrir
insuficiencia cardíaca en el futuro se valora en individuos que
sufren hipertensión, enfermedad aterosclerótica, diabetes y/o
síndrome metabólico.
También es preferible la utilización del
marcador Nogo-C en la valoración del riesgo de
sufrir insuficiencia cardíaca en el futuro en un individuo en
estadio B de acuerdo con las guías de praxis de la ACC/AHA, es
decir, un individuo que muestra un cambio estructural en el corazón
pero no presenta síntomas de insuficiencia cardíaca.
En otra realización preferible, la presente
invención está relacionada con la utilización de
Nogo-C como marcador único de la IC o en una
combinación de marcadores de la IC con propósito de realizar un
cribado.
En el marco de un cribado un nivel elevado de
Nogo-C es un indicador positivo de un riesgo
aumentado del individuo de desarrollar una insuficiencia
cardíaca.
En una realización preferible, la presente
invención está relacionada con un método in vitro de ayuda en
la asignación del estadio en pacientes de insuficiencia cardíaca,
que comprende los pasos de a) medir en una muestra la concentración
del marcador Nogo-C, de b) opcionalmente medir en la
muestra la concentración de uno o más marcadores diferentes de
insuficiencia cardíaca, y asignar el estadio de insuficiencia
cardíaca mediante la comparación de la concentración determinada en
el paso (a) y opcionalmente las concentraciones determinadas en el
paso (b) con la concentración de este marcador o estos marcadores en
su o sus valores de referencia. Preferiblemente, se utiliza el
nivel de marcador Nogo-C como apoyo en la
clasificación de los individuos investigados en grupos de
individuos que son clínicamente "normales" (es decir,
individuos en estadio A de acuerdo con la clasificación de la
ACA/ACC), pacientes asintomáticos con enfermedad estructural del
corazón (estadio B de acuerdo con la clasificación de la ACA/ACC) y
el grupo de pacientes con insuficiencia cardíaca (es decir,
pacientes en estadio C o estadio D de acuerdo con la clasificación
de la ACA/ACC).
En una realización preferible, la presente
invención está relacionada con un método in vitro que ayuda
al diagnóstico diferencial entre un episodio cardíaco agudo y
enfermedad cardíaca crónica, que comprende los pasos de medir en
una muestra la concentración del marcador Nogo-C,
opcionalmente de medir en la muestra la concentración de uno o más
marcadores diferentes de insuficiencia cardíaca, y establecer un
diferencial diagnóstico entre un episodio cardíaco agudo y
enfermedad cardíaca crónica mediante la comparación de la
concentración determinada en el paso (a) y opcionalmente las
concentraciones determinadas en el paso (b) con la concentración de
este marcador o estos marcadores en su o sus valores de
referencia.
El experto en la materia está familiarizado con
el significado de "episodio cardíaco agudo" y de "enfermedad
cardíaca crónica".
Preferiblemente, un "episodio cardíaco
agudo" está relacionado con un estado, enfermedad o disfunción
del corazón aguda, particularmente con la insuficiencia cardíaca
aguda, por ejemplo, el infarto de miocardio (IM) o la arritmia.
Dependiendo de la extensión de un IM, puede continuar por LVD y
CHF.
Preferiblemente, una "enfermedad cardíaca
crónica" es un debilitamiento de la función del corazón debido,
por ejemplo, a isquemia del corazón, enfermedad arterial coronaria,
o infartos de miocardio previos, particularmente leves
(posiblemente seguido de LVD en progresión). También puede haber un
debilitamiento debido a enfermedades inflamatorias, defectos en las
válvulas del corazón (por ejemplo, defectos en la válvula mitral),
cardiomiopatías dilatativas, cardiomiopatía hipertrófica, defectos
en el ritmo del corazón (arritmias), y enfermedad pulmonar
obstructiva crónica. Por lo tanto, queda claro que una enfermedad
cardíaca crónica también puede incluir pacientes que han sufrido de
un síndrome coronario agudo, por ejemplo, IM, pero que actualmente
no están sufriendo un episodio cardíaco
agudo.
agudo.
Es importante diferenciar entre un episodio
cardíaco agudo y enfermedad cardíaca crónica, ya que un episodio
cardíaco agudo y una enfermedad cardíaca crónica pueden requerir
regímenes de tratamiento bastante diferentes. Por ejemplo, para un
paciente que presenta un infarto de miocardio agudo el tratamiento
inicial para la reperfusión puede ser de importancia vital.
Mientras un tratamiento para reperfusión realizado en un paciente
con insuficiencia cardíaca crónica en el mejor de los casos no causa
daños o causa sólo pequeños daños en este paciente.
En otra realización preferible de acuerdo con la
presente invención el marcador Nogo-C se utiliza en
el diagnóstico diferencial de la insuficiencia cardíaca aguda y
crónica.
\newpage
En una realización preferible, la presente
invención está relacionada con un método in vitro para
valorar el riesgo de un paciente de IC de progresar en su
enfermedad, lo que comprende los pasos de medir en una muestra la
concentración del marcador Nogo-C, opcionalmente de
medir en la muestra la concentración de uno o más marcadores
diferentes de insuficiencia cardíaca, y de establecer dicho riesgo
del individuo de progresión de la enfermedad mediante la
comparación de la concentración de Nogo-C y
opcionalmente de las concentraciones determinadas en uno o más
marcadores diferentes con la concentración de este marcador o estos
marcadores en su o sus valores de referencia.
Actualmente es muy difícil evaluar o incluso
predecir con una probabilidad razonable si un paciente al que se le
ha diagnosticado de IC se encuentra en un estado más o menos estable
o si la enfermedad progresará y el estado de salud del paciente
como resultado es probable que empeore. La gravedad y progresión de
la insuficiencia cardíaca normalmente se establece clínicamente
evaluando los síntomas clínicos o mediante la identificación de
cambios adversos utilizando técnicas de imagen como la
ecocardiografía. En una realización, el empeoramiento de la
insuficiencia cardíaca se establece monitorizando la fracción de
eyección ventricular izquierda (LVEF). Un deterioro de la LVEF en
un 5% o más se considera una progresión de la enfermedad.
En otra realización preferible, la presente
invención por lo tanto está relacionada con la utilización del
marcador Nogo-C en la evaluación del riesgo de
progresión de la enfermedad en un paciente que sufre de IC. Para la
valoración de la progresión de la enfermedad en pacientes que sufren
de IC, los niveles elevados de Nogo-C son un
indicador de un riesgo aumentado de progresión de la enfermedad.
En una realización preferible, la presente
invención está relacionada con un método in vitro, que ayuda
en la selección de una terapia apropiada de la IC, que comprende
los pasos de medir en una muestra la concentración del marcador
Nogo-C, opcionalmente de medir en la muestra la
concentración de uno o más marcadores diferentes de insuficiencia
cardíaca, y de seleccionar una terapia apropiada mediante la
comparación de la concentración de Nogo-C y
opcionalmente de las concentraciones determinadas de uno o más
marcadores diferentes con la concentración de este marcador o estos
marcadores en su o sus valores de referencia.
Se espera que el marcador Nogo-C
será de ayuda para el médico en la selección del régimen de
tratamiento más apropiado de los varios regímenes de tratamiento
disponibles en el área de la insuficiencia cardíaca. Otra
realización preferible, por lo tanto está relacionada con la
utilización del marcador Nogo-C en la selección de
un régimen de tratamiento para un paciente que sufre de IC.
En una realización preferible, la presente
invención está relacionada con un método in vitro para
monitorizar la respuesta de un paciente a la terapia contra la IC,
que comprende los pasos de a) medir en una muestra la concentración
del marcador Nogo-C, de b) opcionalmente medir en la
muestra la concentración de uno o más marcadores diferentes de
insuficiencia cardíaca, y de monitorizar la respuesta del paciente a
la terapia para la IC mediante la comparación de la concentración
determinada en el paso (a) y opcionalmente las concentraciones
determinadas en el paso (b) con la concentración de este marcador o
estos marcadores de su o sus valores de referencia.
Alternativamente, el anterior método para
monitorizar la respuesta de un paciente a la terapia puede ponerse
en práctica estableciendo el nivel del marcador
Nogo-C pre- y post-terapéutico y
opcionalmente de uno o más marcadores diferentes y mediante la
comparación de los niveles de los marcadores pre- y
post-terapéuticos.
El diagnóstico de insuficiencia cardíaca se
establece clínicamente. De acuerdo con la presente invención la IC
se considera establecida clínicamente si el paciente cumple los
criterios de los estadios C o D como se definen en las guías de
praxis de la ACC/AHA. De acuerdo con estas guías el estadio C se
refiere a los pacientes con enfermedad estructural del corazón y
con síntomas previos o actuales de insuficiencia cardíaca. Los
pacientes en estadio D son aquellos pacientes con insuficiencia
cardíaca refractaria que requieren intervenciones
especializadas.
Como se ha indicado anteriormente, los valores
medidos de NT-proBNP muestran una importante
correlación con la gravedad de la insuficiencia cardíaca. Sin
embargo, tanto BNP como NT-proBNP parecen no ser
ideales para la monitorización de la respuesta de un paciente a la
terapia, véase por ejemplo,
Beck-da-Silva, L., et al.,
Congest. Heart Fail. 11 (2005) 248-253, quiz
254-255.
El marcador Nogo-C parece ser
apropiado para monitorizar la respuesta de un paciente a la terapia.
La presente invención por lo tanto también está relacionada con la
utilización de Nogo-C en la monitorización de la
respuesta de un paciente a la terapia. En esta área de diagnóstico
el marcador Nogo-C también puede utilizarse para
establecer un valor basal antes de la terapia y para medir
Nogo-C a un periodo de tiempo o varios periodos de
tiempo tras la terapia. En el seguimiento de los pacientes de IC un
nivel elevado de Nogo-C es un indicador positivo de
un tratamiento efectivo de la IC.
Los marcadores bioquímicos también pueden
determinarse individualmente o, en una realización preferible de la
invención, pueden medirse simultáneamente utilizando una tecnología
de chip o de chip basado en cuentas. Las concentraciones de
biomarcadores se interpretan entonces independientemente utilizando
un valor de corte individual para cada marcador o se combinan para
la interpretación, es decir, forman una combinación de
marcadores.
Como el experto en la materia apreciará, el paso
de correlacionar el nivel de marcador con una cierta probabilidad o
riesgo puede realizarse o conseguirse de diferentes formas.
Preferiblemente, los valores medidos para el marcador
Nogo-C y uno o más marcadores diferentes, se
combinan matemáticamente y el valor combinado se correlaciona con
la cuestión diagnóstica subyacente. Los valores de los marcadores
pueden combinarse con la medida de Nogo-C mediante
cualquier método matemático apropiado actual.
Preferiblemente, el algoritmo matemático que se
aplica en la combinación de marcadores es una función logística. El
resultado de aplicar tal algoritmo matemático o tal función
logística preferiblemente es un único valor. Dependiendo de la
cuestión diagnóstica subyacente tal valor puede correlacionarse
fácilmente, por ejemplo, con el riesgo de un individuo de sufrir
insuficiencia cardíaca o con otros usos diagnósticos previstos de
ayuda para la evaluación del paciente con IC. En una realización
preferible tal función logística se obtiene mediante a) la
clasificación de individuos en grupos, por ejemplo, individuos
normales, individuos con riesgo de padecer insuficiencia cardíaca,
pacientes con insuficiencia cardíaca aguda o crónica, etc., b) la
identificación de marcadores que se diferencian significativamente
entre estos grupos mediante un análisis univariado, c) el análisis
de la regresión logística para evaluar los valores independientes de
discriminación de los marcadores útiles en la valoración de estos
diferentes grupos y d) la construcción de la función logística para
combinar los valores independientes de discriminación. En este tipo
de análisis los marcadores no siguen siendo independientes sino que
representan una combinación de marcadores.
En una realización preferible, la función
logística utilizada para combinar los valores de
Nogo-C y el valor de al menos otro marcador
adicional se obtiene mediante a) la clasificación de los individuos
en los grupos de normales y individuos con riesgo de insuficiencia
cardíaca, respectivamente, b) el establecimiento de los valores de
Nogo-C y el valor de al menos otro marcador
adicional, c) el análisis de la regresión logística y d) la
construcción de una función logística para combinar los valores del
marcador Nogo-C y el valor de al menos otro
marcador.
Una función logística para correlacionar una
combinación de marcadores con una enfermedad preferiblemente emplea
un algoritmo desarrollado y obtenido mediante la aplicación de
métodos estadísticos como el análisis discriminante (AD) (es decir,
AD lineal, cuadrático, regularizado), métodos de Kernel (es decir,
SVM), métodos no paramétricos (es decir, clasificadores k del
vecino más próximo), PLS (mínimos cuadrados parciales), métodos
basados en árboles (es decir, regresión lógica, CART, métodos de
bosque aleatorio, métodos de "boosting/bagging"), modelos
lineales generalizados (es decir, regresión logística), métodos
basados en los componentes principales (es decir, SIMCA), modelos
aditivos generalizados, métodos basados en lógica difusa, métodos
basados en redes neurales y algoritmos genéticos. El experto en la
materia no tendrá problemas en seleccionar un método estadístico
apropiado para evaluar una combinación de marcadores de la presente
invención y por lo tanto para obtener un algoritmo matemático
apropiado. Preferiblemente, el método estadístico utilizado para
obtener un algoritmo matemático utilizado para la valoración de la
insuficiencia cardíaca se selecciona de entre AD (es decir,
análisis discriminante lineal, cuadrático, regularizado), métodos de
Kernel (es decir, SVM), métodos no paramétricos (es decir,
clasificadores k del vecino más próximo), PLS (mínimos cuadrados
parciales), métodos basados en árboles (es decir, regresión lógica,
CART, métodos de bosque aleatorio, métodos de
"boosting" o modelos lineales generalizados (es decir,
regresión logística). Los detalles relacionados con estos métodos
estadísticos se encuentran en las siguientes referencias: Ruczinski,
I., et al., J. of Computational and Graphical Statistics 12
(2003) 475-511; Friedman, J.H., J. of the American
Statistical Association 84 (1989) 165-175; Hastie,
T., et al., The Elements of Statistical Learning, Springer
Verlag (2001); Breiman, L., et al., Classification and
regression trees, Wadsworth International Group, California (1984);
Breiman, L., Machine Learning 45 (2001) 5-32; Pepe,
M.S., The Statistical Evaluación of Medical Tests for Classification
and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28, Oxford
University Press (2003); y Duda, R.O., et al., Pattern
Classification, John Wiley & Sons, Inc., 2^{a} Ed. (2001).
Es una preferible realización de la invención la
utilización de un valor de corte multivariado optimizado para la
combinación subyacente de marcadores biológicos y para discriminar
el estado A del estado B, por ejemplo, individuos normales y
individuos con riesgo de padecer insuficiencia cardíaca, pacientes
de IC que responden a la terapia y en los que falla la terapia,
pacientes con una insuficiencia cardíaca aguda y pacientes de IC
con insuficiencia cardíaca crónica, pacientes de IC que muestran
progresión de la enfermedad y pacientes de IC que no muestran
progresión de la enfermedad, respectivamente.
El área bajo la curva operador receptor (=AUC)
es un indicador del funcionamiento o exactitud de un procedimiento
diagnóstico. La mejor manera de describir la exactitud de un método
diagnóstico es mediante las características operativas del receptor
(ROC) (véase especialmente Zweig, M.H., y Campbell, G., Clin. Chem.
39 (1993) 561-577). La gráfica ROC es una
representación de todos los pares sensibilidad/especificidad que
resultan de cambiar continuamente el umbral de decisión a lo largo
de rango completo de datos observados.
El funcionamiento clínico de una prueba de
laboratorio depende de su exactitud diagnóstica, o la capacidad de
clasificar correctamente los sujetos en subgrupos clínicamente
relevantes. La exactitud diagnóstica mide la capacidad de la prueba
para distinguir correctamente dos estados diferentes de los sujetos
investigados. Tales estados son por ejemplo, salud y enfermedad o
progresión de la enfermedad frente a no progresión de la
enfermedad.
En cada caso, la representación ROC muestra el
solapamiento entre las dos distribuciones al representar la
sensibilidad frente a 1 - especificidad a lo largo del rango
completo de umbrales de decisión. En el eje y se encuentra la
sensibilidad, o la fracción verdadero positivo [definida como
(número de resultados de la prueba verdaderos positivos)/(número de
resultados de la prueba verdaderos positivos + número de falsos
negativos)]. Esto también se ha denominado positividad en presencia
de una enfermedad o estado. Se calcula solamente a partir del
subgrupo afectado. En el eje x está la fracción de falsos positivos,
o 1 - especificidad [definida como (número de resultados falsos
positivos)/(número de resultados verdaderos negativos + número de
resultados falsos positivos)]. Este es un índice de especificidad y
se calcula enteramente a partir del subgrupo no afectado. Como las
fracciones verdadero y falso positivo se calculan completamente por
separado, utilizando los resultados de la prueba de dos subgrupos
diferentes, la representación ROC es independiente de la
prevalencia de la enfermedad en la muestra. Cada punto de la
representación ROC representa un par
sensibilidad/1-especificidad correspondiente a un
umbral de decisión particular. Una prueba con una discriminación
perfecta (sin solapamiento en las dos distribuciones de resultados)
posee una representación ROC que pasa a través de la esquina
superior izquierda, donde la fracción verdadero positivo es 1,0 o
100% (sensibilidad perfecta), y la fracción falsos positivo es 0
(especificidad perfecta). La representación teórica de una prueba
sin discriminación (distribuciones idénticas de los resultados de
los dos grupos) es una línea diagonal de 45º desde la esquina
izquierda inferior hasta la esquina derecha superior. La mayoría de
representaciones se encuentran entre estos dos extremos. (Si la
representación ROC se encuentra completamente por debajo de la
diagonal de 45º, se remedia fácilmente revirtiendo el criterio de
"positividad" de "superior a" a "inferior a" o
viceversa.) Cualitativamente, cuanto más cercana se encuentre la
representación a la esquina superior izquierda, mayor será la
exactitud global de la prueba.
Una forma preferible de cuantificar la exactitud
diagnóstica de una prueba de laboratorio es expresar su
funcionamiento mediante un único número. La medida global más común
es el área bajo la curva de la representación ROC (AUC). Por
convención, esta área es siempre \geq 0,5 (si no, puede revertirse
la regla de decisión para conseguirlo). Los valores que oscilan
entre 1,0 (separación perfecta de los valores de la prueba de los
dos grupos) y 0,5 (sin diferencia en la distribución aparente entre
los dos grupos de valores de prueba). El área no depende sólo de
una porción particular de la representación como el punto más
cercano a la diagonal o la sensibilidad al 90% de especificidad,
sino en la representación completa. Ésta es una expresión
cuantitativa, descriptiva de cómo de cercana es la representación
ROC a una representación perfecta (área = 1,0).
La sensibilidad global del ensayo dependerá de
la especificidad requerida para poner en práctica el método que
aquí se describe. En ciertos escenarios preferibles, una
especificidad del 75% puede ser suficientes y los métodos
estadísticos y los algoritmos resultantes pueden basarse en su
necesidad de especificidad. En una realización preferible el método
utilizado para evaluar los individuos con riesgo de padecer
insuficiencia cardíaca se basa en una especificidad del 80%, 85% o
especialmente preferible del 90% o 95%.
Como se ha discutido anteriormente, el marcador
Nogo-C ayuda en la evaluación de los individuos con
riesgo de desarrollar insuficiencia cardíaca así como en la
posterior evaluación diagnóstica in vitro de un paciente con
insuficiencia cardíaca. Una realización preferible de acuerdo con
esto es la utilización de Nogo-C como molécula
marcador para la valoración de la insuficiencia cardíaca.
La utilización de una combinación de marcadores
que comprende Nogo-C y uno o más marcadores
diferentes de la IC para la valoración de los pacientes de IC o
para la valoración de individuos con riesgo de padecer IC
representa otra realización preferible de la presente invención. En
tal combinación de marcadores, uno o más marcadores diferentes
preferiblemente se seleccionan de entre el grupo que consiste en un
marcador del péptido natriurético, un marcador de troponina cardíaca
y un marcador de inflamación.
El marcador o marcadores diferentes de la IC
preferibles seleccionados que pueden combinarse con la medida de
Nogo-C preferiblemente se seleccionan de entre el
grupo que consiste en un marcador del péptido natriurético, un
marcador de troponina cardíaca y un marcador de inflamación. Estos
otros marcadores preferibles cuya medida preferiblemente se combina
con la medida de Nogo-C o que forman parte de una
combinación de marcadores de la IC que comprende
Nogo-C, respectivamente, se discuten en más detalle
a continuación.
Un marcador del péptido natriurético en el
sentido de la presente invención es un marcador seleccionado de
entre la familia del péptido natriurético atrial (ANP) o un marcador
seleccionado de entre la familia del péptido natriurético cerebral
(BNP).
Los marcadores polipeptídicos en la familia del
péptido natriurético atrial o en la familia del péptido
natriurético cerebral se derivan de las
pre-pro-formas de las
correspondientes hormonas activas.
Los marcadores de péptido natriurético
preferibles de acuerdo con la presente invención son
NT-proANP, ANP, NT-proBNP, BNP y
fragmentos fisiológicos de los mismos inmunológicamente detectables.
Como el experto en la materia apreciará rápidamente, el fragmento
detectable inmunológicamente debe comprender al menos un epítopo
que permita la detección específica de tal fragmento fisiológico. Un
fragmento fisiológico es un fragmento tal y como se presenta en la
naturaleza en la circulación de un individuo.
Los marcadores en ambas familias del péptido
natriurético representan fragmentos de las correspondientes
pro-hormonas, es decir, proANP y proBNP,
respectivamente. Como consideraciones similares aplican a ambas
familias, sólo la familia del marcador BNP se describirá con cierto
detalle. La pro-hormona de la familia BNP, es decir,
proBNP consiste en 108 aminoácidos. proBNP se escinde por los 32
aminoácidos C-terminales (77-108)
que representan la hormona BNP biológicamente activa y los
aminoácidos 1-76 N-terminales
denominados proBNP N-terminal (o
NT-proBNP). BNP, proBNP N-terminal
(1-76) así como otros productos adicionales de la
escisión (Hunt, P.J., et al., Biochem. Biophys. Res. Com.
214 (1995) 1175-1183) circulan en sangre. Si la
molécula precursora completa (proBNP 1-108) también
aparece en plasma no está completamente resuelto. Sin embargo se ha
descrito (Hunt, P.J., et al., Peptides 18 (1997)
1475-1481) que es detectable una pequeña liberación
de proBNP (1-108) en plasma pero que debido a una
escisión parcial muy rápida en el extremo
N-terminal, algunos aminoácidos están ausentes.
Actualmente se acepta en general que por ejemplo, para
NT-proBNP la porción central de la molécula, que
reside entre los aminoácidos de 10 a 50 representa una parte
fisiológicamente bastante estable. Las moléculas de
NT-proBNP que comprenden esta parte central de
NT-proBNP puede medirse de forma fiable a partir de
los fluidos corporales. Una descripción detallada en relación a los
métodos basados en la detección inmunológica de esta parte central
de la molécula NT-proBNP se proporciona en la WO
00/45176 y el lector puede dirigirse a esta para más detalles.
Puede ser una ventaja adicional el medir sólo una cierta subfracción
de NT-proBNP para el cual se ha propuesto el
término NT-proBNP nativa. Una descripción detallada
en relación con esta subfracción de NT-proBNP se
encuentra en la WO 2004/099253. El experto encontrará todas las
instrucciones necesarias en ésta. Preferiblemente, el
NT-proBNP medido es o se corresponde con el
NT-proBNP medido con el ensayo Elecsys®
NT-proBNP de Roche Diagnostics, Alemania.
Los pre-análisis son robustos
con NT-proBNP, lo que permite un fácil transporte de
la muestra a un laboratorio central (Mueller, T., et al..
Clin. Chem. Lab. Med. 42 (2004) 942-944). Las
muestras de sangre pueden almacenarse a temperatura ambiente
durante varios días o pueden enviarse por correo o mensajería sin
pérdidas en la recuperación. Por el contrario, el almacenamiento de
BNP durante 48 horas a temperatura ambiente o a 4º Celsius conduce
a una pérdida de concentración de al menos un 20% (Mueller, T.,
et al., supra; Wu, A.H., et al., Clin. Chem. 50 (2004)
867-873).
La familia del péptido natriurético derivado de
cerebro (especialmente BNP y NT-proBNP) se ha
investigado intensamente en el cribado de ciertas poblaciones de
IC. Los hallazgos con estos marcadores, especialmente con
NT-proBNP son muy prometedores. Los valores elevados
de NT-proBNP incluso en "pacientes"
asintomáticos son claramente indicativos de "problemas
cardíacos" (Gremmler, B., et al., Exp. Clin. Cardiol. 8
(2003) 91-94). Estos autores mostraron que un
NT-proBNP elevado indica la presencia de "distrés
cardio-renal" y debe conducir a una recomendación
de investigaciones adicionales. En la línea de varios grupos
diferentes de investigadores, Gremmler et al. también
encontraron que una concentración de NT-proBNP
anormal es una prueba diagnóstica exacta tanto para la exclusión de
IC en la población como para excluir una disfunción ventricular
izquierda (= LVD) en sujetos con problemas de respiración. El papel
de valores negativos de BNP o NT-proBNP en la
exclusión de IC o LVD lo han corroborado otros grupos de
investigadores, véase por ejemplo, McDonagh, T.A., et al.,
Eur. J. Heart Fail. 6 (2004) 269-273 y Gustafsson,
F., et al., J. Card. Fail. 11 (2005)
S15-20.
BNP se produce predominantemente (aunque no
exclusivamente) en el ventrículo y se libera tras un aumento de
tensión en la pared. Por lo tanto, un aumento del BNP liberado
refleja predominantemente disfunciones del ventrículo o
disfunciones que se originan en los atrios pero que afectan al
ventrículo, por ejemplo, mediante un flujo de entrada alterado o
sobrecarga de volumen sanguíneo. Al contrario que BNP, ANP se
produce y se libera predominantemente desde el atrio. El nivel de
ANP por lo tanto puede reflejar predominantemente la función
atrial.
ANP y BNP son las hormonas activas y poseen una
vida media menor que sus respectivos homólogos inactivos,
NT-proANP y NT-proBNP. BNP se
metaboliza en la sangre, mientras que NT-proBNP
circula en la sangre como una molécula intacta y como tal se
elimina a nivel renal. La vida media in vivo de
NT-proBNP es de 120 min., más que la de BNP, que es
de 20 min. (Smith, M.W., et al., J. Endocrinol. 167 (2000)
239-246).
Por lo tanto, dependiendo del patrón de tiempo o
las propiedades de interés, puede ser ventajosa la medida de la
forma activa o la inactiva del péptido natriurético.
Para la valoración de un individuo con riesgo de
padecer insuficiencia cardíaca, el valor medido de
Nogo-C se combina preferiblemente con el valor de
NT-proANP y/o NT-proBNP.
Preferiblemente, el valor de NT-proBNP se combina
con el valor de Nogo-C. Consideraciones similares
aplican para la selección de una terapia apropiada, juzgando el
riesgo de progresión de la enfermedad, y para monitorizar el curso
de la enfermedad.
En el caso de que Nogo-C se
utilice en la evaluación de la respuesta de un paciente a la
terapia, su medida se combina preferiblemente con la medida de ANP o
BNP.
En el caso de que Nogo-C se
utilice para diferenciar entre insuficiencia cardíaca aguda y
crónica, la combinación de marcadores preferible comprende
Nogo-C, ANP o proANP y BNP o proBNP.
El término troponina cardíaca está relacionada
con las isoformas cardíacas de la troponina I y la troponina T. Tal
como ya se ha indicado anteriormente, el término marcador también
está relacionado con las variantes fisiológicas de la molécula
marcadora, como los fragmentos o complejos fisiológicos. Para los
marcadores de troponina cardíaca sus complejos que aparecen
fisiológicamente son conocidos por ser de relevancia diagnóstico y
se incluyen aquí expresamente.
La troponina T tiene un peso molecular de
alrededor de 37.000 Da. La isoforma de troponina T que se encuentra
en el tejido cardíaco (cTnT) es suficientemente divergente de la TnT
de músculo esquelético para permitir la producción de anticuerpos
que distinguen ambas isoformas de estas TnT. TnT se considera un
marcador de daño agudo del miocardio; cf. Katus, H.A., et
al., J. Mol. Cell. Cardiol. 21 (1989) 1349-1353;
Hamm, C.W., et al., N. Engl. J. Med 327 (1992)
146-150; Ohman, E.M., et al., N. Engl. J.
Med. 335 (1996) 1333-1341; Christenson, R.H., et
al., Clin. Chem. 44 (1998) 494-501; y PE 0 394
819.
La troponina I (TnI) es un elemento inhibidor de
25 kDa del complejo de troponina, encontrado en el tejido muscular.
TnI se une a la actina en ausencia de Ga2 +, que inhibe la actividad
ATPasa de la actomiosina. La isoforma TnI que se encuentra en el
tejido cardíaco (cTnI) tiene una divergencia del 40% de la TnI de
músculo esquelético, permitiendo distinguir de forma inmunológica a
ambas isoformas. La concentración normal en plasma de cTnI es
<0,1 ng/ml (4 pM). cTnI se libera al torrente sanguíneo tras la
muerte de células cardíacas; así, la concentración en plasma de
cTnI es elevada en pacientes con infarto agudo de miocardio
(Benamer, H., et al., Am. J. Cardiol. 82 (1998)
845-850).
Las isoformas cardíacas únicas de la troponina I
y T permite distinguirlas de forma inmunológica de las otras
troponinas del músculo esquelético. Por lo tanto, la liberación en
sangre de la troponina I y T desde el músculo cardíaco dañado puede
relacionarse específicamente con el daño del tejido cardíaco.
Actualmente también se aprecia por el experto en la materia que las
troponinas cardíacas pueden detectarse en la circulación tanto en
su forma libre como parte de un complejo (cf. por ejemplo, US
6,333,397, US 6,376.206 y US 6.174.686).
Para la valoración de un individuo con riesgo de
padecer insuficiencia cardíaca así como para la valoración de un
paciente que padece de insuficiencia cardíaca, el valor medido de
Nogo-C se combina preferiblemente con el valor de
la isoforma cardíaca de troponina T y/o troponina I. Una troponina
cardíaca preferible utilizada en combinación con el marcador
Nogo-C es la troponina cardíaca T.
El experto en la materia está familiarizado con
el término marcador de inflamación. Los marcadores preferibles de
inflamación son la interleuquina-6, proteína C
reactiva, amiloide A sérica y una proteína S100.
La interleuquina-6
(IL-6) es una proteína secretada de 21 kDa que posee
numerosas actividades biológicas que pueden dividirse en aquellas
involucradas en la hematopoyesis y en las que implican la activación
de la respuesta inmune innata. La IL-6 es un
reactante de fase aguda y estimula la síntesis de una serie de
proteínas, que incluye a las moléculas de adhesión. Su función
principal es mediar la producción de proteínas hepáticas de fase
aguda, y su síntesis está inducida por las citoquinas
IL-1 y TNF-\alpha. La
IL-6 se produce normalmente por macrófagos y
linfocitos T. La concentración normal en suero de
IL-6 es < 5 pg/ml.
La proteína C reactiva (PCR) es una proteína de
fase aguda homopentamérica de unión a Ca2+ con subunidades de 21
kDa que está involucrada en la defensa del huésped. La síntesis de
PCR está inducida por IL-6, e indirectamente por
IL-1, ya que IL-1 puede disparar la
síntesis de IL-6 mediante las células de Kupffer en
los sinusoides hepáticos. La concentración normal en plasma de la
PCR es < 3 \mug/ml (30 nM) en el 90% de la población sana, y
< 10 \mug/ml (100 nM) en el 99% de los individuos sanos.
La amiloide A sérica (=AAS) es una proteína de
fase aguda de bajo peso molecular de 11,7 kDa. Se sintetiza de
forma predominante en el hígado en respuesta a IL-1,
IL-6 o estimulación por TNF-\alpha
y está involucrada en la regulación de la respuesta inmune
dependiente de las células T. Tras los eventos agudos, la
concentración de AAS aumenta hasta 1000 veces, alcanzando un
miligramo por mililitro. Se utiliza para monitorizar la inflamación
en enfermedades tan diversas como fibrosis quística, rechazo de
injerto renal, traumatismos o infecciones. En la artritis
reumatoide se utiliza en ciertos casos como un sustituto de la PCR,
pero la AAS no se acepta aún de forma extendida.
Las proteínas S100 forman una familia en aumento
constante de proteínas de unión al Ca2+ que hoy en día incluyen más
de 20 miembros. La estructura fisiológicamente relevante de las
proteínas S100 es un homodímero pero algunas pueden también formar
heterodímeros entre ellos, por ejemplo, S100A8 y S100A9. Las
funciones intracelulares comprenden desde la regulación de la
fosforilación de proteínas, de actividad enzimática, o de la
dinámica del citoesqueleto hasta la participación en la
proliferación celular y diferenciación. Como algunas proteínas S100
se liberan también de las células, se han descrito las funciones
extracelulares como la regulación de procesos inflamatorios.
S100A8, S100A9, el heterodímero S100A8/A9 y S100A12 se han
encontrado en inflamación con S100A8 respondiendo a inflamación
crónica, mientras que S100A9, S100A8/A9 y S100A12 están
incrementadas en la inflamación aguda. S100A8, S100A9, S100A8/A9 y
S100A12 están ligadas a diferentes enfermedades con componentes
inflamatorios lo que incluye algunos cánceres, rechazo de aloinjerto
renal, colitis y más importantemente a AR (Burmeister, G., y
Gallacchi, G., Inflammopharmacology 3 (1995)
221-230; Foell, D., et al., Rheumatology 42
(2003) 1383-1389). Los marcadores S100 más
preferibles para valorar un individuo con riesgo de padecer IC o un
paciente con IC por ejemplo, para utilizar en una combinación de
marcadores de acuerdo con la presente invención sonS10 0A8, S100A9,
heterodímero S100A8/A9 y S100A12.
La selectina sE (molécula de adhesión
leucocitaria endotelial 1 soluble, ELAM-1) es una
glicoproteína transmembranal de tipo-I de 115 kDa,
expresada sólo en células endoteliales y sólo tras la activación
mediante citoquinas inflamatorias (IL-1\beta,
TNF-\alpha) o endotoxina. La selectina E de
superficie endotelial es un mediador de la unión por rodamiento de
los leucocitos (del inglés "rolling") al endotelio, un paso
esencial en la extravasación de leucocitos en el lugar de la
inflamación, jugando así un papel importante en la respuesta
inflamatoria localizada. La selectina E soluble se encuentra en la
sangre de individuos sanos, probablemente apareciendo a partir de
la escisión proteolítica de la molécula expresada en superficie. Se
han descrito niveles elevados de selectina sE en suero en una serie
de condiciones patológicas (Gearing, A.J.H.. et al., Ann.
N.Y. Acad. Sci. 667 (1992) 324-331).
En una realización preferible la presente
invención está relacionada con la utilización de
Nogo-C como molécula marcador para IC en combinación
con uno o más molécula(s) marcadoras para IC para la
valoración de la IC a partir de una muestra líquida obtenida de un
individuo.
Tal como se ha indicado antes, en un método
preferible de acuerdo con la presente invención el valor medido para
Nogo-C se combina al menos con el valor de al menos
otro marcador seleccionado de entre el grupo que consiste en un
péptido natriurético marcador, una troponina cardíaca marcador, y un
marcador de inflamación.
En una realización preferible la presente
invención está relacionada con la utilización de la combinación de
marcadores Nogo-C y NTproBNP para la valoración de
la insuficiencia cardíaca.
En una realización preferible la presente
invención está relacionada con la utilización de la combinación de
marcadores Nogo-C y troponina T para la valoración
de la insuficiencia cardíaca.
En una realización preferible la presente
invención está relacionada con la utilización de la combinación de
marcadores Nogo-C y CRP para la valoración de la
insuficiencia cardíaca.
En otra realización preferible la presente
invención está relacionada con una combinación de marcadores que
comprenden los marcadores Nogo-C, troponina T,
NT-proBNP y CRP.
En aún otra realización preferible la presente
invención está relacionada con un panel de marcadores utilizados en
un método para valorar la IC in vitro mediante marcadores
bioquímicos, que comprende medir en una muestra la concentración de
Nogo-C y de uno o más marcadores diferentes de IC y
utilizar las concentraciones determinadas para la valoración de la
IC.
Un panel marcador de acuerdo con la presente
invención se mide preferiblemente utilizando un chip de proteínas.
Un chip es una colección de marcadores localizables de un individuo.
Dichos marcadores pueden estar espacialmente localizables, como
chips contenidos dentro de placas microtituladas o impresos en
superficies plana en los que cada marcador está presente en
diferentes coordenadas X e Y. Alternativamente, los marcadores
pueden estar localizables en base a etiquetas, cuentas,
nanopartículas, o propiedades físicas. Los microchips pueden
prepararse de acuerdo con los métodos conocidos por el experto en la
materia (véase por ejemplo, US 5.807.522; Robinson, W.H., et
al., Nat. Med. 8 (2002) 295-301; Robinson, W.H.,
et al., Arthritis Rheum. 46 (2002) 885-893).
El chip, tal como se utiliza aquí se refiere a cualquier ensayo
inmunológico con múltiples marcadores localizables. En una
realización los marcadores localizables son antígenos. En otra
realización los elementos localizables son autoanticuerpos. Un
microchip es una forma miniaturizada de un chip. Un antígeno tal
como se utiliza aquí se refiere a cualquier molécula que se puede
unir de forma específica a un anticuerpo. El término autoanticuerpo
está bien definido en la técnica actual.
En una realización preferible la presente
invención está relacionada con un chip de proteínas que comprende el
marcador Nogo-C y opcionalmente uno o más marcadores
diferentes de IC.
En una realización preferible la presente
invención está relacionada con un chip de proteínas que comprende
los marcadores Nogo-C y
NT-proBNP.
En una realización preferible la presente
invención está relacionada con un chip de proteínas que comprende
los marcadores Nogo-C y troponina T.
En una realización preferible la presente
invención está relacionada con un chip de proteínas que comprende
los marcadores Nogo-C y CRP.
En otra realización preferible la presente
invención está relacionada con un chip de proteínas que comprende
the marcadores Nogo-C, troponina T,
NT-proBNP y CRP.
\newpage
En aún otra realización preferible la presente
invención está relacionada con un equipo que comprende los reactivos
necesarios para medir de forma específica Nogo-C.
También es preferible un equipo que comprende los reactivos
necesarios para medir de forma específica Nogo-C y
los reactivos necesarios para medir uno o más marcadores diferentes
de insuficiencia cardíaca que se usan en combinación con un marcador
de IC.
Los siguientes ejemplos, listados de secuencias
y figuras se proporcionan para ayudar a entender la presente
invención, su verdadero alcance se establece en las reivindicaciones
anexadas. Se entiende que estas modificaciones pueden realizarse en
los procedimientos establecidos sin alejarse del espíritu de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 Análisis fenotípico de ratones
salvajes y R9C. (A) Las curvas de supervivencia de ratones
salvajes (n=79) y ratones R9C (n=44) se generan tras un periodo de
24 semanas. (B) Acortamiento cardíaco evaluado mediante
ecocardiografía (= acortamiento fraccional). El impedimento
funcional significativo en los animales R9C transgénicos comienza a
las 8 semanas de edad.
Figura 2 Parámetros ecocardiográficos y
hemodinámicos en ratones salvajes y AB. (A) Cambios en la
presión máxima en mmHg a 2, 4, y 8 semanas tras la cirugía. (B)
Cambios en el % de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo
(FEVI) a las 2, 4, y 8 semanas tras la cirugía. (Los círculos
cerrados indican los datos de ratones con operación simulada y los
círculos abiertos indican los datos de ratones con bandeo aórtico
(BA).
Figura 3 Datos de Western blot obtenidos con
tejido cardíaco de ratones R9C y control, respectivamente. Se
observa una fuerte sobreexpresión de Nogo-C en
muestras de tejido derivadas de animales experimentales (R9C) que
padecen de insuficiencia cardíaca versus muestras de tejido
derivadas de ratones sanos (=+/+). Los números por debajo de las
bandas de tinción indican los niveles de expresión relativos para
las tres isoformas de Nogo determinadas mediante los números de
espectro de masas grabados. Las flechas indican las posiciones de
Nogo-A (flecha A), Nogo B (flecha B), una variante
de Nogo B (flecha B*) y Nogo C (flecha C), respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha descrito que una cardiomiopatía humana
heredada dilatada resulta de la conversión de Arg9 a Cys en el gen
humano de la fosfolamban (PLN) (PLN-R9C) (Schmitt,
J.P., et al., Science 299 (2003) 1410-1413).
El inicio de la cardiomiopatía dilatada en pacientes afectados
normalmente se inicia durante la adolescencia, seguido del
deterioro progresivo en la función cardíaca que conduce a una crisis
y la muerte. Un modelo transgénico de ratón de esta mutación mostró
un fenotipo cardíaco similar al de los pacientes afectados y
presentó una cardiomiopatía dilatada, disminución de la
contractibilidad cardíaca, y muerte prematura (Schmitt, 2003,
supra).
Se estableció una curva de supervivencia para el
ratón transgénico. El ratón PLN-R9C presenta una
supervivencia media de sólo \sim20 semanas con menos del 15% de
persistencia tras las 24 semanas (Fig. 1 A). Las primeras muertes
registradas en la línea PLN-R9C se observaron a las
12 semanas de edad, mientras que sólo uno de los ratones salvajes
control murió en el periodo de 24 semanas. Se seleccionó el periodo
de ocho semanas como punto representativo de la enfermedad de
estadio "temprano" antes de la primera muerte registrada,
mientras que se escogió la semana 16 como el punto medio entre las
8 y 24 semanas (DCM clásica). Un análisis detallado de la patología
de corazones aislados muestra evidencias de alargamiento del
ventrículo y atrio incluso a las 8 semanas de edad en los ratones
PLN-R9C. Las muestras de secciones transversales de
músculo cardíaco aislado (obtenido de ratones salvajes y
PLN-R9C seguido de tinción con hematoxilina y eosina
también mostró evidencias de dilatación del ventrículo izquierdo, o
adelgazamiento de la pared ventricular, en los animales
transgénicos al inicio de las 8 semanas, con progresión continuada
de la dilatación con la edad.
Las mediciones cardíacas funcionales se
realizaron mediante ecocardiografía en la semana 8, 16 y 24 de los
ratones macho (resumido en la Tabla 1). Las mediciones de
ecocardiografía del grosor de la pared anterior y posterior muestra
que los ratones R9C poseen una dilatación significativa a las 8
semanas, que continua deteriorándose durante la vida del ratón. La
contractibilidad, analizada mediante el acortamiento cardíaco (Fig.
1 B), está también reducida ligeramente, pero significativamente, a
las 8 semanas, mientras que es claramente más evidente y
pronunciado el descenso a las 16 semanas. Los ratones hembra
analizados mostraron los mismos hechos que los machos (datos no
mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores en la Tabla 1 son la media \pm
EEM. Símbolos utilizados en la Tabla 1: FC = frecuencia cardíaca;
PA, PP = grosor de la pared anterior y posterior (ventrículo
izquierdo); DDFVI, DSFVI = dimensión diastólica y sistólica final
del ventrículo izquierdo, respectivamente; AF = acortamiento
fraccional = (LVEDD-LVESD)/LVEDD x100%; TEC =
tiempo de eyección corregido para la FC; VACC = velocidad del
acortamiento circunferencial corregido para FC = AF/TEC; VPAC =
velocidad del pico aórtico corregido para la FC; onda E = onda
diastólica de llenado precoz; PSFVI, PDFVI = presión sistólica y
diastólica final en el ventrículo izquierdo; +dP/dtmax = primer
derivado positivo máximo de la presión ventricular izquierda;
-dP/dtmax = primer derivado negativo máximo de la presión
ventricular izquierda; AVA = aceleración de la velocidad aórtica
(VPAC/tiempo de aceleración); *P<0,05 comparado
con WT.
con WT.
\vskip1.000000\baselineskip
En este modelo de ratón, la sobrecarga de
presión provocada por el bandeo aórtico (BA) induce hipertrofia
cardíaca.
La sobrecarga de presión se realiza mediante
intervención quirúrgica en ratones C57BL. La coartación de la aorta
ascendente (conocido como bandeo aórtico) induce hipertrofia
cardíaca y crecimiento del músculo miocárdico, especialmente en el
ventrículo izquierdo como respuesta primaria a la coartación de la
aorta. EN los últimos estadio s de este modelo murino el corazón se
hipertrofia y finalmente se dilata. Este modelo está bien
caracterizado y se ha demostrado que es altamente reproducible con
una tasa baja de mortalidad de 10-15% o menos según
la experiencia. Tras la coartación este modelo animal permite el
progreso del desarrollo de hipertrofia ventricular izquierda e
insuficiencia cardíaca en repuesta al estrés hemodinámico.
Brevemente, los ratones C57BL se anestesiaron
con ketamina mezclada (90 mg/kg) y Rompun (10 mg/Kg) y la aorta se
liga utilizando una aguja de calibre 25. Los ratones operados de
forma simulada se les practicó el mismo procedimiento quirúrgico,
con la excepción que la ligación no se realizó con la aguja.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar la respuesta patofisiológica, los
animales bandeados y los controles operados de forma simulada se
sacrificaron a la semana uno, dos, cuatro, y ocho tras la
intervención. Se analizó la función cardíaca y el desarrollo de
hipertrofia mediante análisis ecocardiográfico y se confirmó post
mortem al examinar la histología. La Tabla 2 muestra una visión
sobre la función cardíaca evaluada en los diferentes tiempos
mediante ecocardiografía. Los detalles en los parámetros
ecocardiográficos proporcionados en la Tabla 2 son conocidos por los
expertos en la materia y pueden encontrarse por ejemplo, en Asahi,
M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004)
9199-9204, y Oudit, G.Y., et al., Nat. Med. 9
(2003) 1187-1194.
Además de los parámetros funcionales, se realizó
una tinción histológica con hematoxilina/eosina (HE) en tejido
cardíaco de ratones BA y ratones control a las 2, 4, y 8 semanas. La
histología confirma los procesos necróticos esperados y de
remodelación de los ratones BA, mientras que el tejido cardíaco en
ratones con operación simulada, no mostró ningún cambio
significativo. A las dos semanas tras la cirugía, el ventrículo de
un ratón ligado muestra hipertrofia ventricular izquierda
significativa que tras cuatro semanas ha progresado y tras ocho
semanas tras la cirugía se parece mucho al estadio final de la
cardiomiopatía dilatada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron los corazones, se retiraron los
atrios, los ventrículos se trocearon cuidadosamente con un filo de
bisturí y se enjuagaron abundantemente con PBS enfriado con hielo
(tampón fosfato salino) para eliminar el exceso de sangre. El
tejido se homogenizó durante 30 seg. utilizando un homogenizador de
vidrio manual de ajuste bajo en 10 ml de tampón de lisis (sacarosa
250 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,6, MgCl2 1 mM, DDT 1 mM
(ditiotreitol), y PMSF 1 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo).
Todos los pasos posteriores se realizaron a 4ºC. El lisado se
centrifugó en una centrífuga de sobremesa a 800 x g durante 15 min.;
el sobrenadante sirve como fuente para las fracciones de citosol,
mitocondrias, y microsomales. Los botones que contienen los núcleos
se diluyen en 8 ml de tampón de lisis y se colocaron en 4 ml de
tampón sacarosa 0,9 M (sacarosa 0,9 M, Tris-HCl 50
mM pH 7,6, MgCl2 1 mM, DDT 1 mM, y PMSF 1 mM) y se centrifugaron a
1000 x g durante 20 min. a 4ºC. El botón resultante se resuspendió
en 8 ml de un tampón sacarosa 2 M (sacarosa 2 M,
Tris-HCl 50 mM pH 7,4, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, y PMSF
1 mM), se colocaron en 4 ml de tampón sacarosa 2 M y se
ultracentrifugó a 150.000 x g durante 1 h. (rotor Beckman SW40.1).
Los núcleos se recuperaron en forma de botón. Las mitocondrias se
aislaron del sobrenadante mediante recentrifugación a 7500 x g
durante 20 min. a 4ºC; el botón resultante se lavó dos veces en
tampón de lisis. Los microsomas se ultracentrifugaron a partir del
citoplasma postmitocondrial a 100.000 x g durante 1 h. en un rotor
Beckman SW41. El sobrenadante sirvió como fracción citosólica (=
cito).
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas mitocondriales solubles se
extrajeron incubando las mitocondrias en tampón de lisis hipotónico
(HEPES 10 mM, pH 7,9, DTT 1 mM, PMSF 1 mM), durante 30 min. en
hielo. La suspensión se sonicó brevemente y se eliminaron los
restos mediante centrifugación a 13.000 x g durante 30 min. El
sobrenadante sirve como la fracción "mito 1". El botón
insoluble resultante se resuspendió en tampón de extracción
detergente de membranas (Tris-HCl 20 mM, pH 7,8,
NaCl 0,4 M, glicerol al 15%, DTT 1 mM, PMSF 1 mM,
Triton-X-100 al 1,5%) y se agitó
suavemente durante 30 min. seguido por centrifugación a 13.000 x g
durante 30 min.; el sobrenadante sirvió como la fracción "mito
2".
Las proteínas asociadas a membrana se extrajeron
mediante la resuspensión de microsomas en tampón de extracción
detergente de membranas. La suspensión se incubó con agitación suave
durante 1 h. y los restos insolubles se eliminaron mediante
centrifugación a 13.000 x g durante 30 min. El sobrenadante sirvió
como la fracción "micro".
\vskip1.000000\baselineskip
Una alícuota de alrededor de 100 \mug de
proteína total (determinado mediante ensayo Bradford) de cada
fracción se precipitó durante la noche con 5 volúmenes de acetona
enfriada con hielo a alrededor de 20ºC, seguido por centrifugación
a 13.000 x g durante 15 min. El botón de proteína se solubilizó en
un volumen pequeño de urea 8 M, Tris-HCl 50 mM, pH
8,5, DTT 1 mM, durante 1 h. a 37ºC, seguido de
carboxiamidometilación con yodoacetamida 5 mM durante 1 h. a 37ºC
en la oscuridad. Las muestras se diluyeron entonces en urea 4 M con
un volumen igual de bicarbonato de amonio 100 mM, pH 8,5, y se
digirió con una proporción 1:150 de endoproteinasa
Lys-C (Roche Diagnostics, Laval, Quebec, Canadá) a
37ºC durante la noche. Al día siguiente, las muestras se diluyeron
en urea 2 M con un volumen igual de bicarbonato de amonio 50 mM pH
8,5, suplementado con CaCl2 hasta una concentración final de 1 mM,
y se incubó durante la noche con cuentas de tripsina Poroszyme
(Applied Biosystems, Streetsville, Ontario, Canadá) a 30ºC con
rotación. Las mezclas de péptidos resultantes se extrajeron en fase
sólida con cartuchos SPEC-Plus PT C18 (Ansys
Diagnostics, Lake Forest, CA) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante y se almacenaron a -80ºC hasta su uso posterior. Se
realizó un procedimiento MudPIT multiciclo de 12 pasos de 20 horas
de duración totalmente automatizado como se describe (Mol. Cell
Proteom. 2 (2003) 96-106). Brevemente, una bomba
cuaternaria de HPLC se interconecta con una trampa de iones para
espectrómetro de masas LCQ DECA XP (Thermo Finnigan, San Jose, CA).
Se introdujo una microcolumna capilar de silicio fusionado de
100-\mum i.d. (Polymicro Technologies, Phoenix,
AZ) en una punta fina utilizando un extractor láser
P-2000 (Sutter Instruments, Novato, CA) y se
empaquetó con 8 cm de resina Zorbax Eclipse XDB-C18
5 \mum (Agilent Technologies, Mississauga, Ontario, Canadá),
seguido de 6 cm de resina de intercambio fuerte de cationes
Partisphere 5 \mum (Whatman, Clifton, NJ). Las muestras de
individuo se cargaron manualmente en columnas separadas utilizando
un recipiente de presión. Las condiciones de solvente de
cromatografía son exactamente las descritas en Kislinger, T., et
al., Mol. Cell Proteom. 2 (2003) 96-106.
\vskip1.000000\baselineskip
El algoritmo de búsqueda en las base de datos
SEQUEST se utiliza para buscar coincidencias de espectros de masas
de péptidos en tándem con las secuencias de péptidos en una base de
datos de tipo FASTA mantenida localmente mínimamente redundante
poblada con secuencias de proteínas de ratón y humano obtenidas de
las bases de datos Swiss-Prot/TrEMBL e IPI. Para
evaluar estadísticamente la tasa empírica de falsos resultados para
controlar, y por lo tanto, minimizar las identificaciones de falsos
positivos, todos los espectros se buscaron frente a secuencias de
proteína en ambas orientaciones normal (directa) e invertida
(reversa) de aminoácidos (Kislinger, T., et al., Mol. Cell
Proteom. 2 (2003) 96-106). El algoritmo de filtrado
STATQUEST se aplica entonces a todos los resultados de búsqueda
putativos para obtener un medición de la fiabilidad estadística
(puntuación de confianza) para cada identificación candidata (valor
p de corte \leq,15, que corresponde con una probabilidad del 85% o
superior de ser una coincidencia correcta). Las coincidencias de
alta confianza se analizan en una base de datos casera de tipo SQL
utilizando un programa basado en Perl. La base de datos se diseñó
para acomodar los resultados de búsqueda en la base de datos y la
información espectral (cabeceras de exploración) para coincidencias
de múltiples péptidos a una proteína determinada, junto con la
información respecto al nombre de la muestra, número de
experimento, paso MudPIT, fuente de orgánulos, secuencia de
aminoácidos, masa molecular, punto isoeléctrico, carga, y nivel de
confianza. Sólo aquellas proteínas con una confianza predicha de
valor p de 95% o más, y para la que al menos se han detectado
colectivamente dos espectros, se retienen para un posterior
análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos crudos obtenidos con los métodos
descritos en el Ejemplo 2 consiste en 6190 proteínas cada una con
contajes espectrales, la suma de todos los espectros asociados con
la proteína, para cada uno de los 137 experimentos diferentes. Los
datos crudos, 6190 subgrupo de proteínas, se somete a una
normalización global que separa primero los datos dentro de cada
experimento en un número igual de grupos, ajustado a 100 para
nuestro análisis, basado en su contaje espectral. Se realiza
entonces un LOESS (Cleveland, W.S. y Devlin, S.J., Journal of the
American Statistical Association 83 (1988) 596-610)
en cada grupo (1-100) ajustado a las diferencias en
los contajes espectrales a los largo del grupo de genes con contajes
espectrales similares.
Basándose en los datos crudos se construyeron
dos modelos lineales, el primer modelo utiliza control/enfermedad,
tiempo (8, 16 semanas, fin) y localización (cito, micro, mitoI,
mitoII) como factores y se describe utilizando:
(1)contaje del
experimento = \beta0 + tiempo \beta1 + tiempo \beta2^{2} +
localización \beta3 + control
\beta4
El segundo modelo utiliza sólo el tiempo (8, 16
semanas, fin) y localización (cito, micro, mitoI, mitoII) como
factores y se describe utilizando:
(2)contaje del
experimento = \beta0 + tiempo \beta1 + tiempo \beta2^{2} +
localización
\beta3
en el que \beta0 es el término
interceptor y \beta1, \beta2, \beta3, y \beta4 son las
pendientes estimadas para las variables tiempo, tiempo al cuadrado,
localización, y
control/enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Los dos modelos se compararon utilizando Anova,
siendo la hipótesis nula si no hay diferencia entre los dos
modelos. Un valor p bajo indica entonces que no hay pruebas
suficientes para decir que los dos modelos son el mismo. La
información extra que indica el estado (es decir,
control/enfermedad) parece ser un componente significativo del
modelo. Para poder extraer proteínas que poseen un cambio
significativo en la abundancia relativa de proteína entre nuestro
modelo control y el modelo de enfermedad, nuestra lista de 6190
proteínas se clasifican en base a sus valores p computados. Esto
genera un grupo de 593 proteínas con valores p < 0,05.
Para poder contar análisis de hipótesis
múltiples a partir del modelo anterior, los valores p se corrigen
entonces utilizando una corrección de tasa de descubrimiento falso
(FDR), específicamente corrección FDR de
Benjamini-Hochberg (Benjamini, Y., y Hochberg, Y.,
Journal of the Royal Statistical Society B. 57 (1995)
289-300). Esto genera un grupo de 40 proteínas con
valores p corregidos < 0,05 para el modelo de ratón R9C.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aplica el mismo análisis de datos a los
grupos de datos para el modelo de ratón de bandeo aórtico como se ha
descrito antes para el modelo de ratón R9C.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron lisados de tejido crudo de
muestras de tejido cardíaco de ratón R9C. En breve, el tejido
cardíaco se disgrega, se introduce en un homogenizador Dounce y se
somete a una centrifugación de 8000 g durante 30 min. para eliminar
los núcleos y los restos celulares. El sobrenadante se utiliza para
Western blot.
Se llevan a cabo SDS-PAGE y
Western blot utilizando reactivos y equipamiento de Invitrogen,
Karlsruhe, Alemania. Para cada muestra de tejido analizada, 10
\mug de la fracción citosólica se diluye en tampón de muestra SDS
Nu-PAGE® reductor (Invitrogen) y se calienta durante
10 min. a 95ºC. Las muestras se analizan en geles NuPAGE® al
4-12% (Tris-Glicina) en el sistema
de tampón de electroforesis MES. La mezcla de proteína separada en
gel se somete a electroforesis en membranas de nitrocelulosa
utilizando el módulo Invitrogen XCell II^{TM} Blot (Invitrogen) y
el sistema d tampón de transferencia NuPAGE®. Las membranas se lavan
3 veces en PBS/0,05% Tween-20 y se bloquean con
tampón de bloqueo Roti®-Block (A151.1; Carl Roth GmbH, Karlsruhe,
Alemania) durante 2 h. El anticuerpo primario, de conejo policlonal
contra Nogo (IMG-5346A, Imgenex/Cedarlane Labs,
Horny, ON) se diluye en tampón de bloqueo Roti®-Block y se incuba
con la membrana durante 1 h. Las membranas se lavan 6 veces en
PBS/0,05% Tween-20. El anticuerpo primario
anti-Nogo específicamente unido se marca con un
anticuerpo policlonal anti IgG de conejo conjugado a POD, diluido
hasta 10 mU/ml en tampón de bloqueo Roti®-Block 0,5 x. Tras la
incubación durante 1 h, las membranas se lavaron 6 veces en
PBS/0,05% Tween-20. Para la detección de anticuerpo
anti-IgG de conejo conjugado a POD unido, la
membrana se incuba con el sustrato Lumi-LightPLUS
Western Blotting (Nº Orden 2015196, Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim, Alemania) y se expuso a una película autoradiográfica.
Los resultados de un experimento típico se
muestran en la Figura 3. Se observa una fuerte sobreexpresión de
Nogo-C en muestras de tejido derivadas de animales
experimentales R9C que padecen de insuficiencia cardíaca versus
muestras de tejido derivadas de los correspondientes puntos de
tiempo de un ratón sano.
Para la detección de Nogo-C en
suero humano o plasma, se desarrolló un ELISA en sándwich. Para la
captura y detección del antígeno, se conjugaron alícuotas de un
anticuerpo policlonal anti-Nogo-C
con biotina y digoxigenina, respectivamente.
Las placas microtituladas de 96 pocillos
recubiertas de estreptavidina se incubaron con 100 \mul de
anticuerpo policlonal anti-Nogo-C
biotinilado durante 60 min. a 10 \mug/ml en fosfato 10 mM, pH 7,4,
BSA 1%, NaCl 0,9% y Tween-20 0,1%. Tras la
incubación, las placas se lavaron tres veces con NaCl 0,9%,
Tween-20 0,1%. Los pocillos se incubaron entonces
durante 2 h. con una dilución seriada del Nogo-C
recombinante como antígeno estándar o con muestras de plasma
diluido de pacientes. Tras la unión de Nogo-C, las
placas se lavaron tres veces con NaCl 0,9%,
Tween-20 0,1%. Para la detección específica de
Nogo-C unido, los pocillos se incubaron con 100
\mul de anticuerpo policlonal
anti-Nogo-C digoxigenado durante 60
min. a 10 \mug/ml en fosfato 10 mM, pH 7,4, BSA 1%, NaCl 0,9% y
Tween-20 0,1%. Tras esto, las placas se lavaron tres
veces para eliminar el anticuerpo no unido. En el siguiente paso,
los pocillos se incubaron con 20 mU/ml de conjugados
anti-digoxigenina-POD (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Nº de catálogo 1633716)
durante 60 min. en fosfato 10 mM, pH 7,4, BSA 1%, NaCl 0,9% y
Tween-20 0,1%. Las placas se lavaron posteriormente
tres veces con el mismo tampón. Para la detección de complejos de
antígeno-anticuerpo, los pocillos se incubaron con
100 \mul de solución ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Alemania, Nº de catálogo 11685767) y se midió la DO tras
30-60 min. a 405 nm con un lector de ELISA.
Ejemplo
6.1
La combinación de marcadores
NT-proBNP y Nogo-C se analiza para
la diferenciación de pacientes en estadio B y C más D,
respectivamente. La exactitud del diagnóstico se analiza a través de
las muestras líquidas del individuo obtenidas de los grupos bien
caracterizados de individuos, es decir, 50 individuos en estadio B
de acuerdo con los criterios ACA/ACC para la clasificación de la IC
y 50 pacientes que padecen IC y en el estadio C de acuerdo con los
criterios ACA/ACC para la clasificación de la IC.
NT-proBNP se mide mediante un ensayo comercialmente
disponible (Roche Diagnostics, ensayo NT-proBNP (Nº
de cat. 03 121 640 160 para el analizador de inmunoensayo de
sistemas Elecsys®) y Nogo-C medido como se describe
antes se cuantifica en una muestra de suero obtenida de cada uno de
estos individuos. Se realiza el análisis ROC de acuerdo con Zweig,
M.H., y Campbell, supra. El poder discriminatorio para
diferenciar pacientes en estadio C de los individuos en estadio B
para la combinación de Nogo-C con el marcador
establecido NT-proBNP se calcula mediante análisis
discriminante regularizado (Friedman, J.H., J. of the American
Statistical Association 84 (1989) 165-175).
Ejemplo
6.2
La combinación de marcadores troponina T y
Nogo-C se analiza para la diferenciación de
pacientes que padecen un evento cardíaco tardío a partir de
pacientes que padecen de enfermedad cardíaca crónica,
respectivamente. La exactitud del diagnóstico se analiza a través
de las muestras líquidas del individuo obtenidas de los grupos bien
caracterizados de individuos, es decir, 50 individuos diagnosticados
de un evento cardíaco tardío y 50 individuos diagnosticados de
enfermedad cardíaca crónica. La troponina T se mide mediante un
ensayo comercialmente disponible (Roche Diagnostics, ensayo de
troponina T- (Nº de Cat. 201 76 44 para el analizador de
inmunoensayo de sistemas Elecsys®) y Nogo-C medido
como se describe antes se cuantifica en una muestra de suero
obtenida de cada uno de estos individuos. Se realiza el análisis ROC
de acuerdo con Zweig, M.H., y Campbell, G., supra. El poder
discriminatorio para diferenciar pacientes en estadio C de los
individuos en estadio B para la combinación de
Nogo-C con el marcador establecido troponina T se
calcula mediante análisis discriminante regularizado (Friedman,
J.H., J. of the American Statistical Association 84 (1989)
165-175).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6.3
La combinación de marcadores de proteína
C-reactiva y Nogo-C se analiza para
la diferenciación de pacientes que diagnosticados de cardiomiopatía
versus controles que no padecen de ninguna enfermedad cardíaca de
confundible, respectivamente. La exactitud del diagnóstico se
analiza a través de las muestras líquidas del individuo obtenidas
de los grupos bien caracterizados de individuos, 50 individuos con
cardiomiopatía y de 50 individuos control sanos. La PCR se mide
mediante un ensayo comercialmente disponible (Roche Diagnostics,
ensayo PCR (ensayo de alta sensibilidad de proteína C reactiva
Tinaquant (látex) - Roche Nº de Cat. 11972855 216) y
Nogo-C medido como se describe antes se cuantifica
en una muestra de suero obtenida de cada uno de estos individuos.
El análisis ROC se realiza de acuerdo con Zweig, M.H., y Campbell,
G., supra.
<110> Roche Diagnostics GmbH Universidad
de Toronto F. Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Utilización de
Nogo-C en la detección de la insuficiencia
cardíaca
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 24159 PE
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3,2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 199
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Un método para valorar la insuficiencia
cardíaca en un individuo que comprende los pasos de a) medir en una
muestra obtenida del individuo la concentración de la proteína
marcador Nogo-C, b) opcionalmente medir en la
muestra la concentración de uno o más marcadores diferentes de
insuficiencia cardíaca seleccionados de entre el grupo que consiste
en un marcador de péptido natriurético, un marcador de troponina
cardíaca y un marcador de inflamación, y c) valorar la insuficiencia
cardíaca mediante la comparación de la concentración determinada en
el paso (a) y opcionalmente las concentraciones determinadas en el
paso (b) con la concentración de este marcador o estos marcadores
como se ha establecido en una muestra control, en el que un aumento
del nivel de proteína Nogo C es indicativo de insuficiencia
cardíaca.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
que además se caracteriza porque dicha muestra se selecciona
de entre el grupo que consiste en suero, plasma y sangre total.
3. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, que además se caracteriza porque
dichos uno o más marcadores diferentes se seleccionan de entre el
grupo que consiste en un marcador de péptido natriurético, un
marcador de troponina cardíaca y un marcador de inflamación.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
que además se caracteriza porque dicho uno o más marcadores
diferentes es NT-proBNP.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
que además se caracteriza porque dicho uno o más marcadores
diferentes es troponina T.
6. La utilización de la proteína
Nogo-C, en un ensayo in vitro, como molécula
marcadora para la valoración de la insuficiencia cardíaca.
7. La utilización en un ensayo in vitro,
de una combinación de marcadores que comprende
Nogo-C y uno o más marcadores diferentes de
insuficiencia cardíaca para la valoración de la insuficiencia
cardíaca.
8. La utilización de la combinación de
marcadores de acuerdo con la reivindicación 7, en la que uno o más
marcadores diferentes se seleccionan de entre el grupo que consiste
en un marcador de péptido natriurético, un marcador de troponina
cardíaca y un marcador de inflamación.
9. La utilización de una combinación de
marcadores de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende al menos
Nogo-C y NT-proBNP.
10. Un equipo para realizar el método de acuerdo
con la reivindicación 1 que comprende los reactivos necesarios para
medir específicamente Nogo-C y opcionalmente uno o
más marcadores diferentes de insuficiencia cardíaca.
11. El método de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el marcador Nogo-C se mide en una
muestra obtenida de un individuo con riesgo de insuficiencia
cardíaca.
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|---|---|---|---|
| EP07004532A EP1967853B1 (en) | 2007-03-06 | 2007-03-06 | Use of Nogo-C in the assessment of heart failure |
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| AT (1) | ATE456797T1 (es) |
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