CN107328943A - 一种血管内皮生长因子生物学活性的检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血管内皮生长因子生物学活性的检测方法，包括如下步骤：(1)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入台盼蓝混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至(2‑10)×104/mL；(2)将调整后的细胞在CO2培养箱中培养3‑10h；(3)将内皮生长因子作浓度梯度稀释，向步骤(2)中培养后的细胞中加入各梯度稀释的血管内皮生长因子溶液，混匀后在CO2培养箱中培养80‑100h；(4)向步骤(3)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入阿尔玛蓝显色液，混匀后在CO2培养箱中培养1‑10h；(5)将步骤(4)培养后的样品进行荧光强度的检测。本发明通过对血管内皮生长因子进行活性检测，调整不同批次血管内皮生长因子的使用量，使得活性检测的结果更加稳定准确。
Description
技术领域
本发明属于生物制品质量检测分析领域，涉及一种血管内皮生长因子生物学活性的检测方法及应用。
背景技术
血管内皮生长因子(VEGF)是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生，促进血管再生，目前广泛应用于肿瘤药物的评价检测中，其本身质量的好坏直接关系到药物活性检测结果的准确性。
目前市面上VEGF产品的质量参差不齐，批次间存在较大的差异，主要是因为不当的保存条件与使用方法严重影响了VEGF产品的生物学活性。因此，为保证不同的VEGF产品具有相近的生物学活性，有必要建立一种VEGF产品的活性控制与检测方法。
VEGF具有促进细胞增殖的能力，其生物学活性的评价主要通过检测细胞代谢或DNA合成来完成。如在MTT比色法和CCK8比色法中，化学试剂被活细胞线粒体脱氢酶还原后生成贾瓒产物，生成的贾瓒产物的量与活细胞的数量成正比，利用这一特性可检测活细胞的数量，从而间接检测细胞生长因子的生物学活性。201611195041.6公开了肝素寡糖制备抑制细胞异常增殖药物的新用途，该发明使用MTT法确定VEGF对细胞增殖的影响；201710243886.6公开了抗VEGFR2单克隆抗体及其应用，该发明采用CCK-8法检测VEGFR2对细胞活性的抑制能力。然而生成的贾瓒产物对细胞具有一定的毒性，细胞形态发生变化，并且该方法仅能检测某一时间点的细胞代谢活动，无法连续、快速地检测细胞的增殖状态。
对于其他生长因子的生物学活性的检测，通常采用类似的方法。201610633571.8公开了一种重组人角质细胞生长因子(rhKGF-1)生物学活性检测方法，该方法在处于对数生长期细胞的测定培养基中同时加入rhKGF-1和胸腺嘧啶核苷酸类似物5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)，保证rhKGF-1在促进细胞增殖时，培养基中的EdU能够随着细胞核DNA的复制掺入到新合成的DNA链中，然后结合荧光染色定量分析方法进行rhKGF-1生物学活性的检测。然而该方法使用的EdU分子量小、可以快速地掺入到DNA中，对实验人员具有致癌致畸作用，毒性较大，安全性差；且后续还需要对细胞进行固化、透化和荧光染色等处理，使用较为繁琐。
阿尔玛蓝是一种安全、无毒的蓝色染料，可作为氧分子电子传递链的受体，呈现由蓝向红转变的颜色变化，反映细胞或微生物对氧分子的消耗，以显示细胞或细菌的代谢活动。尽管阿尔玛蓝已广泛应用于细胞增殖实验中，但细胞类型、细胞密度、细胞活性、细胞增殖速率、细胞培养基(如血清浓度)等因素常影响阿尔玛蓝检测的重复性和重现性。目前尚无文献报道将阿尔玛蓝应用VEGF的生物学活性检测中，但是如何利用阿尔玛蓝真实准确地反映VEGF的促细胞增殖活性是本发明亟需解决的技术难点。
发明内容
鉴于现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种血管内皮生长因子生物学活性的检测方法，通过对血管内皮生长因子进行活性检测，调整不同批次血管内皮生长因子的使用量，保证了活性检测结果的稳定性，有利于建立统一的药物活性评价标准。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种血管内皮生长因子生物学活性的检测方法，包括如下步骤：
(1)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入台盼蓝混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至(2-10)×104/mL；
(2)将调整后的细胞在CO2培养箱中培养3-10h；
(3)将内皮生长因子作浓度梯度稀释，向步骤(2)中培养后的细胞中加入各梯度稀释的血管内皮生长因子溶液，混匀后在CO2培养箱中培养80-100h；
(4)向步骤(3)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入阿尔玛蓝显色液，混匀后在CO2培养箱中培养1-10h；
(5)将步骤(4)培养后的样品进行荧光强度的检测。
本发明通过调整细胞的浓度，采用特定的培养时间进行分步培养，加入阿尔玛蓝显色液来检测血管内皮生长因子的生物学活性，通过细胞浓度以及各个阶段的培养时间的配合，可以准备的检测血管内皮生长因子的生物学活性，发明人意外发现，其中各个阶段的培养时间互相关联，任何一个阶段的培养时间的变化都会使得其他阶段的培养时间随着变化，从而影响检测血管内皮生长因子的生物活性。
根据本发明，步骤(1)所述台盼蓝的反应的质量浓度为0.1-3％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.2％、1.3％、1.5％、1.6％、1.8％、2％、2.2％、2.3％、2.5％、2.6％、2.8％或3％，优选为0.4％。
优选地，步骤(1)所述细胞浓度为(2-10)×104/mL，例如可以是2×104/mL、2.5×104/mL、3×104/mL、3.5×104/mL、4×104/mL、4.56×104/mL、5×104/mL、5.5×104/mL、6×104/mL、6.5×104/mL、7×104/mL、7.5×104/mL、8×104/mL、8.5×104/mL、9×104/mL、9.5×104/mL或10×104/mL，优选为(4-8)×104/mL。
优选地，步骤(2)所述培养的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为37℃。
优选地，步骤(2)所述培养的CO2浓度为3-8％，例如可以是3％、4％、5％、6％、7％或8％，优选为5％。
优选地，步骤(2)所述培养的时间为3-10h，例如可以是3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h或10h，优选为4-8h，进一步优选为5-7h。
根据本发明，在步骤(3)加入所述待检测的血管内皮生长因子溶液前还包括将所述待检测的血管内皮生长因子溶液进行稀释的步骤。
优选地，所述待检测的血管内皮生长因子溶液稀释后的浓度从500ng/ml至1ng/ml。
优选地，所述稀释浓度从500ng/ml至1ng/ml选取9个浓度，优选这9个浓度呈倍数关系。
本发明中，通过在500ng/ml至1ng/ml选取9个稀释浓度继续进行试验，才可以通过这9个稀释浓度的选择，做出量效曲线，从而计算内皮血管因子的活性，通过9个呈倍数关系的浓度能够准确判断内皮血管因子的活性。
优选地，所述选取的9个浓度为500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.7ng/ml、7.9ng/ml、4ng/ml和2ng/ml。
本发明中，选取的特定的这个9个稀释浓度，发明人通过大量试验发现，只有选取这9个稀释浓度的组合，才可以使得后续制作的量效曲线能够最准确的计算所述血管内皮因子的活性。
优选地，步骤(3)所述培养的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为37℃；
优选地，步骤(3)所述培养的CO2浓度为3-8％，例如可以是3％、4％、5％、6％、7％或8％，优选为5％；
优选地，步骤(3)所述培养的时间为80-100h，例如可以是80h、81h、82h、83h、84h、85h、86h、87h、88h、89h、90h、91h、92h、93h、94h、95h、96h、97h、98h、99h或100h，优选为85-95h，进一步优选为88-92h。
根据本发明，步骤(4)所述阿尔玛蓝与所述混合液的体积比为1:(2-8)，例如可以是1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7或1:8，优选为1:4。
优选地，步骤(4)所述培养的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为37℃；
优选地，步骤(4)所述培养的CO2浓度为3-8％，例如可以是3％、4％、5％、6％、7％或8％，优选为5％；
优选地，步骤(4)所述培养的时间为1-10h，例如可以是1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h或10h，优选为2-8h，进一步优选为3-5h。
优选地，步骤(5)所述检测的条件为在激发光530nm和发射光590nm下进行。
根据本发明，在步骤(1)之前还包括细胞培养的步骤；
优选地，所述细胞培养的步骤包括：进行细胞培养和细胞消化，收集得到所述细胞；
优选地，所述细胞培养具体包括：将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期；
优选地，所述细胞消化具体包括：向培养到对数生长期的细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，吹打混匀并收集至离心管中；
本发明中，通过将细胞培养到对数生长期，在进行后续的实验，可以提高后续检测的准确性。
优选地，所述胰蛋白酶溶液的质量浓度为0.1-3％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.2％、1.3％、1.5％、1.6％、1.8％、2％、2.2％、2.3％、2.5％、2.6％、2.8％或3％，优选为0.25％。
根据本发明，包括如下步骤：
(1)将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期，向细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，反应浓度为0.1-3％，吹打混匀并收集至离心管中；
(2)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入体积为台盼蓝，反应浓度为0.1-3％，混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至(2-10)×104/mL；
(3)将调整后的细胞放置在含有3-8％CO2的培养箱中，在35-40℃下培养3-10h；
(4)将待检测的血管内皮生长因子溶液稀释到浓度为500ng/ml至1ng/ml，选取其中9个稀释浓度；
(5)向步骤(3)培养后的细胞中加入稀释后的待检测的血管内皮生长因子溶液，混匀后放置在含有3-8％CO2的培养箱中，在35-40℃下培养80-100h；
(6)向步骤(5)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入与所述混合液体积比为(2-8):1的阿尔玛蓝显色液，混匀后在含有3-8％CO2的培养箱中，在35-40℃下培养1-10h；
(7)将步骤(5)培养后的样品在激发光530nm和发射光590nm下进行荧光强度的检测。
根据本发明，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期，向细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，反应浓度为0.25％，吹打混匀并收集至离心管中；
(2)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入体积为台盼蓝，反应浓度为0.4％，混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至(4-8)×104/mL；
(3)将调整后的细胞放置在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养4-8h；
(4)将待检测的血管内皮生长因子溶液稀释到浓度为500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.7ng/ml、7.9ng/ml、4ng/ml和2ng/ml；
(5)向步骤(3)培养后的细胞中加入稀释后的待检测的血管内皮生长因子溶液，混匀后放置在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养85-95h；
(6)向步骤(5)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入与所述混合液体积比为4:1的阿尔玛蓝显色液，混匀后在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养2-8h；
(7)将步骤(5)培养后的样品在激发光530nm和发射光590nm下进行荧光强度的检测。
第二方面，本发明提供一种血管内皮生长因子的质量控制方法，包括如下步骤：
1)将血管内皮生长因子冻干粉进行分装保存；
2)采用如第一方面所述的检测方法进行血管内皮生长因子活性的检测；
3)根据步骤2)检测的血管内皮生长因子的活性调整所述血管内皮生长因子的添加量。
本发明通过先将所述血管内皮生长因子进行特定方式的分装，可以提高血管内皮生长因子的保存时间，其质量的保存液直接影响后续的实验，通过该保存方法配合后续的检测方法，可以进一步提高检测的准确性，通过建立这样一套完整的使用方法，可以保证每个批次间的血管内皮生长因子使用的稳定性。
根据本发明，步骤1)所述分装保存具体包括：
将血管内皮生长因子冻干粉分阶段升温至室温，向所述血管内皮生长因子冻干粉中加入无菌水进行溶解，水浴10-20min，优选为15min，期间每隔3-8min，优选为5min拿出颠倒混匀，将溶解的血管内皮生长因子进行分装，分阶段降温后保存。
所述水浴的时间例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min。
所述间隔时间例如可以是3min、4min、5min、6min、7min或8min。
本发明中，通过采用分阶段升温，水浴，分阶段降温的方法，可以稳定血管内皮生长因子，提高所述血管内皮生长因子后续检测的准确性。
优选地，所述分阶段升温具体包括：将管内皮生长因子冻干粉从-20℃转移到4℃平衡过夜，再从4℃转移到室温平衡1-5h，优选为2h；
所述平衡时间例如可以是1h、2h、3h、4h或5h。
优选地，所述水浴的温度为20-30℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，优选为25℃。
优选地，所述分阶段降温具体包括：将管内皮生长因子溶液室温放置3-10min，优选为5min，转移到4℃平衡过夜，再转移到-20℃保存。
所述放置时间例如可以是3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过先将所述血管内皮生长因子进行特定方式的保存，提高了血管内皮生长因子的保存时间，通过该保存方法配合后续的检测方法，可以进一步提高检测的准确性，通过建立这样一套完整的使用方法，可以保证每个批次间的血管内皮生长因子使用的稳定性和测试结果的准确性。
附图说明
图1为本发明不同批次采用上述方法检测的拟合曲线。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
通过将购买的不同批次的血管内皮生长因子使用前进行质量控制，具体包括如下步骤：
1)将血管内皮生长因子冻干粉进行分装保存；
将血管内皮生长因子冻干粉将管内皮生长因子冻干粉从-20℃转移到4℃平衡过夜，再从4℃转移到室温平衡2h，向所述血管内皮生长因子冻干粉中加入无菌水进行溶解，25℃水浴15min，期间每隔5min拿出颠倒混匀，将溶解的血管内皮生长因子进行分装，分阶段将管内皮生长因子溶液室温放置5min，转移到4℃平衡过夜，再转移到-20℃保存；
2)血管内皮因子的活性检测：
(1)将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期，向细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，反应浓度为0.25％，吹打混匀并收集至离心管中；
(2)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入台盼蓝，反应浓度为0.4％，混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至6×104/mL；
(3)将调整后的细胞放置在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养6h；
(4)将待检测的血管内皮生长因子溶液稀释到浓度为500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.7ng/ml、7.9ng/ml、4ng/ml和2ng/ml；
(5)向步骤(3)培养后的细胞中加入稀释后的待检测的血管内皮生长因子溶液，混匀后放置在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养90h；
(6)向步骤(5)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入与所述混合液体积比为4:1的阿尔玛蓝显色液，混匀后在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养5h；
(7)将步骤(5)培养后的样品在激发光530nm和发射光590nm下进行荧光强度的检测。
实施例2
血管内皮生长因子使用前进行质量控制，具体包括如下步骤：
1)将血管内皮生长因子冻干粉进行分装保存；
将血管内皮生长因子冻干粉将管内皮生长因子冻干粉从-20℃转移到4℃平衡过夜，再从4℃转移到室温平衡3h，向所述血管内皮生长因子冻干粉中加入无菌水进行溶解，23℃水浴16min，期间每隔6min拿出颠倒混匀，将溶解的血管内皮生长因子进行分装，分阶段将管内皮生长因子溶液室温放置6min，转移到4℃平衡过夜，再转移到-20℃保存；
2)血管内皮因子的活性检测：
(1)将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期，向细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，反应浓度为0.5％，吹打混匀并收集至离心管中；
(2)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入台盼蓝，反应浓度为0.8％，混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至5×104/mL；
(3)将调整后的细胞放置在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养5h；
(4)将待检测的血管内皮生长因子溶液稀释到浓度为300ng/ml、150ng/ml、75ng/ml、37.5ng/ml、18.8ng/ml、9.4ng/ml、4.7ng/ml、2.4ng/ml和1.2ng/ml；
(5)向步骤(3)培养后的细胞中加入稀释后的待检测的血管内皮生长因子溶液，混匀后放置在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养88h；
(6)向步骤(5)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入与所述混合液体积比为6:1阿尔玛蓝显色液，混匀后在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养5h；
(7)将步骤(5)培养后的样品在激发光530nm和发射光590nm下进行荧光强度的检测。
实施例3
血管内皮生长因子使用前进行质量控制，具体包括如下步骤：
1)将血管内皮生长因子冻干粉进行分装保存；
将血管内皮生长因子冻干粉将管内皮生长因子冻干粉从-20℃转移到4℃平衡过夜，再从4℃转移到室温平衡4h，向所述血管内皮生长因子冻干粉中加入无菌水进行溶解，28℃水浴12min，期间每隔4min拿出颠倒混匀，将溶解的血管内皮生长因子进行分装，分阶段将管内皮生长因子溶液室温放置6min，转移到4℃平衡过夜，再转移到-20℃保存；
2)血管内皮因子的活性检测：
(1)将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期，向细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，浓度为0.8％，吹打混匀并收集至离心管中；
(2)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入台盼蓝，反应浓度为1％，混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至4×104/mL；
(3)将调整后的细胞放置在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养4h；
(4)将待检测的血管内皮生长因子溶液稀释到浓度为400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.3ng/ml、3.2ng/ml和1.6ng/ml；
(5)向步骤(3)培养后的细胞中加入稀释后的待检测的血管内皮生长因子溶液，混匀后放置在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养95h；
(6)向步骤(5)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入与所述混合液体积比为7:1阿尔玛蓝显色液，混匀后在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养8h；
(7)将步骤(5)培养后的样品在激发光530nm和发射光590nm下进行荧光强度的检测。
实施例4
血管内皮生长因子使用前进行质量控制，具体包括如下步骤：
1)将血管内皮生长因子冻干粉进行分装保存；
将血管内皮生长因子冻干粉将管内皮生长因子冻干粉从-20℃转移到4℃平衡过夜，再从4℃转移到室温平衡4h，向所述血管内皮生长因子冻干粉中加入无菌水进行溶解，28℃水浴18min，期间每隔6min拿出颠倒混匀，将溶解的血管内皮生长因子进行分装，分阶段将管内皮生长因子溶液室温放置8min，转移到4℃平衡过夜，再转移到-20℃保存；
2)血管内皮因子的活性检测：
(1)将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期，向细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，反应浓度为1.2％，吹打混匀并收集至离心管中；
(2)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入为台盼蓝混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至8×104/mL；
(3)将调整后的细胞放置在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养8h；
(4)将待检测的血管内皮生长因子溶液稀释到浓度为200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25.5ng/ml、12.8ng/ml、6.4ng/ml、3.2ng/ml、1.6ng/ml和1ng/ml；
(5)向步骤(3)培养后的细胞中加入稀释后的待检测的血管内皮生长因子溶液，混匀后放置在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养85h；
(6)向步骤(5)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入与所述混合液体积比为3:1阿尔玛蓝显色液，混匀后在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养2h；
(7)将步骤(5)培养后的样品在激发光530nm和发射光590nm下进行荧光强度的检测。
实施例5
血管内皮生长因子使用前进行质量控制，具体包括如下步骤：
1)将血管内皮生长因子冻干粉进行分装保存；
将血管内皮生长因子冻干粉将管内皮生长因子冻干粉从-20℃转移到4℃平衡过夜，再从4℃转移到室温平衡1h，向所述血管内皮生长因子冻干粉中加入无菌水进行溶解，30℃水浴10min，期间每隔3min拿出颠倒混匀，将溶解的血管内皮生长因子进行分装，分阶段将管内皮生长因子溶液室温放置3min，转移到4℃平衡过夜，再转移到-20℃保存；
2)血管内皮因子的活性检测：
(1)将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期，向细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，反应浓度为3％，吹打混匀并收集至离心管中；
(2)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入体积为台盼蓝，反应浓度为3％，混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至2×104/mL；
(3)将调整后的细胞放置在含有3％CO2的培养箱中，在40℃下培养3h；
(4)将待检测的血管内皮生长因子溶液稀释到浓度为350ng/ml、175ng/ml、87.5ng/ml、43.8ng/ml、21.9ng/ml、11ng/ml、5.5ng/ml、2.8ng/ml和1.4ng/ml；
(5)向步骤(3)培养后的细胞中加入稀释后的待检测的血管内皮生长因子溶液，混匀后放置在含有3％CO2的培养箱中，在40℃下培养80h；
(6)向步骤(5)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入与所述混合液体积比为2:1的阿尔玛蓝显色液，混匀后在含有3％CO2的培养箱中，在40℃下培养1h；
(7)将步骤(5)培养后的样品在激发光530nm和发射光590nm下进行荧光强度的检测。
实施例6
血管内皮生长因子使用前进行质量控制，具体包括如下步骤：
1)将血管内皮生长因子冻干粉进行分装保存；
将血管内皮生长因子冻干粉将管内皮生长因子冻干粉从-20℃转移到4℃平衡过夜，再从4℃转移到室温平衡5h，向所述血管内皮生长因子冻干粉中加入无菌水进行溶解，20℃水浴20min，期间每隔8min拿出颠倒混匀，将溶解的血管内皮生长因子进行分装，分阶段将管内皮生长因子溶液室温放置10min，转移到4℃平衡过夜，再转移到-20℃保存；
2)血管内皮因子的活性检测：
(1)将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期，向细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，反应浓度为0.1％，吹打混匀并收集至离心管中；
(2)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入台盼蓝，反应浓度为0.1％，混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至10×104/mL；
(3)将调整后的细胞放置在含有8％CO2的培养箱中，在35℃下培养10h；
(4)将待检测的血管内皮生长因子溶液稀释到浓度为250ng/ml、125ng/ml、62.3ng/ml、31.2ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、2ng/ml和1ng/ml；
(5)向步骤(3)培养后的细胞中加入稀释后的待检测的血管内皮生长因子溶液，混匀后放置在含有8％CO2的培养箱中，在35℃下培养100h；
(6)向步骤(5)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入与所述混合液体积比为8:1阿尔玛蓝显色液，混匀后在含有8％CO2的培养箱中，在35℃下培养10h；
(7)将步骤(5)培养后的样品在激发光530nm和发射光590nm下进行荧光强度的检测。
对比例1
与实施例1相比，除了不包含将血管内皮生长因子冻干粉进行分装保存的步骤，其他条件与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比，除了将血管内皮生长因子冻干粉进行分装保存的步骤中不进行分阶段升温和分阶段降温，即将血管内皮生长因子冻干粉将管内皮生长因子冻干粉从-20℃转移到室温平衡2h，向所述血管内皮生长因子冻干粉中加入无菌水进行溶解，25℃水浴15min，期间每隔5min拿出颠倒混匀，将溶解的血管内皮生长因子进行分装，将管内皮生长因子溶液室温转移到-20℃保存，其他条件与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，除了细胞浓度为1×104/mL，其他条件与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比，除了细胞浓度为10×104/mL，其他条件与实施例1相同。
对比例5
与实施例1相比，除了待检测的血管内皮生长因子溶液浓度为800ng/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.3ng/ml和3.1ng/ml，其他条件与实施例1相同。
对比例6
与实施例1相比，除了待检测的血管内皮生长因子溶液稀释浓度为100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.3ng/ml、3.2ng/ml、1.6ng/ml、0.8ng/ml和0.4ng/ml，其他条件与实施例1相同。
对比例7
与实施例1相比，除了步骤(3)的培养时间为12h，步骤(5)的培养时间为110h，步骤(6)的培养时间为12h，其他条件与实施例1相同。
对比例8
与实施例1相比，除了步骤(3)的培养时间为12h，其他条件与实施例1相同。
对比例9
与实施例1相比，除了步骤(3)的培养时间为1h，其他条件与实施例1相同。
对比例10
与实施例1相比，除了步骤(5)的培养时间为110h，其他条件与实施例1相同。
对比例11
与实施例1相比，除了步骤(5)的培养时间为70h，其他条件与实施例1相同。
对比例12
与实施例1相比，除了步骤(6)的培养时间为12h，其他条件与实施例1相同。
对比例13
与实施例1相比，除了步骤(6)的培养时间为0.5h，其他条件与实施例1相同。
实施例7测试方法比较
将两个批号的血管内皮生长因子采用实施例1的方法进行检测，得到荧光读值后，利用软件进行四参数方程曲线拟合计算，得到五个参数：A、B、C、D、R2，A为拟合曲线的最大值，B为拟合曲线的斜率，C为拟合曲线的半效量的浓度EC50，D为拟合曲线的最小值，R2为拟合曲线的相关系数；
生物学活性值＝对照品的EC50值/供试品的EC50×100％；
结果如图1所示，R2为0.999，两个批号的血管内皮因子活性的比较，新一批号的血管内皮生长因子活性是旧一批号的125％，一般检测活性范围在70-130％，所述检测范围有效。
将两个批号的血管内皮生长因子采用实施例1-6和对比例1-13的方法进行检测，得到荧光读值后，进行拟合计算，结果如表1所示：
表1
从表1可以看出，实施例1-6相比于对比例1-13的拟合曲线好，说明本发明测试方法的稳定性高，实施例1-6相比于对比例1-13的生物活性测试的结果与其他方式检测的更为接近，说明本发明测试方法的准确度高；从实施例1-6可以看出，实施例1中的各个条件的配合，能够达到最优的检测结果和稳定性，随着各个条件的变化，使得测试的准确结果和稳定性都随之下降。
从对比例1-2可以看出，本发明采用了特定的保存方法、分阶段升温和分阶段降温的方法，提高了测试方法的准确度和稳定性，从对比例3-4可以看出，在本申请细胞浓度范围内，其测试结果更为准确，从对比例5-6可以看出，稀释浓度对后续的结果会产生明显的影响，导致结果严重偏离实际，从实施例7-13可以看出，各个阶段的培养时间是相互关联的，共同配合的，不在本申请培养时间的范围内，其检测结果也同样受到影响。
综上所述，本发明通过先将所述血管内皮生长因子进行特定方式的保存，提高了血管内皮生长因子的保存时间，通过该保存方法配合后续的检测方法，可以进一步提高检测的准确性，通过建立这样一套完整的使用方法，可以保证每个批次间的血管内皮生长因子使用的稳定性和测试结果的准确性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (9)
1.一种血管内皮生长因子生物学活性的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入台盼蓝混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至(2-10)×104/mL；
(2)将调整后的细胞在CO2培养箱中培养3-10h；
(3)将内皮生长因子作浓度梯度稀释，向步骤(2)中培养后的细胞中加入各梯度稀释的血管内皮生长因子溶液，混匀后在CO2培养箱中培养80-100h；
(4)向步骤(3)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入阿尔玛蓝显色液，混匀后在CO2培养箱中培养1-10h；
(5)将步骤(4)培养后的样品进行荧光强度的检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述台盼蓝反应的质量浓度为0.1-3％，优选为0.4％；
优选地，步骤(1)所述细胞浓度为(4-8)×104/mL；
优选地，步骤(2)所述培养的温度为35-40℃，优选为37℃；
优选地，步骤(2)所述培养的CO2浓度为3-8％，优选为5％；
优选地，步骤(2)所述培养的时间为4-8h，优选为5-7h。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，在步骤(3)加入所述待检测的血管内皮生长因子溶液前还包括将所述待检测的血管内皮生长因子溶液进行稀释的步骤；
优选地，所述待检测的血管内皮生长因子溶液稀释后的浓度从500ng/ml至1ng/ml；
优选地，所述稀释浓度从500ng/ml至1ng/ml选取9个浓度；
优选地，所述选取的9个浓度为500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.7ng/ml、7.9ng/ml、4ng/ml和2ng/ml；
优选地，步骤(3)所述培养的温度为35-40℃，优选为37℃；
优选地，步骤(3)所述培养的CO2浓度为3-8％，优选为5％；
优选地，步骤(3)所述培养的时间为85-95h，优选为88-92h。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)所述阿尔玛蓝与所述混合液的体积比为1:(2-8)，优选为1:4；
优选地，步骤(4)所述培养的温度为35-40℃，优选为37℃；
优选地，步骤(4)所述培养的CO2浓度为3-8％，优选为5％；
优选地，步骤(4)所述培养的时间为2-8h，优选为3-5h；
优选地，步骤(5)所述检测的条件为在激发光530nm和发射光590nm下进行。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括细胞培养的步骤；
优选地，所述细胞培养的步骤包括：进行细胞培养和细胞消化，收集得到所述细胞；
优选地，所述细胞培养具体包括：将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期；
优选地，所述细胞消化具体包括：向培养到对数生长期的细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，吹打混匀并收集至离心管中；
优选地，所述胰蛋白酶溶液的质量浓度为0.1-3％，优选为0.25％。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期，向细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，反应浓度为0.1-3％吹打混匀并收集至离心管中；
(2)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中台盼蓝，反应浓度为0.1-3％，混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至(2-10)×104/mL；
(3)将调整后的细胞放置在含有3-8％CO2的培养箱中，在35-40℃下培养3-10h；
(4)将待检测的血管内皮生长因子溶液稀释到浓度为500ng/ml至1ng/ml，选取其中9个稀释浓度；
(5)向步骤(3)培养后的细胞中加入9个稀释浓度后的待检测的血管内皮生长因子溶液，混匀后放置在含有3-8％CO2的培养箱中，在35-40℃下培养80-100h；
(6)向步骤(5)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入与所述混合液体积比为(2-8):1的阿尔玛蓝显色液，混匀后在含有3-8％CO2的培养箱中，在35-40℃下培养1-10h；
(7)将步骤(5)培养后的样品在激发光530nm和发射光590nm下进行荧光强度的检测。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将人脐静脉血管内皮细胞培养至对数生长期，向细胞中加入新鲜胰蛋白酶溶液，反应浓度为0.25％，吹打混匀并收集至离心管中；
(2)向收集的人脐静脉血管内皮细胞中加入台盼蓝，反应浓度为0.4％，混匀后进行计数，根据计数的结果调整细胞浓度至(4-8)×104/mL；
(3)将调整后的细胞放置在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养4-8h；
(4)将待检测的血管内皮生长因子溶液稀释到浓度为500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.7ng/ml、7.9ng/ml、4ng/ml和2ng/ml；
(5)向步骤(3)培养后的细胞中加入稀释后的待检测的血管内皮生长因子溶液，混匀后放置在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养85-95h；
(6)向步骤(5)培养后的细胞和血管内皮生长因子的混合液中加入与所述混合液体积比为4:1的阿尔玛蓝显色液，混匀后在含有5％CO2的培养箱中，在37℃下培养2-8h；
(7)将步骤(5)培养后的样品在激发光530nm和发射光590nm下进行荧光强度的检测。
8.一种血管内皮生长因子的质量控制方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将血管内皮生长因子冻干粉进行分装保存；
2)采用如权利要求1-7中任一项所述的检测方法进行血管内皮生长因子活性的检测；
3)根据步骤2)检测的血管内皮生长因子的活性调整所述血管内皮生长因子的添加量。
9.根据权利要求8所述的质量控制方法，其特征在于，步骤1)所述分装保存具体包括：
将血管内皮生长因子冻干粉分阶段升温至室温，向所述血管内皮生长因子冻干粉中加入无菌水进行溶解，水浴10-20min，优选为15min，期间每隔3-8min，优选为5min拿出颠倒混匀，将溶解的血管内皮生长因子进行分装，分阶段降温后保存；
优选地，所述分阶段升温具体包括：将管内皮生长因子冻干粉从-20℃转移到4℃平衡过夜，再从4℃转移到室温平衡1-5h，优选为2h；
优选地，所述水浴的温度为20-30℃，优选为25℃；
优选地，所述分阶段降温具体包括：将管内皮生长因子溶液室温放置3-10min，优选为5min，转移到4℃平衡过夜，再转移到-20℃保存。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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