CN105044057B - 一种利用石墨烯量子点与纳米金检测l‑半胱氨酸浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用石墨烯量子点与纳米金检测L‑半胱氨酸浓度的方法，包括：制备包含有石墨烯量子点和纳米金的检测溶液；建立检测溶液的荧光强度与L‑半胱氨酸浓度的线性关系；向L‑半胱氨酸的待测溶液中加入检测溶液，检测待测溶液的荧光强度，根据步骤二建立的线性关系，确定待测溶液中L‑半胱氨酸的浓度。本发明将石墨烯量子点作为探针，利用纳米金猝灭石墨烯量子点荧光，而L‑半胱氨酸与纳米金结合使石墨烯量子点荧光恢复的特性，对半胱氨酸进行检测，检测过程简单方便，灵敏度高、检测限低，可实现混合样品中L‑半胱氨酸的快速灵敏检测，本发明公开的方法对L‑半胱氨酸的检测限可达到1.5×10‑8mol/L。
Description
技术领域
本发明涉及L-半胱氨酸的检测，特别涉及一种利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法。
背景技术
L-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中惟一具有还原性基团巯基(-SH)的氨基酸，现今已在医药、食品添加剂和化妆品中广泛应用。2002年全世界对L-半胱氨酸的需求达到4400～4600吨，而且以每年2～3％速度递增，其中西欧需求的递增速度达到3～4％，日本则为2％。国内现今，L-半胱氨酸的生产主要依靠人或动物的毛发经酸水解或碱水解提取L-胱氨酸后，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。该方法收率低，能耗高，水解过程产生大量刺激性气体，废酸处理困难，对环境污染严重。随着L-半胱氨酸生产技术的发展，微生物转化法制生产L-半胱氨酸逐渐取代了毛发水解制备L-半胱氨酸。微生物转化法制备工艺以其反应条件温和、专一性强、对环境友好等优点而日益受到重视。德国的WACKER公司已经成功的进行商业化生产发酵法L-半胱氨酸，其年产量已经达到世界总产量的30％，相信在不久的将来，在国内占主导地位的水解法L-胱氨酸生产L-半胱氨酸的会成为历史。
此外，半胱氨酸是一种天然产生的氨基酸，在食品加工中具有许多用途，它主要用于焙烤制品，作为面团改良剂的必需成分。L-半胱氨酸是一种还原剂，它可以促进面筋的形成，减少混合所需的时间和所需药用的能量，L-半胱氨酸通过改变蛋白质分子之间和蛋白质分子内部的二硫键，减弱了蛋白质的结构，这样蛋白质就伸展开来。L-胱氨酸同时也是生产肉味香精所必须的原材料，其反应原来为美拉德反应，肉味香精广泛的应用于薯条、医药、火腿肠等领域。
近年来，石墨烯量子点作为一种新型荧光探针，引起多个研究领域的广泛关注。与传统的半导体量子点和荧光碳点相比，石墨烯量子点具有十分优越的物理化学性质，如：细胞毒性低、生物相容性好、荧光稳定性强、抗光漂白性能强等。这些优越的光谱性质使石墨烯量子点荧光探针广泛应用于生化分析检测领域，发挥了巨大的应用潜力。但迄今为止，将石墨烯量子点荧光探针与纳米金结合检测L-半胱氨酸的相关报道仍未见。
发明内容
本发明设计开发了一种利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法。
本发明提供的技术方案为：
一种利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法，包括以下步骤
步骤一、制备包含有石墨烯量子点和纳米金的检测溶液；
步骤二、建立检测溶液的荧光强度与L-半胱氨酸浓度的线性关系；
步骤三、向L-半胱氨酸的待测溶液中加入检测溶液，检测待测溶液的荧光强度，根据步骤二建立的线性关系，确定待测溶液中L-半胱氨酸的浓度。
优选的是，所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法中，所述步骤一中，将浓度为0.92nM的纳米金溶液与浓度为1.4mg/ml的石墨烯量子按体积比为6∶1混合。
优选的是，所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法中，所述步骤二中，建立检测溶液的荧光强度与L-半胱氨酸浓度的线性关系，具体为：
A、配置多个不同浓度的L-半胱氨酸溶液，作为标准溶液；
B、调节标准溶液的pH值至6；
C、取相同体积的标准溶液，作为测量溶液，向每个测量溶液中加入相同体积的检测溶液；
D、检测每个添加了检测溶液的测量溶液的荧光强度，建立检测溶液的荧光强度与L-半胱氨酸的浓度的线性关系。
优选的是，所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法中，所述B中，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液调节标准溶液的pH值至6。
优选的是，所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法中，所述C中，每个检测溶液与测量溶液按体积比为15∶7混合。
优选的是，所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法中，所述步骤D中，检测每个添加了检测溶液的测量溶液的荧光强度时，采用的荧光检测的激发波长为345nm。
优选的是，所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法中，所述步骤三中，
用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液调节待测溶液的pH值至6；
向调节pH值后的待测溶液中加检测溶液，检测待测溶液的荧光强度；
根据步骤二建立的线性关系，确定待测溶液中L-半胱氨酸的浓度。
优选的是，所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法中，所述步骤三中，
检测加入了检测溶液的待测溶液的荧光强度时，采用的荧光检测的激发波长为345nm。
优选的是，所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法中，所述步骤一中，纳米金溶液的制备方法为：
S1、将浓度为10mM的氯金酸和超纯水按体积比为1∶10混合，得到稀释的氯金酸溶液，加热煮沸稀释的氯金酸溶液；
S2、向煮沸的稀释的氯金酸溶液中加入浓度为1％的柠檬酸钠溶液，继续煮沸15min，停止加热，室温冷却，得到纳米金溶液，其中柠檬酸钠溶液与稀释的氯金酸溶液的体积比为：3∶55；
S3、S2制备得到的纳米金溶液于4℃避光保存。
优选的是，所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法中，
制备纳米金溶液中用到的玻璃仪器，在使用前，均先用王水清浸泡24h后，再用清水冲洗，去除王水。
本发明将石墨烯量子点作为探针，利用纳米金猝灭石墨烯量子点荧光，而L-半胱氨酸与纳米金结合使石墨烯量子点荧光恢复的特性，对半胱氨酸进行检测，检测过程简单方便，灵敏度高、检测限低，可实现混合样品中L-半胱氨酸的快速灵敏检测，本发明公开的方法对L-半胱氨酸的检测限可达到1.5×10-8mol/L。
附图说明
图1为本发明的L-半胱氨酸与石墨烯量子点与纳米金混合液反应后，激发波长为345nm时得到的荧光光谱图。
图2为本发明的检测溶液的荧光强度与L-半胱氨酸浓度之间的线性关系曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
一种利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法，包括：
步骤一、制备包含有石墨烯量子点和纳米金的检测溶液，具体为：
将浓度为0.92nM的纳米金溶液与浓度为1.4mg/ml的石墨烯量子按体积比为6∶1混合，得到检测溶液；
其中，纳米金溶液的制备方法为：
将本制备纳米金溶液时用到的玻璃仪器，用新配置的王水清浸泡24h，将玻璃仪器从王水中取出，用清水多次冲洗，去除玻璃仪器上附着的王水；
S1、将10ml浓度为10mM的氯金酸和100ml超纯水混合，得到稀释的氯金酸溶液，加热煮沸稀释的氯金酸溶液；
S2、向煮沸的稀释的氯金酸溶液中加入6ml浓度为1％的柠檬酸钠溶液，继续煮沸15min，停止加热，室温冷却，得到纳米金溶液；
S3、将制备得到的纳米金溶液于4℃避光保存，备用。
步骤二、建立检测溶液的荧光强度与L-半胱氨酸浓度的线性关系；具体为：
A、配置浓度为0mol/L、5×10-7mol/L、4×10-6mol/L、8×10-6mol/L、2×10-5mol/L和3×10-5mol/L的L-半胱氨酸溶液作为标准溶液，其编号分别为a、b、c、d、e和f；
B、用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液，调节标准溶液的pH值至6；
C、取相同体积的标准溶液置于比色皿中，作为测量溶液，向每个比色皿中加入相同体积的检测溶液，最终使得每个比色皿中的溶液的总体积为3ml，且每个比色皿中的检测溶液与测量溶液的体积比为15∶7；
D、用荧光光度计检测在激发波长为345nm下，检测每个比色皿中溶液的荧光强度；
检测结果如图1所示(图1不对，浓度与荧光强度不对应)，图1所示的荧光光谱中a为0ml/L的L-半胱氨酸和测量溶液的混合液的荧光强度曲线，b为5×10-7mol/L的L-半胱氨酸和测量溶液的混合液的荧光强度曲线，c为4×10-6mol/L的L-半胱氨酸和测量溶液的混合液的荧光强度曲线，d为8×10-6mol/L的L-半胱氨酸和测量溶液的混合液的荧光强度曲线，e为2×10-5mol/L的L-半胱氨酸和测量溶液的混合液的荧光强度曲线，f为3×10-5mol/L的L-半胱氨酸和测量溶液的混合液的荧光强度曲线，g为浓度为1.4mg/ml的石墨烯量子溶液的(空白石墨烯量子点)的荧光强度曲线；
根据a～f的标准溶液的荧光强度曲线，建立检测溶液的荧光强度与L-半胱氨酸的浓度的线性关系，如图2所示，横坐标X为L-半胱氨酸浓度，纵坐标为Y荧光强度比值，线性方程Y＝0.004X+7.485x10-4，R2＝0.999。
步骤三、检测L-半胱氨酸的待测溶液的L-半胱氨酸的浓度，具体为：
用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液调节L-半胱氨酸待测溶液的pH值至6，取一定体积的待测溶液和检测溶液置于荧光比皿中，比色皿中的溶液的总体积为3ml，且比色皿中的检测溶液与测量溶液的体积比为15∶7；
用荧光光度计检测在激发波长为345nm下，检测比色皿中溶液的荧光强度，根据步骤2建立的线性方程，确定待测溶液中L-半胱氨酸的浓度。
本发明公开的方法对L-半胱氨酸的检测限可达到1.5×10-8mol/L。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.一种利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤
步骤一、制备包含有石墨烯量子点和纳米金的检测溶液：将浓度为0.92nM的纳米金溶液与浓度为1.4mg/ml的石墨烯量子按体积比为6:1混合；
步骤二、建立检测溶液的荧光强度与L-半胱氨酸浓度的线性关系；
步骤三、用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液调节L-半胱氨酸的待测溶液的pH值至6；向调节pH值后的待测溶液中加检测溶液，检测待测溶液的荧光强度；根据步骤二建立的线性关系，确定待测溶液中L-半胱氨酸的浓度；其中，检测加入了检测溶液的待测溶液的荧光强度时，采用的荧光检测的激发波长为345nm。
2.如权利要求1所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述步骤二中，建立检测溶液的荧光强度与L-半胱氨酸浓度的线性关系，具体为：
A、配置多个不同浓度的L-半胱氨酸溶液，作为标准溶液；
B、调节标准溶液的pH值至6；
C、取相同体积的标准溶液，作为测量溶液，向每个测量溶液中加入相同体积的检测溶液；
D、检测每个添加了检测溶液的测量溶液的荧光强度，建立检测溶液的荧光强度与L-半胱氨酸的浓度的线性关系。
3.如权利要求2所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述B中，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液调节标准溶液的pH值至6。
4.如权利要求2所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述C中，每个检测溶液与测量溶液按体积比为15:7混合。
5.如权利要求2所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述步骤D中，检测每个添加了检测溶液的测量溶液的荧光强度时，采用的荧光检测的激发波长为345nm。
6.如权利要求1所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述步骤一中，纳米金溶液的制备方法为：
S1、将浓度为10mM的氯金酸和超纯水按体积比为1:10混合，得到稀释的氯金酸溶液，加热煮沸稀释的氯金酸溶液；
S2、向煮沸的稀释的氯金酸溶液中加入浓度为1％的柠檬酸钠溶液，继续煮沸15min，停止加热，室温冷却，得到纳米金溶液，其中柠檬酸钠溶液与稀释的氯金酸溶液的体积比为：3:55；
S3、S2制备得到的纳米金溶液于4℃避光保存。
7.如权利要求6所述的利用石墨烯量子点与纳米金检测L-半胱氨酸浓度的方法，其特征在于，
制备纳米金溶液中用到的玻璃仪器，在使用前，均先用王水清浸泡24h后，再用清水冲洗，去除王水。
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