CN104726531A

CN104726531A - 评价细胞因子TNF-α生物活性的体外检测方法

Info

Publication number: CN104726531A
Application number: CN201510163674.8A
Authority: CN
Inventors: 王少雄; 张宵; 吕品; 刘丹莉
Original assignee: Shanghai Bo Wei Biological Medicine Co Ltd
Current assignee: Shanghai Bo Wei Biological Medicine Co Ltd
Priority date: 2015-04-08
Filing date: 2015-04-08
Publication date: 2015-06-24

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于细胞因子TNF-α的细胞毒性作用评价细胞因子TNF-α生物活性的体外检测方法。本发明公开了一种评价细胞因子TNF-α生物活性的体外检测方法，该方法操作简单，不需要使用十分昂贵的材料与仪器设备，完成方法验证，完全满足方法准确度、精密度及耐用性等方面的要求，其活性检测范围达到50％-150％，重复性及中间精密度检测结果RSD均小于10％，且实验4参数拟合曲线的拟合常数R²均大于0.99，双复孔的CV％均小于15％。因此能够快速、准确、高效的对针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性进行检测。此外，本发明实验方法稳定且易于操作，完全能够满足推广以及高通量操作，满足进行基于细胞因子TNF-α细胞毒性作用的细胞因子TNF-α生物活性检测及其稳定性研究的需要。

Description

评价细胞因子TNF-α生物活性的体外检测方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种评价细胞因子TNF-α生物活性的体外检测方法。

背景技术

肿瘤坏死因子(TNF-α)由单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞等分泌,主要的生理作用包括影响细胞的凋亡、增殖、分化以及细胞功能。TNF-α与其受体结合后,能启动一系列的细胞内事件,如作用于巨噬细胞、促进炎症因子、化学因子的释放,加重炎症反应；作用于内皮细胞,促进分泌粘附分子,增加细胞通透性；作用于成纤维细胞和上皮细胞,影响组织重构和离子转运通透性等。经研究发现TNF-α对靶细胞具有明显的细胞毒作用，细胞死亡率与其浓度呈线性相关。目前已经证实,TNF-α与人类许多疾病有密切关系，如类风湿性关节炎、炎症性肠病等,抑制TNF-α的过度生成和活化能够有效地抑制各种炎症反应,促进组织愈合。基于此，TNF-α是一种重要的促炎症因子和免疫调节因子，具有广泛的生物学功能，该细胞因子TNF-α也是单克隆抗体、蛋白酶抑制剂等生物治疗药物研发领域的重要靶点分子。

在利用DNA重组技术体外表达制备TNF-α过程中，为了便于从大量候选克隆中筛选到能够表达具有生物活性细胞因子的目标克隆，或者是基于该细胞因子的产品放行或稳定性研究，研究人员需要建立快速，高效的体外检测手段用于准确评价TNF-α的生物学活性。生物活性体外检测方法可以基于ELISA或细胞学实验。ELISA实验主要考察TNF-α与受体的结合能力，细胞水平实验则除了考察结合能力外还可评价TNF-α与受体结合之后的生物学功能，基于细胞水平的活性检测更能反映生物制品的体内作用机理。然而在工业界，基于产品筛选、放行、稳定性研究的细胞水平活性检测方法的建立是比较复杂的。包括细胞系选择、活性方法各个参数的优化、方法实验流程的选择等。除此之外，方法验证也有严格的要求，包括准确度、精密度、耐用性等。只有满足这些要求的方法才能保证生物活性检测结果的可靠，用于指导生物制品筛选、产品放行及稳定性研究等工作。此外，在相同的实验条件下，最终确定的方法越简单，操作步骤越少越好，因为这样才更加灵活，利于推广，并且适用于高通量工作。

以基于细胞因子TNF-α的细胞水平生物活性方法开发为例，TNF-α对高表达TNF-α受体的L929小鼠成纤维细胞具有明显的细胞毒作用，是通过TNF-α与细胞表面受体相互作用后介导下游信号传导来杀死细胞的。根据实验设计作用机理一致性原则，研究人员通常利用重组TNF-α对L929细胞的体外杀伤细胞毒作用来评价其生物学活性。然而到目前为止，该细胞学活性方法，并未得到公认或标准化，关键实验参数包括细胞铺板密度，TNF-α与细胞作用时间，显色时间以及显色方式等不同文献的报道也并不一致。更重要的是，在已经报道的TNF-α细胞毒活性方法中，缺乏对检测体系的方法学验证研究，包括准确性、精密度、耐用性等方面的相关评价，难以保证检测结果的稳定性与可靠性。已知文献报道的TNF-α细胞毒检测方法难以满足TNF-α克隆株筛选、生产放行以及稳定性研究的需要。

所以一种能够克服上述缺陷的TNF-α细胞毒检测方法是十分具有实用价值的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上存在的问题与不足，提供一种在评价细胞因子TNF-α生物活性过程中，对具有生物活性TNF-α进行筛选、产品放行测试、稳定性评价的细胞毒生物活性检测方法。该方法能够满足方法验证过程中对准确性，精密度包括重复性，中间精密度，以及耐用性等方面的要求，能够满足TNF-α在研发筛选以及生产过程中的需要。

本发明公开了一种评价细胞因子TNF-α生物活性的体外检测方法，包括下列步骤：

步骤(1)：取对数生长期表达TNF-α受体的细胞经酶消化后，用完全培养基制成细胞悬液，计数并计算所述的细胞悬液中的细胞密度及活率，并调整活细胞密度为n×10⁵个/ml，得到调整后的细胞悬液；

步骤(2)：将所述的调整后的细胞悬液等体积加入细胞培养板的孔中，同时设立空白对照孔，所述的空白对照孔被加入等体积所述的完全培养基，然后将所述的细胞培养板置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养23-25h，得到第一细胞培养板；

步骤(3)：取基础培养基、FBS、放线菌数D，配置成含FBS、放线菌数D(ActD)浓度的样品稀释液；

步骤(4)：取参考品及供试品，分别用所述的样品稀释液进行稀释，得到稀释浓度范围的参考品、供试品溶液；

步骤(5)：取步骤(2)中的所述的第一细胞培养板，将所述的稀释浓度的参考品、供试品以等体积依次加入所述的第一细胞培养板的孔中，所述的空白对照孔则加入等体积的样品稀释液，得到第二细胞培养板；

步骤(6)：将所述的第二细胞培养板放置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养16-18h，得到第三细胞培养板；

步骤(7)：采用检测活细胞或死细胞量的检测体系对所述的第三细胞培养板进行显色反应；

步骤(8)：所述的显色反应完成后，测定所述的显色反应的结果，并根据测定结果计算供试品的细胞毒生物活性。

较佳地，所述n＝3-5。

较佳地，所述的对数生长期表达TNF-α受体的细胞是小鼠成纤维细胞L929。该细胞对TNF-α高度敏感，可用于检测其中的TNF-α活性。

较佳地，所述的完全培养基是含10％FBS的MEM完全培养基。

较佳地，所述的样品稀释液是含2％FBS、1μg/mL放线菌数D的MEM分析培养基。

较佳地，步骤(4)中的所述稀释是用样品稀释液制备参考品及供试品溶液，所述的参考品及供试品溶液的浓度范围是20ng/mL-5.1×10^-5ng/mL。

较佳地，在步骤(7)中，所述的检测活细胞或死细胞量的检测体系包括四唑类化合物氧化还原检测体系、ATP总量检测体系或LDH释放量检测体系。

更佳地，所述的四唑类化合物为MTT、MTS或CCK-8。其中优选为MTS。相对于其他四唑类化合物如MTT而言，MTS所形成的还原显色物质可直接溶于水相，无需添加DMSO助溶，因此使用更加方便，检测灵敏度也较高。

较佳地，所述的细胞培养板为96孔细胞培养板。以便于高通量地进行TNF-α细胞毒生物活性评价。

发明术语“参考品”是指已市售的重组人TNF-α蛋白，已公知其对表达TNF-α受体的细胞表现出细胞毒生物活性。

采用本发明的评价细胞因子TNF-α生物活性的体外检测方法，其作用机理为针对TNF-α细胞因子的细胞毒性作用，能够快速，准确，高效的对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性进行检测，用于其体外活性评价。该方法特异性强，准确性高，测定活性范围达到50％-150％；精密度高，重复性，中间精密度RSD均小于10％，并且双复孔的CV％小于15％，4参数拟合的拟合常数R²均大于0.98。此外，本发明并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的操作，便于推广以及高通量操作，完全能够满足其在针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性的筛选、产品放行以及稳定性评价的需要。

附图说明

图1为实施例1的TNF-α细胞毒生物活性检测参考品及供试品实验4参数拟合图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

一、材料和试剂

材料：细胞因子TNF-α细胞毒作用的参考品-重组人TNF-α蛋白(Invitrogen，Cat.No.PHC3013)，对参考品进行稀释分别得到不同效价水平(50％，75％，100％，125％，150％)的TNF-α供试品，放线菌素D-ActD(MedChemExpress，Cat.No.HY-17559)。

试剂：染色液MTS(Promega，Cat.No.G3581)，MEM培养基(HyClone，Cat.No.SH30024.01B)，胰蛋白酶(GIBCO，Cat.No.25200-072)，FBS(GIBCO，Cat.No.10099-141)。

溶液配制：

MEM完全培养基：取450ml MEM基础培养基，加入50ml FBS，配成500ml含FBS 10％的MEM完全培养基，2-8℃避光保存。

放线菌素D母液：取1瓶放线菌素D(5mg/瓶)，加入1ml DMSO溶解，混匀，制成5mg/ml放线菌素D母液，分装，-15to-25℃避光保存。

细胞株：L929小鼠成纤维细胞株(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号：GNM28)

二、检测方法步骤

1)细胞铺板：取对数生长期的L929细胞经胰蛋白酶消化后用MEM完全培养基制成单细胞悬液。计数，并计算细胞密度及活率，调整活细胞密度至3.0-5.0×10⁵个/ml，以50μl/孔加入96孔细胞培养板中。空白对照孔则以50μl/孔加入MEM完全培养基。完成后将细胞培养板置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养23-25h，使细胞贴壁。

2)参考品及供试品稀释：取MEM基础培养基、FBS和放线菌素D(ActD)母液制备含2％FBS、1μg/mL的MEM分析培养基作为样品稀释液,取参考品及供试品，根据标示浓度，用样品稀释液进行稀释至合适浓度，浓度范围是20ng/mL-5.1×10^-5ng/mL。

3)加样：取贴壁后的细胞培养板，接着将稀释好的参考品及供试品以50μl/孔依次加入铺好细胞的细胞培养板中，空白对照孔则以50μl/孔加入样品稀释液，2-3复孔。完成后将细胞培养板放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养16-18h。

4)显色：采用MTS显色体系分别对细胞培养板中参考品孔，供试品孔，空白对照孔中以20μl/孔加入MTS。完成后将细胞培养板放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中继续孵育1.5-2.5h。

5)读数：取出细胞培养板混匀，放入酶标仪，以650nm为参比波长，在490nm下测定参考品孔，供试品孔及空白对照孔的OD_490-650，记录测定结果。

6)结果分析：用参考品孔、供试品孔OD值与加药浓度的量效关系进行4参数拟合，确定参考品与供试品的EC₅₀值，曲线拟合常数R²，复孔CV％。按照下列公式计算供试品的细胞毒生物活性：

实施例1 评价细胞因子TNF-α生物活性的体外检测方法

以参考品和75％、125％效价水平TNF-α供试品为材料，采用上述检测方法步骤考察75％、125％效价水平TNF-α供试品的生物学活性。

结果如图1所示，TNF-α参考品、供试品实验曲线4参数拟合情况良好，曲线拟合常数R²均满足＞0.98，不同加药稀释浓度下2复孔检测OD值的CV％均满足＜15％。通过与参考品EC₅₀值的比较，75％效价水平供试品的细胞毒生物活性检测结果为76％，125％效价水平供试品的细胞毒生物活性检测为126％，均与理论值接近。

实施例2 准确性评价试验

以参考品(同实施例1)和不同效价水平供试品(50％，75％，100％，125％，150％)为材料，2名实验人员(Analyst 1、2)各自独立的采用上述检测方法对这5个效价水平供试品进行细胞毒生物活性检测。

结果如表1，对效价水平分别为50％，75％，100％，125％，150％的5个供试品，2名实验人员利用本发明方法对这些供试品的检测结果均满足4参数拟合曲线的拟合常数R²＞0.98，2复孔的CV％均满足＜15％，并且不同人员对不同效价水平供试品的实测值相对于理论值的平均偏差(回收率)均满足在95％-105％的范围内。说明在检测针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性时，本发明方法对活性范围在50％-150％内的供试品，能够达到准确性要求。

表1.针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性检测准确性评价结果汇总表

实施例3 精密度评价试验

以参考品(同实施例1)及不同效价水平供试品为材料，对本发明所述方法的精密度进行评价。2名实验人员(Analyst 1、2)采用上述检测方法步骤对效价水平分别为50％，75％，100％，125％，150％的5个供试品进行细胞毒生物活性检测，各平行实验3次，考察方法的重复性，2名实验人员(Analyst 1、2)在不同的3天内采用上述检测方法步骤对75％效价水平供试品进行细胞毒生物活性检测，考察方法的中间精密度。

如表2，利用上述检测方法，由不同实验人员对5个效价水平供试品各进行3次平行检测，结果均满足参考品和供试品的4参数拟合曲线的拟合常数R²＞0.98，2复孔的CV％均满足＜15％，并且各个活性效价水平供试品的3次重复检测结果的RSD满足＜10％，说明在检测针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性时，本发明方法的重复性满足方法精密度要求。

如表3，由不同实验人员在不同的3天内对75％活性效价水平供试品进行平行检测，结果均满足参考品和供试品的4参数拟合曲线的拟合常数R²＞0.99，2复孔的CV％均满足＜15％，并且3次检测结果的RSD满足＜10％，说明在检测针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性时，本发明方法的中间精密度满足方法精密度要求。

表2.针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性检测重复性评价结果汇总表

表3.针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性检测中间精密度评价结果汇总表

实施例4 耐用性评价试验

以参考品(同实施例1)及75％效价水平TNF-α供试品为材料，分别选择不同细胞孵育时间(23h、25h)，不同样品孵育时间(16h、18h)，采用上述检测方法步骤对75％效价供试品进行细胞毒生物活性检测，考察孵育时间对方法稳定性的影响。

表4.针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性检测耐用性(孵育时间)评价结果汇总表

如表4，使用不同细胞以及样品孵育时间，利用该检测方法对75％效价供试品进行检测，结果均满足参考品和供试品的4参数拟合曲线的拟合常数R²＞0.98，2复孔的CV％均满足＜15％，并且不同孵育时间条件下，同一供试品检测结果的RSD满足＜10％且与理论值接近，说明在上述孵育时间条件下，方法检测针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性时满足方法耐用性要求。

实施例5 样品稀释液中不同ActD作用浓度的优化

以TNF-α参考品为材料，分别用含不同ActD作用浓度(0.5μg/mL，1.0μg/mL，2.0μg/mL)的样品稀释液进行样品稀释，采用上述检测方法步骤对参考品细胞毒作用量效关系的4参数拟合曲线进行绘制与考察，确定合适的ActD作用浓度。

如表5，不同ActD作用浓度条件下4参数拟合曲线的EC₅₀值随着ActD作用浓度的提高而降低.但比较ActD浓度为1μg/mL和2μg/mL的检测情况，EC₅₀值的降低趋势并不明显，说明ActD浓度为1μg/mL时，在这个检测体系下，ActD的用量是饱和的。如果ActD用量未饱和，则可能检测体系无法充分表现TNF-α的细胞毒生物活性，导致检测结果稳定性较差。而ActD用量过多则会造成实验成本较高。在该背景下，最终选择样品稀释液中ActD浓度为1μg/mL用以检测针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性。

表5.不同ActD浓度4参数拟合曲线结果汇总表

ActD Conc.(μg/mL)	EC₅₀(TNF-α,ng/mL)	细胞杀伤率％	R²
				0.5	0.0280	85％	0.999
1.0	0.0182	86％	0.999
				2.0	0.0163	86％	0.999

实施例6 样品稀释液中FBS浓度的影响

以TNF-α参考品为材料，分别用含不同FBS作用浓度(0％，2％，5％)的样品稀释液进行样品稀释，采用上述检测方法步骤对参考品细胞毒作用量效关系的4参数拟合曲线进行绘制与考察，确定合适的FBS作用浓度。

结果如表6，从不同实验条件下4参数曲线EC₅₀值的变化可以发现样品稀释液中如果不添加FBS则TNF-α对L929细胞的细胞毒性生物活性基本消失，而无论2％或5％FBS则对TNF-α的细胞毒生物活性没有显著影响。很可能是样品稀释液中需要加入一定量FBS保护TNF-α在稀释过程中不被降解破坏，考虑到方法的有效性及成本，最终确定样品稀释液中FBS浓度为2％。

表6.不同FBS浓度4参数拟合曲线结果汇总表

FBS Conc.(％)	EC₅₀(TNF-α,ng/mL)	细胞杀伤率％	R2
				5％	0.0204	84％	0.999
2％	0.0261	85％	1
				0％	7.32	67％	0.987

综上所述，本发明建立了一种针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性检测方法，该方法快速，高效，易推广，适合高通量作业，通过对方法准确度，精密度以及耐用性等多方面验证和考察证实了该发明方法具有稳定性强，适用性好等特点，能够满足针对细胞因子TNF-α的生产及研发过程中，对具有细胞毒生物活性TNF-α的筛选、产品放行以及稳定性评价的需要。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims

1.一种评价细胞因子TNF-α的生物活性体外检测方法，包括下列步骤：

步骤(3)：取基础培养基、FBS、放线菌数D，配置成含FBS、放线菌数D浓度的样品稀释液；

2.如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-α的生物活性体外检测方法，其特征在于，所述n＝3-5。

3.如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-α的生物活性体外检测方法，其特征在于，所述的对数生长期表达TNF-α受体的细胞是小鼠成纤维细胞L929。

4.如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-α的生物活性体外检测方法，其特征在于，所述的完全培养基是含10％FBS的MEM完全培养基。

5.如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-α的生物活性体外检测方法，其特征在于，所述的样品稀释液是含2％FBS、1μg/mL放线菌数D的MEM分析培养基。

6.如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-α的生物活性体外检测方法，其特征在于，步骤(4)中的所述稀释是用样品稀释液制备参考品及供试品溶液，所述的参考品及供试品溶液的浓度范围是20ng/mL-5.1×10^-5ng/mL。

7.如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-α的生物活性体外检测方法，其特征在于，在步骤(7)中，所述的检测活细胞或死细胞量的检测体系包括四唑类化合物氧化还原检测体系、ATP总量检测体系或LDH释放量检测体系。

8.如权利要求7所述的评价细胞因子TNF-α的生物活性体外检测方法，其特征在于，所述的四唑类化合物为MTT、MTS或CCK-8。

9.如权利要求1所述的评价细胞因子TNF-α的生物活性体外检测方法，其特征在于，所述的细胞培养板为96孔细胞培养板。