CN104781670B - 标志物用于识别心脏毒性剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于诊断和预后心血管疾病，以及用于监测包括心力衰竭和心肌病的心血管疾病的治疗的方法。本发明进一步提供了通过使用选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0‑20:3/D18:1‑20:2/D16:0‑22:3；PE D18:0‑22:5/D18:1‑22:4；PE D16:1‑22:6；PE P18:1‑18:1/P18:0‑18:2/P16:0‑20:2；LPC 20:3；和PC‑LI‑183‑D18:22‑22:6或本文所提供的任何其它生物标志物的一种或多种生物标志物用于识别用于治疗心肌病或心力衰竭的药剂，用于识别心脏毒性剂，以及用于识别减轻或防止药物诱导的毒性的救援剂的方法。本发明进一步提供了用于实施本发明的方法的试剂盒。

Description

标志物用于识别心脏毒性剂的用途
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年9月12日提交的61/700327号；2012年9月27日提交的61/706611号；2012年11月15日提交的61/727104号；2012年11月16日提交的61/727115号；和2012年11月30日提交的61/732105号美国临时申请的优先权。上述申请的全文通过引用在此引入。
发明背景
心血管疾病(也称为心脏疾病)是一类涉及心脏、血管(动脉、毛细血管和静脉)或这两者的疾病。心血管疾病可以指影响心血管系统的任何疾病，主要是心脏疾病、脑和肾的血管疾病及外周动脉疾病。心血管疾病的原因是多种多样的，但动脉粥样硬化和/或高血压是最常见的。此外，随着年龄变老，出现了许多生理和形态学的变化，其改变心血管功能并随后导致心血管疾病的风险增加，甚至在健康无症状的个体中。
心肌病是指心肌的疾病。这些疾病有很多的原因、征兆和症状及治疗。在心肌病中，心肌变大、变厚或变硬。在少数情况下，心脏中的肌肉组织被疤痕组织所代替。当心肌病恶化时，心脏变得更衰弱。它泵送血液通过身体并保持正常的电节律的能力降低。这可能会导致心力衰竭或不规则的心跳(称为心律失常)。随之，心力衰竭可以引起肺、踝、脚、腿或腹部中的液体积聚。心脏的衰弱也可能引起其他并发症，如心脏瓣膜问题。
心肌病的主要类型是扩张型心肌病、肥厚性心肌病、限制型心肌病和致心律失常性右心室发育不良。其他类型的心肌病有时被称为“未分类型心肌病”。心肌病可以是后天的或遗传的，其中肥厚型心肌病和致心律失常性右心室发育不良基本上是遗传性疾病。在某些受试者中，遗传的心肌病不明显直到出现灾难性的事件(例如，心脏病发作)。然而，在缺乏遗传性心肌病的一些已知家族病史的情况下，普通人群筛查是不实际的，因为心肌病的诊断和监测使用医疗和家族史、身体检查、血液检查及成像和功能分析(包括胸部X光检查、EKG(心电图)、动态心电图和事件监控器、超声心动图、压力测试、心导管插入术、冠状动脉造影、心肌活检及遗传学检验的组合进行。
心肌病可通过其它疾病或病症或者通过各种毒素或药物诱发。例如，冠状动脉心脏病、心脏病发作、高血压、糖尿病、甲状腺疾病、病毒性肝炎和HIV可以导致扩张型心肌病；感染，特别是使心肌发炎的病毒感染可导致心肌病；酒精，特别是与不良的饮食习惯相结合；妊娠的最后一个月或出生5个月内的并发症；某些毒素，如钴；和某些药物(如可卡因和安非他明)和化疗药物(例如，蒽环类药物如阿霉素和柔红霉素)和用于治疗糖尿病的药物，其可能会导致突然性心肌病事件。限制型心肌病可由如血色素沉着症、结节病、淀粉样变性和结缔组织疾病的病症以及某些癌症治疗如放疗和化疗导致。
心脏中毒是药剂的发展和批准中的重要障碍。目前制药业进入临床开发的潜在化合物发生90％的损耗，其中的30％是由于差的临床安全性(Kola等(2004)Nat Rev DrugDiscovery:3711-715)。在美国，致命的药物不良反应(ADR)是导致死亡的第4至第6位的主要原因。在美国，直接归因于ADR的费用可能导致每年直接医疗费用增加15.6至40亿美元(Lazarou J等(1998)JAMA；279(15):1200-1225)。药物发现和开发的成本已上升到约10亿美元，部分是由于花费在化合物和后期临床开发的NME的损耗增加(Adams CP,Brantner VV(2010)Spending on New Drug Development.Health Econ.19:130–141)。缺乏可以在药物研发早期帮助预测毒性的可靠工具部分地导致成本增加和投资回报率较低。此外，药品安全性问题是在制药行业中增长的诉讼和赔款的主要原因。在2009年1月和2011年5月之间，业界已经对有关药品安全性问题的诉讼案件花费了超过80亿美元。
为了强化在早期临床试验和药物开发中化合物的“早期终止策略(kill earlypolicy)”，FDA当前鼓励制药行业和社区采取高创新性的策略。FDA白皮书创新或停滞：对新医疗项目的关键路径面临的挑战与机遇(Innovation or Stagnation:Challenges andOpportunity on the Critical Path to New Medical Projects)指出，“迫切需要包含功能强大的新的科学和技术方法如基于动物或计算机的预测模型、用于安全性和有效性的生物标志物以及新的临床评价技术的新产品开发工具包以提高沿着从实验室概念至商业产品的关键路径的预测性和效率”(FDA，2005)。FDA声明中明确强调了缺乏能够帮助药物开发中的有效决策的创新技术的问题。
心脏毒性指由包括治疗性分子的药剂诱导的对心脏功能产生的广泛的不良影响。心脏毒性可能在临床前研究的早期出现或在临床环境中的后期变得明显。这是药物召回的主要原因，占1994年以来所有召回药物的45％以上，这导致对于药物开发的重大的财政负担。心脏毒性导致包括延长的QT间期、心律失常、心肌缺血、高血压和血栓栓塞性并发症以及心肌功能障碍的状况。
目前由FDA使用的心脏安全性生物标志物包括QTc间期延长-神经电生理性心律失常、循环肌钙蛋白c、心率、血压、脂质、肌钙蛋白、C-反应蛋白(CRP)、脑或B型利钠肽(BNP)、离体血小板聚集和成像生物标志物(心脏磁共振成像)。QTc间期延长是非常稳定但复杂的标志物。然而，仅仅基于QTc很难在早期开发中做出停止或维持药物的决定。此外，QTc是主观性的并取决于可导致心动过速(tachyarrythmias)的基础病理。
因此，迫切需要用于分析药物和候选药物的心脏安全性的新的生物标志物，在受试者中存在或易发包括心肌病和心力衰竭的心血管疾病的生物标志物。
发明概述
本发明至少部分地基于申请人的以下发现：在患心血管疾病(特别是心肌病，包括与心脏毒性剂暴露相关的心肌病)的受试者中，多种标志物被差异调节。本发明还至少部分地基于发现对检测心血管疾病(特别是心肌病，包括与心脏毒性剂暴露相关的心肌病)具有最强的预测能力的特定标志物组合。
本发明提供了使用本文中提供的标志物或标志物的组合在哺乳动物中诊断心血管疾病、监测心血管疾病进展或心血管疾病的治疗、预后心血管疾病、治疗心血管疾病、缓解心血管疾病的症状、抑制心血管疾病的进展和预防心血管疾病的方法。本发明还提供了使用本文中提供的标志物或标志物的组合筛选调节心血管疾病的药剂的方法。本发明还提供了用于筛选或鉴定心脏毒性剂，例如导致或引起心血管疾病的药剂的方法。在本发明的优选实施方式中，心血管疾病是心力衰竭或心肌病，包括与心脏毒性剂暴露相关的心肌病。
本发明提供了用于诊断受试者中的心血管疾病的方法，包括：
(1)检测来自受试者的生物样品中一种或多种心血管疾病(CVD)相关生物标志物的水平，该生物标志物选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(Emmprin)、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PED18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6；和
(2)将来自受试者的生物样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平与对照样品中相应的一种或多种CVD相关生物标志物的水平相比较，其中所述生物样品中一种或多种CVD相关生物标志物相对于对照样品的改变的水平是该受试者患有心血管疾病的指示。
本发明用于识别具有患心血管疾病的提高的风险的受试者，其中该方法包括：
(1)检测来自受试者的生物样品中一种或多种心血管疾病(CVD)相关生物标志物的水平，该生物标志物选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6；和
(2)将来自受试者的生物样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平与对照样品中相应的一种或多种生物标志物的水平相比较，其中所述生物样品中一种或多种CVD相关生物标志物相对于对照样品的改变的水平是该受试者具有患心肌病的提高的风险的指示。
本发明还用于监测受试者中的心血管疾病，其中该方法包括：
(1)检测在第一时间从患有心血管疾病的受试者获得的第一生物样品中一种或多种心血管疾病(CVD)相关生物标志物的水平，该生物标志物选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6；
(2)检测在第二时间从受试者获得的第二生物样品中所述一种或多种CVD相关生物标志物的水平，其中所述第二时间晚于所述第一时间；和
(3)将所述第二样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平与所述第一样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平相比较，其中与所述第一样品相比，该第二样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平的改变是受试者中CVD状态改变的指示。
本发明进一步用于在受试者中监测心血管疾病治疗，其中该方法包括
(1)检测在第一时间从患心血管疾病的受试者获得的第一生物样品中一种或多种心血管疾病(CVD)相关生物标志物的水平，其中该生物标志物选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6；
(2)检测在第二时间从受试者获得的第二生物样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平，其中所述第二时间晚于所述第一时间；和
(3)将所述第二样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平与所述第一样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平相比较，其中与第一样品相比，所述第二样品中一种或多种CVD相关生物标志物水平的正常化是该治疗方案有效治疗受试者中的心血管疾病的指示。
在某些实施方式中，所述心血管疾病包括心肌病。在某些实施方式中，心肌病是选自于扩张型心肌病、肥厚性心肌病、限制型心肌病和致心律失常性右心室发育不良的至少一种病症。在某些实施方式中，心肌病包括选自于延长的QT间期、心律失常、心肌缺血、高血压和血栓栓塞性并发症、心肌功能障碍、心肌病、心力衰竭、心房纤颤、心肌病和心力衰竭、心力衰竭和左心室功能障碍、心房扑动和颤动、心脏瓣膜损伤及心力衰竭中的至少一种病症。在某些实施方式中，心肌病是遗传性心肌病。
在某些实施方式中，所述心肌病是后天性心肌病。在某些实施方式中，后天性心肌病是受试者中一种或多种另外的疾病或病症的合并症。在某些实施方式中，后天性心肌病不是受试者中一种或多种另外的疾病或病症的合并症。在某些实施方式中，受试者中一种或多种另外的疾病或病症选自于冠状动脉心脏病、心脏病发作、高血压、糖尿病、甲状腺疾病、病毒性肝炎、HIVl、使心肌发炎的病毒感染、血色素沉着症、结节病、淀粉样变性和结缔组织病症。
在某些实施方式中，后天性心肌病是受试者暴露于心脏毒素的结果。在某些实施方式中，所述心脏毒素是环境心脏毒素。在某些实施方式中，所述心脏毒素是心脏毒性药物。在某些实施方式中，所述心脏毒性药物选自于过量酒精、安非他明、抗癌药物、化疗药物、糖尿病药物、神经药物、抗炎药、二膦酸盐和TNF拮抗剂。在某些实施方式中，所述抗癌药物选自于顺铂、阿霉素、柔红霉素、蒽环类药物、5-氟尿嘧啶、曲妥珠单抗或吉西他滨。在某些实施方式中，糖尿病药物选自于罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮和卡麦角林。在某些实施方式中，所述药物是心脏毒性药物培高利特或舒马曲坦。
在某些实施方式中，所述心血管疾病包括心力衰竭。
在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括CCDC47或HMOX1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括CCDC47和HMOX1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物还包括PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物还包括PAI1。
在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物还包括选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；和PC-LI-183-D18:22-22:6的至少一种脂质生物标志物。在某些实施方式中，所述脂质包括PC-Li-183-D18:2-22:6。
在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物还包括选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCDC47、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HMOX1、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAI1、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA的至少一种CVD相关生物标志物。
在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括CCDC47。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括EDIL3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括HMOX1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括NUCB1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3和IL27。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47和PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7和CCDC47。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1和IGFBP7。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和HMOX1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括EDIL3、NUCB1、CFL2和PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括NUCB1、CFL2和PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括NUCB1和PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括NUCB1和CFL2。
在某些实施方式中，与正常的受试者相比，选自于PTX3、PAI1、EDIL3和NUC1B的至少一种心血管疾病标志物的水平降低是该受试者患有心血管疾病或具有发生心血管疾病的提高的风险的指示。
在某些实施方式中，与正常的受试者相比，选自于HMOX1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2和CCDC47的至少一种心血管疾病标志物的水平的增加是该受试者患有心血管疾病或具有发生心血管疾病的增加的风险的指示。
在某些实施方式中，与正常的受试者相比，选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、LPC20:3和18:0-20:3的至少一种心血管疾病标志物的水平的降低是该受试者患有心血管疾病或具有发生心血管疾病的增加的风险的指示。
在某些实施方式中，与正常的受试者相比，选自于PTX3、PAI1、EDIL3和NUC1B的至少一种心血管疾病标志物的水平的提高是该受试者未患心血管疾病或没有发生心血管疾病的增加的风险的指示。
在某些实施方式中，与正常的受试者相比，选自于HMOX1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2和CCDC47的至少一种心血管疾病标志物的水平的降低是该受试者未患心血管疾病或没有发生心血管疾病的增加的风险的指示。
在某些实施方式中，与正常的受试者相比，选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、LPC20:3和18:0-20:3的至少一种心血管疾病标志物的水平的提高是该受试者未患心血管疾病或没有发生心血管疾病的增加的风险的指示。
本发明提供了用于检测一组心血管疾病(CVD)相关生物标志物的方法，其中该方法包括：
(1)分析来自受试者的生物样品中一组CVD相关生物标志物的两种或更多种CVD相关生物标志物的水平，其中该组CVD相关生物标志物包括CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；和PC-LI-183-D18:22-22:6；
(2)检测所述生物样品中所述两种或更多种CVD相关生物标志物中的每一种，从而检测该组CVD相关生物标志物。
在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括CCDC47或HMOX1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括CCDC47和HMOX1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物还包括PTX3。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物还包括PAI1。
在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物还包括选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；和PC-LI-183-D18:22-22:6的至少一种脂质生物标志物。
在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物还包括选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCDC47、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HMOX1、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAI1、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA的至少一种CVD相关生物标志物。
在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括CCDC47。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括EDIL3。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括HMOX1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括NUCB1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3和IL27。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47和PTX3。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7和CCDC47。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1和IGFBP7。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和HMOX1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括EDIL3、NUCB1、CFL2和PTX3。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括NUCB1、CFL2和PTX3。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括NUCB1和PTX3。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括NUCB1和CFL2。
在某些实施方式中，检测或测定生物样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平的方法包括分离生物样品的组分。
在某些实施方式中，检测或测定生物样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平的方法包括标记生物样品的组分。
在某些实施方式中，检测或测定生物样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平的方法包括处理所述生物样品。
在某些实施方式中，检测或测定生物样品中两种或更多种CVD相关标志物的水平的方法包括将待检测的CVD相关标志物与CVD相关标志物结合剂相接触。
在某些实施方式中，检测或测定生物样品中一种或多种CVD相关标志物的水平的方法包括形成待检测的CVD相关标志物与CVD相关标志物结合剂之间的复合物。
在某些实施方式中，检测或测定生物样品中一种或多种CVD相关标志物的水平的方法包括将一种或多种CVD相关标志物中的每一种与CVD相关标志物结合剂相接触。
在某些实施方式中，检测或测定生物样品中一种或多种CVD相关标志物的水平的方法包括形成一种或多种CVD相关标志物中的每一种与CVD相关标志物结合剂之间的复合物。
在某些实施方式中，检测或测定生物样品中一种或多种CVD相关标志物的水平的方法包括将待检测的CVD相关标志物连接到固体表面上。
本发明提供了在检测方法中使用的试剂组，该试剂组包含至少两种检测试剂，其中各检测试剂对于一组心血管疾病(CVD)相关生物标志物中的至少一种CVD相关标志物的检测是特异性的，其中该组CVD相关生物标志物包括选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的两种或更多种CVD相关生物标志物。
在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括CCDC47或HMOX1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括CCDC47和HMOX1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物还包括PTX3。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物还包括PAI1。
在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物还包括选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6中的至少一种脂质生物标志物。在某些实施方式中，所述脂质包括PC-Li-183-D18:2-22:6。
在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物还包括选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCDC47、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HMOX1、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAI1、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA的至少一种CVD相关生物标志物。
在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括CCDC47。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括EDIL3。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括HMOX1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括NUCB1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3和IL27。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47和PTX3。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7和CCDC47。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1和IGFBP7。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和HMOX1。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括EDIL3、NUCB1、CFL2和PTX3。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括NUCB1、CFL2和PTX3。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括NUCB1和PTX3。在某些实施方式中，所述两种或更多种CVD相关生物标志物包括NUCB1和CFL2。本发明提供了本发明的所述试剂组在本发明的任何方法中的用途。
本发明提供了用于诊断、监测或表征受试者中的心血管疾病的试剂盒，其包含：
至少一种试剂，其对于选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PED18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的至少一种CVD相关标志物的水平的检测是特异性的。
在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括CCDC47或HMOX1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括CCDC47和HMOX1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物还包括PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物还包括PAI1。
在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物还包括选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的至少一种脂质生物标志物。在某些实施方式中，所述脂质包括PC-Li-183-D18:2-22:6。
在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物还包括选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCDC47、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HMOX1、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAI1、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA的至少一种CVD相关生物标志物。
在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括CCDC47。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括EDIL3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括HMOX1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括NUCB1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包含细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3和IL27。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47和PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7和CCDC47。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1和IGFBP7。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和HMOX1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括EDIL3、NUCB1、CFL2和PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括NUCB1、CFL2和PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包含NUCB1和PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括NUCB1和CFL2。
本发明提供了识别用于治疗心血管疾病的化合物的方法，其包括：
(1)获得受试细胞；
(2)将受试细胞与受试化合物相接触；
(3)测定受试细胞中选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PED18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的一种或多种心血管疾病(CVD)相关生物标志物的水平；
(4)将受试细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平与未接触受试化合物的对照细胞相比较；和
(5)选择调节受试细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平的受试化合物，从而识别用于治疗受试者中的CVD的化合物。
本发明提供了识别引起心脏毒性或具有引起心脏毒性的风险的药剂的方法，其包括：
(i)将第一细胞与受试药剂相接触；
(ii)检测与受试药剂相接触的第一细胞中选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的一种或多种CVD相关生物标志物的水平；和
(iii)将第一细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平与第二细胞中相应的一种或多种CVD相关生物标志物的水平相比较，其中该第二细胞是未接触受试药剂的对照细胞；
其中，与所述第二细胞相比，该第一细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平的调节是所述受试药剂是引起心脏毒性或具有引起心脏毒性的风险的药剂的指示。
本发明提供了识别用于预防、减轻或治疗药物诱导的心脏毒性的救援剂的方法，其包括：
(i)将第一细胞与心脏毒性剂相接触；
(ii)将第二细胞与心脏毒性剂和候选救援剂相接触；
(iii)检测与心脏毒性剂相接触的第一细胞中选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；和PC-LI-183-D18:22-22:6的一种或多种CVD相关生物标志物的水平；
(iv)检测与心脏毒性剂和候选救援剂相接触的第二细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平；和
(v)将第二细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平与第一细胞中相应的一种或多种CVD相关生物标志物的水平相比较，
其中，与所述第一细胞相比，该第二细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平的调节是候选救援剂是预防、减轻或治疗药物诱导的心脏毒性的救援剂的指示。
在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括CCDC47或HMOX1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括CCDC47和HMOX1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物还包括PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物还包括PAI1。
在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物还包括选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的至少一种脂质生物标志物。在某些实施方式中，所述脂质包括PC-Li-183-D18:2-22:6。
在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物还包括选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCDC47、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HMOX1、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAI1、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA的至少一种CVD相关生物标志物。
在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括CCDC47。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括EDIL3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括HMOX1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括NUCB1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包含细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、IL27和PAI1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3和IL27。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47和PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7和CCDC47。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1和IGFBP7。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和HMOX1。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括EDIL3、NUCB1、CFL2和PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括NUCB1、CFL2和PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括NUCB1和PTX3。在某些实施方式中，所述一种或多种CVD相关生物标志物包括NUCB1和CFL2。
在某些实施方式中，与未处理的细胞相比，选自于PTX3、PAI1、EDIL3和NUC1B的至少一种心血管疾病标志物的水平的降低是所述受试化合物用于治疗心血管疾病无效的指示。
在某些实施方式中，与未处理的细胞相比，选自于HMOX1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2和CCDC47的至少一种心血管疾病标志物的水平的提高是所述受试化合物用于治疗心血管疾病无效的指示。
在某些实施方式中，与未处理的细胞相比，选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、LPC20:3和18:0-20:3的至少一种心血管疾病标志物的水平的降低是所述受试化合物用于治疗心血管疾病无效的指示。
在某些实施方式中，与未处理的细胞相比，选自于PTX3、PAI1、EDIL3和NUC1B的至少一种心血管疾病标志物的水平的提高是所述受试化合物用于治疗心血管疾病有效的指示。
在某些实施方式中，与未处理的细胞相比，选自于HMOX1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2和CCDC47的至少一种心血管疾病标志物的水平的降低是所述受试化合物用于治疗心血管疾病有效的指示。
在某些实施方式中，与未处理的细胞相比，选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、LPC20:3和18:0-20:3的至少一种心血管疾病标志物的水平的提高是所述受试化合物用于治疗心血管疾病有效的指示。
在本发明的某些筛选方法中，所述细胞是心肌细胞。在某些实施方式中，所述细胞是心肌细胞或糖尿病性心肌细胞。在本发明的某些筛选方法中，所述接触在体外进行。在本发明的某些筛选方法中，所述接触是在体内进行。
在某些实施方式中，所述至少一种CVD相关生物标志物包括至少一种脂质生物标志物和至少一种蛋白质生物标志物。
在某些实施方式中，所述至少一种CVD相关生物标志物包括至少一种脂质标志物和至少一种激酶标志物。
在某些实施方式中，获得样品包括从受试者采取血液和将血细胞与血清分离。
在某些实施方式中，检测标志物的水平包括检测所述标志物的浓度。在某些实施方式中，检测标志物的水平包括检测与对照样品相比的相对浓度。在某些实施方式中，检测标志物的水平包括检测所述标志物的表达水平。在某些实施方式中，检测标志物的水平包括检测所述标志物的活性水平。
本发明提供了用于诊断心肌病的方法，其包括：(1)测定从受试者获得的生物样品中选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的表达水平；和(2)将从受试者获得的生物样品中一种或多种生物标志物的表达水平与对照样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平相比较，其中在所述生物样品中一种或多种生物标志物的表达水平的调节是所述受试者患有心肌病的指示。
在一个实施方式中，EDIL3或NucB1的表达水平的降低是所述受试者患有心肌病的指示。
本发明提供了预测受试者是否易于发生心肌病的方法，该方法包括：(1)测定从受试者获得的生物样品中存在的选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的表达水平；和(2)将从受试者获得的生物样品中存在的一种或多种生物标志物的表达水平与对照样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平相比较，其中，从受试者获得的生物样品中一种或多种生物标志物的表达水平相对于对照样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平的调节是该受试者易于发生心肌病的指示。
在一个实施方式中，EDIL3或NucB1的表达水平的降低是受试者易于发生心肌病的指示。
本发明提供了用于监测受试者中心肌病的治疗的方法，其包括：(1)测定在向受试者施用至少一部分治疗方案之前从受试者获得的第一样品中存在的选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的表达水平；(2)测定在向受试者施用至少一部分治疗方案之后从受试者获得的第二样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平；及(3)将所述第一样品中一种或多种生物标志物的表达水平与所述第二样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平相比较，其中与第一样品中的一种或多种生物标志物相比，第二样品中相应的一种或多种生物标志物的正常化的表达水平是该治疗用于治疗受试者的心肌病有效的指示。
在一个实施方式中，与第一样品相比，第二样品中EDIL3或NucB1的表达水平的提高是该治疗用于治疗受试者的心肌病有效的指示。
本发明提供了表征受试者中的心肌病状态的方法，所述方法包括：(1)测定从受试者获得生物样品中存在的选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的表达水平；和(2)将从受试者获得的生物样品中存在的一种或多种生物标志物的表达水平与对照样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平相比较，其中，从受试者获得的生物样品中一种或多种生物标志物的表达水平相对于对照样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平是受试者中心肌病状态的指示。
在一个实施方式中，与对照样品中相应的生物标志物的表达水平相比，从受试者获得的生物样品中EDIL3或NucB1的表达水平的提高是受试者的心肌病状态改善的指示。
在一个实施方式中，与对照样品中相应的生物标志物的表达水平相比，从受试者获得的生物样品中EDIL3或NucB1的表达水平的降低是受试者的心肌病状态恶化的指示。
本发明提供了识别用于治疗心肌病的化合物的方法，其包括：(1)获得受试细胞；(2)将受试细胞与受试化合物相接触；(3)测定受试细胞中选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的表达水平；(4)将受试细胞中相应的一种或多种生物标志物的表达水平与未接触受试化合物的对照细胞相比较；和(5)选择调节受试细胞中一种或多种生物标志物的表达水平的受试化合物，从而识别用于治疗受试者中的心肌病的化合物。
在一个实施方式中，提高EDIL3或NucB1的表达水平的受试化合物被识别为治疗受试者的心肌病的化合物。
在某些实施方式中，心肌病选自于扩张型心肌病、肥厚性心肌病、限制型心肌病和致心律失常性右心室发育不良。
在某些实施方式中，心肌病是遗传性心肌病。
在某些实施方式中，心肌病是后天性心肌病。在一个实施方式中，后天性心肌病是受试者暴露于心脏毒素的结果。在一个实施方式中，所述毒素是一种环境毒素。在一个实施方式中，所述毒素是心脏毒性的药物。在一个实施方式中，所述心脏毒性药物选自于过量酒精、可卡因、安非他明、化疗药物、阿霉素、柔红霉素、抗癌药物、糖尿病药物、神经药物、抗炎药、蒽环类药物、5-氟尿嘧啶、顺铂、曲妥珠单抗、吉西他滨、罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮、卡麦角林、培高利特、舒马曲坦、二膦酸盐和TNF拮抗剂。
在某些实施方式中，后天性心肌病是受试者中另一种疾病或病症的合并症。在一个实施方式中，受试者中的另一种疾病或病症选自于冠状动脉心脏病、心脏病发作、高血压、糖尿病、甲状腺疾病、病毒性肝炎、HIVl、使心肌发炎的病毒性感染、血色素沉着症、结节病、淀粉样变性和结缔组织病症。
本发明还提供了在受试者中治疗其中心肌病是合并症的疾病或病症的方法，其包括：(1)测定从患有该疾病或病症的受试者获得的第一样品中存在的选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的表达水平；(2)测定在一段时间后从该受试者获得的第二样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平；及(3)比较所述第一样品中一种或多种生物标志物的表达水平与第二样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平，其中第二样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平相对于第一样品中一种或多种生物标志物的调节是该疾病或病症在受试者中确实导致心肌病合并症的指示。
在一个实施方式中，第二样品中EDIL3或NUCB1的表达水平相对于第一样品中相应的生物标志物的表达水平的降低是疾病或病症在受试者中确实导致心肌病合并症的指示。
在某些实施方式中，当检测到在第二样品中相应的一种或多种生物标志物水平的调节时，改变受试者的治疗。在某些实施方式中，改变治疗以保护心脏、治疗心肌病，和该方法可以允许在心肌病的征兆或症状出现之前检测合并症。
在另一个方面，本发明提供了用潜在心脏毒性剂治疗受试者的方法，其包括(1)测定在向受试者施用至少一部分治疗方案之前从受试者获得的第一样品中存在的选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的表达水平；(2)测定在向受试者施用至少一部分治疗方案之后从受试者获得的第二样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平；和(3)将所述第一样品中一种或多种生物标志物的表达水平与所述第二样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平相比较，其中与第一样品中一种或多种生物标志物相比，第二样品中相应的一种或多种生物标志物的非调节的表达水平是受试者中的治疗可以继续且该药剂对于该受试者不是心脏毒性的指示。
在一个实施方式中，与所述相应的生物标志物的表达水平相比，第二样品中EDIL3或NUCB1的表达的水平的降低是该药剂是心脏毒性的指示。
在某些实施方式中，当检测到一种或多种生物标志物的水平的调节(amodulation)时，改变受试者的治疗。在一个实施方式中，当所述第二样品中一种或多种生物标志物的表达水平相比gf第一样品中的一种或多种生物标志物调节时，减小潜在心脏毒性剂的剂量。在一个实施方式中，受试者共施用心脏保护剂以减轻心脏毒性剂的效应。
在另一个方面，本发明提供了用潜在心脏毒性剂治疗受试者的方法，其包括(1)测定在向受试者施用至少一部分治疗方案之前从受试者获得的第一样品中存在的选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的表达水平；(2)测定在向受试者施用至少一部分治疗方案之后从受试者获得的第二样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平；和(3)将所述第一样品中一种或多种生物标志物的表达水平与所述第二样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平相比较，其中与第一样品中的一种或多种生物标志物相比，第二样品中相应的一种或多种生物标志物的非调节的或较低的表达水平是受试者中的治疗可以继续和该药剂对于该受试者不是心脏毒性的指示；和其中与第一样品中的一种或多种生物标志物相比，第二样品中相应的一种或多种生物标志物的较高表达水平是药剂对于受试者是心脏毒性的和受试者中的治疗应停止的指示。
在另一个方面，本发明提供了用潜在心脏毒性剂治疗受试者的方法，其包括(1)测定在向受试者施用至少一部分治疗方案之前从受试者获得的第一样品中存在的选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的表达水平；(2)测定在向受试者施用至少一部分治疗方案之后从受试者获得的第二样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平；和(3)将所述第一样品中一种或多种生物标志物的表达水平与所述第二样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平相比较，其中与第一样品中的生物标志物相比，第二样品中非调节的或提高的EDIL3或NUCB1的表达水平是受试者的治疗可以继续和该药剂对于该受试者不是心脏毒性的指示；和其中与第一样品中的生物标志物相比，第二样品中EDIL3或NUCB1的降低的表达水平是该药剂对该受试者是心脏毒性的和受试者的治疗应停止的指示。
在另一个方面，本发明提供了用潜在心脏毒性剂治疗受试者的方法，其包括(1)测定在向受试者施用至少一部分包括潜在心脏毒性剂的治疗方案后从受试者获得的样品中存在的选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的表达水平；和(2)比较所述样品中一种或多种生物标志物的表达水平与对照样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平，其中第二样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平相比于对照样品中的一种或多种生物标志物的非调节是受试者的治疗可以继续和该药剂对该受试者不是心脏毒性的指示；和/或其中在样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平相比于对照样品中的一种或多种生物标志物的调节是该药剂对于该受试者是心脏毒性的和受试者的治疗应停止的指示。
在另一个方面，本发明提供了用潜在心脏毒性剂治疗受试者的方法，其包括(1)测定在向受试者施用至少一部分包括潜在心脏毒性剂的治疗方案后从受试者获得的样品中存在的选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的表达水平；和(2)比较所述样品中一种或多种生物标志物的表达水平与对照样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平，其中所述样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平相比于对照样品中的一种或多种生物标志物的非调节或降低是受试者的治疗可以继续和该药剂对该受试者不是心脏毒性的指示；和/或其中所述样品中相应的一种或多种生物标志物的表达水平相比于对照样品中一种或多种生物标志物的提高是该药剂对受试者是心脏毒性的和受试者的治疗应停止的指示。
在一个实施方式中，相比于对照样品中相应的生物标志物所述样品中EDIL3或NUCB1的非调节的或提高的表达水平指示受试者的治疗可以继续且该药剂对于该受试者不是心脏毒性的；和/或其中所述样品中EDIL3或NUCB1的表达水平相比于对照样品中相应的生物标志物的降低指示该药剂对于该受试者是心脏毒性的和受试者的治疗应停止。
在一个实施方式中，上述方法进一步包括停止潜在心脏毒性剂的治疗。在一个实施方式中，上述方法进一步包括停止治疗，并建议、指示或施用替代治疗。在一个实施方式中，上述方法还包括继续潜在心脏毒性剂的治疗。
在某些实施方式中，当相对于对照样品，检测到所述样品中一种或多种生物标志物的水平的调节例如增加时，改变受试者的治疗。在一个实施方式中，当样品中一种或多种生物标志物的表达水平相比于对照样品中的一种或多种生物标志物调节(例如，提高)时，减小潜在心脏毒性剂的剂量。在一个实施方式中，当所述第二样品中一种或多种生物标志物的表达水平相比于对照样品中的一种或多种生物标志物调节(例如，提高)时，受试者共同施用心脏保护剂以减轻心脏毒性剂的效应。在一个实施方式中，当检测到样品中一种或多种生物标志物的水平相比于对照样品调节(例如，提高)时，停止受试者的潜在心脏毒性剂的治疗。
在另一个方面，本发明提供了用于识别心脏毒性剂的方法，其包括：比较(i)在该药剂治疗前获得的第一细胞样品中存在的选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的水平，与(ii)在该药剂治疗后得到的第二细胞样品中相应的一种或多种生物标志物的水平；其中，在所述第二样品中相应的一种或多种生物标志物的水平与第一样品相比的调节是该药剂引起药物诱导的毒性或具有引起药物诱导的毒性的风险的指示。
在一个实施方式中，第二样品中EDIL3或NUCB1的表达水平相比于第一样品的降低是该药剂引起药物诱导的毒性或具有导致药物诱导的毒性的风险的指示。
在另一个方面，本发明提供了用于识别减轻或防止药物诱导的毒性的救援剂的方法，其包括：(i)测定在毒性诱导药物处理之前获得的第一细胞样品中选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的正常水平；(ii)测定在毒性诱导药物处理后获得的第二细胞样品中存在的相应一种或多种生物标志物的处理水平以确定在处理的细胞样品中具有水平变化的一种或多种生物标志物；(iii)测定在毒性诱导药物和救援剂处理后获得的第三细胞样品中存在的具有毒性诱导药物处理的样品中改变的水平的所述相应的一种或多种生物标志物的水平；及(iv)比较第三样品中测定的相应一种或多种生物标志物的水平与第一样品中存在的相应一种或多种生物标志物的水平；其中与第一样品相比，所述第三样品中相应的一种或多种生物标志物的正常化水平是救援剂可减轻或防止药物诱导的毒性的指示。
在一个实施方式中，与第一样品中相应的生物标志物的表达水平相比，第三样品中EDIL3或NUCB1的非调节的或提高的水平是救援剂可减轻或防止药物诱导的毒性的指示。
在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是EDIL3。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是HMOX1。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是NUCB1。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、IL27和PAI1组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3和IL27组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47和PTX3组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7和CCDC47组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1和IGFBP7组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和HMOX1组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由EDIL3、NUCB1、CFL2和PTX3组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由NUCB1、CFL2和PTX3组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由NUCB1和PTX3组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由NUCB1和CFL2组成的一组生物标志物。
在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物包括EDIL3。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物包括HMOX1。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物包括NUCB1。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、IL27和PAI1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3和IL27的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47和PTX3的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7和CCDC47的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1和IGFBP7的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和HMOX1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括EDIL3、NUCB1、CFL2和PTX3的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括NUCB1、CFL2和PTX3的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括NUCB1和PTX3的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括NUCB1和CFL2的一组生物标志物。
在上述方法的某些实施方式中，在涉及IGFBP7水平的检测的方法中包括检测HMOX1的水平没有显著增加该方法的预测值。在某些实施方式中，在涉及HMOX1水平的检测的方法中包括检测IGFBP7的水平没有显著增加该方法的预测值。
在另一个方面，本发明提供了用于诊断、监测或表征心脏毒性或心肌病的试剂盒，包括：至少一种对于选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的表达水平的检测特异性的试剂。
在一个实施方式中，该试剂盒还包括基于一种或多种生物标志物的表达水平诊断、监测或表征心脏毒性或心肌病的说明书。
在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是EDIL3。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是HMOX1。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是NUCB1。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、IL27和PAI1组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3和IL27组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47和PTX3组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7和CCDC47组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1和IGFBP7组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和HMOX1组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由EDIL3、NUCB1、CFL2和PTX3组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由NUCB1、CFL2和PTX3组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由NUCB1和PTX3组成的一组生物标志物。在一个实施方式中，一种或多种生物标志物是由NUCB1和CFL2组成的一组生物标志物。
在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物包括EDIL3。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物包括HMOX1。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物包括NUCB1。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、IL27和PAI1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3和IL27的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47和PTX3的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7和CCDC47的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1和IGFBP7的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和HMOX1的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括EDIL3、NUCB1、CFL2和PTX3的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括NUCB1、CFL2和PTX3的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括NUCB1和PTX3的一组生物标志物。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物是包括NUCB1和CFL2的一组生物标志物。
在上述发明的一个实施方式中，一种或多种生物标志物不包括PTX3。
因此，本发明提供了用于识别引起心脏毒性或具有引起心脏毒性的风险的药剂的方法。在一个实施方式中，所述药剂是药物或药物候选物。在一个实施方式中，所述药剂是在环境中的药剂(例如，污染物、建筑材料)。在一个实施方式中，所述毒性是药物诱导的心脏毒性。在一个实施方式中，所述药剂是用于治疗糖尿病、肥胖症、心血管疾病、癌症、神经障碍或炎性病症的药物或候选药物。
在一个方面，本发明提供了用于识别引起心脏毒性的药剂的方法，包括：(i)将第一细胞与药剂相接触；(ii)检测本文所提供的标志物的水平，其中，检测所述标志物的水平包括：(a)形成标志物和探针之间的复合物，并检测标志物和探针之间复合物的形成；和/或(b)从细胞分离标志物以使得至少一种对于标志物特有的特征可以被检测；(iii)比较来自第一细胞的标志物的水平与第二细胞中标志物的水平，其中该第二细胞是未接触所述药剂的对照细胞；其中，所述第一细胞中标志物的水平相比于第二细胞的调节是该制剂引起心脏毒性的指示。
在另一个方面，本发明提供了用于识别预防或治疗心肌病的救援剂的方法，包括：(i)将第一细胞与心脏毒性剂相接触；(ii)将第二细胞与心脏毒性剂和候选救援剂相接触；(iii)检测本文所提供的标志物的水平，其中检测所述标志物的水平包括：(a)形成标志物和探针之间的复合物，并检测标志物和探针之间复合物的形成；和/或(b)从细胞分离标志物以使得至少一种标志物特有的特征可以被检测；(iii)将来自所述第一细胞和第二细胞各自的标志物的水平与对照细胞相比较，其中对照细胞没有接触心脏毒性剂或候选救援剂；其中，在所述第一细胞中标志物的水平相比于对照细胞的调节以及在第二细胞中标志物的水平相比于对照细胞的正常化是所述候选救援剂是预防或治疗心脏毒性的救援剂的指示。
在一个实施方式中，所述细胞是心肌细胞。
在一个实施方式中，所述细胞是心肌细胞或糖尿病性心肌细胞。
在一个实施方式中，所述接触是在体外进行
在一个实施方式中，所述接触是在体内进行。
在一个实施方式中，心脏毒性包括心肌病、心力衰竭、心房纤颤、心肌病和心力衰竭、心力衰竭和左心室功能障碍、心房扑动和颤动、或心脏瓣膜损伤和心力衰竭的至少一种的征兆或症状。
在一个实施方式中，药物诱导心脏毒性包括心肌病、心力衰竭、心房纤颤、心肌病和心力衰竭、心力衰竭和左心室功能障碍、心房扑动和颤动、或心脏瓣膜损伤和心力衰竭的至少一种的征兆或症状。
在一个实施方式中，心肌病是药物诱导心脏毒性的结果。
在一个实施方式中，所述药物是抗癌药、糖尿病药物、神经药或抗炎药。
在一个实施方式中，所述药物是蒽环类药物、5-氟尿嘧啶、顺铂、曲妥珠单抗、吉西他滨、罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮、卡麦角林、培高利特、舒马曲坦、二膦酸盐或TNF拮抗剂。
在一个实施方式中，本文所提供的标志物选自于附录A中提供的标志物的组。
在一个实施方式中，本文所提供的标志物选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCDC47、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HMOX1、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAI1、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、PTX3、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA。
在一个实施方式中，本文所提供的标志物选自于TIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7(IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010和HSPA4。
在一个实施方式中，本文所提供的标志物选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；PC-LI-183-D18:22-22:6；CACNA2D1；EPHX1；BAX；PRKAR2A和MPA2K3。
在一个实施方式中，本文所提供的标志物选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6。
在一个实施方式中，本文所提供的标志物包括至少一种脂质标志物。
在一个实施方式中，本文所提供的标志物包括至少一种激酶标志物。
在一个实施方式中，所述标志物包括至少一种选自于PTX3、BPM-CTMB1、EDIL3和NUC1B的标志物。
在一个实施方式中，细胞中PTX3、BPM-CTMB1、EDIL3和NUC1B中至少一种的表达水平响应于药剂治疗的降低是该制剂引起心脏毒性的指示。
在一个实施方式中，第一细胞中PTX3、BPM-CTMB1、EDIL3和NUC1B中至少一种的表达水平相比于对照细胞的降低和第二细胞中所述标志物的水平相比于对照细胞的正常化是该候选救援剂是防止或治疗心脏毒性的救援剂的指示。
在一个实施方式中，细胞中PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3的水平响应于药剂处理的降低是该药剂引起心脏毒性的指示。
在一个实施方式中，第一细胞中PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3的水平相比于对照细胞的降低和第二细胞中所述标志物的水平相比于对照细胞的正常化是所述候选救援剂是防止或治疗心脏毒性的救援剂的指示。
在另一个方面，本发明提供了用于预后或诊断受试者的心肌病的方法，包括：
(i)获得来自所述受试者的样品；
(ii)检测所述样品中本文所提供的标志物的水平，其中检测所述标志物的水平包括：
(a)形成标志物和探针之间的复合物和检测标志物和探针之间复合物的形成；和/或
(b)从细胞分离标志物以使得至少一种标志物特有的特征可被检测；
(iii)比较所述样品中标志物的水平与对照样品中标志物的水平，其中对照样品来自未患心肌病的受试者；
其中，所述样品中标志物的水平相比于对照样品的调节是该受试者患有或易于发生心肌病的指示。
在另一个方面，本发明提供了用于监测受试者的心肌病的方法，包括：
(i)在第一时间从受试者获得第一样品；
(ii)检测第一样品中本文所提供的标志物的水平，其中检测标志物的水平包括：
(a)形成标志物和探针之间的复合物和检测标志物和探针之间复合物的形成；和/或
(b)从细胞分离标志物以使得至少一个标志物特有的特征可被检测；
(iii)将第一样品中标志物的水平与在随后从受试者获得的第二样品相比较；
其中第一样品中标志物的水平与第二样品相比的调节是受试者中心肌病改变的指示。
在另一个方面，本发明提供了识别用于治疗心肌病的化合物的方法，包括：
(i)获得受试细胞；
(ii)使受试细胞与受试化合物相接触；
(iii)检测受试细胞中本文所提供的标志物的水平，其中检测标志物的水平包括：
(a)形成标志物和探针之间的复合物和检测标志物和探针之间复合物的形成；和/或
(b)从细胞分离标志物以使得至少一个标志物特有的特征可被检测；
(iv)将受试细胞中标志物的水平与未接触受试化合物的对照细胞相比较；和
(v)选择调节受试细胞中标志物水平的受试化合物，从而识别用于治疗受试者的心肌病的化合物。
在一个实施方式中，心肌病包括选自于心力衰竭、心房纤颤、心肌病和心力衰竭、心力衰竭和左心室功能障碍、心房扑动和颤动或者心脏瓣膜损伤和心力衰竭的至少一种征兆或症状。
在一个实施方式中，心肌病是药物治疗的结果，如抗癌药物、糖尿病药物、神经药物或抗炎药。
在一个实施方式中，药物是蒽环类药物、5-氟尿嘧啶、顺铂、曲妥珠单抗、吉西他滨、罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮、卡麦角林、培高利特、舒马曲坦、二膦酸盐或TNF拮抗剂。
在一个实施方式中，本文所提供的标志物选自于在附录A中提供的标志物。
在一个实施方式中，本文所提供的标志物选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCDC47、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HMOX1、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAI1、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、PTX3、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA。
在一个实施方式中，本文所提供的标志物选自于TIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7(IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010和HSPA4。
在一个实施方式中，本文所提供的标志物选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；PC-LI-183-D18:22-22:6；CACNA2D1；EPHX1；BAX；PRKAR2A和MPA2K3。
在一个实施方式中，本文所提供的标志物选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；PC-LI-183-D18:22-22:6。
在一个实施方式中，该标志物包括至少一种脂质标志物。
在一个实施方式中，该标志物包括至少一种激酶标志物。
在一个实施方式中，该标志物包括至少一种选自于PTX3、BPM-CTMB1、EDIL3和NUC1B的标志物。
在一个实施方式中，样品中PTX3、BPM-CTMB1、EDIL3和NUC1B的至少一种的表达水平相比于对照样品的降低是该受试者患有或易于发生心肌病的指示。
在一个实施方式中，第一样品中PTX3、BPM-CTMB1、EDIL3和NUC1B中至少一种的表达水平相比于第二样品的降低是心肌病已经恶化的指示。
在一个实施方式中，与对照样品相比，样品中PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3的水平的降低是该受试者患有或易于发生心肌病的指示。
在一个实施方式中，与第二样品相比，第一样品中PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3的水平的降低是心肌病已经恶化的指示。
在一个实施方式中，所述标志物是多种标志物。
在一个实施方式中，检测和比较多个标志物的水平。
在一个实施方式中，所述多个标志物包括至少一种脂质标志物和至少一种蛋白质标志物。
在一个实施方式中，所述多个标志物包括至少一种脂质标志物和至少一种激酶标志物。
在一个实施方式中，心肌病是后天性心肌病。
在一个实施方式中，心肌病是遗传性心肌病。
在一个实施方式中，心肌病由选自于心血管疾病、高血压、高胆固醇血症、心肌梗死、中风和创伤的病症引起。
在一个实施方式中，获得样品包括从受试者采集血液和将血细胞与血清分离。
在一个实施方式中，检测标志物的水平包括检测标志物的浓度。
在一个实施方式中，检测标志物的水平包括检测相比于对照样品的相对浓度。
在一个实施方式中，检测标志物的水平包括检测所述标志物的表达水平。
在一个实施方式中，检测标志物的水平包含检测所述标志物的活性水平。
在另一个方面，本发明提供用于实施本发明的方法的试剂盒。
在一个实施方式中，该细胞是心血管系统的细胞，例如，心肌细胞。在一个实施方式中，该细胞是糖尿病性心肌细胞。在一个实施方式中，该药物是用于治疗糖尿病、肥胖症、心血管疾病、癌症、神经障碍或炎性病症的药物或候选药物。在一个实施方式中，该药物是蒽环类药物、5-氟尿嘧啶、顺铂、曲妥珠单抗、吉西他滨、罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮、卡麦角林、培高利特、舒马曲坦、二膦酸盐和TNF拮抗剂中的任一种。在一个实施方式中，与第一样品相比，第三样品中选自于在表2中列出的标志物中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160种或更多种生物标志物的大致相同的表达水平是救援剂可以降低或防止药物诱导的心脏毒性的指示。
本发明进一步提供了在本文所提供的方法中有用的生物标志物(例如，基因、蛋白质、酶、脂类)。
在某些实施方式中，该标志物是选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCDC47、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HMOX1、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAI1、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、PTX3、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA的一、二、三、四、五、六、七、八、九、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90种标志物。
在某些实施方式中，该标志物是选自于TIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7(IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010和HSPA4的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或十三种标志物。
在某些实施方式中，该标志物是选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；PC-LI-183-D18:22-22:6；CACNA2D1；EPHX1；BAX；PRKAR2A和MPA2K3的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或十一种标志物。
在某些实施方式中，该标志物是选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；PC-LI-183-D18:22-22:6的一、二、三、四、五、六或七种标志物。
在某些实施方式中，该标志物包括至少一种脂质标志物。
在某些实施方式中，该标志物包括至少一种激酶标志物。
在某些实施方式中，与正常受试者相比，PTX3、BPM-CTMB1、EDIL3和NUC1B中至少一种的表达水平的降低是心肌病的指示。
在某些实施方式中，PTX3、BPM-CTMB1、EDIL3和NUC1B中至少一种的表达水平响应于药剂处理的降低指示该药剂是心脏毒性的。
在某些实施方式中，该方法包括检测PTX3、BPM-CTMB1、EDIL3和NUC1B中至少一种的表达水平。
在某些实施方式中，与正常受试者相比，PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3的水平的降低是心肌病的指示。在某些实施方式中，脂质水平被测量为正常脂质水平的百分比。在某些实施方式中，脂质水平降低至小于正常脂质水平的95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％是心肌病的指示。
在某些实施方式中，PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3的水平响应于药剂处理的降低指示该药剂是心脏毒性的。在某些实施方式中，脂质水平被测量为正常脂质水平的百分比。在某些实施方式中，在向受试者施用药剂后，脂质水平降低至小于正常脂质水平的95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％指示该药剂是心脏毒性的。
在某些实施方式中，与正常的受试者相比，PE 18:0-20:3水平的降低是心肌病的指示。在某些实施方式中，脂质水平测量为正常脂质水平的百分比。在某些实施方式中，脂质水平降低至小于正常脂质水平的95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％是心肌病的指示。
在某些实施方式中，与正常受试者相比，PE 18:0-20:3水平的降低是心脏中重建事件的指示。在某些实施方式中，脂质水平测量为正常脂质水平的百分比。在某些实施方式中，脂质水平降低至小于正常脂质水平的95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％是心脏中重建事件的指示。
在某些实施方式中，PE 18:0-20:3水平响应于药剂处理的降低指示该药剂是心脏毒性的。在某些实施方式中，脂质水平测量为正常脂质水平的百分比。在某些实施方式中，在向受试者施用药剂后，脂质水平降低至小于正常脂质水平的95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％指示该药剂是心脏毒性的。
附图简述
图1示出了证明来自样品集2的单个生物标志物的性能的ROC曲线。
图2示出了基于样品集2通过逻辑回归的各种标志物组合模型的性能。前7个标志物的组合显示了区分正常和心肌病样品的最高预测能力水平。
图3示出了后向消除模型以显示根据特定标志物组的分类器的差异性能。HMOX1和IGFBP7的消除不导致性能降低。
图4示出了证明来自Asterand样品集的单个生物标志物的性能的ROC曲线。
图5示出在Asterand样品集中进行评估的4种生物标志物的组合模型。如图所示，EDIL3的性能未通过在心肌病预测中包括其他标志物而提高。
图6A-B示出了人血清中(A)PTX3和(B)PAI1的比较水平。
图7示出了人血清中EDIL3的比较水平。
图8示出了人血清中NucB1的比较水平。
图9A-B示出了从血清和体外细胞培养物模型得到的Δ网络的两个重叠，其比较(A)心肌病与无心肌病和(B)罗格列酮治疗与无罗格列酮治疗。血清节点为矩形和细胞培养物节点是正方形。重叠的节点是在加黑方格中。
图10A-B示出了以(A)pmol脂质/mg蛋白质或(B)作为正常脂质水平的百分比测定的血清脂质网络和颗粒脂质网络共同的脂质的定量。与单独的糖尿病和使用罗格列酮而没有心肌病相比，PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3在具有心肌病临床诊断的使用罗格列酮的糖尿病受试者中显著降低。
图11示出了探询式平台技术的多组学输出。菱形表示脂质种类，正方形是蛋白质和六边形是激酶(其与活性中心具有因果相关性)。中心-CACNA2D1，一种L型钙通道，与MAP2K3和PRKAR2A(激酶)、BAX(线粒体蛋白)、EPHX1(微粒体蛋白)和PC Li-183-D18:2-22:6(磷脂酰胆碱)相关。结果表明，Δ多组学输出提供了体外毒性模型中分子事件的非常有力的快照(snapshot)。
图12A-B示出了证明CCDC47区分(A)正常受试者与患有心血管疾病的受试者和(B)用或者没有用罗格列酮治疗的患有2型糖尿病和心肌病的受试者的预测值的ROC曲线。
图13A-C示出了用(A)罗格列酮、(B)二甲双胍或(C)阿托伐他汀治疗的受试者中CCDC47水平的散点图。
图14示出了比较CCDC47+IGFBP7组合与CCDC47+IGFBP7+PC-Li-183-D18:2-22:6组合预测受试者的不良心脏事件的预测值的ROC曲线。
发明详述
定义
如本文所使用的，下列术语中的每一个具有与其在本节相关的含义。
如本文所用的，“心脏疾病相关标志物”(其包括“心血管疾病相关生物标志物”、“心肌病相关生物标志物”和“心脏毒性相关生物标志物”)包括一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)生物标志物：细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PED18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC20:3；PC-LI-183-D18:22-22:6的任何组合。心脏疾病相关生物标志物还可以包括本文(例如，在序列表中)所提供的其他生物标志物。
将通过本发明的方法进行治疗的“患者”或“受试者”可以指人或非人动物，优选哺乳动物。“受试者”是指任何动物，包括马、狗、猫、猪、山羊、兔、仓鼠、猴、豚鼠、大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、绵羊、牛、鱼和鸟。人类受试者可以被称为患者。应当指出的是，本文所描述的临床观察是用人类受试者样本进行的，并且在至少一些实施方式中，该受试者是人类。
如本文所使用的，“合并症”是指在患者中引起同一患者中的另一病症、被同一患者中的另一病症引起或以其它方式与同一患者中的另一病症相关的一种医学病症。
“治疗有效量”是指当施用给患者用于治疗疾病时足以实现治疗这样的疾病的效果的化合物的量，例如，以适用于任何治疗的合理的利益/风险比产生某些所希望的局部或全身效果的这种物质的量。当给药用于预防疾病时，该量足以避免或延迟疾病的发作。所述“治疗有效量”根据化合物、其治疗指数、溶解度、疾病和其严重性及被治疗的患者的年龄、体重等会有所不同。例如，可以以足够的量施用通过本发明的方法发现的某些化合物以产生适用于这种治疗的合理利益/风险比。施用治疗有效量的化合物可能需要施用超过一个剂量的该化合物。
“预防”或“防止”是指降低获得疾病或病症的风险(即，使得至少一种疾病的临床症状不在可能接触或易患该疾病但还没有经历或显示疾病的症状的患者中发生)。
术语“预防性”或“治疗性”治疗是指向受试者施用一种或多种所述组合物。如果在不希望的病症(例如，宿主动物的疾病或其它不希望的病症)的临床表现之前施用时，那么治疗是预防性的，即它保护宿主以免于形成不想要的病症，然而如果在表现不希望的病症之后施用，该治疗是治疗性的(即，它意在减少、改善或维持现有的不希望病症或其副作用)。
术语“治疗效果”是指由药理活性物质在动物，特别是哺乳动物中，以及更特别地是人类中所产生的局部或全身效果。因此该术语是指打算在动物或人中用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病或者用于提高期望的身体或精神发育和状态的任何物质的效果。
术语“病症”和“疾病”被包含性地使用，且是指身体的任何部分、器官或系统(或它们的任意组合)的正常结构或功能的任何偏离。具体的疾病表现为特征性的症状和体征，包括生物、化学和物理变化，并通常与各种其它因素相关，包括但不限于，人口统计学、环境、职业、遗传性和医学史因素。可以通过各种方法来量化某些特征性体征、症状以及相关因素以得到重要的诊断信息。
术语“药物诱导的毒性”包括但不限于心脏毒性、肝毒性、肾毒性(hephrotoxicity)、神经毒性、肾脏毒性或肌肉毒性。
术语“心脏毒性”是由心脏毒性剂引起的，且指诱导对心脏功能的广泛不良效应的药剂，包括治疗性分子和毒素。心脏毒性的证据可以在临床前研究的早期出现或随后在临床环境中变得明显。心脏毒性剂可导致多种不良效应，包括但不限于：延长的QT间期、心律失常、心肌缺血、高血压和血栓栓塞性并发症、心肌功能障碍、心肌病、心力衰竭、心房纤颤、心肌病和心力衰竭、心力衰竭和左心室功能不全、心房扑动和颤动，以及心脏瓣膜损伤和心力衰竭的任意一种或多种。
本文使用的“心血管疾病”是一类涉及心脏、血管(动脉、毛细血管和静脉)或这两种的疾病。心血管疾病是指影响心血管系统的任何疾病，主要是心脏疾病，包括心肌病、脑和肾的血管疾病及外周动脉疾病。在某些实施方式中，心血管疾病是指主要影响心脏的疾病，且可以被称为心脏疾病。在某些实施方式中，心血管疾病是指其中病理开始于心脏损伤、功能障碍或畸形的疾病，与其中心脏损伤、功能障碍或畸形是远离心脏部位处存在的主要病理的结果的疾病(例如，作为另一种疾病或病症的合并症的心血管疾病)相反。例如，心力衰竭、心脏节律紊乱(心脏节律的异常，包括延长的QT间期和心房扑动和/或颤动)、包括心内膜炎(心脏内层、心内膜、最通常心脏瓣膜的炎症)的炎性心脏病、炎性心脏肥大(心脏扩大，心肌肥厚)、心肌炎(心肌的炎症)、瓣膜心脏病、先天性心脏病和风湿性心脏病(由于链球菌感染引起的风湿热导致的心肌和瓣膜损害)是心脏损伤、功能障碍或畸形的实例，其中主要病理可以或者是存在于心脏中，且随后可导致血管或其他全身性疾病。可替代地，冠状动脉心脏病(还有缺血性心脏病或冠状动脉病)、高血压性心脏病(高血压继发的心脏疾病)、肺心病(牵连呼吸系统的右侧心力衰竭)、脑血管疾病(脑供血到脑的血管的疾病，例如中风)、外周动脉疾病(供血至胳膊和腿的血管的疾病)和动脉粥样硬化是最初存在于远离心脏位点的病理的结果。开始于心脏或远离心脏的位点的心血管疾病可导致心力衰竭。在本发明的某些实施方式中，心血管疾病包括其中初始病理在远离心脏的位点的疾病。在本发明的某些实施方式中，心血管疾病不包括其中初始病理在远离心脏的位点的疾病。在某些实施方式中，心血管疾病不包括心脏节律紊乱、包括心内膜炎的炎症性心脏病、炎症性心脏肥大、心肌炎、瓣膜心脏病、先天性心脏病、风湿性心脏病、冠状动脉心脏病、高血压性心脏病、肺心病、脑血管疾病、外周动脉疾病和动脉粥样硬化的一种或多种。
如本文所使用的，“心肌病”被理解为选自于延长的QT间期、心律失常、心肌缺血、高血压和血栓栓塞性并发症、心肌功能障碍、心肌病、心力衰竭、心房纤颤、心肌病和心力衰竭、心力衰竭和左心室功能不全、心房扑动和颤动以及心脏瓣膜损伤和心力衰竭的一种或多种病症(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)。在某些实施方式中，心肌病不包括作为另一种疾病或病症的合并症的心肌病。
在某些实施方式中，心肌病是在本文中可互换使用的“诱发性心肌病”或“后天性心肌病”。在某些实施方式中，诱发性或后天性心肌病是暴露于心脏毒性的药物或毒素的结果，例如，用于治疗糖尿病的药物，包括例如，罗格列酮和相关的噻唑烷二酮(TZD)；化疗剂，例如阿霉素、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺和类毒素；可卡因；安非他明；酒精，特别是与不良饮食习惯相结合；和毒素，例如重金属、钴。在某些实施方式中，诱发性心肌病不是药物或毒素暴露的结果。在某些实施方式中，诱发性心肌病是感染的结果，例如病毒感染，包括心脏的细菌或病毒感染(如风湿热)、病毒性肝炎和HIV感染。例如，在某些实施方式中，诱发性心肌病不是感染的结果。在某些实施方式中，心肌病是内分泌失调的结果，例如，糖尿病或甲状腺疾病。在某些实施方式中，心肌病不是内分泌失调的结果。在某些实施方式中，诱发性心肌病是高血压或心脏病发作的结果。在某些实施方式中，诱发性心肌病不是高血压或心脏病发作的结果。在某些实施方式中，诱发性心肌病是缺血的结果，例如，缺血造成的心绞痛、心肌梗死或心力衰竭。在某些实施方式中，诱发性心肌病不是缺血的结果。
在某些实施方式中，心肌病是“遗传性心肌病”，其中肥厚型心肌病和致心律失常性右心室发育不良基本上是遗传性疾病。
如本文所用的，“心力衰竭”(通常被称为充血性心力衰竭(CHF)或充血性心脏衰竭(CCF))应被理解为当心脏不能提供足够的泵送作用以维持血流来满足身体的需要时发生的状况。心力衰竭可导致多种症状，包括气促、下肢肿胀和运动不耐。该病症一般由病人的身体检查诊断和用超声心动图证实。心力衰竭的常见原因包括心肌梗塞和其它形式的缺血性心脏疾病、高血压、心脏瓣膜病和心肌病。术语心力衰竭有时错误地用于其他心脏有关的疾病，如心肌梗死(心脏病发作)或心脏停搏(其可能会导致心脏的衰竭，但不等同于心力衰竭)。
具有“发生心血管疾病(包括心肌病或心力衰竭)的增加的风险”的受试者可能发生或不发生心血管疾病。应当监测心血管疾病的另外的征兆或症状来识别有增加的发生心血管疾病的风险的受试者。本文所提供的用于识别具有增加的发生心血管疾病的风险的受试者的方法可以与心血管疾病的其他已知的风险因子或征兆，包括但不限于，和年龄的评估组合使用。
术语“表达”在本文中用来指由其从DNA制备多肽的过程。该过程涉及基因转录为mRNA及将该mRNA翻译成多肽。根据所用的上下文，“表达”可以指产生RNA或蛋白质或两者。
术语“基因的表达水平”或“基因表达水平”是指在细胞中由该基因编码的mRNA以及前mRNA新生转录本、转录物加工中间体、成熟mRNA和降解产物的水平，或蛋白质的水平。
术语“特异性识别”或“特异性检测”理解为在足够低的分析背景和所用试剂的交叉反应性的情况下检测目标标志物，使得该检测方法可诊断应用。在某些实施方式中，用于特异性识别标志物的试剂只结合于标志物的一个异形体。在某些实施方式中，用于特异性识别标志物的试剂结合标志物的超过一种异形体。在某些实施方式中，用于特异性识别标志物的试剂结合标志物的所有已知的异形体。在某些实施方式中，所述试剂仅结合于蛋白质的磷酸化形式。在某些实施方式中，所述试剂仅结合该蛋白质的非磷酸化形式。
术语生物标志物的“调节”是指生物标志物或反应的上调(即，激活或刺激)、下调(即，阻止或抑制)或者两者的组合或分开。“调节剂”是调节的化合物或分子，和可以是，例如，激动剂、拮抗剂、活化剂、刺激剂、阻遏剂或抑制剂。
“调节的水平”或“改变的水平”是指相对于对照水平或正常水平改变的值。正常是基于历史的正常对照样品或优选在同一个实验中测试的正常对照样品。具体的“正常”值将取决于，例如，分析的类型(例如，ELISA、酶活性、免疫组织化学、PCR、光谱法)、待测试样品(例如，细胞类型和培养条件、受试样品)和本领域技术人员已知的其他考虑因素。对照样品可以被用来定义正常和异常之间的截止值。
与实验室动物或组织培养物研究相关的术语“对照水平”是指标志物的公认的或预先确定的水平，或优选地与测试样品平行测试的对照样品中测定的标志物水平，其被用于与来自没有用潜在毒性药物或救援剂处理的细胞的样品中标志物的水平进行比较。“对照水平”是从在相同的条件(例如，缺氧、高血糖、乳酸等)下培养的细胞获得。
术语“对照水平”指标志物的公认的或预先确定的水平，或优选地与测试样品平行测试的对照样品中或合适的受试样品中测定的标志物的水平，其被用于与来自没有用潜在毒性药物或救援剂处理的细胞的样品中标志物的水平进行比较。在某些实施方式中，“对照水平”是从在相同的条件(例如，缺氧、高血糖、乳酸等)下培养的细胞获得。在某些实施方式中，对照水平从健康的受试者或用药剂(包括，例如，用于治疗心血管疾病，如心肌病的药剂、用于预防和/或治疗心肌病的药剂)处理之前，或在用潜在心脏毒性剂处理之前的受试者获得。
如本文所用的术语“对照样品”是指任何临床相关对比样品，包括，例如，来自未患心血管疾病和/或心肌病的健康受试者的样品，或从较早的时间点，例如，在治疗之前，或者在治疗或疾病的早期阶段来自受试者的样品。对照样品可以是纯化的样品，例如，用试剂盒提供的蛋白质、核酸和/或脂质。这样的对照样品可以被稀释，例如，系列稀释，以允许测试样品中分析物的定量测定。对照样品可以包括来自一个或多个受试者的样品。对照样品可以是在较早的时间点从待评估的受试者获得的样品，例如，在心肌病发病前、在疾病的较早期阶段或在施用用于心肌病或其他病症的治疗或一部分治疗(尤其用已知诱导心肌病的药剂(例如，2型糖尿病药物，化疗剂)治疗)之前，从待评估受试者获得的样品。对照样品也可以是来自动物模型，或来自从心肌病的动物模型获得的组织或细胞系的样品。可以，例如，根据任何适当的统计度量，诸如，例如，集中趋势的度量(包括平均值、中位数或模态值(modal value))来确定由一组测量值组成的对照样品中生物标志物的活性或表达水平。
在一个实施方式中，对照是标准化的对照，如，例如，使用来自没有心血管疾病或心脏疾病的受试者(尤其是没有心肌病的受试者)群体的一种或多种标志物的表达水平的平均值预先确定的对照。而在本发明的另外的实施方式中，标志物的对照水平是来自具有心肌病的受试者的正常样品中标志物的水平。
如本文所用，在“较早的时间点”获得的样品是在过去的足够的时间获得的样品，以至可以从较早的时间点的样品中获得与稍后的时间点相比的临床相关信息。在某些实施方式中，较早的时间点是至少四周前。在某些实施方式中，较早的时间点是至少6周前。在某些实施方式中，较早的时间点是至少两个月前。在某些实施方式中，较早的时间点是至少三个月前。在某些实施方式中，较早的时间点是至少六个月前。在某些实施方式中，较早的时间点是至少九个月前。在某些实施方式中，较早的时间点是至少一年前。本领域技术人员可以根据正常的考虑测定对于特定受试者的适当测试时间间隔。
如本文所使用的，与对照样品或受试者相比“变化的”、“改变的”或“调节的”被理解为水平与来自正常的、未处理的或对照样品的样品统计差异的待检测的分析物或者诊断或治疗指示剂(例如，本发明的标志物)的水平。统计显著性的确定是在本领域的技术人员的能力范围内，例如，构成正结果的距平均值的标准偏差数。
如果细胞用药物处理导致本文所提供的至少一种标志物的水平相对于“正常的”或适当的对照的水平统计学显著的改变，该药物被认为是“心脏毒性”的。应当理解，并非药物的所有浓度一定导致至少一种标志物的水平的统计学显著的变化。在一个优选的实施方式中，如果药物的治疗相关的浓度导致至少一种或多种标志物的水平统计学显著的变化，该药物被认为潜在地具有心脏毒性。
当救援剂以治疗相关的浓度存在，如果标志物的水平以在统计学显著的方式朝向“正常细胞”中的标志物水平调节，“救援剂”被认为有效地降低心脏毒性。在一个优选的实施方式中，救援剂将标志物恢复至与对照细胞中标志物的水平非显著差异的水平。
如本文所用的，术语“获得”在此应理解为制造、购买或以其它方式占有。
“生物样品”或“受试者样品”是其中目的标志物可能存在的体液或组织。在某些实施方式中，样品是血液、呕吐物、唾液、淋巴、囊液、尿液、通过支气管肺泡灌洗收集的流体、通过腹膜漂洗收集的流体或妇科流体。在一个实施方式中，受试者样品是血液样品或它们的组分(例如，血清)。所述样品可以是来自受试者的组织样品，例如来自受试者的心脏组织样品。在某些实施方式中，该组织选自于骨骼、结缔组织、软骨、肺、肝、肾、肌肉组织、心脏、胰腺和皮肤。细胞样品或来自实验室动物的样品可以被用在本文所提供的许多相同的实验方法中用于人的生物或受试者样品中。
如本文所使用的，“检测”、“测定”等被理解为是指执行用于识别样品中的特定标志物，例如，包括脂质生物标志物的任何本文提供的生物标志物的试验。样品中检测的标志物表达、活性或水平的量可以是没有或低于所述测定或方法的检测水平。
“本发明的蛋白质”包括标志物蛋白质和它们的片段；变体标志物蛋白质和它们的片段；肽和多肽，其包含标志物或变体标志物蛋白质的至少15个氨基酸的片段；和包含标志物或变体标志物蛋白质或者标志物或变体标志物蛋白质的至少15个氨基酸的片段的融合蛋白质。在某些实施方式中，本发明的蛋白质是足够大以允许抗体与标志物特异性结合的肽序列或表位。
本发明进一步提供了特异性结合于本发明的标志物蛋白和标志物蛋白片段的抗体、抗体衍生物和抗体片段。除非其中另有指南，术语“抗体”和“多种抗体”宽泛地包括天然存在的抗体的形式(例如，IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体如单链抗体、嵌合的和人源化的抗体和多特异性抗体，以及所有前述的片段和衍生物，该片段和衍生物具有至少抗原结合位点。抗体衍生物可包含与抗体偶联的蛋白质或化学部分。
“本发明的基因”包括标志物基因和它们的片段；变体标志物基因和它们的片段；核酸和互补序列、包含标志物或变体标志物基因的至少15个连续核苷酸的基因片段；和编码包含标志物或变体标志物蛋白或者标志物或变体标志物蛋白的至少15氨基酸的片段的融合蛋白的核酸。在某些实施方式中，本发明的基因是核酸序列的足够大的部分以允许互补核酸与标志物特异性结合。
如本文所用的，“更高的预测值”理解为比其所比较的测试具有显著更高的灵敏度和/或特异性，优选更高的灵敏度和特异性的分析。可以使用，例如，ROC分析确定测试的预测值。在ROC分析中，提供正常和疾病状态之间完美区分或精度的测试的曲线下面积(AUC)＝1.0，而不能提供比随机更好的区分的很差的测试AUC＝0.5。如本文所使用的，具有较高预测值的测试比另一试验具有统计学改进的AUC。在某些实施方式中，提供正常和疾病状态之间的区分或精确度的测试的ROC分析具有至少0.65、至少0.7、至少0.75、至少0.8、至少0.85、至少0.9、至少0.91、至少0.92、至少0.93、至少0.94、至少0.95、至少0.96、至少0.97、至少0.98、至少0.99或更大的AUC。在一个优选的实施方式中，AUC与0.5显著不同。该试验是在合适的受试者群体中进行。
如本文所用的，“形成复合物”应理解为在允许标志物和探针之间形成复合物的条件下将疑似含有标志物(例如，肽、核酸标志物、脂质标志物、酶标志物)的样品与疑似存在于样品中的标记物形成复合物的标志物特异性结合剂或探针结合。在某些实施方式中，所形成的复合物的水平可以低于用来检测所形成的复合物的分析的检测水平。
如本文所用的，“从细胞分离标志物”应理解为从来自目的受试者的细胞的环境中移除标志物的任何方法，其可以包括获得活检样本和处理细胞，获得受试者样品，例如血液或血清样品，例如，从与心脏细胞的接触移除。在体外，从细胞分离标志物可以理解为处理细胞以使标志物可被检测。细胞提取的方法，例如，用有机溶剂来分离脂质或无机溶剂以分离蛋白质和核酸用于分析是本领域技术人员中已知的。应该理解，从细胞移除的样品中存在的标志物的量可以低于试验的检测水平。
术语“基因组”是指生物实体(细胞、组织、器官、系统、生物体)的遗传信息的全部。它在DNA或RNA中(例如在某些病毒中)编码。基因组包括基因和DNA的非编码序列。
术语“蛋白质组”是指在给定时间由基因组、细胞、组织或生物体表达的一整套蛋白质。更具体地，它可以是指在限定的条件下在给定时间在给定类型的细胞或生物体中整套的表达蛋白质。蛋白质组可以包括由于，例如，基因的可变剪接和/或翻译后修饰(如糖基化或磷酸化)导致的蛋白质变体。
术语“转录组”是指在给定时间在一个或一群细胞中产生的一整套转录的RNA分子，包括mRNA、rRNA、tRNA、微RNA和其它非编码RNA。该术语可应用于给定生物体中的总转录物集合，或应用于特定细胞类型中存在的转录物的特定子集。与对于给定的细胞系(不包括突变)大致固定的基因组不同，转录组可以根据外部环境条件的不同而不同。因为它包括细胞中的所有mRNA转录物，转录组反映在任何特定时间活跃地表达的基因，例外是mRNA降解现象，如转录衰减。
转录组学(也称作表达谱)的研究检验在给定的细胞群体中mRNA的表达水平，通常采用基于DNA微阵列技术的高通量技术。
术语“代谢组”是指在给定的时间给定的条件下在生物样品(如单一有机体)中发现的整个小分子代谢物(如代谢中间体、激素和其他信号传导分子以及次级代谢产物)集合。代谢组是动态的，且可能随时间变化。
术语“脂质组”是指在给定的时间给定的条件下在生物样品(如单个有机体)中发现的整个脂质集合。该脂质组是动态的，且可能随时间变化。
术语“相互作用组”是指在被研究的生物系统(例如，细胞)中的整个分子间相互作用的集合。它可以被显示为有向图。分子间相互作用可以在属于不同的生物化学家族的分子(蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物等)之间和也可以在给定的家族内发生。当就蛋白质组学方面而言，相互作用组指蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)或蛋白质相互作用网络(PIN)。相互作用组的另一广泛研究类型是蛋白质-DNA相互作用组(即通过转录因子和DNA或染色质调节蛋白形成的网络)以及它们的靶基因。
术语“细胞输出”包括与细胞的状态有关的参数(优选可测量的参数)的集合，包括，但不限于，一种或多种基因的转录水平(例如，可通过RT-PCR、qPCR、微阵列等测量的)、一种或多种蛋白质的表达水平(例如，可通过质谱法或蛋白质印迹测量的)、一种或多种酶或蛋白质的绝对活性(例如，可测量为底物转化率)或相对活性(例如，可测量为相对于最大活性的％值)、一种或多种代谢物或中间体的水平、氧化磷酸化的水平(例如，可由耗氧率或OCR测量)、糖酵解的水平(例如，可由细胞外酸化率或ECAR测量)、配体-靶结合或相互作用程度、细胞外分泌分子的活性等。细胞输出可以包括预定数目的靶基因或蛋白质等的数据，或者可以包括用于所有可检测的基因或蛋白质的总体评估。例如，质谱法可用于鉴定和/或定量在给定的样品或细胞群体中表达的所有可检测的蛋白质而无需事先知道任何特定的蛋白质是否可以在样品或细胞群体中表达。
如本文所使用的，“细胞系统”包括同质或异质细胞群体。系统内的细胞可以在天然或生理环境中体内生长，或可以在，例如，在受控的组织培养环境中体外生长。系统内的细胞可以是相对均质的(例如，不低于70％、80％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％均质的)，或者可以包含两种或更多种细胞类型，如通常发现在体内接近生长的细胞类型，或可以通过，例如，旁分泌或其他长距离细胞间通讯在体内彼此相互作用的细胞类型。细胞系统内的细胞可以源自已建立的细胞系，包括癌细胞系、永生细胞系或正常细胞系，或者可以是原代细胞或从活组织或器官新分离的细胞。
细胞系统中的细胞通常与可以提供可以的营养物、气体(氧气或二氧化碳等)、化学物质或蛋白质性/非蛋白质性刺激剂(其规定影响细胞行为的条件)的“细胞环境”相接触。细胞环境可以是具有规定的化学成分和/或较少限定的组织提取物或血清组分的化学介质，并且可以包括细胞生长的特定pH、CO2含量、压力和温度。可替代地，细胞环境可以是对于特定细胞系统在体内发现的天然或生理环境。
在某些实施方式中，细胞环境包含模拟生物系统或过程的方面的条件，例如，模拟疾病状态、过程或环境。这样的培养条件包括，例如，高血糖、缺氧或富乳酸条件。在本文中描述了许多其它的这类条件。
在某些实施方式中，用于特定细胞系统的细胞环境还包括细胞系统的某些细胞表面特征，如在细胞表面上的受体或配体的类型和它们相应的活性、碳水化合物或脂质分子的结构、膜极性或流动性、某些膜蛋白的簇集状态等。这些细胞表面特征可以影响附近细胞的功能，如属于不同细胞系统的细胞。然而，在某些其他实施方式中，细胞系统的细胞环境不包括细胞系统的细胞表面特征。
细胞环境可以被改变为“修饰的细胞环境”。改变可以包括在细胞环境中发现的任何一种或多种组分的变化(例如，增加或减少)，包括对细胞环境添加一种或多种“外部刺激成分”。环境扰动或外部刺激成分可以是细胞环境内源的(例如，细胞环境包含某些水平的刺激物，和加入更多的相同刺激物以增加其水平)，或者可以是细胞环境外源的(如，改变之前细胞环境中大部分不存在的刺激物)。细胞环境可以通过加入外部刺激成分导致的次级变化而进一步改变，因为外部刺激成分可以改变细胞系统的细胞输出，包括由细胞系统分泌到细胞环境中的分子。
如本文所使用的，“外部刺激成分”，在此也称为“环境扰动”，包括可能会影响细胞功能的任何外部物理和/或化学刺激物。这可以包括任何大的或小的有机或无机分子、天然或合成的化学物质、温度偏移、pH变化、辐射、光(UVA、UVB等)、微波、声波、电流、调制的或未调制的磁场等。
冠词“一”和“一个”在本文中用于指一个或超过一个(即至少一个)所述冠词的语法对象。以举例的方式，“一个元素”意指一个元素或多于一个元素。
术语“包括”在本文中用于指短语“包括但不限于”，并可与其互换使用。
术语“或”在本文中包含地使用，并可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有明确说明。
术语“例如”在本文中用于指短语“例如但不限于”，并可与其互换使用。
除非特别说明或者从上下文中显而易见的，本文所用的术语“约”被理解为在本领域中正常公差的范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以被理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非从上下文另外清楚的，本文所提供的所有数值可以通过术语约进行修饰。
本文的变量的任何定义中化学基团列表的叙述中包括该变量作为所列举基团的任何单一基团或组合的定义。本文的变量或方面的实施方式的叙述包括该实施方式作为任何单一实施方式或与任何其他实施方式或其部分组合。
本文所提供的任何组合物或方法可与本文所提供的任何其他组合物和方法的一种或多种进行组合。
本文所提供的范围被理解为范围内的所有值的简写。例如，1至50的范围被理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组的任意数、数的组合或子范围。
现在将对本发明的示例性实施方式进行详细地说明。尽管结合示例性实施方式对本发明进行描述，但是应该理解，其并不旨在将本发明限制于那些实施方式。与此相反，它旨在覆盖可以被包括在通过所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内的替换、修改和等同物。
本发明的标志物及其用途
本发明至少部分地基于识别与心血管疾病相关的生物标志物，该心血管疾病包括心力衰竭、心肌病和诱导的毒性，例如，药物诱导的心脏毒性，如药物诱导心脏毒性，或药物诱导毒性对扰动的反应，例如治疗或救援剂。标志物也可用于检测由于任何原因引起的心血管疾病和心肌病，例如遗传或生理异常或损伤(例如，缺血性损伤、心血管病、创伤)。
特别地，本发明涉及在实施例中描述的标志物(以下称为“标志物”或“本发明的标志物”)。本发明提供了由标志物编码或与标志物对应的核酸和蛋白质(以下分别称为“标志物核酸”和“标志物蛋白质”)。本发明还提供了在实施例中描述的脂质标志物。本发明还提供了酶标志物，例如，在实施例中描述的激酶标志物。本发明的这些标志物特别可用在诊断和预测诱导心脏毒性的状态；开发用于各种药物诱导心脏毒性状态的药物靶标；筛选诱导心脏毒性的存在；识别引起或具有引起诱导心脏毒性的风险的药剂；识别可以减少或防止诱导心脏毒性(例如，毒素或药物诱导心脏毒性)的救援剂；减轻、减少或预防诱导心脏毒性；和识别预测诱导心脏毒性的进一步的标志物。在优选的实施方式中，诱导的毒性是药物诱导毒性，优选药物诱导心脏毒性。还提供了用于预后、诊断和监测心血管疾病(包括心肌病和心力衰竭)的方法。
“标志物”是基因、蛋白质、酶或脂质，其在组织或细胞中的水平相对于它在正常或健康组织或细胞中水平的改变与心血管疾病(例如，心肌病)、药物诱导的毒性(例如，心脏毒性)或心肌病的易感性(例如由于导致心脏疾病或心血管疾病(如心肌病或心力衰竭)的遗传因素或状态，例如，糖尿病、肥胖症、高胆固醇血症、高血压等，产生的心血管疾病)相关。
“标志物核酸”是本发明的标志物编码的或与之相对应的核酸(例如，mRNA、cDNA)。这样的标志物核酸包括DNA(如cDNA)，其包含作为本发明的标志物的任何基因的整个或部分序列或这样的序列的互补序列。在某些实施方式中，标志物与由原发性心脏病理导致的心脏疾病相关。这样的序列是本领域技术人员已知的，并可以在，例如，NIH政府PubMed网站上找到。所述标志物核酸也包括RNA，其包含本发明的任何基因标志物的整个或部分序列或这种序列的互补序列，其中所有的胸苷残基被替换为尿嘧啶残基。
“标志物蛋白质”是由本发明的标志物编码或与之对应的蛋白质。标志物蛋白质包含任何本发明的标志物蛋白质的整个或部分序列。这样的序列是本领域的技术人员已知的，并可以在，例如，NIH政府PubMed网站上找到。术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。
“标志物酶”，例如，激酶，是具有活性水平变化的酶，其中该变化是由于，例如，表达水平的变化、翻译后修饰的改变(例如，酶的磷酸化、酶的裂解)、结合伴体的变化(例如，βγ亚基从α亚基释放)中的一种或多种而导致，其导致与其在正常或健康组织或细胞中的表达水平相比酶活性的变化，与包括心力衰竭或心肌病(包括药物诱导性心肌病)的心血管疾病有关。检测酶活性变化的方法是本领域公知的。
“标志物脂质”是其与正常或健康组织或细胞中的水平相比改变的水平与心血管疾病(例如药物诱导的毒性，例如心脏毒性)相关或与心血管疾病或心肌病相关的脂质。脂质参与了细胞内和细胞外信号传导。此外，与大多数蛋白质不同，脂质在一系列规定的步骤中进行加工，而不是被翻译，使得存在于样品中的脂质的比率(而不是样品中特定的脂质水平)也可以被认为是作为诱导的心脏毒性(例如，药物诱导心脏毒性)、心血管疾病或心肌病引起的变化的“标志物”。
“标志物水平”或“生物标志物水平”是存在于样品中的标志物的绝对或相对量。可以通过检测样品中标志物的浓度来确定标志物水平，例如，样品中存在的蛋白质、脂质或核酸的量，或样品中酶的活性单位的数量。可以通过检测样品中标志物的相对浓度来确定标志物水平，例如，与另一个样品(例如，对照的“正常”或“未经处理”的样品、来自较早的时间点的样品、受到不同处理的对照样品等)相比存在于样品中的蛋白质、脂质、核酸或酶活性的量。测定标志物水平的具体方法取决于，例如，待测定的标志物水平的类型。
标志物的“正常”水平或表达水平是未有毒性状态或心肌病的人类受试者或患者的细胞中标志物的(表达)水平。
标志物的“过表达”、“较高水平”或“较高表达水平”是指测试样品中高于用来评估该标志物水平的测定法的标准误差的水平，并且优选比对照样品(例如，来自不具有心脏病，例如，心肌病的健康受试者的样品)中标志物水平和优选地几个对照样品中所述标志物(或多种标志物)的平均水平高至少25％、高至少35％、高至少40％、高至少50％、高至少60％、高至少75％、高至少85％或是至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍或至少十倍。为简单起见，如本文所用的，较高的表达水平也可以指升高的脂质水平，虽然可以理解脂质不是被表达的。
标志物的“较低水平”或“较低表达水平”是指测试样品中小于对照样品(例如，来自不具有心脏病，例如，心肌病的健康受试者的样品)中所述标志物的水平和优选地几个对照样品中所述标志物的平均表达水平的90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％的水平(例如，表达水平)。为简单起见，如本文所用的，较低的表达水平也指降低的脂质水平，尽管可以理解脂质不是被表达的。
“正常化水平”或“正常化表达”理解为将先前例如，由于心血管疾病、心肌病或心脏毒性剂的治疗而失调的标志物的水平恢复到更接近正常对照水平(例如，健康受试者中的标志物水平，未处理的细胞中的标志物水平)的水平。在一个实施方式中，标志物的正常化水平优选是在标志物的正常对照值的标准差内。在一个实施方式中，标志物的正常化水平是在标志物的正常对照值的两个标准差内。在一个实施方式中，标志物的正常化水平是在标志物的正常对照值的三个标准差内。在一个实施方式中，标志物的正常化水平是在标志物的正常对照值的10％内。在一个实施方式中，标志物的正常化水平是在标志物的正常对照值的25％内。在一个实施方式中，标志物的正常化水平是在标志物的正常对照值的50％内。在一个实施方式中，标志物的正常化水平比与疾病或心脏毒性状态相关的标志物异常水平更接近于标志物正常对照值的值。
在一个实施方式中，本发明的标志物是与药物诱导心脏毒性相关的或参与药物诱导心脏毒性的基因、蛋白质或脂质。这类参与药物诱导心脏毒性的基因或蛋白质包括，例如，本文中(例如，在序列表)中提供的标志物。在一些实施方式中，本发明的标志物是本文所提供的至少二、三、四、五、六、七、八、九、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160或更多种基因、蛋白质或脂质的组合；或它们的任何组合。在前述的列表中列出的所有值还可以是意在作为本发明的一部分的范围的上限或下限，例如，前述基因、蛋白质或脂质的1至5、1至10、1至20、1至30、2至5、2至10、3至10、4至10、5至10、2至20、3至20、4至20、5至20、10至20、10至25、10至30种；或它们的任何组合。
心血管疾病和心肌病相关标志物
本发明至少部分地基于识别与心血管疾病和心肌病(包括与诱导的心脏毒性如药物诱导心脏毒性相关的心肌病)相关的生物标志物。
下面更详细地描述一些特别优选的本发明的标志物。
细胞外基质金属蛋白酶诱导因子
细胞外基质金属蛋白酶诱导因子也称为M6、OK、5F7、TCSF、CD147和BSG。由该基因编码的蛋白质是质膜蛋白，其在精子发生、胚胎着床、神经网络形成以及肿瘤发展中非常重要。所编码的蛋白质也是免疫球蛋白超家族的成员。已经发现了这种基因的编码不同异形体的多个转录物变体，具体地，GenBank NM_001728.3，基础免疫球蛋白(basigin)异形体1前体；GenBank NM_198589.2，基础免疫球蛋白异形体2；GenBank NM_198590.2，基础免疫球蛋白异形体3；和GenBank NM_198591.2，基础免疫球蛋白异形体4，其在SEQ ID NO:1-8中提供。关于该基因的其他信息可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/682中找到，其中的全部内容以本申请的优先权日可用的版本通过引用并入本文中。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的水平增加指示心血管疾病，例如，心力衰竭和心肌病。
HMOX1
HMOX1也被称为血红素加氧酶(脱环)1、HO-1、HSP32和bK286B10。由该基因编码的蛋白质血红素加氧酶(其为血红素分解代谢中必不可少的酶)裂解血红素以形成胆绿素，其随后由胆绿素还原酶转化为胆红素和一氧化碳(推定的神经递质)。血红素加氧酶活性是通过其底物血红素和通过各种非血红素物质诱导的。血红素加氧酶以2个同功酶存在，诱导型血红素加氧酶1和组成型血红素加氧酶2。HMOX1和HMOX2属于血红素加氧酶家族。HMOX1的GenBank登录号是NM_002133且氨基酸和核酸序列在SEQ ID NO:9-10中提供。关于该基因的其他信息可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3162中找到，其中的全部内容以本申请的优先权日可用的版本通过引用并入本文中。HMOX1水平的增加指示心血管疾病，例如，心力衰竭和心肌病。
IGFBP7
胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)也被称为AGM、PSF、TAF、FSTL2、IBP-7、MAC25、IGFBP-7、RAMSVPS、IGFBP-7V和IGFBPRP1。这个基因编码胰岛素样生长因子(IGF)结合蛋白(IGFBP)家族的成员。IGFBP以高亲和力结合IGF，并且在体液和组织中调节IGF的可用性，并调节IGF与其受体的结合。该蛋白质以相对低的亲和力结合IGF-I和IGF-II，并属于低亲和力IGFBP亚家族。它也刺激前列环素的产生和细胞粘附。已描述这种基因的编码不同异形体的可变剪接转录物变体，且一个变体已与视网膜动脉大动脉瘤相关(PMID:21835307)。IGFBP7异形体1和2的GenBank登录号分别是NM_001553和NM_001253835，其序列提供于SEQ ID NO:11-14中。关于该基因的其他信息可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ 3490中找到，其中的全部内容以本申请的优先权日可用的版本通过引用并入本文中。IGFBP7水平的增加指示心血管疾病，例如，心力衰竭和心肌病。
CCDC47
含的卷曲螺旋结构域47(CCDC47)也被称为GK001、MSTP041。GenBank登录号是NM_020198且氨基酸和核酸序列示于SEQ ID NO:15-16中。CCDC47水平的增加指示心血管疾病，例如，心力衰竭和心肌病。
PTX3
PTX3也被称为穿透素(pentraxin)3，长；TNFAIP5；TSG-14；TNFα诱导蛋白5；穿透素相关基因，IL-1β快速诱导的，肿瘤坏死因子，α诱导蛋白5；穿透素相关蛋白PTX3；穿透素-3；穿透素相关基因，IL-1β快速诱导的；穿透素相关蛋白PTX3；肿瘤坏死因子α诱导蛋白5；肿瘤坏死因子，α诱导蛋白5；肿瘤坏死因子诱导基因14蛋白；和肿瘤坏死因子诱导蛋白TSG-14。GenBank登录号是NM_002852且氨基酸和核酸序列示于SEQ ID NO:17-18中。关于该基因的其他信息可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5806中找到，其中的全部内容以本申请的优先权日可用的版本通过引用并入本文中。PTX3水平的下降指示心血管疾病，例如，心力衰竭和心肌病。
IL27
白细胞介素27(IL27)也被称为IL-27、IL-27A、IL27A、IL27p28、IL30、P28、IL-27p28亚基；IL-27α亚基；IL-27-A；IL27-A；白细胞介素30；和白介素27亚基α。由该基因编码的蛋白质是异二聚体细胞因子复合物的亚基之一。这种蛋白质与白细胞介素12A(IL12A)有关。它与Epstein-Barr病毒诱导基因3(EBI3)(类似于白细胞介素12B(IL12B)的蛋白质)相互作用，并形成复合物(其已被证明驱动初始的但不是记忆CD4(+)T细胞的快速扩增。该复合物也被发现与白细胞介素12强烈协同以触发初始CD4(+)T细胞的干扰素γ(IFNG)的产生。这种细胞因子的生物效应是由I类细胞因子受体(WSX1/TCRR)介导的。GenBank登录号是1.NM_145659且氨基酸和核酸序列示于SEQ ID NO:19-20中。关于该基因的其他信息可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/246778中找到，其中的全部内容以本申请的优先权日可用的版本通过引用并入本文中。IL27水平的增加指示心血管疾病，例如，心力衰竭和心肌病。
PAI1
PAI1也被称为SERPINE1，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂，进化枝E(连接蛋白，纤溶酶原激活物抑制剂1型)，成员1；PAI，PAI-1，PAI1，PLANH1；内皮细胞纤溶酶原激活物抑制剂；纤溶酶原激活物抑制剂1；丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂，进化枝E(连接蛋白，纤溶酶原激活物抑制剂1型)，成员1；和丝氨酸蛋白酶抑制蛋白E1。这个基因编码丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)超家族的成员。该成员是组织纤溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶(uPA)的主要抑制剂，并因此是纤维蛋白溶解的抑制剂。该基因的缺陷是纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂-1缺陷(PAI-1缺陷)的原因，且该基因产物的高浓度与血栓形成倾向有关。已经发现这种基因的编码不同异形体的可变剪接转录物变体。异形体1和2的GenBank登录号分别是NM_000602和NM_001165413，和提供在SEQ ID NO:21-24中。关于该基因的其他信息可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5054中找到，其中的全部内容以本申请的优先权日可用的版本通过引用并入本文中。PIA1水平的下降指示心血管疾病，例如，心力衰竭和心肌病。
CFL2
CFL2也被称为丝切蛋白(cofilin)2(肌肉)；NEM7；丝切蛋白，肌肉异形体；和丝切蛋白-2。该基因编码参与调节肌动蛋白丝动力学的细胞内蛋白质。这种蛋白是核内和细胞质肌动蛋白杆的主要成分。它可以以丝切蛋白与肌动蛋白1：1的比例结合G-以及F-肌动蛋白，并且它以pH依赖性的方式可逆地控制肌动蛋白的聚合和解聚。该基因的突变导致杆状体肌病7型，先天性肌病的一种形式。可变剪接产生三个转录物变体，但是，两个变体编码相同的蛋白质。该序列可在GenBank登录号NM_001243645(丝切蛋白-2异形体2)；NM_021914(丝切蛋白-2异形体1)；和NM_138638(转录物变体丝切蛋白-2异形体1)中获得。氨基酸和核酸序列被提供在SEQ ID NO:25-30中。关于该基因的其他信息可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1073中找到，其中的全部内容以本申请的优先权日可用的版本通过引用并入本文中。CFL2水平的增加指示性心血管疾病，例如，心力衰竭和心肌病。
EDIL3
EDIL3也被称为EGF样重复和盘状结构域(discoidin)I样结构域3；DEL1；内皮发育位点(developmental endothelial locus)-1；发育调节内皮细胞位点1蛋白；整联蛋白结合蛋白DEL1。由该基因编码的蛋白质是整联蛋白配体。它在介导血管发生中起重要作用，并可能在血管壁重建和发育中非常重要。它也影响内皮细胞的行为。GenBank登录号是NM_005711且氨基酸和核酸序列可以在SEQ ID NO:31-32中找到。关于该基因的其他信息可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10085中找到，其中的全部内容以本申请的优先权日可用的版本通过引用并入本文中。EDIL3水平的下降指示心血管疾病，例如，心力衰竭和心肌病。
NUCB1
NUCB1也称为核连蛋白(nucleobindin)1、CALNUC和NUC。这个基因编码小的钙结合EF手蛋白(EF hand protein)家族的成员。所编码的蛋白质被认为在高尔基器钙稳态和Ca(2+)调控信号转导事件中具有重要作用。GenBank登录号是1.NM_006184，且氨基酸和核酸序列可以在SEQ ID NO:33-34中找到。关于该基因的其他信息可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4924中找到，其中的全部内容以本申请的优先权日可用的版本通过引用并入本文中。NUCB1水平的下降指示心血管疾病，例如，心力衰竭和心肌病。
脂质
脂质标志物PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3和LPC20:3在具有心肌病的临床诊断的糖尿病受试者(其用已知心脏毒性药物治疗)中比没有用已知心脏毒性药物治疗的糖尿病患者和比用已知心脏毒性药物治疗的无心肌病的糖尿病患者显著降低。因此PED18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3和/或LPC20:3水平的降低指示心血管疾病，包括心肌病。PD18:0-20:3与正常受试者相比的水平降低指示代表心血管疾病的心脏重构。
根据标志物的特性，标志物的增加或减少可以指示包括心力衰竭或心肌病的心血管疾病，或指示药剂很可能是心脏毒性的。例如，与正常受试者相比，选自于PTX3、PAI1、EDIL3和NUC1B的至少一种心血管疾病标志物的水平的降低指示受试者患有心血管疾病或具有发生心血管疾病的增加的风险或者指示药剂是心脏毒性的。相反地，与正常受试者相比，选自于PTX3、PAI1、EDIL3和NUC1B的至少一种心血管疾病标志物的水平没有变化或增加指示受试者未患心血管疾病或没有发生心血管疾病的增加的风险或者指示药剂不是心脏毒性的。
选自于HMOX1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2和CCDC47的至少一种心血管疾病标志物的水平相比于正常受试者的增加指示受试者患有心血管疾病或具有发生心血管疾病的增加的风险或者指示药剂是心脏毒性的。相反，选自于HMOX1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2和CCDC47的至少一种心血管疾病标志物的水平相比于正常受试者的降低指示受试者未患心血管疾病或没有发生心血管疾病的增加的风险或指示药剂不是心脏毒性的。
对于脂质标志物，选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、LPC20:3和18:0-20:3的至少一种心血管疾病标志物的水平相比于正常受试者的降低指示受试者患有心血管疾病或具有发生心血管疾病的增加的风险或指示药剂是心脏毒性的。选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、LPC20:3和18:0-20:3的至少一种心血管疾病标志物的水平相比于正常受试者的增加指示受试者未患心血管疾病或没有增加的风险发生心血管疾病的增加的风险或指示药剂不是心脏毒性的。
当分析化合物以识别用于治疗心血管疾病的药剂时，与未处理的细胞相比，用受试化合物处理的受试细胞中选自于PTX3、PAI1、EDIL3和NUC1B的至少一种心血管疾病标志物水平的降低指示所述受试化合物用于治疗心血管疾病是无效的。反之，选自于PTX3、PAI1、EDIL3和NUC1B的至少一种心血管疾病标志物水平的增加指示该受试药剂在治疗心血管疾病中是有效的。
当分析化合物以识别用于治疗心血管疾病的药剂时，与未处理的细胞相比，用受试化合物处理的受试细胞中选自于HMOX1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2和CCDC47的至少一种心血管疾病标志物水平的升高指示所述受试化合物用于治疗心血管疾病是无效的。相反，选自于HMOX1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2和CCDC4的至少一种心血管疾病标志物水平的降低指示该受试药剂在治疗心血管疾病中是有效的。
当分析化合物以识别用于治疗心血管疾病的药剂时，与未处理的细胞相比，用受试化合物处理的受试细胞中选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、LPC20:3和18:0-20:3的至少一种心血管疾病标志物水平的降低指示所述受试化合物用于治疗心血管疾病是无效的。相反地，选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、LPC20:3和18:0-20:3的至少一种心血管疾病标志物水平的增加指示该受试药剂在治疗心血管疾病中是有效的。
在血清中检测到的标志物的量作为绝对值而不是相对值可被认为是心血管疾病的指示，包括心力衰竭或心肌病。例如，不超过1000pg/ml、900pg/ml、800pg/ml、700pg/ml、600pg/ml或500pg/ml的CCDC47的血清水平可以指示不存在心血管疾病，包括心力衰竭或心肌病。至少1300pg/ml、1400pg/ml、1500pg/ml、1600pg/ml、1700pg/ml、1800pg/ml、1900pg/ml或2000pg/ml的CCDC47的血清水平可以指示没有心血管疾病，包括心力衰竭或心肌病。不大于10pmole/mg蛋白质、8pmole/mg蛋白质、6pmole/mg蛋白质或5pmole/mg蛋白质的PED18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3的血清水平可被认为指示包括心力衰竭或心肌病的心血管疾病。至少12pmole/mg蛋白质、14pmole/mg蛋白质、16pmole/mg蛋白质或20pmole/mg蛋白质的PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3的水平可被认为指示没有心血管疾病，包括心力衰竭或心肌病。对于标志物LPC20:3，不大于25pmole/mg蛋白质、22pmole/mg蛋白质、20pmole/mg蛋白质、18pmole/mg蛋白质或15pmole/mg蛋白质的水平指示包括心力衰竭和心肌病的心血管疾病。至少30pmole/mg蛋白质、35pmole/mg蛋白质、40pmole/mg蛋白质或45pmole/mg蛋白质的LPC20:3的水平可被认为指示没有心血管疾病，包括心力衰竭或心肌病。
本发明的诊断/预后用途
本发明提供了用于在受试者中诊断心血管疾病，尤其是心力衰竭和/或其中心肌病(包括与心脏毒性剂接触而导致的心肌病)的方法。本发明进一步提供了用于预后或监测心血管疾病(尤其是心力衰竭和/或心肌病，包括与心脏毒性剂接触而导致的心肌病)对于治疗性处理的反应的方法。本发明进一步提供了用于选择用于治疗非心脏相关疾病或病症的治疗性处理中的变化的方法，例如，降低潜在心脏毒性剂的剂量。
在一个实施方式中，本发明提供了用于诊断心血管疾病尤其是心力衰竭和/或心肌病(包括与心脏毒性剂接触而导致的心肌病)的方法。本发明的方法可以与熟练技术人员所使用的任何其他方法结合实施来预后心血管疾病。本文所提供的诊断和预后方法可用于确定是否应当对受试者进行附加的和/或更侵入性的测试或监测。可以理解，如心血管疾病一样复杂的疾病很少使用单一测试诊断。因此，可以理解，本文所提供的诊断、预后和监测方法通常与本领域中已知的其它方法结合使用。例如，本发明的方法可以与包括遗传测试和/或非基于标志物的方法(例如，医疗和家族史分析、身体检查、血液检查及成像和功能分析，包括胸部X-射线检查、EKG(心电图)、动态心电图和事件监测器、超声心动图、压力测试、心导管插入术、冠状动脉造影及心肌活检)的方法结合进行。
还提供了用于在受试者中评估治疗方案(例如，血液稀释剂、外科手术、β-阻滞剂)的功效或者改变潜在诱导或加重心肌病的药剂(即，心脏毒性剂)的非心脏相关疾病治疗的效力的方法。在这些方法中评估了一对样品(在较早的时间点或治疗方案之前的从受试者获得的第一样品，和在较晚的时间点例如在受试者已经经历了至少一部分治疗方案或已改变治疗方案的较晚时间点从受试者获得的第二样品)中标志物的量。
也可以使用本发明的方法来选择能够调节(例如，减少)药剂的心脏毒性的化合物。在该方法中，心肌细胞接触受试化合物，和测定受试化合物调节心肌细胞中本发明的一种或多种标志物的表达和/或活性的能力，其中在心肌细胞中调节本发明的一种或多种标志物的表达和/或活性的受试化合物被选择为能够减少药剂的心脏毒性的化合物。
使用本文描述的方法，可以筛选多种分子以鉴定调节本发明的标志物的表达和/或活性的分子。可以向受试者提供这样鉴定的化合物以防止或治疗受试者中的心肌病。
在以下章节中进一步详细描述本发明的各个方面。
筛选心脏毒性剂或救援剂的方法
使用本文描述的方法，可以筛选多种分子(特别是包括足够小以能够穿过细胞膜的分子)以识别调节(例如，增加或减少)本发明的标志物的表达和/或活性的分子。可以向受试者提供这样识别的化合物以在受试者中减少、减轻或预防药物诱导的心脏毒性。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种用于识别可以减少或预防药物诱导心脏毒性或者预防或治疗心肌病的药剂的方法，包括：(i)测定用毒性诱导药物处理之前获得的第一细胞样品中存在的一种或多种生物标志物的正常水平；(ii)测定用毒性诱导药物处理之后获得的第二细胞样品中存在的一种或多种生物标志物的处理水平，以确定在处理的细胞样品中具有表达变化的一种或多种生物标志物；(iii)测定在用毒性诱导药物和救援剂处理后获得的第三细胞样品中存在的毒性诱导药物处理样品中具有表达水平改变的一种或多种生物标志物的水平；及(iv)比较第三样品中测定的一种或多种生物标志物的水平与在所述第一样品中测定的一种或多种生物标志物的水平；且与第一样品相比，该第三样品中一种或多种生物标志物的正常化水平指示该药剂可以减少或预防药物诱导心脏毒性或可用于预防或治疗心肌病。在一个实施方式中，该一种或多种生物标志物选自于本文所提供的标志物。
在一个实施方式中，所述细胞是心血管系统的细胞，例如，心肌细胞。在一个实施方式中，该细胞是糖尿病性心肌细胞。在一个实施方式中，该药物是用于治疗糖尿病、肥胖症或心血管疾病的药物或候选药物。在一个实施方式中，该药物是蒽环类药物、5-氟尿嘧啶、顺铂、曲妥珠单抗、吉西他滨、格列酮类(如罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮)、卡麦角林、培高利特、舒马曲坦、二膦酸盐或TNF拮抗剂。在一个实施方式中，与第一样品相比，所述第三样品中选自于本文所提供的生物标志物的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、二十五、三十、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160或更多种生物标志物的正常化表达水平指示该救援剂可降低或预防药物诱导心脏毒性。
在某些实施方式中，该标志物是选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCDC47、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HMOX1、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAI1、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA的一、二、三、四、五、六、七、八、九、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90种标志物。
在某些实施方式中，该标志物是选自于TIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7(IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010和HSPA4的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或十三种标志物。
在某些实施方式中，该标志物是选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、PE D18:0-22:5/D18:1-22:4、PE D16:1-22:6、PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2、LPC 20:3、PC-LI-183-D18:22-22:6、CACNA2D1、EPHX1、BAX、PRKAR2A和MPA2K3的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或十一种标志物。
在某些实施方式中，该标志物是选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、PE D18:0-22:5/D18:1-22:4、PE D16:1-22:6、PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2、LPC 20:3、PC-LI-183-D18:22-22:6的一、二、三、四、五、六或七种标志物。
在一个实施方式中，该受试者是人类。
在一个实施方式中，生物样品中的一种或多种标志物的表达水平是通过分析样品中转录的多核苷酸或一部分而测定的。在一个实施方式中，其中分析转录的多核苷酸包括扩增所述转录的多聚核苷酸。
在一个实施方式中，受试者样品中标志物的表达水平是通过分析样品中的蛋白质或其部分而测定的。在一个实施方式中，使用与蛋白质特异性结合的试剂分析所述蛋白质。
在一个实施方式中，通过分析样品中的脂质水平或脂质水平的比率(例如，一种特定脂质与另一种的比率，或一种脂质与总脂质的比率)来测定受试者样品中的标志物水平。
在一个实施方式中，使用选自于所述样品的聚合酶链反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、单链构象多态性分析(SSCP)、错配切割检测、异源双链分析、Southern印迹分析、northern印迹分析、western印迹分析、原位杂交、阵列分析、脱氧核糖核酸测序、限制性片段长度多态性分析以及它们的组合或子组合的技术测定样品中一种或多种标志物的表达水平。
在一个实施方式中，使用选自于免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA和质谱法的技术来测定样品中标志物的表达水平。
可以通过如本文所提供的多种光谱光度测量方法之一来完成脂质检测。在某些实施方式中，使用色谱法测定脂质水平。
在一个实施方式中，测定多种标志物的水平。
本发明进一步提供了用于在有需要的受试者中减轻、减少、预防或治疗心肌病(包括药物诱导的心脏毒性)的方法，包括向受试者(例如，哺乳动物、人类或非人类动物)施用通过本文提供的筛选方法识别的药剂，从而在受试者中减少或预防药物诱导心脏毒性。在一个实施方式中，向已经用心脏毒性诱导药物治疗的受试者施用所述药剂。在一个实施方式中，在用心脏毒性诱导药物治疗受试者的同时向受试者施用所述药剂。在一个实施方式中，在用心脏毒性诱导药物治疗受试者之前向受试者施用所述药剂。
在某些实施方式中，该标志物是选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCDC47、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HMOX1、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAI1、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90种标志物。
在某些实施方式中，该标志物是选自于TIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7(IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010和HSPA4的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或十三种标志物。
在某些实施方式中，该标志物是CCDC47和HMOX1中的一种或两种。在某些实施方式中，标志物是CCDC47和HMOX1。在某些实施方式中，该标志物是CCDC47、HMOX1和PAI-1。在某些实施方式中，该标志物是CCDC47、HMOX1和PTX3。在某些实施方式中，该标志物是CCDC47、HMOX1、PAI-1和PTX3。
在某些实施方式中，该标志物是选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6、PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2、LPC 20:3、PC-LI-183-D18:22-22:6、CACNA2D1、EPHX1、BAX、PRKAR2A和MPA2K3的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或十一种标志物。
在某些实施方式中，该标志物是选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、PE D18:0-22:5/D18:1-22:4、PE D16:1-22:6、PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2、LPC 20:3、PC-LI-183-D18:22-22:6的一、二、三、四、五、六或七种标志物。
本发明进一步提供了可用作药物诱导心脏毒性的预测标志物的生物标志物(例如，基因和/或蛋白质)。这些生物标志物包括在整个申请中所提供的标志物。在某些实施方式中，该标志物是选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCDC47、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HMOX1、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAI1、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA的一、二、三、四、五、六、七、八、九、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90种标志物。
在某些实施方式中，该标志物是选自于TIMP1、PTX3、HSP76、FINC、CYB5、PAI1、IBP7(IGFBP7)、1C17、EDIL3、HMOX1、NUCB1、CS010和HSPA4的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或十三种标志物。
在某些实施方式中，该标志物是选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、PE D18:0-22:5/D18:1-22:4、PE D16:1-22:6、PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2、LPC 20:3、PC-LI-183-D18:22-22:6、CACNA2D1、EPHX1、BAX、PRKAR2A和MPA2K3的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或十一种标志物。
在某些实施方式中，该标志物是选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3、PE D18:0-22:5/D18:1-22:4、PE D16:1-22:6、PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2、LPC 20:3、PC-LI-183-D18:22-22:6的一、二、三、四、五、六或七种标志物。
在某些实施方式中，标志物包括至少一种脂质标志物。
在某些实施方式中，标志物包括至少一种激酶的标志物。
但是，普通技术人员通过使用本文描述的方法，例如，通过实施本文描述的方法但使用已知诱导心脏毒性的不同药物，能够识别另外的预测药物诱导心脏毒性的生物标志物。下面进一步描述本发明的示例性心肌病和药物诱导心脏毒性的生物标志物。
本发明的目标包括，但不限于，本文所提供的基因、蛋白质、酶或脂质。基于由申请人在此描述的实验的结果，在心血管疾病中调节的关键标志物与不同的途径或分子组相关或者可以被划分为不同的途径或分子组，包括细胞骨架成分、转录因子、细胞凋亡反应、戊糖磷酸途径、生物合成途径、氧化应激(助氧化剂)、膜改变和氧化磷酸化代谢。
因此，在本发明的一个实施方式中，标志物可以包括选自于本文所提供的标志物中的一种或多种基因(或蛋白质)。在一些实施方式中，该标志物是本文所提供的标志物中至少二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、二十五、三十、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160或更多种标志物的组合。
下面描述可用于识别所鉴定的标志物的调节剂的筛选分析。
本发明还提供了用于识别通过调节本发明的标志物的表达和/或活性用于治疗或预防心肌变或毒性状态的调节剂，即候选或受试化合物或药剂(例如，蛋白质、肽、肽模拟物、类肽、小分子或其他药物)，的方法(在此也称为“筛选分析法”)。这类分析法一般包括本发明的标志物和一种或多种分析组分之间的反应。其它组分可以是受试验化合物本身，或受试化合物与本发明标志物的天然结合伴体的组合。通过如本文所述的那些分析法鉴定的化合物可被用于，例如，调节(例如，抑制、改善、治疗或预防)疾病状态或毒性状态的侵袭性。
在某些实施方式中，本发明提供了用于识别引起心脏毒性或具有引起心脏毒性的风险的药剂的方法，其是通过将第一细胞与受试药剂相接触，并检测与受试药剂相接触的第一细胞中选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的一种或多种CVD相关的生物标志物或本文所提供的任何其它标志物的水平。在某些实施方式中，检测一种或多种生物标志物的水平包括形成所述的一种或多种生物标志物的每一种与相应的生物标志物特异性探针之间的复合物，并检测各生物标志物和相应的生物标志物特异性探针之间复合物的形成；和/或从细胞分离所述一种或多种生物标志物，以使得一种或多种生物标志物的每一种特有的至少一个特征能够被检测；和将第一细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平与第二细胞中相应的一种或多种CVD相关生物标志物的水平相比较，其中该第二细胞是尚未接触受试药剂的对照细胞；其中与第二细胞相比，在所述第一细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平的调节指示所述受试药剂是引起心脏毒性或具有引起心脏毒性的风险的药剂。
在其他实施方式中，本发明提供了用于识别预防、减少或治疗药物诱导心脏毒性的救援剂的方法，其是通过将第一细胞与心脏毒性剂接触；将第二细胞与心脏毒性剂和候选救援剂接触；和检测与心脏毒性剂接触的第一细胞中选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的一种或多种CVD相关生物标志物或本文所提供的任何其他标志物的水平，并进一步检测接触心脏毒性剂和候选救援剂的第二细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平。在某些实施方式中，检测一种或多种生物标志物的水平包括形成所述一种或多种生物标志物的每一种与相应的生物标志物特异性探针之间的复合物，并检测在各种生物标志物和相应的生物标志物特异性探针之间复合物的形成；和/或从细胞分离所述一种或多种生物标志物，以使得一种或多种生物标志物的每一种特有的至少一个特征能够被检测；和将第二细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平与第一细胞中相应的一种或多种CVD相关生物标志物的水平相比较，其中与第一细胞相比，在所述第二细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平的调节指示该候选救援剂是用于预防、减少或治疗药物诱导心脏毒性的救援剂。
可以由任何可用的来源获得在本发明的筛选分析法中使用的受试化合物，包括天然和/或合成化合物的系统文库。受试化合物也可以通过本领域已知的组合文库方法中的许多途径中的任一种获得，包括：生物学文库；类肽文库(具有肽的功能性但具有新型的非肽主链(其具有酶降解抗性而仍然保持生物活性)的分子的文库；见，例如，Zuckermann等，1994，J.Med.Chem.37:2678-85)；可空间寻址平行固相或溶液相文库；需要去卷积的合成文库方法；“一珠一化合物”文库方法；和使用亲和层析选择的合成文库法。生物学文库和类肽文库途径限于肽文库，而其它四种途径适用于肽、非肽低聚物或化合物的小分子文库(Lam,1997,Anticancer Drug Des.12:145)。
用于分子文库合成的方法的实例可以在本领域中找到，例如在：DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422；Zuckermann等(1994).J.Med.Chem.37:2678；Cho等(1993)Science 261:1303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；和Gallop等(1994)J.Med.Chem.37:1233中。
化合物文库可存在于溶液中(例如，Houghten，1992，Biotechniques 13:412-421)，或在珠(Lam,1991,Nature 354:82-84)、芯片(Fodor,1993,Nature 364:555-556)、细菌和/或孢子(Ladner,USP 5,223,409)、质粒(Cull等1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)或噬菌体(Scott和Smith，1990,Science 249:386-390；Devlin,1990,Science249:404-406；Cwirla等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378-6382；Felici,1991,J.Mol.Biol.222:301-310；Ladner，同上)上。
本发明的筛选方法包括将毒性状态细胞与受试化合物接触并测定受试化合物调节细胞中本发明的标志物的表达和/或活性的能力。可以如本文所述的测定本发明的标志物的表达和/或活性。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于筛选作为本发明的标志物或其生物活性部分的底物的候选或受试化合物的分析法。而在另一个实施方式中，本发明提供了用于筛选结合本发明的标志物或其生物学活性部分的候选或受试化合物的分析法。例如，通过将化合物与放射性同位素或酶标记缀合以使得可以通过检测复合物中标记的标志物化合物来测定所述化合物与标志物的结合，可以实现受试化合物直接结合标志物的能力的测定。例如，可以直接或间接地用131I、125I、35S、14C或3H标记化合物(如，标志物底物)，和通过直接计数放射性辐射或通过闪烁计数检测放射性同位素。可选地，可以用例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶酶学标记分析成分，和通过测定合适的底物向产物的转化检测酶学标记。
本发明进一步涉及通过上述筛选分析识别的新型药剂。因此，在合适的动物模型中进一步使用如本文所述识别的药剂在本发明的范围之内。例如，可以在动物模型中使用如本文所述识别的能够调节本发明标志物的表达和/或活性的药剂以测定用这样的药剂治疗的功效、毒性或副作用。可选代地，可以在动物模型中使用如本文所述识别的药剂以测定这种药剂的作用机制。此外，本发明涉及使用通过上述筛选分析识别的新药剂用于如本文所述的治疗。
诊断分析和标志物检测分析
对于蛋白质和核酸标志物的标志物检测分析通常基于包括在标志物和探针之间形成特定的复合物并检测包含该标志物和探针的复合物的分析法。在某些实施方式中，通过从复合物移除未结合的标志物或未结合的探针的至少一种而检测该复合物。在某些实施方式中，复合物的形成导致产生可检测的信号。
在某些实施方式中，蛋白质标志物被抗体或受体结合以形成复合物。可选地，核酸被互补核酸结合以形成复合物。
在某些实施方式中，所述复合物一旦形成基本上在剩余的分析期间保持完整。例如，标志物-抗体复合物在基于抗体的分析，例如ELISA、western印迹、免疫沉淀、免疫组织化学、蛋白质芯片、荧光激活细胞分选术中形成。基于抗体的蛋白质分离方法，例如那些在Harlow和Lane(Harlow和Lane，1988,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)中所描述的，可用于标志物的检测。标志物核酸和核酸探针之间的复合物一旦形成，可以在整个分析中保持，例如基因芯片、荧光原位杂交(FISH)、Southern或Northern印迹，或者在整个分析中瞬时地和可能反复地形成，例如，PCR和其他核酸扩增方法。
用于检测生物样品中标志物蛋白质或核酸的存在或不存在的示例性方法包括从测试受试者获得生物样品(例如，体液或组织样品)和将生物样品与能够检测多肽或核酸(例如，mRNA、基因组DNA或cDNA)的化合物或药剂接触。因此本发明的检测方法可用于检测mRNA、蛋白质、cDNA或基因组DNA，例如，在体外以及在体内生物样品中。例如，用于检测mRNA的体外技术包括PCR、微阵列或基因芯片、Northern杂交和原位杂交。用于检测标志物蛋白质的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、western印迹、斑点或狭缝印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。此外，用于检测标志物蛋白质的体内技术包括向受试者引入针对蛋白质或其片段的标记抗体。例如，可以用放射性标志物标记抗体，其在受试者中的存在和位置可通过标准成像技术来检测。
这样的诊断和预后分析法的一般原理包括在适当的条件下在足以使标志物和探针相互作用并结合的时间内制备可以包含标志物和探针的样品或反应混合物，从而形成可以在反应混合物中被移除和/或检测的复合物。在该方法中使用的特异性探针取决于许多因素。例如，如northern、Southern、斑点或狭缝印迹和原位杂交的方法通常依赖于使用单一探针以检测每种标志物。应当理解，表达水平不通过Southern印迹检测。因此，为了提供与目的标志物序列特异性杂交的探针，通常在高严格的条件下，至少约20个核苷酸长度，优选至少约30个核苷酸长度，优选至少50个核苷酸长度的探针。当基因是短的，探针的长度可以通过该基因的长度限制。通常探针是约500个核苷酸或更少，通常约400个核苷酸或更少，通常约300个核苷酸或更少，和通常约200个核苷酸或更少。核酸探针可以是所提供的值所包含的任何长度范围。在其中所述标志物核酸结合单一探针序列的方法中，所述探针序列通常包括可检测的标记或连接于可检测的标记，例如，绿。
在涉及扩增步骤的方法中，如引物延伸或PCR(包括定量或实时PCR和原位PCR)，使用相对较短的探针(例如，通常长度约15个核苷酸至约50个核苷酸)检测标志物。在PCR方法中，至少两个探针，通常被称为“引物”，被成对使用以扩增目的靶序列。在定量PCR的某些形式中，第三引物被用于检测，但不扩增靶序列。在某些实施方式中，一个或多个引物包括可检测的标记。在某些实施方式中，扩增产物能够结合可检测的标记。
应当理解，可以在探针中使用包括非天然的碱基、糖和骨架部分的核酸来调节探针对其靶序列的亲和力和/或特异性。
用于检测蛋白质标志物的探针一般包括抗体，典型地对于蛋白质特异性的单克隆抗体或重组抗体。抗体宽泛地包括抗体的天然存在形式(例如，IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体如单链抗体、嵌合和人源化抗体及多特异性抗体，以及所有上述形式的片段和衍生物，该片段和衍生物具有至少一个抗原结合位点。抗体衍生物可包含与抗体缀合的蛋白质或化学部分。ELISA法通常依赖于使用在标志物上的不同位点与目的标志物结合的两种抗体。Western印迹、斑点和狭缝印迹、免疫组织化学方法且有时ELISA和免疫沉淀法依赖于使用结合于与所述探针结合的抗体(即，第二抗体)的抗体。在某些实施方式中，第二抗体被可检测地标记。
可以通过多种方式进行用于检测标志物的分析。下面提供示例性的方法。
例如，进行这种分析的一种方法涉及将标志物或探针锚定在固相支持物(也被称为基板)上，和在反应结束时检测锚定在固相上的目标标志物/探针复合物。在这样的方法的一个实施方式中，待分析标志物的存在和/或浓度的来自受试者的样品可以被锚定到载体或固相支持物上。在另一个实施方式中，相反的情况是可能的，其中探针可以被锚定到固相上和来自受试者的样品可以允许作为该分析的非锚定组分进行反应。其中至少两个不同的探针(例如，用于检测至少两种标志物，或用于检测至少一种标志物和适当的对照)连接的固体支持物被称为一组(panel)。
有许多用于将分析组分锚定到固相的已建立的方法。这些包括但不限于，通过生物素和链霉亲和素的偶联固定的标志物或探针分子。可以使用本领域中已知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals,Rockford,IL)由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备这样的生物素化分析组分，并在链霉亲和素涂布的96孔板(Pierce Chemical)的孔中固定。在某些实施方式中，可以预先制备具有固定的分析组分的表面并存储。
用于此类分析的其它合适的载体或固相支持物包括能够结合标志物或探针所属的分子种类的任何材料。公知的支持物或载体包括但不限于玻璃、聚苯乙烯、硝基纤维素、尼龙、聚丙烯、尼龙、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然的和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩以及磁铁矿。为在组中使用，优选的固相支持物可以容易地手动操纵，例如，载玻片、多层板(multiwall plate)、膜等。
为了用上述方法进行分析，将非固定的组分加入到其上锚定第二成分的固相上。反应完成后，可以在使得任何形成的复合物将保持固定在固相上的条件下移除(例如，通过洗涤)未复合的组分。本文中概述的许多方法可以完成锚定至固相的标志物/探针复合物的检测。
在一个优选的实施方式中，探针(当它是未锚定的分析组分时)可以用可检测标记(例如，酶学标记、荧光标记、发光标记)进行标记以为了无论是直接或间接的检测和分析读数的目的。
也可能直接检测标志物/探针复合物的形成而无需任一组分(标志物或探针)的进一步处理或者标记，例如通过利用荧光能量转移的技术(参见，例如，Lakowicz等，5,631,169号美国专利；Stavrianopoulos等，4,868,103号美国专利)。选择第一“供体”分子上的荧光团标记以使得当用适当波长的入射光激发时，其发射的荧光能量被第二“受体”分子上的荧光标记吸收，其随之由于吸收的能量而能够发荧光。或者，“供体”蛋白质分子可以简单地利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长的光的标记以使得“受体”分子标记可以与“供体”的标记区分开。由于标记之间能量传递的效率与分子间隔的距离有关，可以评估分子之间的空间关系。在分子之间发生结合的情况下，分析中“受体”分子标记的荧光发射应是最大的。通过本领域中公知的标准荧光检测方法(例如，使用荧光计)可以方便地测量FET结合事件。
在另一个实施方式中，通过利用如实时生物分子相互作用分析(BIA)(见，例如，Sjolander,S.和Urbaniczky,C.,1991,Anal.Chem.63:2338-2345，和Szabo等,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705)的技术，可以完成探针识别标志物的能力的测定而不标记任一分子组分(探针或标志物)。如本文所使用的，“BIA”或“表面等离子体共振”是用于实时研究生物特异性相互作用而不标记任何相互作用物的技术(例如，BIAcore)。结合表面处质量变化(指示结合事件)导致表面附近光折射率的改变(表面等离子共振(SPR)的光学现象)，从而产生可检测的信号，其可以用作生物分子之间实时反应的指示。
或者，在另一个实施方式中，可以用标志物和探针作为在液相中的溶质进行类似的诊断和预后分析。在这样的分析中，通过多种标准技术中的任何一种，包括但不限于：差速离心、色谱、电泳和免疫沉淀，从未复合的组分分离复合的标志物和探针。在差速离心中，可以由于基于它们不同的尺寸和密度而导致的不同沉降平衡通过一系列离心步骤从未复合的分析组分分离标志物/探针复合物(参见，例如，Rivas,G.和Minton,A.P.,1993,TrendsBiochem Sci.18(8):284-7)。标准层析技术也可用于将复合的分子与非复合物分子分离。例如，凝胶过滤色谱法基于大小和通过利用柱形式的适当凝胶过滤树脂分离分子，例如，相对较大的复合物可以与相对较小的未复合组分分离。类似地，可以利用标志物/探针复合物与未复合的组分相比的相对不同的电荷性质来区分复合物与未复合的组分，例如通过使用离子交换层析树脂。这种树脂和色谱技术是本领域技术人员公知的(参见，例如，Heegaard,N.H.,1998,J.Mol.Recognit.Winter 11(1-6):141-8；Hage,D.S.和Tweed,S.A.JChromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10；699(1-2):499-525)。也可使用凝胶电泳分离复合的分析组分与未结合的组分(见，例如，Ausubel等ed.,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1987-1999)。在该技术中，例如根据大小或电荷分离蛋白质或核酸复合物。为了在电泳过程中保持结合相互作用，非变性凝胶基质材料和不存在还原剂的条件通常是优选的。因此对于特定的分析和其组分适当的条件是本领域技术人员所公知的。
在具体的实施方式中，使用本领域中已知的方法，可以通过原位和通过体外形式测定生物样品中的标志物mRNA的水平。术语“生物样品”旨在包括自受试者分离的组织、细胞、生物流体和其分隔物，以及受试者中存在的组织、细胞和体液。许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法，可以使用不针对mRNA的分离选择的任何RNA分离技术以用于从细胞纯化RNA(见，例如，Ausubel等,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,New York 1987-1999)。此外，可以使用本领域的技术人员熟知的技术容易地处理大量的组织样品，如，例如，Chomczynski的单步RNA分离方法(1989，4,843,155号美国专利)。
可以在包括，但不限于，Southern或Northern分析、聚合酶链反应分析和探针阵列的杂交或扩增分析中使用分离的mRNA。用于检测mRNA水平的一种优选的诊断方法包括将分离的mRNA与可以与被检测到的基因编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)相接触。核酸探针可以是，例如，全长cDNA或其部分，如长度至少7、15、20、25、30、50、100、250或500个核苷酸或者这些值所包括的任何长度范围且在严格条件下足够与编码本发明标志物的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。在本文中描述了在本发明的诊断分析中使用的其他合适的探针。mRNA与探针的杂交表明所述的标志物正被表达。
在一种形式中，mRNA被固定在固体表面上并接触探针，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA和将mRNA从凝胶转移至膜，如硝化纤维。在可选的形式中，探针被固定在固体表面上，且mRNA与探针接触，例如，在基因芯片阵列或其它的核酸探针阵列中。熟练的技术人员可容易地适应于已知的mRNA检测方法而用于检测由本发明的标志物所编码的mRNA的水平。可制备含至少两个探针的组，其中至少一个探针特异性结合一种核酸标志物。在某些实施方式中，组包括至少两个不同的探针以用于结合至少两种不同的核酸标志物。
用于测定样品中的mRNA标志物的水平的可选方法涉及核酸扩增的过程，例如，通过RT-PCR(Mullis，1987，4,683,202号美国专利中公开的实验性实施方式)、连接酶链式反应(Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189-193)、自持续序列复制(Guatelli等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等,1988,Bio/Technology6:1197)、滚环复制(Lizardi等5,854,033号美国专利)或任何其它核酸扩增方法，随后使用本领域的技术人员公知的技术检测扩增的分子。如果这样的分子以非常低的量存在，则这些检测方案对于核酸分子的检测是特别有用的。如本文所使用的，扩增引物被定义为是一对核酸分子，其可以与基因的5'或3'区域(分别正和负链，或反之亦然)退火，并包含之间的短区域。通常，扩增引物长度是从约10至30或约15至50个核苷酸，并侧邻约50至200个核苷酸长度的区域。在适当条件下和用适当的试剂，这类引物允许扩增包含引物侧邻的核苷酸序列的核酸分子。
对于原位方法，检测之前不需要分离mRNA。在这样的方法中，使用已知的组织学方法制备/处理细胞或组织样品。然后将样品固定在支持物上，典型地玻璃载玻片，且然后与能够与编码标志物的mRNA杂交的探针接触。在某些实施方式中，例如，用荧光标记直接标记探针用于检测。在某些实施方式中，探针包括至少一个用于酶学标记(例如，辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶)或荧光标记的结合用于检测结合的探针的结合位点，例如，生物素结合位点。
可以通过分离检测脂质，典型地首先通过从样品的大量非脂质部分提取脂质(通常通过使用有机溶剂，例如，氯仿/甲醇)，随后分离脂质组分，例如通过色谱法，例如，薄层色谱法、固相萃取(SPE)色谱法、高效液相色谱法(HPLC或LC)、正相(NP)HPLC或反相(RP)HPLC、亲水性相互作用液体色谱(HILIC)和超高效液相色谱法(UPLC)。检测是基于色谱和/或光谱性质，如通过质谱(MS)(包括电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI))、核磁共振(NMR)光谱法、荧光光谱和双偏振干涉的一种或多种而测定的，典型地与已知的标记对照脂质相比较。本文所提供的用于分离和检测标志物脂质的方法可用于与本文所提供的方法相关的脂质的检测。
MALDI方法还允许原位的直接脂质检测。当在已经涂布了MALDI基质的整个组织表面获得连续光谱，从薄的组织切片的直接分析产生丰富的脂质相关的离子。分子离子的碰撞激活可以被用来测定脂质家族和通常从结构上定义分子种类。这种技术使得能够检测组织如心脏、肾和脑中的磷脂、鞘脂和甘油脂类。此外许多不同的脂质分子种类的分布常常定义这些组织内的解剖区域。
作为基于标志物的绝对表达水平进行测定的替代方式，测定可基于标志物的标准化表达水平。通过校正标志物的绝对表达水平来标准化表达水平，这是通过其表达与非标志物的基因(例如组成型表达的管家基因)的表达相比较。用于标准化的合适基因包括管家基因如肌动蛋白基因或上皮细胞特异性基因。该标准化允许在一个样品(例如，患者样品)中的表达水平与另一样品(例如，非疾病或非毒性样品，或在不同来源的样品之间)对比。
可选地，表达水平可以被提供为相对表达水平。为测定标志物的相对表达水平，在测定研究中的样品表达水平之前，例如，对于正常与疾病或治疗的细胞物的10或更多个样品，优选50个或更多个样品测定标志物的表达水平。测定在较大量的样品中分析的各基因的平均表达水平，并且这被用作标志物的基线表达水平。然后对于受试样品测定的标志物表达水平(绝对表达水平)除以对于该标志物所获得的平均表达值。这提供了相对表达水平。
优选地，在基线测定中使用的样品来自未经毒性剂(特别是心脏毒性剂)处理的细胞，或从未患有心血管疾病和没有用已知心脏毒性的药剂治疗的受试者获得。细胞源的选择取决于相对表达水平的使用。使用在正常组织中发现的表达作为平均表达评分来帮助验证分析的标志物是否为毒性特异性的(相对于正常细胞)。此外，随着更多的数据被累积，平均表达值可以被修正，从而提供基于累积的数据改进的相对表达值。来自疾病细胞或毒性细胞的表达数据提供了用于分级疾病或毒性状态的严重程度的手段。
在某些实施方式中，本发明提供了诊断和预后心血管疾病的方法，包括以下步骤。
例如，本发明提供了用于在受试者中诊断或预后心血管疾病(CVD)，例如，心肌病的方法，其是通过从受试者获得样品和检测样品中一种或多种CVD-相关生物标志物的水平，包括选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的一种或多种CVD相关生物标志物或本文所提供的任何其它生物标志物。在某些实施方式中，检测所述一种或多种CVD相关生物标志物的水平包括在所述一种或多种生物标志物每一种和相应的生物标志物特异性探针之间形成复合物，和检测每个生物标志物和相应的生物标志物特异性探针之间复合物的形成；和/或从细胞分离所述一种或多种生物标志物以使得一种或多种生物标志物的每一种特有的至少一个特征能够被检测；和比较样品中所述一种或多种CVD相关生物标志物的水平与对照样品中相应的一种或多种CVD相关生物标志物的水平，其中所述对照样品来自未患心肌病的受试者，其中与对照样品相比，样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平的调节指示该受试者患有或易于发生心血管疾病(CVD)，例如心肌病。
此外，本发明提供了用于在受试者中监测心血管疾病(CVD)，例如，心肌病的方法，其是通过检测在第一时间从受试者获得的第一样品中选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的一种或多种CVD相关生物标志物或任何本文所提供的其它生物标志物的水平。在某些实施方式中，检测一种或多种CVD相关生物标志物的水平包括形成所述一种或多种生物标志物每一种和相应的生物标志物特异性探针之间的复合物，和检测每一种生物标志物和相应的生物标志物特异性探针之间复合物的形成；和/或从细胞分离所述一种或多种生物标志物以使得一种或多种生物标志物的每一种特有的至少一个特征能够被检测；和比较第一样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平与在较晚的时间从受试者获得的第二样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平；其中，与所述第一样品相比，第二样品中标志物的水平的调节指示受试者中心血管疾病，例如，心肌病状态的变化。
本发明进一步提供了识别用于治疗心血管疾病(CVD)，例如心肌病，的化合物的方法，其是通过获得受试细胞；将受试细胞与受试化合物相接触；检测与受试化合物接触的受试细胞中选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的一种或多种心血管疾病相关生物标志物或任何本文所提供的其它生物标志物的水平。在某些实施方式中，检测一种或多种CVD相关生物标志物的水平包括形成所述一种或多种生物标志物的每一种和相应的生物标志物特异性探针之间的复合物，和检测每一种生物标志物和相应的生物标志物特异性探针之间复合物的形成；和/或从细胞中分离所述一种或多种生物标志物以使得一种或多种生物标志物的每一种特有的至少一个特征能够被检测；和比较受试细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平与未接触受试化合物的对照细胞中一种或多种CVD相关生物标志物的水平；并选择在受试细胞中调节一种或多种CVD相关生物标志物的水平的受试化合物，从而识别用于在受试者中治疗心血管疾病(CVD)，例如心肌病的化合物。
试剂盒
本发明还提供了用于识别具有心血管疾病(包括心力衰竭和/或心肌病)的风险或患心血管疾病的受试者；或监测具有心血管疾病(包括心力衰竭和/或心肌病)的风险或患有心血管疾病的受试者的组合物和试剂盒。本发明还提供了用于识别具有导致药物诱导心脏毒性的风险的药剂或者可以减轻药物诱导心脏毒性的药剂的组合物和试剂盒。这些试剂盒可包括一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)对于一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)本发明的标志物的检测特异性的试剂，和使用说明书。
对于基于抗体的试剂盒，该试剂盒可以包含，例如：(1)结合标志物蛋白质的第一抗体(例如，连接于固相载体)；和任选地，(2)不同的第二抗体，其结合于所述蛋白质或第一抗体且与可检测标记偶联。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，该试剂盒可以包含，例如：(1)与编码标志物蛋白质的核酸序列杂交的寡核苷酸，例如，可检测地标记的寡核苷酸，或(2)可用于扩增标志物核酸分子的一对引物。该试剂盒还可以包含，例如，缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。该试剂盒可以进一步包含对于检测可检测标记必需的组分(例如，酶或底物)。该试剂盒还可以含有可被分析并与受试样品相比较的对照样品或一系列对照样品。试剂盒的各组分可以被封闭在单独的容器内，和各种不同的容器全部可以连同用于解释使用该试剂盒进行的分析的结果的说明在单一包装内。
本发明的试剂盒可任选地包含用于执行本发明的方法的其他组分。以举例的方式，该试剂盒可以包含适合于退火互补核酸或适合于将抗体和与其特异性结合的蛋白质相结合的流体(例如，洗涤缓冲液、封闭剂)、一个或多个样品隔室、描述本发明方法的性能的指导材料和组织特异性对照/标准品。
试剂盒可以包括用于特异性检测本发明的一种或多种脂质标志物的组分(例如，对照样品，对于本发明的脂质特异性的提取缓冲液)。
试剂盒可以包括用于检测本发明的激酶标志物的组分(例如，激酶特异性抗体)。
本发明还包括用于检测生物样品中标志物蛋白质、核酸或脂质的存在的试剂盒。这类试剂盒可以用来测定受试者是否具有心血管疾病(包括心力衰竭和/或心肌病)的风险或患有心血管疾病；或用于监测具有心血管疾病(包括心力衰竭和/或心肌病)的风险或患有心血管疾病的受试者。这类试剂盒也可用于识别很可能导致更高药物诱导心脏毒性的药剂，或识别可以减轻药物诱导心脏毒性的药剂。例如，该试剂盒可以包含能够检测生物样品中的标志物蛋白质或核酸的标记的化合物或药剂，以及用于测定样品中的蛋白质或mRNA的量的手段(例如，结合蛋白质或其片段的抗体，或结合编码蛋白质的DNA或mRNA的寡核苷酸探针)。试剂盒还可以包括用于特异性检测本发明的一种或多种脂质标志物的试剂。试剂盒还可以包括使用该试剂盒用于实施任何本文所提供的方法或解释基于本文所提供的教导使用试剂盒所获得的结果的说明书。该试剂盒还可以包括用于检测样品中与心血管疾病不相关的对照蛋白质(例如，对于组织样品的肌动蛋白、对于样品中存在的标志物量标准化的血液或血液衍生的样品中的白蛋白)。该试剂盒还可以包括用于检测的纯化标志物，其用作对照或用于该试剂盒进行的分析法的定量。
试剂盒包括用于在受试者中诊断心血管疾病的方法中使用的试剂组，所述试剂组包含至少两种检测试剂，其中每种检测试剂对于本文所提供的标志物之一特异性的。
对于基于抗体的试剂盒，该试剂盒可以包含，例如：(1)第一抗体(例如，连接于固相载体)，其结合第一标志物蛋白；和任选地，(2)不同的第二抗体，其结合所述第一标志物蛋白或所述第一抗体且与可检测标记偶联。在某些实施方式中，试剂盒包括(1)第二抗体(例如，连接于固相载体)，其结合第二标志物蛋白；和任选地，(2)不同的第二抗体，其结合第二标志物蛋白或第二抗体且与可检测标记偶联。在一个实施方式中，第一和第二标志物是本发明的任何两种标志物。在一个实施方式中，第一和第二标志物是CCDC47和HMOX1。在某些实施方式中，该试剂盒包含第三抗体，其结合与第一和第二标志物蛋白不同的第三标志物蛋白，以及结合第三标志物蛋白或与所述第三标志物蛋白质结合的抗体的不同的第二抗体，其中第三标志物蛋白与第一和第二标志物蛋质不同。在某些实施方式中，第三标志物是PAI1或PTX3。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，该试剂盒可以包含，例如：(1)与编码标志物蛋白的核酸序列杂交的寡核苷酸，例如，可检测地标记的寡核苷酸，或(2)可用于扩增标志物核酸分子的一对引物。在某些实施方式中，该试剂盒可以进一步包括，例如：(1)与编码第二标志物蛋白的核酸序列杂交的寡核苷酸，例如，第二可检测地标记的寡核苷酸，或(2)可用于扩增所述第二标志物核酸分子的一对引物。第一和第二标志物是不同的。在一个实施方式中，第一和第二标志物是本发明的任何两种标志物。在一个实施方式中，第一和第二标志物是CCDC47和HMOX1。在某些实施方式中，试剂盒还可以包括，例如：(1)与编码第三标志物蛋白的核酸序列杂交的寡核苷酸，例如，可检测地标记的第三寡核苷酸，或(2)可用于扩增第三标志物核酸分子的一对引物，其中所述第三标志物与第一和第二标志物不同。在某些实施方式中，试剂盒包括针对各核酸标志物特异性的第三引物以允许用定量PCR方法检测。
对于色谱法，试剂盒可以包括标志物(中包括标记的标志物)以允许通过色谱法检测和识别本发明的一种或多种标志物。在某些实施方式中，用于色谱方法的试剂盒包括用于发明的一种或多种标志物衍生化的化合物。在某些实施方式中，用于色谱方法的试剂盒包括用于解析该方法的标志物的柱。
对于检测本发明的标志物特异性的试剂允许检测和定量复杂混合物(例如，血液、血清或组织样品)中的标志物。在某些实施方式中，所述试剂是物种特异性的。在某些实施方式中，所述试剂不是物种特异性的。在某些实施方式中，所述试剂是异形体特异性。在某些实施方式中，所述试剂不是异形体特异性。在某些实施方式中，所述试剂检测总细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、IGFBP7、PAI-1或CFL2。
在某些实施方式中，所述试剂盒还可以包含，例如，缓冲剂、防腐剂、蛋白稳定剂、反应缓冲液。该试剂盒可以进一步包含检测可检测标记所必需的组分(例如，酶或底物)。该试剂盒还可以含有对照样品或一系列对照样品，其可被分析并与受试样品相比较。该对照可以是对照血清样品或者纯化的蛋白质、核酸或脂质的对照样品，适当时，具有已知水平的目标标志物。试剂盒的各组分可以被封闭在单独的容器内，且各种不同的容器全部可以连同用于解释使用该试剂盒进行的分析的结果的说明在单一包装内。
本发明的试剂盒可任选地包含用于执行本发明的方法的其他组分。
组(Panel)
本发明提供用于检测受试者样品中一种或多种心血管疾病、心肌病或心脏毒性标志物的试剂的组和至少一种对照试剂。在某些实施方式中，对照试剂是为了检测用于在生物样品中进行检测的标志物，其中所述组具有其中含有用作阳性对照的和任选地定量生物样品中存在的标志物量的标志物的对照样品。在某些实施方式中，该组包括用于已知存在或不存在于生物样品中的与心血管疾病不相关的标志物的检测试剂以分别提供阳性或阴性对照。该组可具有用于检测样品中与心血管疾病不相关的对照蛋白质(例如，用于组织样品的肌动蛋白，血液或血液衍生样品中用于标准化样品中存在的标志物量的白蛋白)的试剂。该组可以具有用于检测的纯化标志物以用作对照或用于用该组进行的分析的定量。
在一个优选的实施方式中，该组包括用于检测本发明的两种或更多种标志物(例如，2、3、4、5、6、7、8、9种)的试剂，优选与对照试剂结合。在该组中，每种标志物是由对于该标志物特异性的试剂进行检测的。在某些实施方式中，该组包括重复的孔、点或部分以允许分析生物样品和对照样品的各种稀释物(例如，系列稀释)。在一个优选的实施方式中，该组允许定量检测本发明的一种或多种标志物。
在某些实施方式中，该组是用于检测一种或多种标志物的蛋白质芯片。在某些实施方式中，该组是用于检测一种或多种标志物的ELISA板。在某些实施方式中，该组是用于检测一种或多种标志物的定量PCR的板。
在某些实施方式中，该检测试剂组被提供在包括用于本发明的一种或多种标志物的检测试剂和至少一个对照样品的单一装置上。在某些实施方式中，该检测药剂组被提供在包括用于本发明的两种或更多种标志物的检测药剂和至少一个对照样品的单一装置上。在某些实施方式中，用于检测本发明的不同标志物的多个组具有至少一个均匀的对照样品以促进组间结果的比较。
阵列
本发明还包括包含本发明的标志物的阵列。该阵列可用于分析阵列中一种或多种标志物的水平。在一个实施方式中，该阵列可用于分析组织中的基因表达以确定阵列中基因的组织特异性。以这种方式，可以同时分析最多达约7600个基因的表达。这允许开发显示在一种或多种组织中特异性表达的一组基因的谱。
除了这种定性测定，本发明允许基因表达的定量。因此，不仅可确定组织中基因的组织特异性，而且一组基因的表达水平可被确定。因此，可以基于其组织表达本身和该组织中的表达水平将基因分组。这可用于，例如，确定组织之间或之中基因表达的关系。因此，可以扰动一种组织和可测定第二组织中基因表达的影响。在这种情况下，可以测定一种细胞类型响应于生物刺激对另一种细胞类型的影响。这样的测定对于，例如，在基因表达水平了解细胞间相互作用的影响是有用的。如果治疗性地施用治疗一种细胞类型但对另一种细胞类型有不良的影响的药剂，本发明提供了确定不良影响的分子基础并因此提供共施用中和剂或以其他方式处理不良影响的机会的分析法。类似地，即使在单一细胞类型中，可以在分子水平测定不良生物影响。因此，药剂对目标基因以外的表达的影响可被确定并抵消。
在另一个实施方式中，阵列可用于监测阵列中一种或多种基因表达的时间过程。这可发生在各种生物学背景下，如本文所公开的，例如药物诱导毒性的发生、药物诱导毒性的发展和过程，如与药物诱导的性相关的这样的细胞转化。
该阵列也可用于确定一个基因的表达对于相同细胞或不同细胞中的其他基因的表达的影响。这提供了，例如，对于用于治疗性干预的可选分子靶标的选择，如果最终或下游靶标不能被调节。
该阵列也可用于确定正常和异常细胞中一种或多种基因的差异表达模式。这提供了可以用作诊断或治疗性干预的分子靶的一组基因。
用于获取和制备样品的方法
在本发明的方法中有用的样品包括表达本发明的标志物的任何组织、细胞、组织活检或体液样品。在一个实施方式中，样品可以是组织、细胞、全血、血清、血浆、口腔刮屑、唾液、脑脊髓液、尿液、粪便或支气管肺泡灌洗液。在优选的实施方式中，组织样品是毒性状态样品。在更优选的实施方式中，组织样品是心血管样品或药物诱导毒性样品。
可以通过本领域已知的多种技术从受试者获得身体样品，包括例如，通过使用活检或通过刮取或擦拭某区域或通过使用针抽吸体液。用于收集各种身体样品的方法是本领域公知的。
适合于检测和定量本发明的标志物的组织样品可以是新鲜的、冷冻的或根据本领域技术人员公知的方法固定的。合适的组织样品优选被切片并放置在显微镜载玻片上用于进一步分析。可选地，固体样品，即组织样品，可以被溶解和/或均质化，并随后作为可溶性提取物进行分析。
在一个实施方式中，使用例如，液氮或二氯二氟甲烷冷冻新获得的活检样品。装载冷冻样品用于使用，例如OCT切片，和在低温恒温器中连续切片。将连续切片收集在玻璃显微镜载片上。对于免疫组织化学染色，载玻片可被涂覆，例如，铬明矾、明胶或聚L-赖氨酸，以确保该切片粘贴到载玻片上。在另一个实施方式中，切片前将样品固定和包埋。例如，可以将组织样品固定在，例如，福尔马林中，连续脱水并包埋在例如石蜡中。
一旦获得了样品，可以使用在本领域中已知适合于检测和定量本发明的标志物的任何方法(在核酸、蛋白质和/或脂质水平)。这些方法是本领域熟知的，且包括但不限于western印迹、Northern印迹、Southern印迹、免疫组织化学、ELISA，例如，扩增ELISA、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞术、免疫细胞化学、质谱分析，例如，MALDI-TOF和SELDI-TOF、核酸杂交技术、核酸反转录方法和核酸扩增方法。在特定的实施方式中，使用例如，特异性结合这些蛋白质的抗体在蛋白质水平检测本发明标志物的表达。
为了使得本发明的标志物易达到抗体结合，可能需要修饰样品。在免疫细胞化学或免疫组织化学方法的特定方面，载玻片可以被转移到预处理缓冲液中和任选地被加热以增加抗原可达性。在预处理缓冲液中加热样品迅速破坏细胞的脂质双层，并使抗原(可能是新鲜标本的情况，但通常不发生在固定标本中)更易达到与抗体的结合。术语“预处理缓冲器”和“制备缓冲液”在本文中可互换使用以指被用于制备用于免疫染色的细胞学或组织学样品(特别是通过提高本发明的标志物的对于抗体结合的可达性)的缓冲液。预处理缓冲液可包含pH特异性的盐溶液、聚合物、洗涤剂或者非离子或阴离子表面活性剂如，例如，乙氧基化阴离子或非离子表面活性剂、链烷酸酯或烷氧基化物或甚至这些表面活性剂的混合物或甚至使用胆汁盐。预处理缓冲液可以是，例如，0.1％至1％的脱氧胆酸、钠盐的溶液或月桂醇聚醚-13羧酸钠(例如，Sandopan LS)的溶液或乙氧基化阴离子复合物。在一些实施方式中，预处理缓冲液也可以被用作载玻片存储缓冲液。
用于使得本发明的标志物蛋白质更易于抗体结合的任何方法可以用于本发明的实施中，包括在本领域中已知的抗原修复方法。见，例如，Bibbo等(2002)Acta.Cytol.46:25-29；Saqi等(2003)Diagn.Cytopathol.27:365-370；Bibbo等(2003)Anal.Quant.Cytol.Histol.25:8-11，其各自的全部内容在此通过引用并入本文。
在预处理以增加标志物蛋白质可达后，可以使用适当的封闭剂，例如，过氧化物酶封闭剂如过氧化氢封闭样品。在一些实施方式中，可使用蛋白质封闭剂封闭样品以防止抗体的非特异性结合。该蛋白质封闭剂可以包含，例如，纯化的酪蛋白。然后特异性结合本发明的标志物的抗体，特别是单克隆抗体或多克隆抗体与样品一起孵育。本领域的技术人员将理解，在某些情况下，可以通过检测患者样品中本发明的标志物蛋白质上的多个表位而得到更精确的预后或诊断。因此，在具体的实施方式中，使用至少两种针对本发明标志物的不同表位的抗体。当使用一种以上的抗体时，这些抗体可以作为单独的抗体试剂顺序地或作为抗体的混合物同时地添加到单一样品。可选地，各单独的抗体可以被添加到来自同一患者的单独样品，并将得到的数据汇总。
用于检测抗体结合的技术是本领域中公知的。可以通过使用产生对应于抗体结合水平并因此对应于标志物蛋白质的表达水平的可检测信号的化学试剂来检测抗体与本发明标志物的结合。在本发明的免疫组织化学或免疫细胞化学方法之一中，通过使用与标记的聚合物偶联的第二抗体检测抗体结合。标记的聚合物的实例包括但不限于聚合物-酶偶联物。在这些复合物中的酶通常用于催化色原在抗原-抗体结合位点的沉积，从而导致对应于目标生物标志物表达水平的细胞染色。特别感兴趣的酶包括，但不限于，辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。
在本发明的一个特定的免疫组织化学或免疫细胞化学方法中，通过使用与二级抗体偶联的HRP标记聚合物检测抗体与本发明标志物的结合。也可以通过使用结合单克隆抗体或多克隆抗体的物种特异性探针试剂，和与所述物种特异性探针试剂结合的HRP相偶联的聚合物检测抗体与本发明标志物的结合。载玻片使用任何色原，例如，色原3,3-二氨基联苯胺(DAB)进行抗体结合的染色，然后用苏木和任选的染蓝剂例如氢氧化铵或TBS/吐温20复染。其它合适的色原包括，例如，3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)。在本发明的一些方面中，由细胞学技师和/或病理学家对载片进行显微镜检查以评估细胞染色，例如，荧光染色(即，标志物表达)。或者，可以通过自动化显微镜或通过借助有利于识别阳性染色细胞的计算机软件由人员对样品进行检查。
可通过将抗标志物抗体与可检测物质偶联来帮助抗体结合的检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括发光氨；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S、14C或3H。
在本发明的一个实施方式中，如上所述地制备冷冻样品，并随后使用以例如Tris缓冲盐水(TBS)稀释至适当浓度的针对本发明标志物的抗体染色。可以通过将载玻片在生物素化抗免疫球蛋白中孵育来检测初级抗体。这一信号可以任选地放大和利用抗原的二氨基联苯胺沉淀来可视化。此外，载玻片可以任选地使用例如苏木精复染以可视化细胞。
在另一个实施方式中，被固定和包埋的样品用针对本发明标志物的抗体染色，并如上对于冷冻切片所述地复染。此外，可以任选地用药剂处理样品来放大信号，以可视化抗体的染色。例如，可以使用生物素-酪酰胺的过氧化物酶催化的沉积，其随之与过氧化物酶偶联的链霉亲和素反应(催化的信号扩增(CSA)系统，DAKO，Carpinteria，CA)。
基于组织的分析(即，免疫组织化学)是检测和定量本发明标志物的优选的方法。在一个实施方式中，可通过免疫组织化学来测定本发明标志物的存在或不存在。在一个实施方式中，免疫组织化学分析使用低浓度的抗标志物抗体，使得缺乏该标志物的细胞不被染色。在另一个实施方式中，使用采用高浓度的抗标志物抗体以使得缺少标志物蛋白质的细胞重染色的免疫组织化学方法测定本发明的标志物的存在或不存在。未染色的细胞包含突变的标志物并且不能产生可抗原识别的标志物蛋白，或者是其中调节标志物水平的途径失调而导致可忽略的标志物蛋白质的稳态表达的细胞。
本领域的技术人员将认识到，用于实施本发明的方法的特定抗体的浓度将根据如用于结合的时间、抗体对于本发明标志物的特异性水平以及样品制备方法的这类因素而变化。此外，当多种抗体被使用时，所需浓度可能受其中抗体被施加到样品中的顺序影响，例如，作为混合物同时地或作为单独抗体试剂依次地。此外，用于可视化抗体与本发明标志物的结合的检测化学也必须被优化以产生所需的信噪比。
在本发明的一个实施方式中，蛋白质组学方法，例如，质谱法，被用于检测和定量本发明的标志物蛋白质。例如，可以使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)或表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF MS)(其涉及应用生物样品如血清至蛋白质结合芯片)(Wright,G.L.,Jr.等.(2002)Expert Rev Mol Diagn 2:549；Li,J.等(2002)Clin Chem 48:1296；Laronga,C.等(2003)Dis Markers 19:229；Petricoin,E.F.等(2002)359:572；Adam,B.L.等(2002)Cancer Res 62:3609；Tolson,J.等(2004)Lab Invest84:845；Xiao,Z.等(2001)Cancer Res 61:6029)来检测和定量PY-Shc和/或p66-Shc蛋白质。质谱方法被描述于，例如，5,622,824、5,605,798和5,547,835号美国专利中，其各自的全部内容通过引用并入本文。
在其他的实施方式中，在核酸水平对本发明标志物的表达进行检测。用于评估表达的基于核酸的技术是本领域众所周知的，和包括，例如，测定来自受试者的样品中标志物mRNA的水平。许多表达检测方法使用分离的RNA。不针对mRNA的分离选择的任何RNA分离技术可以用于从表达本发明标志物的细胞纯化RNA(见，例如，Ausubel等人编,(1987-1999)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,New York))。另外，使用本领域的技术人员所熟知的技术，例如，如Chomczynski的单步RNA分离方法(1989，4,843,155号美国专利)可以容易地处理大量的组织样品。
可以使用膜印迹(如在杂交分析如Northern、Southern、斑点印迹等中使用的)或者微孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或者任何包含结合的核酸的固体支持物)来监测本发明标志物的表达水平。见5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934号美国专利，其通过引用引入本文。标志物表达的检测还可以包括使用在溶液中的核酸探针。
在本发明的一个实施方式中，微阵列被用于检测本发明标志物的表达。微阵列因为不同实验之间的再现性而特别好地适用于此目的。DNA微阵列提供了一种用于同时测量大量基因的表达水平的方法。每个阵列由被连接于固相载体的捕获探针的可重现模式组成。标记的RNA或DNA被杂交于阵列上的互补探针，且然后通过激光扫描检测。测定阵列上各探针的杂交强度，并转换为表示相对基因表达水平的定量值。见，6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316号美国专利，其通过引用引入本文。高密度寡核苷酸阵列特别可用于测定样品中大量RNA的基因表达谱。
标志物的量和/或本发明标志物的量的数学关系可使用本发明的方法(其可以包括本领域技术人员已知的回归分析的方法)被用来计算在用药物治疗的受试者中心血管疾病(包括心力衰竭和心肌病，包括药物诱导的心肌病)的风险，治疗方案用于治疗、预防或抵消毒性状态的效果，等。例如，适合的回归模型包括，但不限于CART(如，Hill,T和Lewicki,P.(2006)“STATISTICS Methods and Applications”StatSoft,Tulsa,OK)、Cox(例如，www.evidence-based-medicine.co.uk)、指数、常态和对数正态的(例如，www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html)、逻辑(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression)、参数、非参数、半参数的(例如，www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion)、线性的(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression)或加性的(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model)。
在一个实施方式中，回归分析包括标志物的量。在另一个实施方式中，回归分析包括标志物的数学关系。而在另一个实施方式中，标志物的量和/或标志物数学关系的回归分析可以包括额外的临床和/或分子共变量。
使用的标志物组合
在整个申请中的方法、装置以及试剂盒是指单独或以任何组合使用本文所提供的任何标志物。本发明还提供了可以在包括本文所提供的方法、装置和试剂盒的任何本发明实施方式中使用的标志物的组合。如下提供了示例性的非限制性的标志物组合。
如本文所用的，术语“一种或多种生物标志物”意图指细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的至少一种(或组合)用在本发明的方法、组或试剂盒中。在本发明的某些实施方式中，“一种或多种生物标志物”包括CCDC47和HMOX1中的一种或两种。在某些实施方式中，该“一种或多种生物标志物”除CCDC47和HMOX1中的一种或两种外还包括PTX3。在某些实施方式中，该“一种或多种生物标志物”除了CCDC47和HMOX1的一种或两种外还包括PAI1。在某些实施方式中，该“一种或多种生物标志物”除了CCDC47和HMOX1的一种或两种外还包括PTX3和PAI1。在某些实施方式中，该“一种或多种生物标志物”除了CCDC47和HMOX1的一种或两种外还包括至少一种脂质标志物。在某些实施方式中，该“一种或多种生物标志物”除了CCDC47和HMOX1的一种或两种外还包括至少一种脂质标志物和IGFBP7。在某些实施方式中，该“一种或多种生物标志物”除了包括CCDC47和HMOX1的一种或两种的组合外还包括的至少一种脂质标志物，其是脂质PC-Li-183-D18:2-22:6。在某些实施方式中，该“一种或多种生物标志物”除了CCDC47和HMOX1的一种或两种外还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。在某些实施方式中，该“一种或多种生物标志物”除了CCDC47和HMOX1的一种或两种外还包括IL-12。在某些实施方式中，该“一种或多种生物标志物”除了CCDC47和HMOX1的一种或两种外还包括CFL2。在某些实施方式中，该“一种或多种生物标志物”除了CCDC47和HMOX1的一种或两种外还包括还包括EDIL3。在某些实施方式中，该“一种或多种生物标志物”除了CCDC47和HMOX1的一种或两种外还包括NUC1B。
在某些实施方式中，组合或组至少包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。在某些实施方式中，组合或组至少包括HMOX1。在某些实施方式中，组合或组至少包括IGFBP7。在某些实施方式中，组合或组至少包括CCDC47。在某些实施方式中，组合或组至少包括PTX3。在某些实施方式中，组合或组至少包括IL27。在某些实施方式中，组合或组至少包括PAI1。在某些实施方式中，组合或组至少包括CFL2。在某些实施方式中，组合或组至少包括EDIL3。在某些实施方式中，组合或组至少包括NUCB1。在某些实施方式中，组合或组至少包括PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3。在某些实施方式中，组合或组至少包括PE D18:0-22:5/D18:1-22:4。在某些实施方式中，组合或组至少包括PE D16:1-22:6。在某些实施方式中，组合或组至少包括PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2。在某些实施方式中，组合或组至少包括LPC 20:3。在某些实施方式中，组合或组至少包括PC-LI-183-D18:22-22:6。
在某些实施方式中，所述组包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1中的至少两种。在某些实施方式中，所述组包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1中的至少三种。在某些实施方式中，所述组包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1中的至少四种。在某些实施方式中，所述组包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1中的至少五种。在某些实施方式中，所述组包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1中的至少六种。在某些实施方式中，该组包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1中的至少七种。在某些实施方式中，所述组包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1中的至少八种。
在某些实施方式中，标志物的组合或组包括选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1；HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27和PAI1；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、IL27和PAI1；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3和IL27；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47和PTX3；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7和CCDC47；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1和IGFBP7；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和HMOX1；EDIL3、NUCB1、CFL2和PTX3；NUCB1、CFL2和PTX3；NUCB1和PTX3；NUCB1和CFL2的组合或组。
在某些实施方式中，任何上述组合或组进一步包括至少一种脂质标志物。在某些实施方式中，所述至少一种脂质标志物包括PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3。在某些实施方式中，所述至少一种脂质标志物包括LPC20:3。在某些实施方式中，所述至少一种脂质标志物包括PE 18:0-20:3。在一个优选的实施方式中，该至少一种脂质标志物是选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；PC-LI-183-D18:22-22:6的一、二、三、四、五、六或七种标志物，优选除了CCDC47和HMOX1的一种或两种之外，如那些上面所提供的。在某些实施方式中，该“一种或多种生物标志物”进一步包括选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；PC-LI-183-D18:22-22:6；CACNA2D1；EPHX1；BAX；PRKAR2A和MPA2K3的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或十一种标志物，优选除了CCDC47和HMOX1的一种或两种之外。
在某些实施方式中，所述组包括PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PED18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC20:3；PC-LI-183-D18:22-22:6的至少两种。在某些实施方式中，所述组包括PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；PC-LI-183-D18:22-22:6的至少三种。在某些实施方式中，所述组包括PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PED16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；PC-LI-183-D18:22-22:6的至少四种。在某些实施方式中，所述组包括PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PED18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC20:3；PC-LI-183-D18:22-22:6的至少五种。
在任何前述的实施方式中，该“一种或多种生物标志物”进一步包括选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCDC47、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HMOX1、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAI1、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA的一、二、三、四、五、六、七、八、九、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80或90种标志物，优选除了CCDC47和HMOX1的一种或两种之外。在某些实施方式中，所述组合还包括至少一种脂质。
在整个申请中提供了其它的标志物组合。如上所给出的标志物组合不应被理解为是限制性的。
在本发明的某些实施方式中，该一种或多种标志物可以被排除在本发明的实施方式(包括本文所提供的方法、装置和试剂盒)之外。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括HMOX1。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包含IGFBP7。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括CCDC47。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括PTX3。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括IL27。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括PAI1。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括CFL2。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括EDIL3。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括NUCB1。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括任何肌钙蛋白标志物。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括任何心肌肌钙蛋白。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括肌钙蛋白I、肌钙蛋白C和/或肌钙蛋白T中的一种或多种。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括C反应蛋白(CRP)。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括BNP。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括GRP78。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括GRP75。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括TIMP1。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括HSP76。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括PDAI4。在某些实施方式中，心肌病或心脏相关生物标志物不包括CA2D1。
药物基因组学
本发明的标志物也可用作药物基因组学标志物。如本文所使用的，“药物基因组学标志物”是客观的生化标志物，其表达水平与患者中的特定临床药物反应或易感性相关(见，例如，McLeod等，(1999)Eur.J.Cancer 35(12):1650-1652)。该药物基因组学标志物表达的存在或量与患者的预测反应和更具体地患者对响应于特定药物或药物种类的治疗的不良事件的阳性反应的可能性相关。通过评估患者中一种或多种药物基因组学标志物的存在或表达的量，可以选择最适合于患者的或者被预测为具有较大的成功程度的药物治疗。例如，基于由特定的标志物编码的RNA或蛋白质在患者中的存在或量，可以选择被优化用于治疗受试者以提高期望的治疗效果和减少不良事件的药物或治疗过程。因此，使用药物基因组学标志物允许选择或设计用于每个患者的最适当治疗而无需尝试不同的药物或方案。
药物基因组学的另一个方面涉及改变机体作用于药物的方式的遗传条件。这些药物基因组学条件可以作为罕见的缺陷或以多态性发生。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷是常见的遗传性酶病，其中主要的临床并发症是摄取氧化剂药物(抗疟疾药物、磺胺类药物、止痛药、硝基呋喃)和食用蚕豆后的溶血。
作为说明性的实施方式，药物代谢酶的活性是药物作用的强度和持续时间的主要决定因素。药物代谢酶(例如，N-乙酰基转移酶2(NAT2)及细胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)遗传多态性的发现对于为什么有些病人在服用标准和安全剂量的药物后没有获得预期的药物作用或表现出过大的药物反应和严重毒性提供了解释。这些多态性在人群中表现为两个表型，强代谢者(EM)和弱代谢者(PM)。PM的患病率在不同人群中是不同的。例如，编码CYP2D6的基因是高度多态性的且一些突变已经在PM中被确定，这都导致缺乏功能性的CYP2D6。当CYP2D6和CYP2C19的弱代谢者接受标准剂量时，他们很经常地发生过大的药物反应和副作用。如果代谢物为活性的治疗部分，PM将不显示治疗效果，如由其形成的CYP2D6代谢产物吗啡介导的可待因镇痛作用所表现的。另一个极端是所谓的超快速代谢者，其不对标准剂量作为反应。最近，超快速代谢的分子基础已被确定为是由于CYP2D6基因的扩增。
因此，个体中的本发明标志物的表达水平能够被测定，从而选择合适的药剂用于个体的治疗或预防性治疗。此外，药物遗传学研究可被用于将编码药物代谢酶的多态性等位基因的基因分型应用于鉴定个体的药物反应表型。这种知识当被应用于给药或药物选择时，可以避免用本发明标志物的表达的调节剂治疗受试者时的不良反应或治疗失败，从而增强治疗或预防效率。
监控临床试验
监测药剂(例如，药物化合物)对本发明标志物的水平的影响不仅可以应用在基本的药物筛选中而且可以应用在临床试验中。例如，可以在接受心肌病(例如，心脏毒性)或药物诱导毒性治疗的受试者的临床试验中监测药剂影响标志物表达的效力。在一个优选的实施方式中，本发明提供了用于监测药剂(例如，激动剂、拮抗剂、拟肽、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他药物候选物)治疗受试者的有效性的方法，其包括步骤：(i)在施用药剂之前从受试者获得给药前样品；(ii)检测给药前样品中本发明的一种或多种选择的标志物的水平；(iii)从所述受试者获得一个或多个给药后样品；(iv)检测所述给药后样品中所述标志物的水平；(v)比较给药前样品中标志物的水平与一个或多个给药后样品中标志物的表达水平；和(vi)相应地改变向受试者的药剂施用。例如，在治疗过程中增加的标志物基因的表达可表明无效的剂量和增加剂量的需求。相反地，标志物基因的减少的表达可以指示有效的治疗和不需要改变剂量。例如，相比于正常受试者，PTX3、PAI1、EDIL3和NUC1B中至少一种的表达水平的降低是心肌病的指示。类似地，响应于药剂治疗的PTX3、PAI1、EDIL3和NUC1B中至少一种的表达水平的降低指示该药剂是心脏毒性的。相反地，响应于药剂治疗的PTX3、PAI1、EDIL3和NUC1B中至少一种的表达水平的增加或者表达水平没有降低指示该药剂是心脏保护性的。
疾病状态的治疗
本发明提供了用于使用一种或多种本文所提供的标志物治疗受试者，例如，哺乳动物，例如，人类中的疾病，例如，心血管疾病，尤其是心力衰竭和/或心肌病(包括与心脏毒性剂接触导致的心肌病)的方法。
本发明还提供了管理用潜在心脏毒性药剂治疗的受试者(例如，需要用潜在心脏毒性剂治疗的受试者)的方法，包括：
(i)检测在向受试者施用至少一部分包含潜在心脏毒性剂的第一治疗方案之前从受试者获得的第一样品中选自于CCDC47、HMOX1、PTX3、PAI1、IL27、IGFBP7、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、CFL2、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；和PC-LI-183-D18:22-22:6的一种或多种CVD相关生物标志物的水平；
(ii)检测在向受试者施用至少一部分包含潜在心脏毒性剂的第一治疗方案之后从受试者获得的第二样品中对应的一种或多种CVD相关生物标志物的水平；
(iii)将第二样品中一种或多种CVD相关生物标志物的水平与第一样品中相应的一种或多种CVD相关生物标志物的水平进行比较，
(iv)确定所述潜在心脏毒性剂是否对受试者是心脏毒性的，其中所述第二样品中一种或多种CVD相关生物标志物与第一样品相比的非调节水平指示该药剂对于受试者不是心脏毒性的，和所述第二样品中一种或多种生物标志物与第一样品相比调节的水平指示该药剂对于受试者是心脏毒性的；和
(v)基于步骤(3)的比较选择用于受试者的治疗方案。
在某些实施方式中，选择用于受试者的治疗方案包括当药剂确定为对受试者为心脏毒性时停止或改变第一治疗方案，或药剂确定为对受试者不具心脏毒性时继续所述第一治疗方案。
在某些实施方式中，该方法包括改变第一治疗方案，包括减少潜在心脏毒性剂的剂量、停止用潜在的脏毒性剂治疗和/或选择潜在心脏毒性剂的替代治疗剂。
本发明还提供了用调节一种或多种心肌病相关标志物的表达或活性的治疗剂(例如，基于核酸或抗体的治疗剂)治疗患有心血管疾病(尤其特别是心力衰竭和/或心肌病，包括与心脏毒性剂接触而导致的心肌病)的受试者的方法。
本发明还提供了用于根据检测本文所提供的一种或多种标志物的水平与对照相比的变化选择已知的治疗剂或治疗性干预的方法。治疗方案的选择可以进一步包括一种或多种非基于标志物的方法以协助选择治疗剂和干预。本发明还提供了将本文所提供的标志物用于非心脏相关疾病治疗的选择中，其中用于治疗非心脏相关病症的治疗剂可以导致或加剧心肌病。
分离的核酸分子
本发明的一个方面涉及分离的核酸分子，包括编码标志物蛋白质或其一部分的核酸。本发明的分离的核酸还包括足以用作杂交探针来鉴定标志物核酸分子的核酸分子及标志物核酸分子的片段，例如那些适合用作PCR引物用于扩增标志物核酸分子的特定产品或突变。如本文所用的，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如，mRNA)及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。所述核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链的DNA。
“分离的”核酸分子是与核酸分子的天然来源中存在的其它核酸分子分离的核酸分子。在一个实施方式中，“分离的”核酸分子没有该核酸来源于其中的生物体的基因组DNA中核酸天然侧翼序列(即位于核酸的5'和3'端的序列)(优选蛋白质编码序列)。例如，在各种实施方式中，分离的核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的该核酸来源于其中的细胞的基因组DNA中核酸分子天然侧翼的核苷酸序列。在另一个实施方式中，“分离的”核酸分子(如cDNA分子)当通过重组技术产生时可以基本上不含其它细胞物质或培养基，或者当被化学合成时可以基本上不含化学前体或其他化学品。基本上不含细胞物质的核酸分子包括具有少于约30％、20％、10％或5％的异源核酸(在此也称为“污染核酸”)的制剂。
可以使用标准分子生物学技术和本文中所述的数据库记录中的序列信息来分离本发明的核酸分子。使用这样的核酸序列的全部或一部分，本发明的核酸分子可以使用标准杂交和克隆技术(例如，如在Sambrook等编辑,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中所述的)分离。
可以使用作为模板的cDNA、mRNA或基因组DNA和合适的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术来扩增本发明的核酸分子。这样扩增的核酸可以被克隆到合适的载体中和通过DNA序列分析表征。而且，可以通过标准合成技术，例如，使用自动的DNA合成仪来制备对应于本发明核酸分子的全部或一部分的核酸。
在另一个优选的实施方式中，本发明的分离的核酸分子包含具有与标志物核酸的核苷酸序列或与编码标志物蛋白质的核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸分子。互补于给定的核苷酸序列的核酸分子是与给定的核苷酸充分地互补以至于其能够与给定的核苷酸序列杂交从而形成稳定的双链体的核酸分子。
“互补的”指在两个核酸链的区域之间或同一核酸链的两个区域之间的序列互补的广义概念。已知第一核酸区域的腺嘌呤残基能够与反平行于所述第一区域的第二核酸区域的残基(如果该残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶)形成特定的氢键(“碱基配对”)。类似地，已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够与反平行于第一链的第二核酸链的残基(如果该残基是鸟嘌呤)碱基配对。如果当两个区域以反平行的方式排列时第一区域中的至少一个核苷酸残基能够与第二区域的残基碱基配对，则核酸的第一区域与相同或不同核酸的第二区域互补。优选地，所述第一区域包含第一部分和所述第二区域包含第二部分，由此当第一和第二部分以反平行的方式排列时，第一部分的至少约50％，和优选至少约75％，至少约90％，或至少约95％的核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更优选地，第一部分的所有核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
如本文所使用的“相同的”或“同一性”是指相同核酸链的两个区域之间或两个不同核酸链的区域之间的核苷酸序列相似性。当两个区域中的核苷酸残基由相同的核苷酸残基占据时，则该区域在该位置处是相同的。如果各个区域的至少一个核苷酸残基的位置由相同的残基占据，则第一区域与第二区域相同。两个区域之间的同一性是就由相同核苷酸残基占据的两个区域的核苷酸残基位置的比例而言的。通过举例的方式，具有核苷酸序列5'-ATTGCC-3'的区域和具有核苷酸序列5'-TATGGC-3'的区域拥有50％的同一性。优选地，第一区域包含第一部分和第二区域包含第二部分，由此所述部分各自的核苷酸残基位置的至少约50％，和优选至少约75％，至少约90％或至少约95％由相同的核苷酸残基占据。更优选地，所述部分各自的所有核苷酸残基位置由相同的核苷酸残基占据。
此外，本发明的核酸分子可以包含仅一部分的核酸序列，其中全长核酸序列包含标志物核酸或其编码标志物蛋白质。这样的核酸可用作，例如，探针或引物。所述探针/引物典型地被用作一种或多种基本上纯化的寡核苷酸。寡核苷酸通常包含在严格条件下与本发明核酸的至少约15，更优选至少约25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个或更多个或者由这些值所包括的任何范围的连续核苷酸杂交的核苷酸序列。
基于本发明核酸分子的序列的探针可以被用于检测对应于本发明的一种或多种标志物的转录物或基因组序列。所述探针包含连接于其上的标记基团，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。这样的探针可以被用作诊断测试试剂盒的部分用于识别表达或误表达蛋白质的细胞或组织，例如通过测量来自受试者的细胞样品中编码蛋白质的核酸分子的水平，例如检测mRNA水平或者测定编码该蛋白质的基因或它的翻译控制序列是否已经突变或删除。
本发明还包含由于遗传密码的简并性而与编码标志物蛋白质(例如，具有在图中提供的序列的蛋白质)的核酸的核苷酸序列不同，且因此编码相同的蛋白质的核酸分子。
那些本领域的技术人员可以理解的是，在群体(例如，人类群体)中可以存在导致氨基酸序列改变的DNA序列的多态性。这些遗传多态性可由于天然等位基因变异和已知例如在癌症中发生的变化而存在于群体的个体之间。等位基因是可选择地存在于给定基因座的一组基因中的一个。另外，可以理解的是，影响RNA的表达水平的DNA多态性也可以存在，其可影响该基因的总体表达水平(例如，通过影响调节或降解)。
如本文所用的，短语“等位基因变体”是指存在于给定基因座的核苷酸序列或指由核苷酸序列编码的多肽。
如本文所用的，术语“基因”和“重组基因”是指包含编码与本发明标志物的多肽对应的开放阅读框的核酸分子。此类天然等位基因变异一般可导致给定基因的核苷酸序列中1-5％的差异度。可以通过测序许多不同个体中的目的基因来鉴定可选的等位基因。这可以通过使用杂交探针来识别各种个体中的相同基因座而容易地进行。作为天然等位基因变异的结果并且不改变功能活性的任何和所有此类核苷酸变异和所得的氨基酸多态性或变异都旨在属于本发明的范围。
在另一个实施方式中，本发明的分离的核酸分子长度是至少15、20、25、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、550、650、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3500、4000、4500或更多个或由这些值所包括的任何范围的核苷酸且在严格条件下与标志物核酸或与编码标志物蛋白质的核酸杂交。如本文所用的，术语“在严格条件下杂交”旨在描述用于杂交和洗涤的条件，在该条件下至少60％(65％、70％，优选75％)彼此相同的核苷酸序列通常保持彼此杂交。此类严格条件是本领域技术人员已知的，并可以在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989)的6.3.1-6.3.6节中找到。严格杂交条件的优选的非限制性例子是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在大约45℃下杂交，接着在0.2×SSC、0.1％SDS中在50-65℃下洗涤一次或多次。
核酸治疗剂
核酸治疗剂是本领域中公知的。核酸治疗剂包括与细胞中的靶序列互补的单链和双链的(即，具有至少15个核苷酸长度的互补区的核酸治疗剂，其可以是一个或两个核酸链)核酸。核酸治疗剂可以被递送到培养中的细胞，例如，通过将核酸单独添加到培养基中或者与促进核酸摄取到细胞中的药剂一起添加。核酸治疗剂可以通过任何施用途径被递送到受试者中的细胞，即，在体内。具体制剂取决于施用途径。
除非另外指出，如本文所用的术语“互补的”当被用于与第二核苷酸序列有关描述第一核苷酸序列时，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在特定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交和形成双链体结构的能力，如本领域技术人员理解的。这样的条件可以是，例如，严格条件，其中严格条件可包括：400mM的氯化钠，40mMPIPES，pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃下，12-16小时，随后洗涤。可以应用其它条件，如可能在生物体内遇到的生理相关条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用来确定最适合于两个序列互补性测试的条件组。
当第一核苷酸序列的核苷酸与第二核苷酸序列的核苷酸在第一和第二核苷酸序列的整个长度上存在碱基配对时，序列可以是彼此“完全互补的”。然而，当本文中第一序列相对于第二序列被称为“基本互补的”，该两条序列可以是完全互补的，或者它们在杂交时可形成一个或多个，但一般不超过4、3或2个错配的碱基对，而同时保留在与它们的最终应用最相关的条件下杂交的能力。然而，当如在双链核酸治疗剂中常见的，两个寡核苷酸被设计成在杂交时形成一个或多个单链突出端时，这种突出端不应视为对于确定互补性的错配。例如，含有长度21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA(其中较长的寡核苷酸包含与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列)还可以用于本文所描述的目的的被称为“完全互补的”。
如本文所使用的“互补”的序列也可以包括非Watson-Crick碱基对和/或由非天然的和修饰的核苷酸形成的碱基对，或者完全由其形成，只要满足关于它们的杂交能力的上述要求。这样的非Watson-Crick碱基对包括但不限于，G:U摆动或Hoogstein碱基配对。
术语“互补的”、“完全互补的”和“基本互补的”可以相对于dsRNA的有义链和反义链之间，或者dsRNA的反义核酸或反义链与靶序列之间的碱基匹配使用，如从其使用环境理解的。
如本文所用的，“基本上互补于至少部分的”信使RNA(mRNA)的多核苷酸是指基本上互补于目的mRNA的连续部分(包括5'UTR、开放阅读框(ORF)或3'UTR)的多核苷酸(例如，编码心肌病相关标志物的mRNA)。例如，如果多核苷酸的序列基本上互补于编码心肌病相关标志物的mRNA的非中断部分，该多核苷酸互补于心肌病相关标志物的mRNA的至少一部分。
核酸治疗剂典型地包括化学修饰以改善其稳定性和调节其药代动力学和药效学性质。例如，核苷酸的修饰可以包括，但不限于，LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-脱氧、2'-羟基以及它们的组合。
核酸治疗剂可进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间键修饰可以存在于链任何位置中的有义链或反义链或两者(在包括有义链的核酸治疗剂中)的任何核苷酸上。例如，核苷间键修饰可以存在于有义链或反义链的每个核苷酸上；每个核苷间键修饰可以以交替模式发生在有义链或反义链上；或者有义链或反义链可以交替的模式包含两种核苷间键修饰。有义链上核苷间键修饰的交替模式与反义链可以是相同的或不同的，且有义链上核苷间键修饰的交替模式可以相对于反义链上核苷间键修饰的交替模式具有偏移。
单链核酸治疗剂
反义核酸治疗剂是单链核酸治疗剂，通常为约16至30个核苷酸长度和互补于靶细胞(无论是在培养中或在生物体中)中的靶核酸序列。
涉及反义核酸、化学修饰和治疗用途的专利被提供于，例如，5,898,031号美国专利中(其涉及化学修饰的含RNA治疗性化合物)和6,107,094号美国专利中(其涉及使用这些化合物作为治疗剂的方法)。7,432,250号美国专利涉及通过施用单链的化学修饰的RNA样化合物治疗患者的方法；和7,432,249号美国专利涉及含有单链的化学修饰的RNA样化合物的药物组合物。7,629,321号美国专利涉及使用具有多个核苷和至少一种化学修饰的单链寡核苷酸切割靶mRNA的方法。在本段中列出的前述专利各自的全部内容在此通过引用明确并入本文。
双链核酸治疗剂
在许多实施方式中，双链体区的长度为15-30个核苷酸对。在一些实施方式中，双链体区为17-23个核苷酸对长度、17-25个核苷酸对长度、23-27个核苷酸对长度、19-21个核苷酸对长度或21-23个核苷酸对长度。
在某些实施方式中，每条链具有15-30个核苷酸。
在本发明的方法中使用的RNAi剂包括具有化学修饰的药剂，如公开在例如公开WO2009/073809和WO/2012/037254中，其各自的全部内容在此明确地通过引用引入。
如本文中可互换使用的“RNAi剂”、“双链RNAi剂”、双链RNA(dsRNA)分子，也称为“dsRNA剂”、“dsRNA”、“siRNA”、“iRNA剂”是指核糖核酸分子的复合物，其具有包含两个反平行的和基本上互补的(如下所定义)的核酸链的双链体结构。如本文所使用的，RNAi剂还可以包括dsiRNA(见，例如，美国专利公开20070104688，其通过引用并入本文)。在一般情况下，每条链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但如本文中所描述的，每条链或两条链也可以包括一种或多种非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。此外，如在本说明书中所使用的，“RNAi剂”可以包括具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi剂可在多个核苷酸处包括实质性的修饰。这样的修饰可以包括所有类型的本文公开的或本领域已知的修饰。任何这样的修饰，如在siRNA型分子中使用的，用于本说明书和权利要求书的目的被涵盖于“RNAi剂”中。
形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或者它们可以是单独的RNA分子。在其中两条链是一个较大分子的部分和因此在一条链的3'-端和形成双链体结构的相应另一条链的5'端之间通过不间断核苷酸链连接的情况中，连接RNA链被称为“发夹环”。在两条链通过一条链的3'-端和形成双链体结构的相应另一条链的5'端之间的不间断核苷酸链之外的方式共价连接的情况中，该连接结构被称作“连接体”。该RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是dsRNA中最短链的核苷酸数目减去存在于双链体中的任何突出端。除了双链体结构外，RNAi剂可包含一个或多个核苷酸突出端。术语“siRNA”也用于本文中指如上所述的RNAi剂。
在另一个方面，所述药剂是单链反义RNA分子。反义RNA分子互补于靶mRNA内的序列。反义RNA可以通过与mRNA碱基配对和物理上阻碍翻译机制以化学计量方式抑制翻译，参见，Dias,N.等人，(2002)Mol Cancer Ther 1:347-355。反义RNA分子可具有约15-30个互补于靶mRNA的核苷酸。例如，反义RNA分子可具有至少15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的序列，其互补于本文所提供的心肌病相关标志物序列。
术语“反义链”是指双链RNAi剂的包括与靶序列(例如，人TTR mRNA)基本上互补的区域的链。如本文所用，术语“与编码运甲状腺素蛋白的mRNA的部分互补的区域”是指反义链上与TTR mRNA序列的部分基本上互补的区域。在互补性区域不与靶序列完全互补的情况中，错配在末端区域中是最耐受的，且如果存在的话，通常是在一个或多个末端区域中，例如，在5'和/或3'末端的6、5、4、3或2个核苷酸内。
如本文使用的，术语“有义链”是指包括与反义链的区域基本互补的区域的dsRNA链。
本发明还包括具有至少一个与本发明的核酸的互补区域的分子信标核酸，使得所述分子信标可用于定量样品中本发明的核酸的存在。“分子信标”核酸是包含一对互补的区域并且具有荧光团和与其相关联的荧光淬灭剂的核酸。荧光团和淬灭剂与核酸的不同部分相关联，其取向使得当互补区域彼此退火时，荧光团的荧光被淬灭剂淬灭。当核酸的互补区域彼此不退火时，荧光团的荧光被淬灭程度较轻。分子信标核酸被描述于，例如，5,876,930号美国专利中。
分离的蛋白质和抗体
本发明的一个方面涉及分离的标志物蛋白质及其生物活性部分，以及适合用作免疫原以产生针对标志物蛋白质或其片段的抗体的多肽片段。在一个实施方式中，通过适当的纯化方案使用标准蛋白质纯化技术可从细胞或组织来源分离天然标志物蛋白质。在另一个实施方式中，通过重组DNA技术生产包含标志物蛋白的全部或片段的蛋白质或肽。替代重组表达，这样的蛋白质或肽可使用标准肽合成技术来化学合成。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含细胞物质或来自该蛋白质所来源的细胞或组织来源的其他污染蛋白质，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。语言“基本上不含细胞物质”包括其中蛋白质是从它被分离或重组产生的细胞的细胞组分被分离的蛋白质制剂。因此，基本上不含细胞物质的蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的异源蛋白质(在此也称为为“污染蛋白质”)的蛋白质制剂。当重组产生蛋白质或其生物活性部分时，也优选基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂体积的少于约20％、10％或5％。当蛋白质通过化学合成产生时，优选基本上不含化学前体或其它化学品，即它与蛋白质的合成中所涉及的化学前体或其它化学品分离。因此这样的蛋白质制剂除了目的多肽外具有少于约30％、20％、10％、5％(以干重计)的化学前体或化合物。
“本发明的蛋白质”包括标志物蛋白质和它们的片段；变体标志物蛋白质和它们的片段；包含标志物或变体标志物蛋白质的至少15个氨基酸的片段肽和多肽；和包含标志物或变体标志物蛋白质或者标志物或变体标志物蛋白质的至少15个氨基酸的片段的融合蛋白质。在某些实施方式中，本发明的蛋白质是足够大以允许抗体与标志物特异性结合的肽序列或表位。
标志物蛋白质的生物活性部分包括多肽，其包含的氨基酸序列与标志物蛋白质的氨基酸序列充分相同或源自标志物蛋白质的氨基酸序列，其包括比全长蛋白质较少的氨基酸，并表现出相应的全长蛋白质的至少一种活性。典型地，生物活性部分包含具有至少一种相应的全长蛋白质的活性的结构域或基序。本发明标志物蛋白质的生物活性部分可以是为例如，10、25、50、100或更多个氨基酸的长度的多肽。此外，其中标志物蛋白质的其他区域被删除的其他生物活性部分可通过重组技术制备和评估标志物蛋白质的天然形式的一种或多种功能活性。
优选的标志物蛋白质是由包含任何附图的序列的核苷酸序列所编码的。其他有用的蛋白质与这些序列之一的是基本上相同的(例如，至少约40％，优选50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)，并保持相应的天然存在的标志物蛋白质的功能活性而由于天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上有所不同。
为了测定两个氨基酸序列或两个核酸的百分同一性，将所述序列对准用于最佳对比目的(例如，可以将空位引入第一氨基酸或核酸序列的序列中用于与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后对在对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置上是相同的。优选地，使用全局比对计算两个序列之间的百分同一性。可选地，使用局部比对计算两个序列之间的百分同一性。两个序列之间的百分同一性是序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置#/总位置#(例如，重叠位置)×100)。在一个实施方式中，两个序列具有相同的长度。在另一个实施方式中，两个序列是不一样的长度。
可以使用数学算法来完成两个序列之间百分同一性的测定。用于两个序列的比较的数学算法的优选的非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268的算法，在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中改进。这样的算法被整合到Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTN和BLASTX程序中。可以用BLASTN程序，得分＝100，字长＝12进行BLAST核苷酸检索以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTP程序，得分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质检索以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带空位比对，可以利用被称为带空位BLAST的新版BLAST算法，如Altschul等(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中所描述的，它能够执行程序BLASTN、BLASTP和BLASTX的带空位局部比对。或者，PSI-BLAST可以用于执行迭代检索，其检测分子间的远源关系。当利用BLAST、带空位BLAST和PSI-Blast程序时，可使用相应程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一个优选的非限制性实例是Myers和Miller，(1988)CABIOS 4:11-17的算法。这样的算法被整合到ALIGN程序(版本2.0)中，其是GCG序列比对软件包的部分。当使用ALIGN程序用于氨基酸序列比较时，可以使用PAM120权重残差表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。而用于确定局部序列相似性的区域和比对的另一个有用的算法是FASTA算法，如Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-2448中所描述的。当使用FASTA算法用于比较核苷酸或氨基酸序列时，可以使用例如，PAM120权重残差表，具有k-元组值2。
可以使用类似于上述的那些技术来测定两个序列之间的百分同一性，具有或不具有容许的空位。在百分同一性的计算中，只计数正确匹配。
本发明的另一个方面涉及针对本发明蛋白质的抗体。在优选的实施方式中，抗体特异性地结合标志物蛋白质或其片段。在本文中可互换使用的术语“抗体”和“多种抗体”指免疫球蛋白分子以及其片段和其衍生物，其包含免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即，这种部分包含与抗原特异性结合的抗原结合位点，如标志物蛋白，例如标志物蛋白的表位)。例如，除非文中另外指明，术语“抗体”和“多种抗体”宽泛地包括天然存在的抗体形式(例如，IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体如单链抗体、嵌合和人源化抗体及多特异性抗体，以及所有前述形式的片段和衍生物，该片段和衍生物具有至少一个抗原结合位点。抗体衍生物可包含与抗体偶联的蛋白质或化学部分。特异性结合于本发明蛋白质的抗体是结合天然包含该蛋白质的样品(如生物样品)中的蛋白质但基本上不结合其它分子的抗体。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括，但不限于，单链抗体(scAb)、F(ab)和F(ab')2片段。
本发明的分离的蛋白质或其片段可以用作免疫原以产生抗体。可以使用全长蛋白质，或者可选地本发明提供了用作免疫原的抗原性肽片段。本发明蛋白质的抗原性肽包含本发明蛋白质之一的氨基酸序列的至少8个(优选10、15、20或30个或更多个)氨基酸残基，且包括蛋白质的至少一个表位以使得引起的针对该肽的抗体与该蛋白质形成特异性免疫复合物。抗原性肽所包含的优选的表位是位于该蛋白质表面上的区域，例如亲水性区域。疏水性序列分析、亲水性序列分析或类似的分析可用于识别亲水性区域。在优选的实施方式中，分离的标志物蛋白质或其片段被用作免疫原。
本发明提供了多克隆和单克隆抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指只含有能够与特定表位免疫反应的一种类型的抗原结合位点的抗体分子群体。优选的多克隆和单克隆抗体组合物是已经选择针对本发明蛋白质的抗体的那些。特别优选的多克隆和单克隆抗体制剂是仅包含针对标志物蛋白质或其片段的抗体的那些。制备多克隆、单克隆和重组抗体和抗体片段的方法是本领域公知的。
用于识别本发明的标志物的系统
脂质在细胞内和细胞外信号传导和代谢中发挥关键作用。蛋白质、脂质和核酸生物标志物的相互作用及生物标志物的蛋白质、脂质和核酸的失调可能会导致疾病和器官功能障碍。
细胞模型被用于识别标志物，包括毒性的标志物(例如心脏毒性标志物，包括蛋白质/基因标志物)、包括激酶标志物的酶标志物、脂质标志物和代谢产物标志物。在国际申请号PCT/US2012/027615、PCT/US2012/054321和PCT/US2012/054323中提供了用于样品制备、收集和分析以识别这种标志物的方法，其各自的全部内容通过引用并入本文。下面进一步讨论用于识别本文所提供的脂质标志物的方法。
血清中作为过氧化物酶体功能的整合标志物的过氧化物酶体脂质
具有高氧化能力的组织需要碳水化合物和脂质代谢产物的完整通道来建立动态的和可塑的代谢系统以适应生理需求。需要整合充当生化决策者的亚细胞器，如过氧化物酶体、微粒体和线粒体以实现高效的器官功能。因此，在疾病的病理进展过程中或通过各种药物干预的脱靶效应，建立的生化动态平衡中细胞器功能的维持是生理功能所必需的。这个过程以糖尿病对心脏功能的效应为例，这迫使心肌只能利用脂肪酸氧化来支持血液动力学功能，其然后促成心肌病。此外，经由断开过氧化物酶体-微粒体-线粒体轴改变脂肪酸代谢的药物导致改变的代谢产物支持心血管或肌肉功能的输送，这可能导致心力衰竭。该轴对于建立代谢流以及对于保持完整的膜功能和经由嵌入结构脂质组中的氧化性代谢产物适应环境压力关键的脂质组支架的产生是关键的。
缩醛磷脂
脂质的独特的一个亚类(缩醛磷脂)通过它们对膜曲率和融合、电生理学和抗氧化剂能力以及启动调节血液动力学功能的高效信号传导氧化分子的产生的调节作用而对于生物功能是关键的。缩醛磷脂只在过氧化物酶体中合成，并且可以是用于过氧化物酶体动态平衡的标志物。缩醛磷脂与其他亚类的脂质不同，因为它们是由在连接脂肪酸与甘油部分的磷脂的sn-1位置处的乙烯基醚键所组成。其他亚类在该位置具有醚或酯键。因此，通过在质谱中使用结构阐明的固有能力，可以采用可通过独特的磷脂酶靶向的酰基链的定位位置获得不同脂质亚类的定量来展现控制血管舒张/血管收缩、钙动态平衡、炎症以及消炎的机制的高效生物效应。
信号传导脂质
氧化的脂质代谢产物表示独特种类的脂质，其是形成导致在多样的器官系统中差异生理的调节控制的生物过程的复杂通道的最终产物。信号传导脂质以高调控方式产生。信号传导脂质的前体在相对于细胞、组织或生物流体的代谢健康被控制和维持的脂质种类的复杂网络中自我平衡。一般地，信号传导脂质的前体被嵌入包括磷脂酰肌醇以及胆碱和乙醇胺甘油磷脂的磷脂上的sn-2位置。通过起到信号传导脂质产生的看门者作用的独特磷脂酶的靶向作用，可释放出酰基链的多样集合，其可随后被氧化。这些酰基链包括亚油酸(18：2)、亚麻酸(18：3)、花生四烯酸(AA，20：4)、二十碳五烯酸(EPA，20：5)、二十二碳五烯酸(DPA，22：5)和二十二碳六烯酸(DHA，22：6)。靶向磷脂酶的酰基链释放后，脂肪酸被引导以被脂肪氧合酶、环氧合酶和细胞色素P450表氧化酶选择性氧化，从而产生特定的氧化分子以适应生理需求。因此，保持不同的功能性磷脂分子种类携带信号传导脂质前体的脂肪酸代谢以及指定的磷脂酶、脂肪氧合酶、环氧合酶和细胞色素P450表氧化酶的协调作用的动态平衡代表生物动态平衡的主轴。
可收获各前述的酰基链以产生在调节生理机能中具有多效作用的有力的氧化代谢产物。亚油酸(18：2)氧化代谢产物的功能重要性所知甚少，但是代表整体线粒体动态平衡以及用于控制膜的流动性的多不饱和脂肪酸(PUFA)产生中的主要分支点。在心肌中，亚油酸高度富集在线粒体特异性脂质心磷脂中。氧化的亚油酸代谢产物(HODEs、DiHOMEs、oxoODEs和EpOMEs)的信号传导功能是调节离子通道和钙动态平衡，这对于线粒体的功能是内在重要的。另外，亚油酸起到前体的作用来合成花生四烯酸(20:4)，这是功能上最多研究的氧化代谢产物。
花生四烯酸代谢产物(通常被称为类花生酸类)主要形成HETE’s、EETs和前列腺素类。目前，数百种不同的氧化花生四烯酸代谢产物是已知的，然而，它们的独特功能作用尚未在不同组织中被确定，尽管它们根据氧化产物的位置定位似乎是炎性/抗炎以及血管舒张/血管收缩功能的平衡。因此，控制氧化代谢产物的输送调节炎性和血管调节轴。已经进行了许多尝试来药理学地调节该轴，但是缺乏对这些代谢物的平衡作用的认识，这些代谢物的有利的和病理的作用已经导致药物从市场退出。特异性地抑制环氧合酶2(这被认为产生促炎性代谢产物)的治疗剂最突出，但是，缺乏对靶向炎症和疼痛的下游代谢产物的生物效应的理解导致了对心血管功能的最终有害作用，其在被治疗的患者中促发心力衰竭。因为，这些炎症途径根据功能作用在不同组织中差异地调节，缺乏对这些过程的生物了解导致意外有害副作用，其限制靶向这些途径的药物干预的功效。
二十二碳六烯酸(DHA，22：6)主要由于对心血管和神经系统功能的有益作用而已知，但是确切的机制远远超出在当前的教导中所强调的其ω-3的化学结构。实际上，DHA的氧化代谢产物被喻为对炎症的消退效应超过十年的时间。DHA氧化代谢物的种类包括D系列消退素(resolvin)、保护素/神经保护素和maresins。一旦DHA被释放和氧化，代谢产物具有恢复炎症级联至动态平衡的关键调控能力。因此，通过磷脂酶以及特定氧化酶的协调作用，生理控制的动态平衡可被维持以及病理可通过复杂的生物学途径的协调工作而改变。
缩醛磷脂和信号传导脂质
由sPLA2s、cPLA2s或iPLA2s的多样集合对指定的磷脂靶向分子种类的调节控制在个别分子种类的混合的(amalgamated)化学组成的立体电子结构。缩醛磷脂在sn-1位包含乙烯基醚键，它缺乏相邻于头基的羰基氧，从而使此亚类脂质比酯或其它醚键脂质亚类更亲脂。这导致在头基之间更强的分子间的氢键，从而导致形成逆六方相(HII)的更大倾向。这种固有的结构特性允许被磷脂酶更高地识别，从而指定缩醛磷脂为用于氧化代谢产物前体的存储的关键生物支架，其由于被磷脂酶容易地和特异性地识别。与缩醛磷脂的生物学作用一样，起到心肌、神经、免疫或血管组织中缩醛磷脂分子种类的信号传导分析的支架的作用揭示了这些组织中缩醛磷脂的丰度以及亚油酸和花生四烯酸在sn-2位置的特异性定位，这是最容易被磷脂酶识别的。
数据收集
本发明的方法包括分析样品，通常受试者样品，以检测标志物，例如蛋白质、核酸、脂质。执行定量聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质组学来通过定量聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质组学分析细胞mRNA和蛋白质表达的变化。可以使用市售的RNA提取试剂盒来分离总RNA。cDNA合成后，可以按照制造商的说明采用对于疾病区域或细胞过程(如血管生成、细胞凋亡和糖尿病)的具体市售的qPCR阵列(例如，那些来自SA Biosciences的)来分析预定组的基因。例如，CFX-384扩增系统可用于所有转录谱实验。数据采集(Ct)后，按制造商的说明概述的δCt法来测定相对于控制的最终倍数变化。可以如在随后的章节中描述的进行蛋白质组学样品分析。
所述方法可以采用类似性质的数百个样品的大规模高通量定量蛋白质组学分析，并提供识别细胞输出差异所需的数据。
有适用于这一目的的众多本领域公认的技术。示例性技术，与质谱结合的分析，简要描述如下。
定量蛋白质组学途径是基于用8-重试剂和2D-LC MALDI MS/MS标记的稳定同位素而用于肽的识别和定量。用这一技术的定量是相对的：肽和蛋白质被分配相对于参照样品的丰度比率。在多重实验中的共同参照料样品促进在多重实验中的样品比较。
例如，为了实施这种分析方案，根据制造商的建议，6个初级样品和两个对照池样品可以被组合成一个8-重混合物。然后可以通过二维液相色谱法对这一八样品的混合物进行分馏；然后可对第一维中的强阳离子交换(SCX)和第二维中的反相HPLC进行质谱分析。
可以使用多种方法进行脂质检测，其中包括但不限于，质谱(MS)、核磁共振(NMR)谱、荧光光谱、双偏振干涉和计算方法。可以使用集成的可商购的设备，如来自的TSQ vantage EMR三重四极杆质谱，用于自动和/或高通量脂质组学分析。
本文中提供了可使用的示例性实验室程序的简要概述。
蛋白质提取：可以用8M尿素裂解缓冲液与蛋白酶抑制剂(Thermo ScientificHalt蛋白酶抑制剂，无EDTA)来裂解细胞并在冰上孵育30分钟，每10分钟涡旋5秒。可以通过以5秒脉冲超声完成裂解。可以14000×g将细胞裂解物离心15分钟(4℃)以去除细胞碎片。可以进行Bradford分析以测定蛋白质浓度。来自每个样品的100微克蛋白质可被还原(10mM的二硫苏糖醇(DTT)，55℃，1小时)、烷基化(25mM碘乙酰胺，室温，30分钟)和用胰蛋白酶消化(1:25w/w，200mM三乙基碳酸氢铵(TEAB)，37℃，16小时)。
分泌组样品制备：1)在一个实施方式中，可以在无血清培养基中培养细胞：条件培养基可通过冷冻干燥器将浓缩，还原(10mM的二硫苏糖醇(DTT)，55℃，1小时)，烷基化(25mM碘乙酰胺，室温下孵育30分钟)，和然后通过丙酮(actone)沉淀脱盐。可以用胰蛋白酶(1:25w/w，200mM三乙基碳酸氢铵(TEAB)，37℃，16小时)消化来自浓缩的条件培养基的等量蛋白质。
在一个实施方式中，可在含血清培养基中培养细胞：使用3k MWCO的Vivaspin柱(GE Healthcare Life Sciences)可以减少培养基的体积，然后可以用1xPBS重构。可以按照制造商的说明及缓冲液交换的改进使用AlbuVoid柱(Biotech Support Group,LLC)从所有样品中耗减血清白蛋白以优化用于条件培养基应用。
8重标记：来自各实验组中的各胰蛋白酶消化物的等分试样可以汇集到一起来创建合并的对照样品。根据制造商的说明(AB)，可以通过8重试剂标记来自各样品和合并的对照样品的等份试样。该反应可以被结合，抽真空至干燥，通过加入0.1％的甲酸再悬浮，并通过LC-MS/MS进行分析。
2D-NanoLC-MS/MS：可以通过在线2D-nanoLC分离所有标记的肽混合物并通过电喷雾串联质谱法进行分析。可以在与配备有纳米电喷雾离子源(Thermo Electron,Bremen,Germany)的LTQ质谱仪连接的2D NanoLC Ultra系统上进行实验。
可以用4微升/分钟的流速将肽混合物注入到5cm SCX柱(300μm ID，5μm，PolySULFOETHYL Aspartamide柱，来自PolyLC,Columbia,MD)，和在10个离子交换洗脱片段中洗脱至C18捕捉柱(2.5cm，100μm ID,5μm,ProteoPrepTM II，来自New Objective,Woburn,MA)中和用H2O/0.1％FA洗涤5分钟。然后可使用2-45％B(H2O/0.1％FA(溶剂A)和ACN/0.1％FA(溶剂B))的梯度，在15cm的熔融二氧化硅柱(75μm ID，5μm，ProteoPepTM II，来自New Objective,Woburn,MA)上以300nL/min进一步进行分离120分钟。
可以在Orbitrap中用30000的分辨率来获得全扫描MS谱(m/z 300-2000)。最高强度的离子(高达10)可使用高能量C-阱解离(HCD)顺序分离用于破碎，且动态排除30秒。可以用1.2Da的分离宽度进行HCD。可在轨道阱中用7500的分辨率扫描所得的碎片离子。可以通过2.1基础1.0.1对LTQ Orbitrap VelosTM进行控制。
肽/蛋白质识别和定量：可以使用具有针对SwissProt数据库的Mascot搜索引擎的Proteome Discoverer软件(Thermo Electron)通过自动化的数据库检索来识别肽和蛋白质。检索参数可以包括10ppm的MS容差，0.02Da的MS2容差，和允许最多2个错失切割的全胰蛋白酶消化。脲甲基化(C)可以被设置为固定的修饰。氧化(M)、TMT6和脱酰胺(NQ)可被设置为动态的修饰。可以用Mascot显著性阈值(P<0.05)过滤肽和蛋白质识别。该过滤器可以允许蛋白质识别的99％的置信水平(1％FDA)。
Proteome Discoverer软件可以在报告离子上应用校正因子，并可拒绝所有定量值，如果不是所有量化通道都存在。可通过在平均强度的标准化来实现相对蛋白质定量。
脂质分离和检测：从生物样品中提取和分离脂质的大多数方法利用烃链在有机溶剂中的高溶解度。考虑到在脂质类别的多样性，不可能向所有类别提供共同的提取方法。传统的Bligh/Dyer方法使用氯仿/甲醇为基础的方案，其包括相分配到有机层中。这些方案对于各种各样的生理相关脂质效果相对较好，但它们必须适应于复杂的脂质化学及低丰度和不稳定的脂质代谢产物。这种考虑是本领域技术人员很好理解的。所使用的具体提取方法和检测方法取决于，例如，待分离和检测的脂质的数量、待分离和检测的脂质的特定性能及待分离和检测的其中脂质的样品的数量。
固相萃取(SPE)色谱可用于将粗脂质混合物快速、制备性地分离成不同的脂质种类。这涉及使用含有二氧化硅或其它固定相的预装柱以从粗脂质混合物分离甘油磷脂、脂肪酸、胆固醇酯、甘油脂质和甾醇。高效液相色谱法(HPLC或LC)被广泛地使用在脂质组学分析中以在质量分析前分离脂质。可以通过正相HPLC或反相HPLC来实现分离。例如，正相HPLC根据头基极性有效地分离甘油磷脂，而反相HPLC根据链长、不饱和度和取代度有效地分离脂肪酸如类花生酸。脂质的HPLC可以离线或在线执行，其中洗脱液与质谱仪的电离源整合。
一般地可以通过光谱学方法和尤其用于质谱的软电离技术如电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)实现脂质检测。“软”电离不会引起广泛的破碎，从而使在复杂的混合物中整个脂质范围的全面检测可与实验条件或疾病状态相关联。除了ESI和MALDI外，大气压化学电离(APCI)的技术也可用于非极性脂质的分析。
ESI MS可用于脂质的分析，并包括来自极性的、热不稳定的和大多非挥发性分子的气体离子的形成。软电离方法通常不会在质量分析前破坏分析物的化学性质。已经开发了各种ESI-MS方法用于分析来自生物提取物的不同种类、亚类和个别脂质种类且在本领域是已知的。ESI-MS典型地是高度准确的、灵敏的、可重复的，并且可以用于复杂的溶液而不需要事先衍生化。直接将粗脂质提取物注入ESI源(其基于其固有的电特性针对脂质的内源分离优化)可用于复杂混合物的分析。
MALDI质谱分析是通常用于大蛋白质的分析的基于激光的软电离方法，其已经被成功地用于脂质。脂质与基质如2,5-二羟基苯甲酸混合，并作为一个小斑点被施加到样品支持物上。激光被射向该点，且基质吸收能量，其然后被转移到分析物，从而导致该分子的电离。MALDI-飞行时间-(MALDI-TOF)MS已成为用于脂质组学研究的非常有前途的途径，特别是用于来自组织切片的脂质的成像。
APCI类似于ESI，除了离子通过被加热的分析物溶剂与设定在高电势的电晕放电针相互作用形成。在针周围立即形成初级离子，且这些与溶剂相互作用以形成最终电离样品的二级离子。APCI对非极性脂质如甘油三酯、甾醇和脂肪酸酯的分析特别有用。
MALDI方法的最近进展已经使得能够原位直接检测脂质。当在已涂覆有MALDI基质的组织表面上获得连续谱时，从薄组织切片的直接分析产生丰富的脂质相关离子。分子离子的碰撞活化可以被用来确定脂质家族和通常结构上定义分子种类。这种技术使得能够检测在组织如心脏、肾和脑中的磷脂、鞘脂和甘油脂质。此外许多不同的脂质分子种类的分布常常限定这些组织内的解剖区域。
利用细胞模型用于探询式生物评估
本文描述的，以及在国际申请号No.PCT/US2012/027615和PCT/US2012/054321(二者均通过引用并入本文)中所进一步描述的方法和细胞模型可以用于或应用于多种“探询式生物评估”。用于识别心脏中毒相关标志物的特定细胞模型被提供在，例如，PCT/US2012/054323(通过引用并入本文)中。使用本发明的方法用于探询式生物评估有利于识别药物诱导毒性的“调节剂”或决定性细胞过程“驱动者”。
如本文所使用的“探询式生物评估”可包括识别生物系统的一种或多种调节剂，例如，与环境扰动或外部刺激成分相关的决定性细胞过程“驱动者”(例如，生物途径或者该途径的关键成员或者该途径成员的关键调控者的活性的增加或减少)或者在生物系统或过程中特有的独特因果关系。它可以进一步包括被设计来测试或验证所识别的决定性细胞过程驱动者对于与环境扰动或外部刺激成分(包括体内动物模型和/或体外组织培养实验)相关的下游事件是否必要和/或足够的附加步骤。
在一个优选的实施方式中，探询式生物评估是药剂(例如，药物)对细胞、组织、器官或生物体的药物诱导毒理学特征的评估，其中识别的生物系统调节剂，例如，决定性的细胞过程驱动者(例如，在生物系统或过程中独特的细胞交互差异或因果关系)可以是诱导的毒性(例如，药物诱导毒性如心脏毒性)的指示剂，并且可以相应地用来预测或识别药物的毒理学特征。在一个实施方式中，识别的药物诱导毒性调节剂，例如，决定性的细胞过程驱动者(例如，药物诱导毒性特有的细胞交互差异或因果关系)是药物或候选药物的心脏毒性的指示剂，并且随之可以用来预测或确定药物或候选药物的心脏毒性学特征。
预测医学
本发明涉及预测医学领域，其中诊断分析、预后分析、药物基因组学和监测临床试验被用于预后(预测)目的，从而预防性地治疗个体。因此，本发明的一个方面涉及用于测定一种或多种标志物蛋白或核酸的表达水平以确定个体是否具有发生疾病或病症(例如但不限于，心肌病)的风险的诊断分析法。此类分析可用于预后或预测目的，从而在发病前预防性地治疗个体。
本发明的再另一个方面涉及监测药剂(例如，施用用于抑制心肌病或用于治疗或预防任何其他病症(即，为了了解这种治疗可能有的任何心脏毒性)药物或其他化合物)对于临床试验中本发明标志物的表达或活性的影响。在以下节中进一步详细描述这些和其它药剂。
随同本文提交序列表以提供本文所提供的标志物的序列。基因名称、相关联的登录号和相应的核苷酸(偶数)和氨基酸(奇数)SEQ ID NO提供在下表中。所有相关的登录号通过引用引入本文。
本发明的示例说明：
通过下列不应被解释为限制的实施例进一步说明本发明。整个本申请中引用的所有参考文献和公开的专利和专利申请的内容通过引用并入本文。
实施例1：心脏毒性与心肌病的生物标志物的识别
使用基于探询式系统生物学的发现平台获得心脏毒性和心肌病生理知识的机制理解。该平台技术涉及跨系统层级的发现，包括来自前列腺癌患者的基于人细胞的体外模型，及采用基于人工智能(AI)的信息学模块的下游数据集成和数学建模。
作为功能毒性组学(Toxicomics)平台的一部分，申请人开发了各种生理条件下探询的原代心肌细胞的体外模型。另外，将来自七个患者的细胞培养物暴露于心脏毒性药物和表观代谢转变剂(epimetabolic shifter)，辅酶Q10。通过质谱法分析信号传导和代谢的变化。对高通量分子数据进行预处理、标准化并通过贝叶斯网络推理软件进行分析。所得的分子相互作用网络对于与功能端点如耗氧率、ATP产生以及活性氧物质产生的变化直接关联的因果关系进行检验。产生潜在的毒性调节剂和标志物的列举用于进一步在人血清中验证。另外，由心脏毒性化合物的存在影响的分子变量也被分类为用于潜在生物标志物进一步验证。
本文所提供的结果表明，选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、CCDC47、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物的调节与心脏毒性和/或心肌病相关。通过使用平台技术推断这些生物标志物的因果关系，其被详细描述于2012年3月2日提交的WO2012119129和2012年9月7日提交的13/607630号美国申请中，其全部内容在此通过引用明确并入本文。在本申请中，识别心肌病或心脏毒性病理生理学的新驱动者，和然后在患者血清样品中进行验证。
实施例2：候选标志物的统计学性能：生物回收(Bioreclamation)样品集#2
从商业来源获得来自正常个体、患有心肌病、2型糖尿病的个体及用已知心脏毒性药物治疗的2型糖尿病个体的人血清样品。用市售的ELISA试剂盒测定正常和心肌病样品中的标志物组。图1显示了来自正常个体的16个血清样品和来自心肌病患者的9个血清样品的组中候选标志物的性能。这些标志物显示各种预测能力。根据ROC曲线度量(AUC)的个体性能水平的组如下。
生物标志物 AUC
细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 0.792
HMOX1 0.722
IGFBP7 0.660
CCDC47 0.621
PTX3 0.611
IL27 0.569
PAI1.B 0.569
PAI1.A 0.438
在这一样品集中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子是表现最好的生物标志物，而PAI1运行1是表现最差的标志物。由于运行之间的低相关性，对于PAI1的两种ELISA运行被包括在分析中。因为运行之间的高度相关性，只有一个ELISA运行被包括在对于HMOX1的分析中。PAI1.A数据被从后续研究排除。
为了评估最高性能标志物的子集是否能组合地实现最高性能水平，应用逐步逻辑回归。前七位的标志物的逻辑回归模型表现出在正常个体和心肌病患者之间进行区分的优越预测能力，达到0.961的AUC。最优标志物的其它组合显示低等的统计特征，如图2所示。从向前的逐步逻辑回归分析的结论是较低性能的标志物如PAI1.B、PTX3和IL27可能潜在地有助于在较大临床研究中分类器性能的统计学显著的提高。
向后消除逐步逻辑回归被用来检验是否任何候选标志物显示冗余数据和可能不基于组合模型产生患者分层中的任何其他信息。图3中示出了择一模型(one-out model)的统计性能。值得注意的是，消除HMOX1和IGFBP7标志物不导致在AUC值的任何变化，表明该组的其余部分的两个标志物值中存在强冗余。此外，从该组消除HMOX1导致了AIC值的显著减小，其表明6标志物模型(不包括HMOX1)可以是相比于包括整个生物标志物组的7标志物模型更优的模型。同样有趣地注意到，消除任何较低排名的生物标志物导致了分类器性能的显著降低。
实施例3：候选标志物的统计性能：Asterand样品集
在来自Asterand公司的单独样品集中评估其它的标志物。由于该个体集合的变化，这些标志物的性能不能直接与前面的集合相比且它们不能与前面的集合的标志物组合来评估多变量的性能。
图4和下面的表展示了单个生物标志物的性能。
生物标志物 AUC
PTX3 0.592
CFL2 0.595
EDIL3 0.947
NUCB1 0.788
值得注意的是，PTX3蛋白质在这两个样品集中都显示出相当的性能，AUC＝0.611和AUC＝0.592。该EDIL3生物标志物显示出在Asterand样品集中的优越性能。在正常个体和具有诊断的心肌病的患者之间区分的单独EDIL3标志物的预测能力是杰出的，AUC＝0.947。
还通过逻辑回归对于四种生物标志物检验了多变量分类。该四标志物组逻辑回归小幅提高了单独EDIL3的预测能力，具有AUC＝0.96。在无EDIL3的情况下，用剩下的三种生物标志物的回归模型显示某种程度的临床适当的性能，AUC＝0.808。然而，大多数的变异性是由NUCB1标志物说明的，且添加CFL2和/或PTX3仅导致略有改善，其中AUC＝0.788对AUC＝0.808。
根据单变量和多变量统计分析，所有分析的生物标志物具有以不同水平的灵敏度和特异性在来自正常个体和心肌病患者的血清之间区分的预测能力。一些标志物显示出非常高的预测能力，例如，EDIL3、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、NUCB1，而另一些表现出略微的预测能力，例如，PTX3、IL27、CFL2。多变量分析评估了单个标志物和它们的组合的测量中的信息含量。多变量分析表明，HMOX1和IGFBP7相比于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子具有低的附加信息含量，且因此可能不是在生物标志物组中与细胞外基质金属蛋白酶诱导因子组合的最佳标志物。EDIL3单独表现出显著的预测性能，并且明确地是该组中最领先的生物标志物。下表显示了来自初步研究的生物标志物的排名如下。
层1 层2 层3
EDIL3 IGFBP7 HMOX1
细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 CCDC47 IL27
NUCB1 PTX3
API1 CFL2
实施例4：用生物标志物监测心肌病治疗
在诊断心肌病的时候，邀请受试者参与试验。获得受试者样品，例如，对照样品。定期地，在整个监测和治疗受试者期间，获得新的受试者样品。在研究结束时，对于上述的一种或多种生物标志物的水平对所有的受试者样品进行测试。使受试者样品与受试者的病历相匹配以使相应的一种或多种生物标志物的水平与诊断时的心肌病状态、疾病的进展速率和/或受试者对于一种或多种干预的响应相关联。
实施例5：人血清中心脏毒性生物标志物的对比水平
从商业来源获得来自具有2型糖尿病(T2DM)(“组1”)个体和已经用已知引起心脏毒性的糖尿病药物治疗的T2DM个体(“组2”)的人血清样品。通过使用市售的ELISA试剂盒测量来自T2DM个体和药物治疗的T2DM个体的血清样品中心脏毒性生物标志物PTX3和PAI1的蛋白质表达的水平。
测定心脏毒性生物标志物PTX3和PAI1的表达水平和计算组1和组2的各生物标志物的平均表达。然后将各样品中PTX3与PAI1的表达水平表示为对于该组(组1或组2)相应的生物标志物平均表达的百分比，如图6A和6B所示。相比于其他六个药物治疗的T2DM个体(由上部的圆圈表示)，两种药物治疗的T2DM个体表现出升高的PTX3和PAI1表达水平。表现出PTX3和PAI1两者的较高表达水平的这两个药物治疗T2DM个体被证实为患有心肌病。
基于这些观察，本文中鉴定的生物标志物可以用来识别T2DM个体亚群，其当用具有引起心脏毒性的风险或已知引起心脏毒性的糖尿病药物治疗时很容易在治疗期间发生心肌病。此外，本文中识别的生物标志物可以被用于识别T2DM个体或T2DM个体亚群，其当用具有引起心脏毒性的风险或已知引起心脏毒性的糖尿病药物治疗时不易在治疗期间发生心肌病和/或有可能从治疗中获益(例如，超越治疗的心脏毒性副作用的治疗益处)。
实施例6：心脏毒性生物标志物在人血清中的比较水平
从商业来源获得来自正常个体、没有经罗格列酮治疗的2型糖尿病(T2DM)的个体、经罗格列酮治疗的T2DM个体以及具有心肌病的个体的人血清样品。通过使用市售的ELISA试剂盒测定来自这四组个体的血清样品中心脏毒性生物标志物EDIL3和NucB1的蛋白质表达水平。
测定心脏毒性生物标志物EDIL3和NucB1的表达水平和计算每组个体的每个生物标志物的平均表达。然后将各样品中EDIL3和NucB1的表达水平表示为没有用罗格列酮治疗的T2DM个体中相应生物标志物的平均表达的百分比，如图7和8中所示。一些经罗格列酮治疗的T2DM个体相比于其他罗格列酮治疗的T2DM个体表现出降低的EDIL3和NucB1表达水平(由较低的圆圈表示)。如图7和8所示，相比于所有其他三组的个体中EDIL3和NucB1的平均表达水平，心肌病的个体有降低的EDIL3和NucB1平均表达水平(由较低的圆圈表示)。
基于这些观察，本文中识别的生物标志物可用于识别T2DM个体的亚群，其当用具有引起心脏毒性的风险或已知引起心脏毒性的糖尿病药物治疗时很可能在治疗期间发生心肌病。此外，本文中识别的生物标志物可以被用于识别T2DM个体或T2DM个体的亚群，其当用具有引起心脏毒性的风险或已知引起心脏毒性的糖尿病药物治疗时不太可能在治疗期间发生心肌病和/或有可能从治疗中获益(例如，超越治疗的心脏毒性副作用的治疗益处)。
此外，基于这些观察，本文中识别的生物标志物可以被用于识别很可能发生心肌病的个体或个体亚群。此外，本文中识别的生物标志物可以被用于识别个体或个体亚群，其当用具有引起心脏毒性的风险或已知引起心脏毒性的药物治疗时不太可能在治疗期间发生心肌病和/或有可能从治疗中获益(例如，超越治疗的心脏毒性副作用的治疗益处)。
实施例7：使用功能性ToxicOmicsTM平台来识别药物诱导心脏毒性的生物标志物。
本文所提供的平台方法使得能够从人药物诱导器官毒性模型整合多组学印记。此处考虑的该平台性能的实际例子是人药物诱导心脏毒性的情形。人类药物诱导心脏毒性模型由以下组成：i)基于人心肌细胞的心脏毒性体外模型和ii)服用诱导心脏毒性的药物的患者的血清样品。体外模型包括用脂肪酸(亚油酸、油酸和L-肉碱)预处理，随后用药物处理的人心肌细胞。此处考虑的药物是噻唑烷二酮。在体外模型上进行特异性测定功能终点(即线粒体ATP、ROS、细胞存活力和线粒体生物能量学)的基于细胞的分析法。
如在以前的报告中提到的，使用来自Thermo Scientific的LTQ Orbitrap进行蛋白质组学。使用来自thermo的TSQ vantage EMR三Quad质谱进行Shortgun脂质组学。
使用Bayesian Network Inference算法进行数据的整合来生成基于他们的联合概率分布(JPD)的分子实体潜在关联图谱。生成以下类型的网络。
i)来自体外模型的单独蛋白质组学网络
ii)来自体外模型的蛋白质组学+端点分析(线粒体ATP、ROS、细胞存活力和线粒体生物能量学)
iii)仅来自血清的脂质组学和
iv)血清脂质网与颗粒脂质网络的交叉验证模型
v)来自体外模型的结合蛋白质组学和脂质组学输出的多组学网络
从体外模型(颗粒)和血清脂质分析产生脂质网络
血清数据
脂质组学血清数据集的预BNI产生244种脂质和71个样品。实验的设计矩阵示于下表中。随后是合并、标准化和归因的标准程序。这些步骤的质量控制图包括在所附折页(folder)中。
表4：CM血清脂质组学数据的设计矩阵
心肌细胞数据
脂质组学血清数据集的预BNI产生259种脂质和41个样品。实验的设计矩阵示于表中。随后是合并、标准化和归因的标准程序。这些步骤的质量控制图包括在所附折页中。
表5：CM粒脂质组学数据的设计矩阵
BNI和Δ网络
血清网络
列举产生469384个片段。在优化过程中产生1000套网络。待比较的条件是：糖尿病、无治疗、CM和糖尿病、无治疗和无CM。进行模拟以：
1.获得基线表达的差异
2.识别两个条件的模拟网络的Δ
图9A中示出含有连接29种脂质的20个边缘的Δ网络(CM–无CM)。
心肌细胞网络
列举产生934782个片段。在优化过程中产生1000套网络。待比较的条件是：罗格列酮治疗和对照。进行模拟以识别两个条件的模拟网络的Δ。
Δ网络(罗格列酮-对照)包含连接64种脂质的75个边缘。Δ网络的概略显示在图9B中。
血清脂质网络和颗粒脂质网络共有的脂质的定量。如图10A所示，与仅糖尿病和服用罗格列酮而无心肌病的糖尿病相比，PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3在服用罗格列酮的具有心肌病临床诊断的糖尿病受试者中显著降低。在图10B中脂质水平表示为正常脂质水平的百分比。
来自平台的多组学输出。蓝色菱形代表脂质种类，正方形是蛋白质和六边形是与活性中枢因果相关的激酶。中枢-CACNA2D1是L型钙通道，与MAP2K3和PRKAR2A(激酶)、BAX(线粒体蛋白)、EPHX1(微粒体蛋白)和PC Li-183-D18:2-22:6(磷脂酰胆碱)相关。Δ多组学输出在体外毒性模型中提供非常强大的分子事件的概况，如图11所示。
通过脂质组学分析对用罗格列酮治疗的患者分层识别的标志物
对来自70个患者的血清样品进行总体脂质组学的盲法分析用以产生基于治疗策略的网络，其相对于患者是否用罗格列酮治疗进行事后分析。采用探询式生物学固有的计算能力，我们利用蛋白质组学和脂质组学数据来推断条件之间的因果关系而生成多组学网络。探询式生物学识别的关键脂质组学中枢的检验强调通用的共同生物关联，其中65％以上的生物标志物的分子种类存在于乙醇胺甘油磷脂中，这些标志物的88％被鉴定为缩醛磷脂，几乎所有那些含有用于氧化代谢产物的不同前体，其证明补偿性生理作用效用的趋异平衡。识别乙醇胺甘油磷脂中关键脂质组学中枢之后，在对照、对照心肌病、糖尿病、糖尿病性心肌病、糖尿病罗格列酮无心肌病、糖尿病罗格列酮心肌病之间进行患者分层中不同病因学的进一步剖析，其识别浆油烯基乙醇胺(plasmolenylethanolamine)分子种类内的特定模式。
在根据关于罗格列酮的临床疗效的患者组分层时，分离三种不同的病因用于比较，其包括糖尿病、糖尿病罗格列酮无心肌病和糖尿病罗格列酮心肌病。因为，罗格列酮治疗的功效靶向糖尿病患者中过氧化物酶体代谢的调节，了解乙醇胺甘油缩醛磷脂含量的分层被用于评估与糖尿病患者中罗格列酮诱导心肌病相关的水平。因此，P16:0-20:4、D18:0-18:2、P16:0-22:6、P18:0-20:4和D18:0-20:4全部与罗格列酮治疗一起分层且进一步用心肌病分层。因为18:2、20:4和22:6氧化产物的产生在调节生理学中相互抵消，血清脂质组中确定的这些固有变化表明起因于磷脂酶靶向的特定分子种类的信号传导脂质产生的前体的改变。
用于罗格列酮治疗的患者分层的治疗策略或生物标志物评估
代表糖尿病诱导的过氧化物酶应激、药物治疗的指示剂以及代表影响脉管血流动力学的脂质诱导信号传导的生理轴的脂质分子种类的识别是至关重要的。在这里，我们证明功能性显著分子种类的耗尽，其证明通过底物输送治疗的治疗途径或可选地用作生物标志物以基于其几种标志物的水平确定是否病人应该或不应该用罗格列酮治疗。此外，通过探询式生物学识别的脂质分子种类代表心肌中的主要种类。尽管在血清中天然不充裕，识别的分子种类反映功能失调的心肌过氧化物酶体代谢，因为血液代表其中组织与脉管系统连接的管道。这一信息的利用提供了理解罗格列酮诱导的或对脂肪酸代谢的效应引起的基础心脏毒性机制的治疗、生物标志物以及功能性探索的几种途径。
实施例8：如在病例对照研究中证明的血清中CCDC47是心肌病的预测生物标志物
从商业来源获得来自用各种药物治疗的2型糖尿病(T2D)和/或心肌病的个体及适当的对照受试者(总共n＝120)的人血清样品。该组的特征如下：
*显著的
使用市售的ELISA试剂盒，在来自T2DM个体和药物治疗的T2DM个体的血清样品中测量心肌病蛋白质生物标志物CCDC47的水平。使用制造商的说明书进行分析。执行ROC分析以确定是否血清CCDC47水平与心肌病相关。该分析的结果示于图12A和B中。图12A示出升高的血清CCDC47的存在与患T2D的受试者中心肌病之间存在可测量的相关性(AUC＝0.6770，T2D，无心肌病与T2D，心肌病)。然而，用罗格列酮治疗的患T2D与心肌病的受试者与没有用罗格列酮治疗的患T2D与心肌病的受试者相比较升高的血清CCDC47之间有很强的相关性(AUC＝0.9075，T2D，心肌病与用罗格列酮治疗的T2D，心肌病)。这些结果表明，CCDC47是区分正常受试者(无2型糖尿病，无心肌病)与患有心肌病的受试者(无2型糖尿病)的良好预测子。此外，这些结果表明，CCDC47是区分用罗格列酮以外的药剂(例如，二甲双胍，阿托伐他汀)治疗的患有心肌病的2型糖尿病受试者与用罗格列酮治疗的患心肌病的2型糖尿病受试者的优良预测子。这些结果表明，CCDC47在心肌病和在用已知诱导心肌病的药剂治疗的受试者中升高。
图13A-C示出受试者的血清中以pg/ml计的CCDC47浓度的散点图，其中该受试者没有用或用(A)二甲双胍或阿托伐他汀相对罗格列酮，(B)罗格列酮或阿托伐他汀相对二甲双胍；和(C)二甲双胍或罗格列酮相对阿托伐他汀治疗。A显示，与用二甲双胍或阿托伐他汀治疗的受试者相比较，用罗格列酮治疗的受试者的血清中CCDC47的水平显著提高(p＝3.61×10-8)。在用罗格列酮或阿托伐他汀相对二甲双胍；或用二甲双胍或罗格列酮相对阿托伐他汀治疗的受试者的CCDC47血清水平中没有观察到显著的差异(分别为P值＝0.26和0.19)。
实施例9：如在病例对照研究中证明的CCDC47、IGFBP7和PC-Li-183-D18:2-22:6作为血清中心肌病的预测生物标志物
从商业来源获得来自具有2型糖尿病(T2D)的个体(n＝200)的人血清样品。上面提供了该组的特征。使用市售的ELISA试剂盒，在来自T2DM个体和药物治疗的T2DM个体的血清样品中测定心肌病蛋白质标志物CCDC47和IGFBP7的水平。使用制造商的说明书进行该分析。使用TSQ Vantage EMR Triple Quadrapole与advion nanomate在相同血清样品中测定脂质PC-Li-183-D18:2-22:6的水平。执行ROC分析以确定在用罗格列酮治疗的患有2型糖尿病的受试者中，血清CCDC47和IGFBP7水平或血清CCDC47、IGFBP7和PC-Li-183-D18:2-22:6水平是否与包括心力衰竭的不良心脏事件的增加的发生率相关。该分析的结果示于图14中。图14示出升高的血清CCDC47和IGFBP7水平(AUC＝0.67)的存在与包括心力衰竭的不良心脏事件的发生率之间有可测量的相关性，或和升高的血清CCDC47、IGFBP7和PC-Li-183-D18:2-22:6(AUC＝0.78)的存在与包括心力衰竭的不良心脏事件之间的发生性存在更强的相关性。这些结果表明，在用罗格列酮治疗的患有2型糖尿病的受试者中，CCDC47和IGFBP7水平的组合是不良事件的良好的预测子，并表明进一步包括PC-Li-183-D18:2-22:6水平增加了该分析结果的可预测性。
实施例10：识别在治疗期间很可能发生药物诱导心肌病的患者亚群
当指定用已知引起心肌病的药物治疗时，受试者被邀请参与试验。获得受试者样品，例如，对照样品。定期地，在监测和治疗受试者的整个过程中，获得新的受试者样品。在研究结束时，测试所有受试者样品的上述一种或多种生物标志物的水平。使受试者样品与受试者的病历相匹配以将相应的一种或多种生物标志物的水平(和/或其改变)与药物诱导心肌病的发生和/或受试者对药物治疗的反应关联。可选地，分析在监测和治疗受试者的整个过程中获得的受试者样品中上述一种或多种生物标志物的水平，并与对照群体(例如，具有类似的疾病和还没有经过任何治疗或者具有类似的疾病和用不引起心脏毒性的不同药物治疗的受试者群体，或正常健康受试者群体)中一种或多种生物标志物的平均水平相比较。
进一步验证为与药物诱导心脏毒性的发生相关的表达调节的标志物可用于在心脏毒性的生理表现被检测到之前很久，在用药物(如，已知导致心脏毒性或已知具有引起心脏毒性的风险的药物)治疗的早期识别受试者为具有发生心脏毒性的风险。因此受试者的该药物治疗可以终止和/或可推荐、指定或施用替代疗法。
等同：
本领域的技术人员可以认识到或者能够只使用常规实验确定许多本文所述的具体的实施方式和方法的等同方式。这些等同方式意在被包含在以下的权利要求的范围中。

Claims (65)

1.一种或多种心肌病相关生物标志物在制备用于诊断受试者中的心肌病的检测试剂中的用途，其中所述诊断包括：
(i)检测来自所述受试者的血清样品中包括CCDC47的所述一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平；和
(ii)将来自所述受试者的血清样品中所述一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平与对照样品中相应的一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平相比较，
其中所述血清样品中一种或多种心肌病相关生物标志物相对于所述对照样品的提高的蛋白质表达水平是该受试者患有心肌病的指示。
2.一种或多种心肌病相关生物标志物在制备用于识别受试者为处于患心肌病的增加的风险中的检测试剂中的用途，其中所述识别包括：
(i)检测来自所述受试者的血清样品中包括CCDC47的所述一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平；和
(ii)将来自所述受试者的血清样品中的所述一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平与对照样品中相应的一种或多种生物标志物的蛋白质表达水平相比较，
其中所述血清样品中所述一种或多种心肌病相关生物标志物相对于所述对照样品的提高的蛋白质表达水平是该受试者处于患心肌病的增加的风险中的指示。
3.一种或多种心肌病相关生物标志物在制备用于在受试者中监测心肌病的检测试剂中的用途，其中所述监测包括：
(i)检测在第一时间从患有心肌病的受试者获得的第一血清样品中包括CCDC47的所述一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平；
(ii)检测在第二时间从所述受试者获得的第二血清样品中所述一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平，其中所述第二时间晚于所述第一时间；和
(iii)将所述第二样品中一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平与所述第一样品中一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平相比较，
其中与所述第一样品相比，该第二样品中所述一种或多种心肌病相关生物标志物的水平的提高是所述受试者中心肌病进展的指示。
4.一种或多种心肌病相关生物标志物在制备用于在受试者中监测心肌病的治疗的检测试剂中的用途，其中所述监测包括：
(i)检测在向所述受试者施用至少一部分治疗方案前从受试者获得的第一血清样品中包括CCDC47的所述一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平；
(ii)检测在向所述受试者施用至少一部分治疗方案后从受试者获得的第二血清样品中所述一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平；和
(iii)将在向所述受试者施用至少一部分治疗方案前获得的所述第一样品中所述一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平与在向所述受试者施用至少一部分治疗方案后从受试者获得的所述第二样品中所述一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平相比较，
其中与所述第一样品中在向所述受试者施用至少一部分治疗方案前从受试者获得的所述一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平相比，所述第二样品中在向所述受试者施用至少一部分治疗方案后从受试者获得的所述一种或多种心肌病相关生物标志物的降低的蛋白质表达水平指示该治疗方案用于治疗所述受试者中的心肌病是有效的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中心肌病为选自于扩张型心肌病、肥厚性心肌病、限制型心肌病和致心律失常性右心室发育不良中的至少一种病症。
6.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中心肌病包括选自于延长的QT间期、心律失常、心肌缺血、高血压和血栓栓塞性并发症，心肌功能障碍、心肌病、心力衰竭、心房纤颤、心肌病和心力衰竭、心力衰竭和左心室功能障碍、心房扑动和颤动、心脏瓣膜损伤和心力衰竭中的至少一种病症。
7.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述心肌病是遗传性心肌病。
8.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述心肌病是后天性心肌病。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述后天性心肌病是在所述受试者中一种或多种另外的疾病或状况的合并症。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述受试者中一种或多种另外的疾病或病症选自于冠状动脉心脏病、心脏病发作、高血压、糖尿病、甲状腺疾病、病毒性肝炎、HIVl、使心肌发炎的病毒感染、血色素沉着症、结节病、淀粉样变性和结缔组织病症。
11.如权利要求8所述的用途，其中所述后天性心肌病是受试者暴露于心脏毒素的结果。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述心脏毒素是环境心脏毒素。
13.如权利要求11所述的用途，其中所述心脏毒素是心脏毒性药物。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述心脏毒性药物选自于过量酒精、安非他明、抗癌药物、化疗药物、糖尿病药物、神经药物、抗炎药、二膦酸盐和TNF拮抗剂。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述抗癌药物选自于顺铂、阿霉素、柔红霉素、蒽环类药物、5-氟尿嘧啶、曲妥珠单抗或吉西他滨。
16.如权利要求14所述的用途，其中所述糖尿病药物选自于罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮和卡麦角林。
17.如权利要求13所述的用途，其中所述心脏毒性药物是培高利特或舒马曲坦。
18.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27、PAI1、CFL2、EDIL3和NUCB1的一种或多种生物标志物。
19.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括HMOX1。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括PTX3。
21.如权利要求19所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括PAI1。
22.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PED16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3；和PC-LI-183-D18:22-22:6的至少一种脂质生物标志物。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述脂质包括PC-LI-183-D18:2-22:6。
24.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HMOX1、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAI1、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA的至少一种心肌病相关生物标志物。
25.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括EDIL3。
26.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。
27.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括NUCB1。
28.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1。
29.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1。
30.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、PTX3、IL27和PAI1。
31.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1。
32.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3、IL27和PAI1。
33.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、IL27和PAI1。
34.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7、PTX3和IL27。
35.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1、IGFBP7和PTX3。
36.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1和IGFBP7。
37.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、HMOX1和IGFBP7。
38.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和HMOX1。
39.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括EDIL3、NUCB1、CFL2和PTX3。
40.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括NUCB1、CFL2和PTX3。
41.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括NUCB1和PTX3。
42.如权利要求24所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括NUCB1和CFL2。
43.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平使用选自于蛋白质印迹分析、免疫组织化学、免疫荧光化学、流式细胞术、ELISA、质谱及其组合。
44.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物的蛋白质表达水平通过使用抗体测定。
45.用于检测方法中的试剂组，该试剂组包含至少两种检测试剂，其中每种检测试剂对于一组心肌病相关生物标志物的至少一种心肌病相关生物标志物的检测是特异性的，其中该组心肌病相关生物标志物包括CCDC47及选自于IL27、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PED16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的一种或多种心肌病相关生物标志物。
46.如权利要求45所述的试剂组，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物选自于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、IL27、EDIL3和NUCB1。
47.如权利要求45-46中任一项所述的试剂组，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括选自于PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的至少一种脂质生物标志物。
48.如权利要求47所述的试剂组，其中所述脂质包括PC-Li-183-D18:2-22:6。
49.如权利要求45-46中任一项所述的试剂组，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物还包括选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA的至少一种心肌病相关生物标志物。
50.如权利要求45-46中任一项所述的试剂组，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物包括EDIL3。
51.如权利要求45-46中任一项所述的试剂组，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。
52.如权利要求45-46中任一项所述的试剂组，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物包括NUCB1。
53.如权利要求45-46中任一项所述的试剂组，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和IL27。
54.如权利要求47-51中任一项所述的试剂组，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物包括IL27。
55.如权利要求45-46中任一项所述的试剂组，其中所述一种或多种心肌病相关生物标志物包括EDIL3和NUCB1。
56.一种用于诊断、监测或表征受试者中的心肌病的试剂盒，其包含：
至少两种试剂，其中各试剂是对于一组心肌病相关生物标志物的至少一种心肌病相关生物标志物的水平的检测特异性的试剂，其中该组心肌病相关标志物包括CCDC47及选自于IL27、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、EDIL3、NUCB1、PE D18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PE P18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的一种或多种心肌病相关生物标志物。
57.如权利要求56所述的试剂盒，其中该组心肌病相关生物标志物还包括选自于PED18:0-20:3/D18:1-20:2/D16:0-22:3；PE D18:0-22:5/D18:1-22:4；PE D16:1-22:6；PEP18:1-18:1/P18:0-18:2/P16:0-20:2；LPC 20:3和PC-LI-183-D18:22-22:6的至少一种脂质生物标志物。
58.如权利要求57所述的试剂盒，其中所述脂质包括PC-Li-183-D18:2-22:6。
59.如权利要求56所述的试剂盒，其中该组心肌病相关生物标志物还包括选自于1A69、1C17、ACBD3、ACLY、ACTR2、ANXA6、ANXA7、AP2A1、ARCN1、ASNA1、ATAD3A、ATP5A、ATP5B、ATP5D、ATP5F1、ATP5H、ATPIF1、BSG、C14orf166、CA2D1、CAPN1、CAPZA2、CARS、CCDC22、CCT7、CLIC4、CMPK1、CNN2、CO1A2、CO6A1、COTL1、COX6B1、CRTAP、CS010、CTSA、CTSB、CYB5、DDX1、DDX17、DDX18、DLD、EDIL3、EHD2、EIF4A3、ENO2、EPHX1、ETFA、FERMT2、FINC、FKB10、FKBP2、FLNC、G3BP2、GOLGA3、GPAT1、GPSN2、GRP75、GRP78、HNRNPD、HNRNPH1、HNRPG、HPX、HSP76、HSP90AB1、HSPA1A、HSPA4、HSPA9、IBP7、IDH1、IQGAP1、ITB1、ITGB1、KARS、KIF5B、KPNA3、KPNB1、LAMC1、LGALS1、LMO7、M6PRBP1、MACF1、MAP1B、MARS、MDH1、MPR1、MTHFD1、MYH10、NCL、NHP2L1、NUCB1、OLA1、P08621、P3H1、P4HA2、P4HB、SEC61A1(P61619)、PAPSS2、PCBP2、PDCD6、PDIA1、PDIA3、PDIA3、PDIA4、PDLIM7、PEBP1、PFKM、PH4B、PLIN2、POFUT1、PRKDC、PSMA1、PSMA7、PSMD12、PSMD3、PSMD4、PSMD6、PSME2、PTBP1、Q9BQE5、Q9Y262、RAB1B、RP515A、RPL32、RPL7A、RPL8、RPS25、RPS6、RRAS2、RRP1、SAR1B、SDHA、SENP1、SEPT11、SEPT7、SERPH、SERPINE1、SFRS2、SH3BGRL、SNRPB、SNX12、SOD1、SPRC、ST13、SUB1、SYNCRIP、TAGLN、TAZ、TGM2、TIMP1、TLN1、TPM4、TRAP1、TSP1、TTLL12、TXNDC12、UBA1C、UGDH、UGP2、UQCRH、VAMP3和VAPA的至少一种心肌病相关生物标志物。
60.如权利要求56-59中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种心肌病相关生物标志物还包括EDIL3。
61.如权利要求56-59中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种心肌病相关生物标志物还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。
62.如权利要求56-59中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种心肌病相关生物标志物还包括NUCB1。
63.如权利要求56-59中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种心肌病相关生物标志物还包括细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和IL27。
64.如权利要求56-59中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种心肌病相关生物标志物还包括IL27。
65.如权利要求56-59中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种心肌病相关生物标志物还包括EDIL3和NUCB1。
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