WO2005080981A1 - 血管障害の程度の判定方法 - Google Patents

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WO2005080981A1
WO2005080981A1 PCT/JP2005/003029 JP2005003029W WO2005080981A1 WO 2005080981 A1 WO2005080981 A1 WO 2005080981A1 JP 2005003029 W JP2005003029 W JP 2005003029W WO 2005080981 A1 WO2005080981 A1 WO 2005080981A1
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WO
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ptx3
antibody
protein
cells
vascular
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Application number
PCT/JP2005/003029
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English (en)
French (fr)
Inventor
Tatsuhiko Kodama
Takao Hamakubo
Yukio Ito
Hiroko Iwanari
Masao Ohkuchi
Akira Sugiyama
Original Assignee
Perseus Proteomics Inc.
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
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    • G—PHYSICS
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/328—Vasculitis, i.e. inflammation of blood vessels

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the degree of a vascular disorder and a method for screening a therapeutic agent for a vascular disorder.
  • PTX3 also known as Pentraxin, Pentaxin, TSG-14, MPTX3, belongs to the pentraxin family discovered as being expressed on human umbilical cord endothelial cells stimulated with interleukin 1 (IL 1) It is a secreted protein (Non-Patent Document 1).
  • the pentraxin family includes C reactive proteins (CRP) and serum amyloid P component (SAP) known as inflammatory proteins; ⁇ .
  • CRP C reactive proteins
  • SAP serum amyloid P component
  • Pentraxin is also known as Long Pentraxin, and CRP is also called Short Pentraxin.
  • Pentraxin is a name derived from having a CRP sequence in its structure, and is presumed to function as an inflammatory protein.
  • PTX3 is not induced by IL-6.
  • cell types that express the PTX3 protein are also different from CRP and SAP, suggesting that PTX3 also has a different function from CRP and SAP (Non-Patent Document 2).
  • inflammation covers a wide range and includes dermatitis, inflammation of various organs, and the like. Among them, vascular inflammation leads to serious diseases such as heart disease and brain disease.
  • risk factors for acute myocardial infarction include high blood total cholesterol, hypertension, diabetes, obesity, and smoking.
  • high total cholesterol in blood not only diet therapy but also various statins are used as hypolipidemic agents to eliminate this risk factor.
  • Brain diseases include dementia due to vascular disorders, and treatment with aspirin Has been done.
  • Non-Patent Document 3 As a conventional method for measuring PTX3, a method based on the ELISA method described in Non-Patent Document 3 is known. In this assay, the PTX3 concentration reached a maximum of 22 ng / mL at 7.5 hours after a myocardial infarction attack, and then decreased sharply to a level of 0.5 in normal subjects who did not appear to have heart disease. 2. It is stated that it will be 5 ngZmL. As described above, according to the conventional PTX3 measurement results, it is known that the PTX3 concentration in the blood is increased only during a myocardial infarction attack. I don't really know how the concentration changes!
  • Statin and antipyretic analgesic aspirin which are therapeutic agents for vascular disorders, are known as therapeutic agents for vascular disorders. Epidemiologic studies have shown that they improve vascular disorders. There are no drugs developed for the treatment of vascular disorders.
  • Non-patent literature l Breviorio et al .: J. Biol. Chem., 267 (31), 22190-7 (1992)
  • Non-Patent Document 2 J. Biol. Chem., 267 (31), 22190-7 (1992); Domyaku Koka (Arteriosclerosis), 24 (7-8), 375-80 (1996)
  • Non-Patent Document 3 Arthritis and Rheumatism, 44/12 (2841-50), 2001, Circulation, 102, 636-41 (2000), Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002; 22: el0-el4
  • the degree of vascular damage before myocardial infarction or cerebrovascular dementia can be determined, the degree of heart disease or cerebrovascular disease can be diagnosed, and the therapeutic effect of a therapeutic agent for heart disease or a therapeutic agent for cerebrovascular disease can be determined. Can be determined. In addition, if a system that can determine the degree of vascular disorders can be developed, screening for therapeutic drugs for vascular disorders will be possible.
  • an object of the present invention is to provide a method for determining the degree of vascular injury as a risk factor for myocardial infarction and cerebrovascular dementia and a method for screening a therapeutic agent for vascular injury.
  • PTX3 concentration which was considered to increase only in the acute phase during a stroke of myocardial infarction, and studied statins and aspirin known to treat vascular disorders.
  • the blood PTX3 protein concentration was measured before and after their administration, and the PTX3 concentration was clearly reduced after administration of these drugs.
  • the measurement of plasma PTX3 concentration in patients with myocardial infarction and stable angina and unstable angina, which is considered to be a precursor disease showed that PTX3 concentration was clearly higher in proportion to the severity of vascular disorders.
  • PTX3 is a diagnostic marker having high specificity for blood vessels, which is not a diagnostic marker for a systemic inflammatory response, and is useful for knowing the degree of injury.
  • this method can be used as a screening method for a therapeutic drug for vascular disorders, and completed the present invention.
  • a new anti-PTX3 antibody was prepared and a high-sensitivity measurement system was established, and PTX3 in serum was measured before and after statin administration and before and after aspirin administration, and a decrease in PTX3 after administration was confirmed.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention provides a method for determining the degree of vascular injury, which comprises measuring the concentration of PTX3 in a test sample.
  • the present invention also provides a diagnostic agent for the degree of vascular disorder containing an anti-PTX3 antibody.
  • the present invention provides a method for screening a therapeutic agent for vascular disorders, which comprises administering or contacting a test substance to an animal or a cell, and measuring a change in PTX3 protein or PTX3 gene amount.
  • the present invention it is possible to diagnose the degree of vascular damage before the onset of acute myocardial infarction, vascular dementia, etc., thereby diagnosing the degree of heart disease or cerebrovascular disease, and And a shift to brain disease can be prevented. Also, blood vessels due to drug treatment Provides guidance on treatment of disorders. In addition, new therapeutic agents for cardiovascular and cerebrovascular disorders can be screened.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of comparison between recombinant PTX3 and native PTX3 by Western blotting.
  • FIG. 2 is a view showing a plurality of newly constructed ELISA standard curves.
  • FIG. 3 is a diagram showing a comparison between a newly constructed PTX3 measurement system provided for clinical sample measurement and a conventional PTX3 measurement system.
  • FIG. 4 is a view showing the measurement results of PTX3 in the blood of a heart disease patient.
  • the measurement includes a quantitative or non-quantitative measurement.
  • the non-quantitative measurement it is simply determined whether or not the PTX3 protein is present, or the PTX3 protein is present in a certain amount or more. Measurement, comparing the amount of PTX3 protein with other samples (for example, control samples), and the like.
  • Quantitative measurement includes measurement of PTX3 protein concentration, PTX3 protein And the like can be used.
  • the nucleotide sequence of the PTX3 gene is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the PTX3 protein is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the test sample is not particularly limited as long as it is a sample that may contain the protein of PTX3, but a sample obtained by collecting the physical strength of an organism such as a mammal is preferable, and a sample obtained from human is more preferable.
  • Sample Specific examples of the test sample include, for example, blood, interstitial fluid, plasma, extravascular fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, serum, lymph, saliva, urine, etc. Preferred are blood, serum and plasma.
  • a sample obtained from a test sample such as a culture solution of cells collected from an organism, is also included in the test sample of the present invention.
  • Vascular damage is a process that involves damage to vascular endothelial cells, migration of vascular medial smooth muscle cells, accumulation of macrophages, foaming, thrombus adhesion, plaque formation, vascular fibrosis, and plaque rupture. And severe disease.
  • vascular disorders in the present invention include hyperlipidemia and brain disease, as well as hypertension. Includes vascular disorders caused by disease, diabetes, obesity and smoking.
  • the degree of the vascular disorder refers to the degree of the disorder accompanying the progression of the vascular disorder. That is, the vascular disorder following the above-mentioned progression process is histopathologically shown as a measure of the extent to which the plaque ruptures finally. (a) the size of the lipid core, (b) the thickness of the fibrous cap, (c) the intensity of shear stress, (d) the degree of infiltration of inflammatory cells, and (a) the larger the The thinner (b), the stronger (c), and the stronger (d), the more plaque-bursting is. Therefore, the degree of vascular damage in the present invention refers to the above (a) to (d).
  • the measurement of PTX3 is preferably an immunoassay using an anti-PTX3 antibody.
  • the measurement method using the anti-PTX3 antibody will be described in detail.
  • the anti-PTX3 antibody used in the present invention may be of any type as long as it specifically binds to the PTX3 protein, regardless of its origin, type (monoclonal or polyclonal) and shape.
  • known antibodies such as a mouse antibody, a rat antibody, a human antibody, a chimeric antibody, and a humanized antibody can be used.
  • the antibody may be a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the anti-PTX3 antibody immobilized on the support and the anti-PTX3 antibody labeled with a labeling substance may recognize the same epitope of the PTX3 molecule, but preferably recognize different epitopes.
  • the anti-PTX3 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammal-derived monoclonal antibody is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by hybridomas and those produced by hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be basically produced as follows using a known technique. That is, PTX3 is used as a sensitizing antigen, immunized with the usual immunization method, the obtained immunocytes are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and monoclonal antibodies are obtained by a normal screening method.
  • Antibody-producing cells It can be prepared by screening.
  • a monoclonal antibody may be prepared as follows.
  • PTX3 which is used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody, is obtained by purifying the available cell culture supernatant. Alternatively, it can be obtained according to the method disclosed in JP-T-2002-503642.
  • this purified PTX3 protein is used as a sensitizing antigen.
  • a partial peptide of PTX3 can be used as a sensitizing antigen.
  • the partial peptide can be obtained by chemical synthesis from the amino acid sequence of human PTX3, or can be obtained by incorporating a part of the PTX3 gene into an expression vector, and further, natural PTX3 can be decomposed by a protease. Can also be obtained.
  • the portion and size of PTX3 used as a partial peptide are not limited.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but it is generally preferable to select a mammal in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Rodents animals, for example, mice, rats, genotypes, musters, or egrets and monkeys are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted and suspended in an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, and then mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified.
  • a suitable carrier can be used at the time of immunization with the sensitizing antigen.
  • a partial peptide having a small molecular weight is used as a sensitizing antigen, it is preferable to immunize albumin or keyhole limpet by binding to a carrier protein such as mosine.
  • the mammal After immunizing a mammal in this way and confirming that the level of the desired antibody in the serum increases, the mammal is also harvested for immune cells and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells are And especially splenocytes.
  • Mammalian myeloma cells are used as the other parent cells to be fused with the immune cells.
  • the myeloma cells can be obtained from various known cell lines, for example, P3 (P3x63Ag8.653) ( J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. DH et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M.
  • the cell fusion of the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Kohler and Milstein, et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73 , 3-46).
  • the cell fusion is carried out, for example, in a normal nutrient medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to enhance the fusion efficiency.
  • the ratio of the use of the immune cells to the myeloma cells can be arbitrarily set. For example, it is preferable that the number of immune cells be 110 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, an RPMI1640 culture medium, a MEM culture medium suitable for the growth of the myeloma cell line, and other ordinary culture mediums used for this kind of cell culture can be used. Further, a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • polyethylene glycol (for example, having an average molecular weight of 1,000 to 6000) is prepared by mixing a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells in the culture solution and heating the mixture to about 37 ° C in advance.
  • the solution is usually added at a concentration of 30-60% (w / v) and mixed to form the desired fused cells (hybridomas).
  • an operation of successively adding an appropriate culture medium and centrifuging to remove the supernatant is repeated to remove the cell fusion agent and the like which are favorable for the growth of the hybridoma.
  • the thus obtained hybridoma can be used in a usual selective culture medium, for example, a HAT culture medium.
  • a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine Selected.
  • the culturing in the HAT culture solution is continued for a time (usually several days to several weeks) sufficient for the death of cells (non-fused cells) other than the target hybridoma.
  • the usual limiting dilution method is performed, and screening and single-cloning of the hybridoma producing the desired antibody are performed.
  • Screening and single-cloning of the desired antibody may be performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • the antigen is bound to a carrier such as beads made of polystyrene or a commercially available 96-well microtiter plate, reacted with the culture supernatant of the hybridoma, washed with the carrier, and reacted with an enzyme-labeled secondary antibody, etc.
  • a hybridoma producing the desired antibody can be cloned by a limiting dilution method or the like. At this time, the antigen used for immunization may be used.
  • the thus-produced monoclonal antibody producing hybridomas can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored in liquid nitrogen for a long period of time. .
  • the hybridoma is obtained by culturing the hybridoma according to a usual method and obtaining a culture supernatant thereof, or administering the hybridoma to a mammal compatible therewith. Then, a method of obtaining the ascites is used.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • the antibody gene is cloned into a hybridoma.
  • a recombinant vector can be used, which is inserted into an appropriate vector, introduced into a host, and produced using a gene recombination technique (for example, Vandamme, AM et al., Eur. J Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990).
  • mRNA encoding the variable (V) region of the anti-PTX3 antibody is isolated from the hybridoma producing the anti-PTX3 antibody.
  • the mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) is used to prepare total RNA, and then the desired mRNA is prepared using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Alternatively, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA of the antibody V region is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase. Synthesis of cDNA is performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Seikagaku Corporation) or the like. In order to synthesize and amplify cDNA, the 5, -RACE method using the 5,-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and PCR (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Scad. USA (1988) 85, 8 998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) and the like can be used.
  • a target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated to a vector DNA.
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli or the like, and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector. Then, the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, a dideoxynucleotide chain termination method or the like.
  • the DNA is inserted into an expression vector containing the DNA encoding the desired antibody constant region (C region).
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter.
  • an expression control region for example, an enhancer or a promoter.
  • host cells are transformed with this expression vector to express the antibody.
  • Antibody gene expression is determined by separating the DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain).
  • the host cells may be co-transformed by incorporating them into an expression vector, or the host cells may be transformed by incorporating DNA encoding the H chain and L chain into a single expression vector (W094Z11523). No.).
  • transgenic animals that can use not only the above host cells but also can be used.
  • an antibody gene is inserted into a gene encoding a protein (eg, goat ⁇ -casein) that is specifically produced in milk to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • Embryo-accepted goats The milk produced by the born transgeneic goat or its offspring also produces the desired antibodies.
  • Hormones may also be used in transgenic enigma as appropriate in order to increase the amount of milk containing the desired antibody that is also produced by transgenic energetics (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1 994) 12, 699—702).
  • artificially modified recombinant antibodies for example, chimeric antibodies and humanized antibodies can be used. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • the chimeric antibody is produced by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with the DNA encoding the human antibody C region, incorporating the DNA into an expression vector, introducing the resulting vector into a host, and producing the chimeric antibody. Obtained from this. Using this known method, a chimeric antibody useful in the present invention can be obtained.
  • the humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, which is used to replace the complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal, for example, a mouse antibody. It has been transplanted into the complementarity determining region, and its general gene recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, W096Z02576).
  • a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody has a portion overlapping both terminal regions of both the CDR and FR.
  • FR framework region
  • a region in which the complementarity determining region forms a favorable antigen-binding site is selected. If necessary, the amino acids of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. (19 93) 53, 851— 856) Q
  • C region of the chimeric antibody and the humanized antibody those of a human antibody are used.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, and C ⁇ 4 are used for the H chain, and C ⁇ , C ⁇ can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • a chimeric antibody works with the variable region of an antibody derived from a mammal other than human and the constant region derived from a human antibody.
  • a humanized antibody is composed of a complementarity determining region of an antibody derived from a mammal other than human, a framework region and a C region derived from a human antibody. Since the humanized antibody has reduced antigenicity in the human body, it is useful as an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention.
  • the antibody used in the present invention is not limited to the whole antibody molecule, and includes a bivalent antibody and a monovalent antibody, which may be a fragment of the antibody or a modified product thereof, as long as it binds to antibody 3.
  • Fab, F (ab ') 2 Fv, Fab Zc having one Fab and complete Fc, or Fv of H chain or L chain were linked with an appropriate linker.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragment is constructed and introduced into an expression vector.
  • an enzyme such as papain or pepsin
  • the scFv is obtained by linking the H chain V region and the L chain V region of the antibody.
  • the H chain V region and L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 8 5, 5879—5883).
  • a linker preferably a peptide linker
  • the H chain V region and L chain V region in the scFv are described herein as antibodies, they may be derived from the deviation.
  • the peptide linker connecting the V regions for example, any single-chain peptide having 12 to 19 amino acid residues can be used.
  • the DNA encoding the scFv may be all or all of the sequences of the DNA encoding the H chain or H chain V region and the DNA encoding the L chain or L chain V region of the antibody.
  • the DNA portion encoding the desired amino acid sequence is made into a type II, amplified by the PCR method using a pair of primers defining both ends thereof, and then the DNA encoding the peptide linker portion, and both ends thereof are each H chain, It is obtained by combining and amplifying a primer pair that is defined so as to be linked to the L chain.
  • DNAs encoding scFv are prepared, an expression vector containing them and a host transformed by the expression vector can be obtained according to a conventional method. By using, scFv can be obtained according to a conventional method.
  • Antibodies in the present invention also include fragments of these antibodies.
  • an anti-PTX3 antibody bound to various molecules such as a labeling substance can also be used.
  • the “antibody” in the present invention includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field.
  • the antibody used in the present invention may be a bispecific antibody.
  • the bispecific antibody may be a bispecific antibody having an antigen-binding site that recognizes a different epitope on the PTX3 molecule, or one antigen-binding site may recognize PTX3 and the other antigen-binding site may A labeling substance or the like may be recognized.
  • Bispecific antibodies It can be prepared by binding HL pairs of two types of antibodies, or can be obtained by fusing hybridomas producing different monoclonal antibodies to produce a bispecific antibody-producing fusion cell. Furthermore, bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • expression can be achieved by operably linking a useful promoter commonly used, an antibody gene to be expressed, and a polyA signal downstream of the 3 ′ side thereof.
  • a useful promoter commonly used for example, there can be mentioned human cytomegalovirus wax Ino-less early promoter / En'no ⁇ capacitors 1 ⁇ ⁇ the (human cytomegalovirus immediate early promoter / en hancer).
  • promoters that can be used for antibody expression used in the present invention, such as retroviruses, polioviruses, adenoviruses, Simian virus 40 (SV40), and other promoters such as Winenores promoters Z enhancers, Some include promoters derived from mammalian cells, such as human cell aging factor-1 la (HEFla).
  • the gene can be easily expressed by the method of Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).
  • the gene can be expressed by operably linking a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • the promoter include a lacz promoter and an araB promoter.
  • the lacz promoter use the method of Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422—2427) [From here, use the araB promoter! In this case, it can be expressed by the method of Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043).
  • a pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) is used for production in the periplasm of Escherichia coli. do it. After separating the antibody produced in the periplasm, the antibody structure is appropriately refolded and used.
  • the vector can include aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, large S bacterium xanthinguanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene, etc. as selectable markers. .
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt large S bacterium xanthinguanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • Eukaryotic cells include, for example, established mammalian cell lines, insect cell lines, animal cells such as filamentous fungal cells and yeast cells, and prokaryotic cells include, for example, bacterial cells such as E. coli cells.
  • Eukaryotic cells include, for example, established mammalian cell lines, insect cell lines, animal cells such as filamentous fungal cells and yeast cells, and prokaryotic cells include, for example, bacterial cells such as E. coli cells.
  • the antibody used in the present invention is expressed in mammalian cells, for example, CHO, COS, Kazuma Mie, BHK, Vero, HeLa cells.
  • the transformed host cells are cultured in vitro or in vivo to produce the desired antibody.
  • Culture of the host cell is performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture solution, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • the antibody expressed and produced as described above can be separated from cells and host animals and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be performed using an affinity column.
  • affinity column For example, columns using a protein A column include Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia), and the like.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography columns other than the above-mentioned affinity columns, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. (Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • the PTX3 to be measured in the present invention is not particularly limited.
  • the method for detecting the PTX3 protein contained in the test sample is not particularly limited, but is preferably detected by an immunological method using an anti-PTX3 antibody.
  • the immunological method include, for example, radioimmunoassay, enzymatic immunoassay, fluorescent immunoassay, luminescence immunoassay, immunoprecipitation, immunoturbidimetry, western plot, immunostaining, immunodiffusion, and the like.
  • Enzymimnoassay is preferred, and particularly preferred is enzyme-linked immunosorbent assay (enzyme-linked immunosorbent assay: £, LISA) (eg, sandwich ELISA).
  • Enzyme-linked immunosorbent assay £, LISA
  • sandwich ELISA sandwich ELISA
  • an anti-PTX3 antibody is immobilized on a support, a test sample is added thereto, followed by incubation, and binding of the anti-PTX3 antibody and the PTX3 protein. After that, washing is performed, and a PTX3 protein bound to the support via an anti-PTX3 antibody is detected to detect a PTX3 protein in the test sample.
  • the support used in the present invention includes, for example, insoluble polysaccharides such as agarose and cellulose, synthetic resins such as silicone resin, polystyrene resin, polyacrylamide resin, nylon resin, and polycarbonate resin; An insoluble support such as glass can be used.
  • These supports can be used in the form of beads or plates. In the case of beads, a column or the like filled with these can be used. In the case of a plate, a multiwell plate (eg, a 96-well multiwell plate) or a biosensor chip can be used.
  • the binding between the anti-PTX3 antibody and the support can be achieved by a commonly used method such as chemical bonding or physical adsorption. All of these supports can be used commercially.
  • the binding between the anti-PTX3 antibody and the PTX3 protein is usually performed in a buffer.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a Tris buffer, a citrate buffer, a borate buffer, a carbonate buffer, and the like are used.
  • Incubation conditions include those already used, such as incubation at 4 ° C and room temperature for 1 hour to 24 hours. Is done. Washing after the incubation may be performed using anything that does not prevent the binding between the PTX3 protein and the anti-PTX3 antibody.
  • a buffer containing a surfactant such as Tween20 is used.
  • a control sample may be provided in addition to the test sample from which PTX3 protein is to be detected.
  • Control samples include a negative control sample containing no PTX3 protein and a positive control sample containing PTX3 protein.
  • it is possible to detect the PTX3 protein in the test sample by comparing the result obtained with the negative control sample containing no PTX3 protein with the result obtained with the positive control sample containing the PTX3 protein. is there.
  • a series of control samples in which the concentration is changed stepwise are prepared, the detection results for each control sample are obtained as numerical values, a standard curve is created, and the test sample It is also possible to quantitatively detect the PTX3 protein contained in the sample.
  • a preferable example of the measurement of PTX3 protein bound to a support via an anti-PTX3 antibody is a method using an anti-PTX3 antibody labeled with a labeling substance.
  • a test sample is brought into contact with an anti-PTX3 antibody immobilized on a support, and after washing, detection is performed using a labeled antibody that specifically recognizes the PTX3 protein.
  • the labeling of the anti-PTX3 antibody can be performed by a generally known method.
  • a labeling substance known to those skilled in the art such as a fluorescent dye, an enzyme, a coenzyme, a chemiluminescent substance, a radioactive substance, and specific examples include radioisotopes ( 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, 131 I, etc.), fluorescein, rhodamine, dansylcotide lid, umberifferon, luciferase, peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, j8-darcosidase, horseradish peroxidase, glucomirror And lysozyme, saccharidoxidase, microperoxidase, biotin and the like.
  • biotin When using biotin as a labeling substance, it is preferable to add a biotin-labeled antibody and then add avidin to which an enzyme such as alkaline phosphatase is bound.
  • an enzyme such as alkaline phosphatase
  • a known method such as the dartalaldehyde method, the maleimide method, the pyridyl disulfide method, and the periodate method can be used. it can.
  • a solution containing an anti-PTX3 antibody is placed on a support such as a plate, and the anti-PTX3 antibody is immobilized on the support.
  • the plate block with, for example, BSA, gelatin, albumin, etc. to prevent non-specific binding of proteins. Wash again and place the test sample on a plate.
  • wash and add labeled anti-PTX3 antibody After appropriate incubation, wash the plate and detect any remaining labeled anti-PPTX3 antibody on the plate.
  • Detection can be performed by a method known to those skilled in the art. For example, in the case of labeling with a radioactive substance, detection can be performed by liquid scintillation or the RIA method.
  • a substrate is added, and enzymatic change of the substrate, for example, color development can be detected by an absorptiometer.
  • the substrate include 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammo-dum salt (ABTS), 1,2-phenylene-diamine (orsofu-dienamine), 3, 3 ', 5, 5-tetramethylbenzidine (TME) and the like.
  • TME 5-tetramethylbenzidine
  • a fluorescent substance it can be detected by a fluorometer.
  • a particularly preferred embodiment of the method for measuring PTX3 protein of the present invention includes a method using an anti-PTX3 antibody labeled with biotin and avidin.
  • a solution containing an anti-PTX3 antibody is placed on a support such as a plate, and the anti-PTX3 antibody is immobilized. After washing the plate, block with, for example, BSA to prevent non-specific binding of proteins. Wash again and add the test sample to the plate. After the incubation, the plate is washed and a biotin-labeled anti-PTX3 antibody is removed. After an appropriate incubation, the plate is washed, and avidin conjugated with an enzyme such as alkaline phosphatase or peroxidase is removed. After the incubation, wash the plate, add the substrate corresponding to the enzyme bound to avidin, and detect the PTX3 protein based on the enzymatic change of the substrate.
  • an enzyme such as alkaline phosphatase or peroxidase
  • one or more primary antibodies that specifically recognize the PTX3 protein and one or more secondary antibodies that specifically recognize the primary antibody are used. Methods can be mentioned.
  • a test sample is contacted with one or more kinds of anti-PTX3 antibodies immobilized on a support, After incubation, washing is performed, and the bound PTX3 protein is detected by the primary anti-PTX3 antibody and one or more secondary antibodies that specifically recognize the primary antibody.
  • the secondary antibody is preferably labeled with a labeling substance.
  • Another embodiment of the method for measuring the PTX3 protein of the present invention includes a detection method utilizing an agglutination reaction.
  • PTX3 can be detected using a carrier sensitized with an anti-PTX3 antibody.
  • a carrier for sensitizing the antibody any carrier may be used as long as it is insoluble, does not cause nonspecific reaction, and is stable.
  • latex particles bentonite, collodion, kaolin, fixed sheep erythrocytes and the like can be used, but latex particles are preferably used.
  • the latex particles for example, it is preferable to use polystyrene latex particles that can use polystyrene latex particles, styrene-butadiene copolymer latex particles, polyvinyl toluene latex particles, and the like.
  • the sensitized particles are mixed with the sample and stirred for a certain time.
  • the higher the concentration of the anti-PTX3 antibody in the sample the greater the degree of aggregation of the particles. Therefore, PTX3 can be detected by visually observing the aggregation.
  • the turbidity due to aggregation can be detected by measuring with a spectrophotometer or the like.
  • Another embodiment of the method for measuring the PTX3 protein of the present invention includes, for example, a method using a Noo sensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon.
  • a biosensor using the surface plasmon resonance phenomenon can observe the interaction between proteins in real time as a surface plasmon resonance signal using a small amount of protein and without labeling.
  • BIAcore Pharmacia
  • a test sample is brought into contact with a sensor chip on which an anti-PTX3 antibody is immobilized, and PTX3 protein binding to the anti-PTX3 antibody can be detected as a change in resonance signal.
  • the measurement method of the present invention can be automated using various automatic inspection devices, and it is possible to inspect a large number of samples at once.
  • the present invention also aims to provide a diagnostic agent for the degree of vascular disorder, but the diagnostic agent contains at least an anti-PTX3 antibody.
  • the diagnostic agent includes a kit.
  • the diagnostic agent is an ELISA
  • the antibody may contain a carrier for immobilizing the antibody, and the antibody may be bound to the carrier in advance.
  • the carrier may contain a carrier to which an antibody is adsorbed.
  • the diagnostic agent may appropriately contain a blocking solution, a reaction solution, a reaction stop solution, a reagent for processing a sample, and the like.
  • a screening method for a therapeutic agent for vascular disorders is carried out by administering or contacting a test substance to an animal or a cell and measuring the amount of PTX3 protein or the amount of PTX3 gene.
  • the test substance is administered orally or intravenously, and the blood PTX3 protein or PTX3 gene concentration before and after the administration is measured and compared with the test substance non-administration group.
  • animal models of hyperlipidemia, brain disease, diabetes, obesity, and hypertension can be used.
  • high-fat diet-loaded animals WHHL ⁇ egrets, apoE-deficient mice, LDL receptor-deficient mice, human-type apoB-introduced mice, dominant mutant apoE-introduced mice, hyper-LDLemia pigs and mi- Pigs and brain disease models are SHRSP rats, and obesity 'diabetes models are leptin-deficient mice, NOD mice, KK / Ta Jcl mice, KK AyZTa Jcl mice, C57BL / KsJ-db / db Jcl mice, C57BL / KsJ- It is preferable to use db / + m Jcl mice, GK / Jcl rats, model animals having vascular disorders such as SHR rats as a model for developing hypertension, and coronary artery balloon injury models (rats, egrets) as a heart disease. Good.
  • test substance When cells are used, the test substance is cultivated and cultured using a PTX3 producing cell line and a PTX3 forced expression cell, and the amount of the produced PTX3 protein or PTX3 gene is measured by a known method. After that, screening can be performed by comparing the amount with no addition.
  • a known method such as ELISA can be used as a method for measuring the PTX3 protein.
  • Examples of the method for measuring the amount of a gene include a method using quantitative RT-PCR.
  • a commonly used reporter gene assay can also be used.
  • the general method is to use the promoter region of the PTX3 gene with a marker such as luciferase ⁇ galatatosidase, GFP, etc.
  • a vector connected upstream of the protein cDNA is prepared, and this vector is transfected into animal cells by a general method.
  • the test compound can be screened by adding the test substance to the transfected cells, culturing the cells, and detecting the marker protein by an appropriate method.
  • a single-stranded cDNA of human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) was prepared by the method described in (0034) above, and was used as a template to design a primer PTX3-F (Kpnl) (sequence based on GenBank number (NM-002852)). No. 3) and ⁇ 3-R (BamHI) (SEQ ID NO: 4) were used to isolate the full-length ORF gene by PCR.
  • the fragment obtained by the PCR method was inserted into a vector using the Zero Blunt TO PO PCR Cloning Kit, the nucleotide sequence was analyzed by a standard method, and the fragment cut at the Kpnl site and the BamHI site was converted to a phCMV vector (Stratagene). And transfer vector phCMV-PTX3 was prepared.
  • lxl0 5 cells of CHO cells were seeded on a 6-well dish the day before transfection, and cultured, and the following day, 8 ⁇ g of the expression vector was expressed.
  • phCMV-3 and 16 ⁇ L of FuGENE 6 reagent were mixed with 100 ⁇ L of serum-free DMEM medium, incubated at room temperature for 20 minutes, and added to the cells.
  • clawing was performed using the ultra-dilution method and G418, a selective reagent.
  • the culture supernatant of each clone was recovered, and cells expressing the ⁇ 3 protein were screened.
  • a clone hereinafter, CHO-PTX3 that constantly expressed about 2-3 gZmL of the PTX3 protein could be selected.
  • the protein was purified by the method of Bottazzi et al. (Bottazzi B, Vouret—Craviari, et al., J Biol Chem. 1997; 272 (52): 32817-23.) Specifically, after culturing CHOMA—PTX3 in a 150 cm 2 flask, use a roller bottle (BD Bioscience) and use 300 mL of serum-free medium (S—SFM——, GIBCOZlnvitrogen) per bottle. The rolling speed was adjusted so that the number of revolutions became 1 rotation per minute, and the cells were cultured for 4 days, and the culture supernatant was collected.
  • 1 L of the culture supernatant was concentrated to 50 mL using an ultrafiltration membrane concentrator, pellicon XL device Biomax 100 (MILLIPORE).
  • the concentrate was dialyzed against 5 L of 50 mM Imidaole, pH 6.6 buffer. The dialysis operation was performed twice on the same buffer solution. It was then applied to ion exchange chromatography using HiPrep 16/10 Q XL (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). After washing until the background level was reduced, the concentration of NaCl was increased from 0 to 0.58M for 35 minutes to increase the calorie, and then PTX3 was eluted with 1M NaCl. The elution was monitored at an absorbance of 280 nm.
  • Fractions containing the PTX3 protein were collected, and subjected to Genole filtration chromatography using Sephacry S-300 in PBS. Furthermore, in order to obtain only the multimeric form PTX3 of PTX3, purification was performed using a Superose 6 column (Pharmacia Biotech). That is, after performing calibration using a molecular weight standard, PTX3 was applied to the column, and elution was performed with PBS at a flow rate of 0.4 mL Zmin. Each eluted fraction was analyzed by SDS-PAGE to obtain a purified recombinant multimeric PTX3 protein.
  • Comparison of natural # 3 and recombinant # 3 was performed by Western blotting. That is, 10 ⁇ L of a 0.5 ⁇ g ZmL solution of natural ⁇ 3 and recombinant ⁇ 3 was subjected to SDS-PAGE in a reduced state, and the gel after electrophoresis was transferred to a PVDF membrane. P on the transferred membrane TX3 was reacted with an anti-PTX3 polyclonal antibody (ALEXIS). Thereafter, the anti-PTX3 polyclonal antibody was reacted with an HRP-labeled anti-Egret IgG antibody, and a PTX3 band was detected. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 1, the two were almost identical in molecular weight. It was assumed that the slight difference was due to the difference in sugar chains.
  • ALEXIS anti-PTX3 polyclonal antibody
  • the monoclonal antibody was prepared by the following operation. That is, BalbZC mice (CRL) or PTX3 knockout mice were immunized with PTX3.
  • PTX3 knockout mice were immunized with PTX3.
  • For the first immunization prepare immunoprotein at 10 or 100 ⁇ g / animal and use FCA (Freund's complete adjuvant (H37 Ra), Difco (3113-60), betaton Dickinson (cat # 231131)). The emulsion was administered subcutaneously. Two weeks later, 5 or 50 gZ animals were emulsified with FIA (Incomplete Freund's Adjuvant, Difco (0639-60), Betaton Dickinson (cat # 263910)) and subcutaneously administered. Thereafter, booster immunization was performed twice in total at weekly intervals.
  • mice were diluted in PBS and administered into the tail vein.
  • the mouse myeloma cells P3U1 and mouse spleen cells were mixed, and PEG1500 (Roche's diagnostic, cat # 783 641).
  • the cells were inoculated on a 96-well culture plate, and the culture supernatant was screened by ELISA after selection on the HAT medium from the next day.
  • the positive clone was subjected to monocloning by the limiting dilution method, and then subjected to expansion culture to collect a culture supernatant. Screening by ELISA was performed using the binding activity to the PTX3 protein as an index, and many anti-PTX3 antibodies having strong and binding ability were obtained.
  • the monoclonal antibody was purified using Hi Trap Protein G HP (Amersham CAT # 17-0404-01). Was charged directly to column High Priestess dormer culture supernatant, and eluted with binding buffer (20mM sodium phosphate (P H7. 0)) After washing with elution buffer (0. 1M glycine HCl (pH2. 7)). The eluate was collected in a tube containing a neutralization buffer (1 M Tris-HCl (pH 9.0)) and immediately neutralized. After the antibody eluted fraction was bullated, it was dialyzed all day and night with 0.05% Tween20ZPBS to replace the buffer. The purified antibody was stored at 4 ° C. after adding NaN to 0.02%. [0091] Isotyping of the anti-PTX3 monoclonal antibody was performed as follows.
  • Antibody concentrations were determined by performing a mouse IgG sandwich ELISA using goat anti-mouse IgG (gamma) (ZYMED CAT # 62-6600) and alga lipophosphatase-one goat anti-mouse IgG (gamma) (ZYMED CAT # 62-6622).
  • a commercially available purified mouse IgGl antibody ZYMED CAT # 02-6100 was used as a standard for quantification.
  • Isotyping of the anti-PTX3 antibody was performed using ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit II (PIERCE CA T # 37502), and the method was in accordance with the attached manual. As a result of isotyping, IgGl, IgG2a, and IgM class antibodies were obtained.
  • PTX3 protein was prepared so as to be 100 gZ, and emulsified using FCA (Freund's complete adjuvant (H37 Ra), Difco (3113-60), betaton Dickinson (cat # 231131)) Was administered subcutaneously.
  • FCA Full's complete adjuvant
  • Difco (3113-60) Difco (3113-60)
  • betaton Dickinson cat # 231131
  • FIA Complete Freund's adjuvant, Difco (0639-60), Betaton Dickinson (cat # 263910).
  • 100 gZ FIA emulsions were subcutaneously administered every two weeks, for a total of five immunizations.
  • a sandwich ELISA system for PTX3 was constructed as follows.
  • antibodies coated on 96-well plates include monoclonal antibodies such as PPMX0101 (FERM P-1 9697), PPMX0102, PPMX0112, and PPMX0148, and a polyclonal antibody labeled with biotin as an antibody to detect PTX3 bound thereto. (ALEXIS or the antibody prepared in Example 7) was used.
  • the antibody was used for Piotin-dani using Sulfo-NHS-LC Biotin (CAT # 21335) manufactured by Pierce.
  • Anti-III antibody was diluted with PBS (-) to a concentration of 10 ⁇ g ZmL in a 96-Elimno plate. This was coated and incubated at 4 ° C. The next day, after washing three times with 300 LZwell washing buffer (0.05% (v / v) Tween20, PBS), 150 ⁇ L of ABI immunoassay stabilizer (ABI # 10—601—001) was used. Calo, blocking was done. After several hours at room temperature or after storage at 4 ° C overnight, the purified protein, human serum, etc. are appropriately diluted with a dilution buffer (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 0.15 M NaCl) containing animal serum.
  • a dilution buffer 50 mM Tris-Cl pH 8.0, 0.15 M NaCl
  • the ELISA standard curve was obtained using a concentration-tested PTX3 protein standard (ALEXIS), and was used for 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0. It was made. Further, a standard curve was obtained in the same manner as described above using the antibody of Non-patent Document 3, ie, the MNB4 antibody purchased from ALEX IS, for sensitivity comparison of ELISA. Comparison of the measurement system prepared this time with the measurement by the antibody of Non-Patent Document 3 (Fig. 3) confirmed that the sensitivity of the new measurement system was clearly superior.
  • ALEXIS concentration-tested PTX3 protein standard
  • Blood was collected before the start of statin administration, and then blood was collected after administration of atomatic pastatin once a day for 1 week after dinner.
  • the collected blood sample was subjected to incubation at 37 ° C for 2 hours, followed by serum separation at 1000 rpm for 10 minutes. Collect serum supernatant components and Stored at ° C.
  • the serum PTX3 protein concentration was measured using an ELISA system newly constructed using these sera. As a result, the serum PTX3 protein concentration was decreased in 6 of the 6 cases (Table 1). Further, as a result of the t-test, the PTX 3 concentration after one week of administration of atovatic pastatin was significantly (p 0.01) lower.
  • serum and plasma have been used as blood samples for measuring blood components.
  • the examination was performed using serum, which is the most common blood sampling method.
  • the difference in blood PTX3 concentration between blood collection methods was examined in the addition test of standard PTX3 in the ELIS A system using the PPMX0112 monoclonal antibody.As shown in Table 2, the blood collection method using EDTA was optimal. Something became clear.
  • Example 12 it was found that the preservability of PTX3 at 80 ° C could not be ensured, but it was speculated that the cause was not only deterioration of PTX3 but also changes in other plasma components.
  • EDTA or a protease inhibitor to the buffer used for the measurement was examined using an ELISA system using the PPMX0112 monoclonal antibody. As a result, improvement of the measured value was confirmed by the addition of EDTA.
  • various surfactants such as Tween20 and Bridje were added to the plasma sample in the presence of EDTA. As shown in Table 5, the improvement effect that was insufficient with EDTA alone could be obtained with Tween20.
  • Example 6 Using the monoclonal antibody and the biotin-labeled polyclonal antibody prepared in Example 6, optimal antibody selection under the improved measurement conditions of Example 13 was performed. That is, the EDTA-collected plasma is diluted with a buffer containing EDTA and a detergent. Next, the diluted sample is added to a plate pre-coated with various monoclonal antibodies. After washing, a monoclonal antibody was selected by adding a biotin-labeled polyclonal antibody. As a result, since PPMX0102 was selected as the optimal antibody, the monoclonal antibody was designated as FERM AP-20395 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Tsukuba Ito, Ibaraki Pref. — 1 Deposited to Chuo No. 6).
  • Example 15 Addition of PTX3 to Plasma of Healthy Subjects by Conventional Measurement System and Newly Constructed Measurement System Recovery Test and Stability Test after Cryopreservation
  • PTX3 addition concentration (PTX3ng / mL) (PTX3ng / mL) (PTX3ng / mL) (PTX3ng / mL)
  • PTX3 concentration was measured by E-LISA using PPMX0102 (FERM AP-20395). That is, coronary artery (CA) normal coronary artery group (ANCA) 25 people, stable angina group (AP) 9 people, unstable angina group (UAP) 3 people, myocardial infarction group (AMI) 3 people PTX3 concentration in plasma was measured and compared between groups. As a result, PTX3 values were significantly increased in the UAP CA group compared to the ANCA CA group, and PTX3 values were significantly increased in the AMICA group compared to the ANCA CA and AP CA groups. As shown in FIG.
  • CA coronary artery
  • ANCA normal coronary artery group
  • AP stable angina group
  • UAP unstable angina group
  • AMI myocardial infarction group
  • CRP an inflammatory protein that belongs to the pentraxin family like PTX3 Used as a diagnostic. Unlike PRP hepatocytes, PTX3-producing cells are restricted to vascular constituent cells such as endothelial and smooth muscle cells.To demonstrate the vascular specificity of PTX3, the blood concentration in three cold patients was determined. It was measured. As a result, as shown in Table 8, the pre-onset value was 0.67—1.15 and the average was 0.92 ngZmL, while after onset 0.79—1.06 and the average was 0.90 ngZmL. The measured values were almost the same. These results confirmed that PT X3 is a highly specific marker for blood vessels, not a diagnostic marker for systemic inflammatory response, and is useful for determining the degree of vascular damage.

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Abstract

　血管障害の程度の診断方法および血管障害治療薬のスクリーニング法の提供。 　被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする血管障害の程度の判定方法。  

Description

明 細 書
血管障害の程度の判定方法
背景技術
[0001] 本発明は、血管障害の程度の判定方法および血管障害治療薬のスクリーニング方 法に関する。
技術分野
[0002] PTX3は、 Pentraxin, Pentaxin、 TSG— 14、 MPTX3とも呼ばれ、インターロイキ ン 1 (IL 1)刺激を受けたヒト臍帯内皮細胞に発現しているものとして発見されたペン トラキシンファミリーに属する分泌タンパク質である（非特許文献 1)。
[0003] ペントラキシンファミリーには炎症性タンパクとして知られている C reactive prote in (CRP)や serum amyloid P component (SAP)など; ^存在する。 Pentraxin は、別名 Long Pentraxinとも呼ばれ、 CRPは Short Pentraxinともよばれる。 Pe ntraxinは構造中に CRP配列部分を有することからの呼称であり、炎症性タンパクと して機能していることが推定される。し力し、 PTX3は CRPや SAPと異なり IL— 6によ る誘導を受けな ヽ。また PTX3タンパク質を発現する細胞種も CRPや SAPとは異な ることから、 PTX3は CRPや SAPとは異なる機能も有することが示唆されている（非特 許文献 2)。
[0004] 一方で、炎症反応の一種と考えられる急性心筋梗塞の患者で PTX3の血中濃度が 高く上がること、小血管炎のインディケータとなりうる、進行性動脈硬化巣プラークに おける免疫染色による検出等が発見され、炎症への関与が推定された (非特許文献 3)。
[0005] 炎症と言う呼称は広範囲に渡り、皮膚炎、各種臓器の炎症等がある。それらの中で 血管の炎症は心疾患、脳疾患等の重篤な疾患に繋がる。心疾患においては、急性 心筋梗塞の危険因子として血中高総コレステロール値、高血圧、糖尿病、肥満、喫 煙が挙げられる。血中高総コレステロール値については、この危険因子除去のため 食事療法のみならず高脂血症低下剤として各種スタチン類による治療がなされてい る。脳疾患においては、血管障害による痴呆症等があげられ、アスピリンによる治療 が行われている。
[0006] 従来の PTX3の測定法として、非特許文献 3に記載の ELISA法による方法が知ら れている。この測定法においては、 PTX3濃度は、心筋梗塞発作の 7. 5時間に最大 値が 22ng/mLとなり、その後急激に減少し、心疾患を有していないと思われる正常 者の 0. 5力 2. 5ngZmLになるとの記載がある。このように、従来の PTX3測定結 果によれば、心筋梗塞発作時のみに血中 PTX3濃度が高くなることは知られている 力 心筋梗塞や脳血管障害性痴呆症になる以前の段階で PTX3濃度がどのように 変化して!/、るのかは全くわかって ヽな 、。
[0007] 血管障害の治療薬として、高脂血症治療薬スタチンおよび解熱'鎮痛薬アスピリン が知られているが、それらは疫学的調査により血管障害を改善することが明らかにさ れたものであり、血管障害治療を目的に開発された薬物は無い。
非特許文献 l : Breviorio et al. ： J. Biol. Chem. , 267 (31) , 22190-7 (199 2)
非特許文献 2 :J. Biol. Chem. , 267 (31) , 22190-7 (1992)； Domyaku Koka (Arteriosclerosis) , 24 (7—8) , 375—80 (1996)
非特許文献 3 : Arthritis and Rheumatism, 44/12 (2841— 50) , 2001、 Cir culation, 102, 636— 41 (2000)、 Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002 ; 2 2 : el0-el4
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 心筋梗塞や脳血管障害性痴呆症になる以前の血管障害の程度が判定できれば、 心疾患や脳血管疾患の程度が診断でき、かつ心疾患治療薬や脳血管疾患治療薬 の治療効果が判定できる。また、血管障害の程度が判定できる系が開発できれば、 血管障害治療薬のスクリーニングも可能となる。
従って本発明の目的は、心筋梗塞や脳血管障害性痴呆症の危険因子としての血 管障害の程度を判定する方法および血管障害治療薬のスクリーニング方法を提供 することにある。
課題を解決するための手段 [0009] そこで本発明者は、心筋梗塞の発作時急性期にしか血中濃度が上昇しないと考え られていた PTX3濃度に着目し、血管障害を治療することが知られているスタチン類 およびアスピリンを用い、それらの投与前後で血中の PTX3タンパク濃度を測定した ところ、これらの薬物投与後に明確に PTX3濃度が低下した。さらに、心筋梗塞なら びにその前兆疾患と考えられる安定狭心症および不安定狭心症患者について血漿 中 PTX3濃度を測定した結果、血管障害の重篤化に比例し PTX3の濃度が明らかに 高値を示した。
一方、 PTX3と同じくペントラキシンファミリーに属する炎症性タンパクである CRPが 感冒の診断として使用されて 、ることから、感冒患者における血液中 PTX3濃度を検 討した。その結果、 CRPとは異なり血中濃度の上昇は認められな力つた。これらのこ とから、 PTX3が全身性の炎症反応の診断マーカーではなぐ血管に特異性の高い 、障害の程度を知るに有用な診断マーカーであることを見出した。またこの方法が血 管障害治療薬のスクリーニング方法として使用できることを見出し、本発明を完成し た。
[0010] 本発明にお 、て、新たに抗 PTX3抗体を作製し高感度測定系を確立し、スタチン 投与前後およびアスピリン投与前後の血清中 PTX3を測定し、投与後の PTX3低下 が確認されたことから、本発明を完成させるに至った。
[0011] すなわち、本発明は、被検試料中の PTX3濃度を測定することを特徴とする血管障 害の程度の判定方法を提供するものである。
また、本発明は、抗 PTX3抗体を含有する血管障害の程度の診断薬を提供するも のである。
さらに本発明は、動物または細胞に被験物質を投与または接触させ、 PTX3タンパ ク質又は PTX3遺伝子量の変化を測定することを特徴とする血管障害治療薬のスク リーニング方法を提供するものである。 発明の効果
[0012] 本発明によれば、急性心筋梗塞や血管障害性痴呆症等が発症する以前における 血管障害の程度が診断できることで、心疾患や脳血管疾患の程度が診断でき、より 重篤な心および脳疾患への移行を予防することができる。また、薬物治療による血管 障害の治療指針を得ることができる。さらに、心および脳血管障害の新規な治療薬を スクリーニングすることができる。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]ウェスタンブロティングによるリコンビナント PTX3と天然 PTX3の比較結果を示 す図である。
[図 2]新規構築した複数の ELISA標準曲線を示す図である。
[図 3]臨床試料測定に供した新規構築の PTX3測定系と従来法の PTX3測定系との 比較を示す図である。
[図 4]心疾患患者血液中 PTX3の測定結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 測定とは、定量的または非定量的な測定を含み、例えば、非定量的な測定としては 、単に PTX3タンパク質が存在するか否かの測定、 PTX3タンパク質が一定の量以 上存在するか否かの測定、 PTX3タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール 試料など）と比較する測定などを挙げることができ、定量的な測定としては、 PTX3タ ンパク質の濃度の測定、 PTX3タンパク質の量の測定などを挙げることが出来る。な お PTX3遺伝子の塩基配列を配列番号 1に、 PTX3タンパク質のアミノ酸配列を配列 番号 2に示す。
[0015] 被検試料とは、 PTX3のタンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制 限されないが、哺乳類などの生物の体力 採取された試料が好ましぐさらに好ましく はヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間 質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを 挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿である。又、生物の体から採取 された細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含ま れる。
[0016] 血管の障害は血管内皮細胞の障害、血管中膜平滑筋細胞の遊走、マクロファージ の集積'泡沫化、血栓の付着、プラークの形成、血管の線維化、プラークの破裂とい つた経過を迪り、重篤な疾患を呈す。
すなわち、本発明における血管障害には、高脂血症および脳疾患の他に高血圧 症、糖尿病、肥満および喫煙が原因として生ずる血管障害が含まれる。 また、本発明における血管障害の程度とは上記血管障害の進行過程に伴う障害の 程度を言う。すなわち、上記進行過程をたどる血管障害は最終的なプラークの破裂 に至る程度の尺度として病理組織的に次のように示される。 (a) lipid coreの大きさ、 (b) fibrous cap の厚さ、（c) shear stressの強さ、（d)炎症細胞の浸潤の程度の 具合であり、（a)は大きければ大きいほど、（b)は薄ければ薄いほど、（c)は強ければ 強いほど、（d)は強ければ強いほどプラーク破裂のしゃすさは増す。したがって本発 明における血管障害の程度は上記の（a)— (d)の程度を言う。
[0017] 本発明方法にぉ 、ては、 PTX3の測定は、抗 PTX3抗体を用いる免疫学的測定法 が好ましい。以下、抗 PTX3抗体を用いた測定法について詳細に説明する。
1.抗 PTX3抗体の作製
本発明で用いられる抗 PTX3抗体は PTX3タンパク質に特異的に結合すればよぐ その由来、種類 (モノクローナル、ポリクローナル)および形状を問わない。具体的に は、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を 用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であ ることが好ましい。
又、支持体に固定される抗 PTX3抗体と標識物質で標識される抗 PTX3抗体は PT X3分子の同じェピトープを認識してもよ 、が、異なるェピトープを認識することが好ま しい。
[0018] 本発明で使用される抗 PTX3抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモ ノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗 PTX3抗体として、 特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好まし 、。哺乳動物由来のモノクローナ ル抗体は、ハイプリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗 体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
[0019] モノクローナル抗体産生ハイプリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下の ようにして作製できる。すなわち、 PTX3を感作抗原として使用して、これを通常の免 疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の 親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞を スクリーニングすることによって作製できる。
[0020] 具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用される PTX3を、入手可能な細胞の培養上 清力も精製して得る。あるいは、特表 2002-503642に開示された方法に従い得る ことも出来る。
次に、この精製 PTX3タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、 PTX3の部分 ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒト PTX3の アミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、 PTX3遺伝子の一部を発現べク ターに組込んで得ることもでき、さらに天然の PTX3をタンパク質分解酵素により分解 することによつても得ることができる。部分ペプチドとして用いる PTX3の部分および 大きさは限られない。
[0021] 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融 合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一般的にはげつ 歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ノ、ムスター、あるいはゥサギ、サル等が使用され る。
[0022] 感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。例えば、一般的 方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる 。具体的には、感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline)や生理食塩水等 で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完 全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に 4一 21日毎に数回投与する。また 、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分 ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットへモシ ァニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
[0023] このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した 後に、哺乳動物力も免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞 としては、特に脾細胞が挙げられる。
[0024] 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用い る。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、 P3 (P3x63Ag8. 653) ( J. Immnol. (1979) 123, 1548— 1550)、 P3x63Ag8U. 1 (Current Topics i n Microbiology and Immunology (1978) 81, 1— 7)、 NS— 1 (Kohler. G. an d Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511— 519)、 MPC— 11 (Marguli es. D. H. et al. , Cell (1976) 8, 405-415) , SP2/0 (Shulman, M. et al. , Nature (1978) 276, 269— 270)、 FO (de St. Groth, S. F. et al. , J. Im munol. Methods (1980) 35, 1—21)、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) , R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277, 131 —133)等が好適に使用される。
[0025] 前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば 、ケーラーとミルスティンらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、 Methods En zymol. (1981) 73, 3— 46)等に準じて行うこと力 Sできる。
[0026] より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄 養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール (PE G)、センダイウィルス (HVJ)等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるため にジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
[0027] 免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミ エローマ細胞に対して免疫細胞を 1一 10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用 いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI1640培 養液、 MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用 可能であり、さらに、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。
[0028] 細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混 合し、予め 37°C程度に加温したポリエチレングリコール (PEG) (例えば平均分子量 1 000— 6000程度)溶液を通常 30— 60% (w/v)の濃度で添加し、混合することによ つて目的とする融合細胞 (ハイプリドーマ）を形成する。続、て、適当な培養液を逐次 添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好 ましくな 、細胞融合剤等を除去する。
[0029] このようにして得られたノヽイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば HAT培養液
(ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選 択される。上記 HAT培養液での培養は、目的とするハイプリドーマ以外の細胞 (非 融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日一数週間)継続する。ついで、通 常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニン グおよび単一クロー-ングを行う。
[0030] 目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローユングは、公知の抗原抗体反応 に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや 市販の 96ゥエルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイプリドー マの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第 2次抗体等を反応させる ことにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決 定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニン グすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球 を in vitroで PTX3に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエ口 一マ細胞と融合させ、 PTX3への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもでき る（特公平 1—59878号公報参照)。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有 するトランスジヱニック動物に抗原となる PTX3を投与して抗 PTX3抗体産生細胞を 取得し、これを不死化させた細胞力も PTX3に対するヒト抗体を取得してもよい（国際 特許出願公開番号 W094Z25585号公報、 W093Z12227号公報、 WO92/03 918号公報、 WO94Z02602号公報参照）。
[0031] このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するノ、イブリドーマは、通常の 培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが 可能である。
[0032] 当該ノ、イブリドーマ力 モノクローナル抗体を取得するには、当該ハイプリドーマを 通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはノ、イブリドーマを これと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採 用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は 、抗体の大量生産に適している。
[0033] 本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をノヽイブリドーマ力もクロー- ングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用 いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、 Vandamme, A. M. et al. , Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990参照）。
具体的には、抗 PTX3抗体を産生するハイプリドーマから、抗 PTX3抗体の可変 (V )領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グ ァ-ジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al. , Biochemistry (1979) 18, 5294 — 5299)、 AGPC法（Chomczynski, P. et al. , Anal. Biochem. (1987) 162, 156— 159)等により行って全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharm acia製）等を使用して目的の mRNAを調製する。また、 QuickPrep mRNA Purif ication Kit (Pharmacia製）を用いることにより mRNAを直接調製することもでき る。
[0034] 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDN Aの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First— strand cDNA Synthesi s Kit (生化学工業社製)等を用いて行う。また、 cDNAの合成および増幅を行うに は、 5，— Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製）および PCRを用いた 5，— R ACE法（Frohman, M. A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85, 8 998— 9002、 Belyavsky, A. et al. , Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919— 2932)等を使用することができる。
[0035] 得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、ベクター DNAと連結する。
さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所 望の組換えベクターを調製する。そして、目的とする DNAの塩基配列を公知の方法 、例えば、ジデォキシヌクレオチドチェインターミネーシヨン法等により確認する。
[0036] 目的とする抗 PTX3抗体の V領域をコードする DNAを得たのち、これを、所望の抗 体定常領域 (C領域)をコードする DNAを含有する発現ベクターへ組み込む。
[0037] 本発明で使用される抗 PTX3抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、 例えば、ェンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組 み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
[0038] 抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖 (H鎖)または軽鎖 (L鎖）をコードする DNAを別々 に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいは H 鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形 質転換させてもょ 、 (W094Z11523号公報参照)。
[0039] また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなぐトランスジエニック動物 を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパ ク質 (ャギ βカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調 製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し 、この胚を雌のャギへ導入する。胚を受容したャギカ 生まれるトランスジエニックャ ギまたはその子孫が産生する乳汁力も所望の抗体を得る。また、トランスジエニックャ ギカも産生される所望の抗体を含む乳汁量を増カロさせるために、適宜ホルモンをトラ ンスジエニックャギに使用してもよい（Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology (1 994) 12, 699—702)。
[0040] 本発明では、上記抗体のほかに、人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば 、キメラ抗体、ヒト型化 (Humanized)抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知 の方法を用いて製造することができる。
[0041] キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C領域 をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生さ せること〖こより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得る ことができる。
[0042] ヒト型化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動 物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determinin g region)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝 子組換え手法も知られて ヽる（欧州特許出願公開番号 EP 125023号公報、 W09 6Z02576号公報参照)。
[0043] 具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework reg ion;FR)とを連結するように設計した DNA配列を、 CDRおよび FR両方の末端領域 にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライ マーとして用いて PCR法により合成する（W098Z13388号公報に記載の方法を参 照)。
[0044] CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好 な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補 性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレ ームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K. et al. , Cancer Res. (19 93) 53, 851— 856) Q
[0045] キメラ抗体およびヒト型化抗体の C領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えば H 鎖では、 C γ 1、 C γ 2、 C γ 3、 C γ 4を、 L鎖では C κ、 C λを使用することができる。 また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体 C領域を修飾しても よい。
[0046] キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域 と力 なる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域 と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域および C領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体 内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用で ある。
[0047] 本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、 ΡΤΧ3に結合する限り、 抗体の断片またはその修飾物であってもよぐ二価抗体も一価抗体も含まれる。例え ば、抗体の断片としては、 Fab、 F (ab' ) 2、 Fv、 1個の Fabと完全な Fcを有する Fab Zc、または H鎖若しくは L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン F v (scFv)が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理 し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、こ れを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、 Co, M. S . et al. , J. Immunol. (1994) 152, 2968— 2976、 Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.、 Plueckthun, A. &Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178 , 476—496, Academic Press, Inc.、 Lamoyi, E. , Methods in Enzymo logy (1989) 121, 652— 663、 Rousseaux, J. et al. , Methods in Enzymolo gy (1989) 121, 663—669、 Bird, R. E. et al. , TIBTECH (1991) 9, 132—13 7参照)。
[0048] scFvは、抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結することにより得られる。この scFv において、 H鎖 V領域と L鎖 V領域は、リンカ一、好ましくはペプチドリンカ一を介して 連結される（Huston, J. S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1988) 8 5, 5879— 5883)。 scFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、本明細書に抗体 として記載されたものの 、ずれの由来であってもよ 、。 V領域を連結するペプチドリン カーとしては、例えばアミノ酸 12— 19残基力もなる任意の一本鎖ペプチドが用いら れる。
[0049] scFvをコードする DNAは、前記抗体の H鎖または H鎖 V領域をコードする DNA、 および L鎖または L鎖 V領域をコードする DNAのうち、それらの配列のうちの全部ま たは所望のアミノ酸配列をコードする DNA部分を铸型とし、その両端を規定するブラ イマ一対を用いて PCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカ一部分をコード する DNA、およびその両端が各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプライマー 対を組み合せて増幅することにより得られる。
[0050] また、ー且 scFvをコードする DNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター 、および該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、 また、その宿主を用いることにより、常法に従って scFvを得ることができる。
[0051] これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により 産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含され る。
[0052] 抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗 PTX3抗体を使用する こともできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このよう な抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる 。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
[0053] さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体 (bispecific antibody)で あってもょ ヽ。二重特異性抗体は PTX3分子上の異なるェピトープを認識する抗原 結合部位を有する二重特異性抗体であってもよ 、し、一方の抗原結合部位が PTX3 を認識し、他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。二重特異性抗体は 2種類の抗体の HL対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗 体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、 得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも 可能である。
[0054] 前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することが できる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子 、その 3 '側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例 えばプロモーター Zェンハンサ一としては、ヒトサイトメガロウイノレス前期プロモーター /ェンノヽンサ 1 ~~ (human cytomegalovirus immediate early promoter/ en hancer)を挙げることができる。
[0055] また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター Zェンノヽン サ一として、レトロウイルス、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、シミアンウィルス 40 ( SV40)等のウイノレスプロモーター Zェンハンサー、ある 、はヒトェロンゲーシヨンファ クタ一 la (HEFla)などの哺乳類細胞由来のプロモーター Zェンハンサ一等が挙げ られる。
[0056] SV40プロモーター Zェンハンサーを使用する場合は Mulliganらの方法（Nature
(1979) 277, 108)により、また、 HEFlaプロモーター Zェンハンサーを使用する場 合は Mizushimaらの方法（Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)により、容易 に遺伝子発現を行うことができる。
[0057] 大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列 および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることが できる。プロモーターとしては、例えば laczプロモーター、 araBプロモーターを挙げる ことができる。 laczプロモーターを使用する場合は Wardらの方法（Nature (1098) 3 41 , 544-546 ;FASEB J. (1992) 6, 2422— 2427)【こより、ある!/ヽ ίま araBプロモ 一ターを使用する場合は Betterらの方法（Science (1988) 240, 1041— 1043) により発現することができる。
[0058] 抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる場合 、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)を使用 すればよい。そして、ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適 切に組み直して (refold)使用する。
[0059] 複製起源としては、 SV40、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウイ ルス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー 数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラー ゼ (APH)遺伝子、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、大 S暴菌キサンチングァニンホスホ リボシルトランスフェラーゼ (Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等 を含むことができる。
[0060] 本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または 原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば榭立された哺乳類細 胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、 原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
[0061] 好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えば CHO、 COS,ミエ口 一マ、 BHK、 Vero、 HeLa細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞を in vitroまたは in vivoで培養して目的とする抗 体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、 DMEM、 MEM、 RPMI1640、 IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS) 等の血清補液を併用することもできる。
[0062] 前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製 することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はァフィユティーカラムを用 いて行うことができる。例えば、プロテイン Aカラムを用いたカラムとして、 Hyper D、 POROS、 Sepharose F. F. (Pharmacia製）等が挙げられる。その他、通常のタ ンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何ら限定されるもので はない。例えば、上記ァフィユティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルタ 一、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精 製することができる (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。
[0063] 2. PTX3の測定 本発明において測定する PTX3は、特に限定されず、全長 PTX3でも、その断片で ちょい。
被検試料に含まれる PTX3タンパク質の検出方法は特に限定されな 、が、抗 PTX 3抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては 、例えば、ラジオィムノアツセィ、ェンザィムィムノアツセィ、蛍光ィムノアツセィ、発光 ィムノアツセィ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウェスタンプロット、免疫染色、免疫拡散 法などを挙げることができる力 好ましくはェンザィムィムノアッセィであり、特に好まし Vヽのは酵素結合免役吸着定量法（enzvme— linked immunosorbent assay :£,L ISA) (例えば、 sandwich ELISA)である。 ELISAなどの上述した免疫学的方法 は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
[0064] 抗 PTX3抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗 PTX3抗体を支持 体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗 PTX3抗体と PTX3タン パク質を結合させた後に洗浄して、抗 PTX3抗体を介して支持体に結合した PTX3 タンパク質を検出することにより、被検試料中の PTX3タンパク質の検出を行う方法を 挙げることができる。
[0065] 本発明において用いられる支持体としては、例えば、ァガロース、セルロースなどの 不溶性の多糖類、シリコン榭脂、ポリスチレン榭脂、ポリアクリルアミド榭脂、ナイロン 榭脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げ ることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能 である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレート の場合、マルチウエルプレート（96穴マルチウエルプレート等）、やバイオセンサーチ ップなどを用いることができる。抗 PTX3抗体と支持体との結合は、化学結合や物理 的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体は すべて巿販のものを用いることができる。
[0066] 抗 PTX3抗体と PTX3タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液 としては、例えば、リン酸緩衝液、 Tris緩衝液、クェン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭 酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく 用いられている条件、例えば、 4°C一室温にて 1時間一 24時間のインキュベーション が行われる。インキュベート後の洗浄は、 PTX3タンパク質と抗 PTX3抗体の結合を 妨げないものであれば何でもよぐ例えば、 Tween20等の界面活性剤を含む緩衝液 などが使用される。
[0067] 本発明の PTX3タンパク質測定方法においては、 PTX3タンパク質を検出したい被 検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、 PTX 3タンパク質を含まない陰性コントロール試料や PTX3タンパク質を含む陽性コント口 ール試料などがある。この場合、 PTX3タンパク質を含まない陰性コントロール試料 で得られた結果、 PTX3タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比 較することにより、被検試料中の PTX3タンパク質を検出することが可能である。また 、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料 に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準 曲線に基づいて、被検試料に含まれる PTX3タンパク質を定量的に検出することも可 能である。
[0068] 抗 PTX3抗体を介して支持体に結合した PTX3タンパク質の測定の好ま 、態様と して、標識物質で標識された抗 PTX3抗体を用いる方法を挙げることができる。
[0069] 例えば、支持体に固定された抗 PTX3抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、 PT X3タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
[0070] 抗 PTX3抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物 質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に 公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ (32P、 14C、 125I、 3H、 131Iなど）、フルォレセイン、ローダミン、ダンシルク口リド、ゥンべ リフエロン、ルシフェラーゼ、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、 β—ガラクト シダーゼ、 j8—ダルコシダーゼ、ホースラディッシュパーォキシダーゼ、グルコアミラー ゼ、リゾチーム、サッカリドォキシダーゼ、マイクロペルォキシダーゼ、ビォチンなどを 挙げることができる。標識物質としてピオチンを用いる場合には、ピオチン標識抗体 を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加す ることが好ましい。標識物質と抗 PTX3抗体との結合には、ダルタルアルデヒド法、マ レイミド法、ピリジルジスルフイド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることが できる。
[0071] 具体的には、抗 PTX3抗体を含む溶液をプレートなどの支持体にカ卩え、抗 PTX3 抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐた め、例えば BSA、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試 料をプレートにカ卩える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗 PTX3抗体を加える。適 度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗 PPTX3抗 体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物 質による標識の場合には液体シンチレーシヨンや RIA法により検出することができる 。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度 計により検出することができる。基質の具体的な例としては、 2, 2—アジノビス（3—ェ チルベンゾチアゾリンー 6—スルホン酸）ジアンモ -ゥム塩（ABTS)、 1, 2—フエ-レン ジァミン（ォルソーフエ-レンジァミン）、 3, 3' , 5, 5，ーテトラメチルベンジジン (TME) などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することがで きる。
[0072] 本発明の PTX3タンパク質測定方法の特に好ましい態様として、ピオチンで標識さ れた抗 PTX3抗体およびアビジンを用いる方法を挙げることができる。
[0073] 具体的には、抗 PTX3抗体を含む溶液をプレートなどの支持体にカ卩え、抗 PTX3 抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例え ば BSAなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュ ペートの後、洗浄し、ピオチン標識抗 PTX3抗体をカ卩える。適度なインキュベーション の後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルォキシダーゼなどの酵素と結 合したアビジンをカ卩える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合し ている酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標に PTX3タンパク 質を検出する。
[0074] 本発明の PTX3タンパク質測定方法の他の態様として、 PTX3タンパク質を特異的 に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗 体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
[0075] 例えば、支持体に固定された一種類以上の抗 PTX3抗体に被検試料を接触させ、 インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合している PTX3タンパク質を、一次 抗 PTX3抗体および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により 検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
[0076] 本発明の PTX3タンパク質の測定方法の他の態様としては、凝集反応を利用した 検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗 PTX3抗体を感作した担体を 用いて PTX3を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非 特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例 えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用す ることができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、 例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン ブタジエン共重合体ラテックス粒子、 ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができる力 ポリスチレンラテックス 粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試 料中に抗 PTX3抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集 を肉眼でみることにより PTX3を検出することができる。また、凝集による濁度を分光 光度計等により測定することによつても検出することが可能である。
[0077] 本発明の PTX3タンパク質の測定方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモ ン共鳴現象を利用したノィォセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面ブラ ズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質 タンパク質間の相互作用を 微量のタンパク質を用いてかつ標識することなぐ表面プラズモン共鳴シグナルとし てリアルタイムに観察することが可能である。例えば、 BIAcore (Pharmacia製）等の バイオセンサーを用いることにより PTX3タンパク質と抗 PTX3抗体の結合を検出す ることが可能である。具体的には、抗 PTX3抗体を固定ィ匕したセンサーチップに、被 検試料を接触させ、抗 PTX3抗体に結合する PTX3タンパク質を共鳴シグナルの変 ィ匕として検出することができる。
[0078] 本発明の測定方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度 に大量の試料にっ 、て検査を行うことも可能である。
[0079] 本発明は、血管障害の程度の診断薬の提供をも目的とするが、該診断薬は少なく とも抗 PTX3抗体を含む。ここで診断薬には、キットも含まれる。該診断薬が ELISA 法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよぐ抗体があらかじめ担 体に結合して 、てもよ 、。該診断薬力 Sラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場 合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキン グ溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい
[0080] 血管障害治療薬のスクリーニング方法は、被験物質を動物または細胞に投与また は接触させ、 PTX3タンパク質量又は PTX3遺伝子量を測定することにより行なわれ る。動物を使用する場合には、被験物質を経口、静注等の手段で投与し、その投与 前後の血中 PTX3蛋白又は血中 PTX3遺伝子濃度を測定し、被験物質非投与群と 比較することによりスクリーニングできる。このとき、動物としては、高脂血症、脳疾患、 糖尿病、肥満症、高血圧症のモデル動物が使用できる。特に、動脈硬化モデルとし ての高脂肪食負荷動物、 WHHLゥサギ、アポ E欠損マウス、 LDL受容体欠損マウス 、ヒト型アポ B導入マウス、ドミナント変異アポ E導入マウス、高 LDL血症ブタおよびミ -ブタ等ならびに脳疾患モデルとしては SHRSPラット、肥満'糖尿病モデルとしては 、レプチン欠損マウス、 NODマウス、 KK/Ta Jclマウス、 KK AyZTa Jclマウス 、 C57BL/KsJ-db/db Jclマウス、 C57BL/KsJ— db/+m Jclマウス、 GK/J clラット、さらに、高血圧発症モデルとしては SHRラット、心臓疾患として冠動脈バル ーン傷害モデル (ラット、ゥサギ)等の血管障害を有するモデル動物を用いるのが好 ましい。
[0081] また、細胞を用いる場合には、 PTX3産生細胞株および PTX3強制発現細胞を用 い、被験物質をカ卩えて培養し、産生された PTX3タンパク質又は PTX3遺伝子量を 公知の方法にて測定した後、無添加時の量と比較することによりスクリーニングするこ とがでさる。
[0082] PTX3タンパク質を測定する方法としては ELISA等の知られた方法が利用できる。
また、遺伝子量測定方法として、定量的 RT— PCRによる方法等が挙げられる。また、 PTX3遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニングのためには、一般的に用いら れているレポータージーンアツセィを用いることもできる。一般的な方法とは、 PTX3 遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼゃガラタトシダーゼ、 GFP等のマーカー タンパク質の cDNAの上流に接続したベクターを作製し、このベクターを一般的な方 法により、動物細胞にトランスフエクシヨンする。トランスフエクシヨンされた細胞に、被 験物質を加えて培養し、マーカータンパク質をそれぞれに適した方法によって検出 することによって目的の化合物をスクリーニングすることができる。
実施例
[0083] 以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例 に限定されるものでない。
[0084] 実施例 1 PTX3のクローニング
PTX3の全長 ORF領域を含む配列のクローユングを実施した。ヒト臍帯静脈内皮 細胞（HUVEC)の 1本鎖 cDNAを上記（0034)記載の方法により調製し、それを铸 型として GenBank番号（NM— 002852)よりデザインしたプライマー PTX3— F (Kp nl) (配列番号： 3)と ΡΤΧ3 - R (BamHI) (配列番号: 4)を用いて、 PCR法にて、全長 ORF遺伝子の単離を行った。 PCR法により得られたフラグメントを Zero Blunt TO PO PCR Cloning Kitを用いベクター挿入し、塩基配列解析を定法にて実施し た後、 Kpnlサイトおよび BamHIサイトにて切断したフラグメントを phCMVベクター（ Stratagene社）へ挿入し、トランスファーベクター phCMV— PTX3を作製した。
[0085] 実施例 2 リコンビナント PTX3発現細胞の構築
FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals社）のプロトコールに準じて、ト ランスフエクシヨン前日に 6ゥエルディッシュに lxl05cellの CHO細胞を播種しー晚 培養を行 、、翌日に 8 μ gの発現ベクター phCMV— ΡΤΧ3と 16 μ Lの FuGENE 6 reagentを無血清 DMEM培地 100 μ Lに混合し、 20分間の室温におけるインキュ ベーシヨン後、細胞に添加した。トランスフエクシヨン翌日に限外希釈法および選択試 薬である G418を用いてクローユングを実施した。各クローンの培養上清を回収し、 Ρ ΤΧ3タンパク質発現細胞のスクリーニングを行った。その結果、約 2— 3 gZmLの PTX3タンパク質を恒常的に発現するクローン (以後、 CHO— PTX3)を選択すること が出来た。
[0086] 実施例 3 リコンビナント PTX3タンパク質の取得
蛋白質の精製は Bottazziらの方法（Bottazzi B, Vouret— Craviari, et al. , J Biol Chem. 1997 ; 272 (52) : 32817— 23. )【こ準じて実施した。具体的【こ ίま CH O— PTX3を 150cm2のフラスコにて培養の後、ローラーボトル（BD Bioscience社） を用い 1ボトル当たり 300mLの無血清培地（S— SFM— Π, GIBCOZlnvitrogen社 )用い、 1分間当たり 1回転になるようにローリングのスピードの調節を行い 4日間培養 し、培養上清を回収した。 1Lの培養上清を、限外濾過膜濃縮装置、 pellicon XLデ バイス バイオマックス 100 (MILLIPORE社）を用いて 50mLまで濃縮を行った。濃 縮液を 50mM Imidaole, pH6. 6の緩衝液 5Lに対し透析した。透析操作は同緩 衝液に対し、 2度実施した。次いで、 HiPrep 16/10 Q XL (Pharmacia Biote ch, Uppsala, Sweden)を用いたイオン交換クロマトグラフィーにアプライした。バッ クグランドレベルが低くなるまで洗浄した後、 NaClの濃度を 0から 0. 58Mに 35分間 力けて増カロさせ、その後 1Mの NaClにて PTX3の溶出を行った。尚、溶出のモニタ 一は 280nmの吸光度にて行った。 PTX3蛋白質を含むフラクションを集め、 Sephac ryl S— 300によるゲノレ濾過クロマトグラフィーを PBSにて展開した。さらに PTX3のう ち多量体 PTX3のみを得るために Superose 6 column (Pharmacia Biotech)を 使用して精製した。すなわち、分子量スタンダードを用いキャリブレーションを行った 後に PTX3をカラムへアプライし、流速 0. 4mLZminにて PBSにより溶出を行った。 各溶出フラクションを SDS— PAGEにより解析を行い、精製リコンビナント多量体 PTX 3タンパク質を得た。
[0087] 実施例 4 天然 PTX3タンパク質の取得
HUVECの培養上清から PTX3タンパク質の取得を試みた。すなわち、 175cm2フ ラスコを用い、 5% FBSを含む EGM— 2培地にて 37°C、 3日培養後、培養液を回収 した。蛋白質の精製は Bottazziらの方法（Bottazzi B, Vouret— Craviari, et al . , J Biol Chem. 1997 ; 272 (52) : 32817— 23. )【こ準じて、具体的【こ ίま上記実 施例 3と同様な操作にて天然 ΡΤΧ3を取得した。
[0088] 実施例 5 ウェスタンブロティングによるリコンビナント ΡΤΧ3と天然 ΡΤΧ3の比較
天然より得た ΡΤΧ3とリコンビナント ΡΤΧ3の比較をウェスタンブロティングにより行 つた。すなわち、天然 ΡΤΧ3とリコンビナント ΡΤΧ3の 0. 5 μ gZmL溶液 10 μ Lを還 元状態で SDS— PAGEし、泳動後のゲルを PVDF膜に転写した。転写した膜上の P TX3を抗 PTX3ポリクローナル抗体 (ALEXIS社）と反応させた。その後、抗 PTX3ポ リクローナル抗体は HRP標識抗ゥサギ IgG抗体と反応させ、 PTX3のバンドを検出し た。その結果を図 1に示した。図 1に示すように両者は分子量の上でほぼ一致した。 若干の差は糖鎖の違いに基づくものと推察した。
[0089] 実施例 6 抗 PTX3モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体は下記の操作により作製した。すなわち、 BalbZCマウス （CR L)あるいは PTX3ノックアウトマウスに PTX3を免疫した。初回免疫には免疫タンパク 質を 10あるいは 100 μ g/匹となるように調製し、 FCA (フロイント完全アジュバント（ H37 Ra)、 Difco (3113— 60)、ベタトンディッキンソン（cat # 231131) )を用いて ェマルジヨンィ匕したものを皮下に投与した。 2週間後に 5あるいは 50 gZ匹となるよ うに調製したものを FIA (フロイント不完全アジュバント、 Difco (0639— 60)、ベタトン ディッキンソン（cat # 263910) )でェマルジヨン化したものを皮下に投与した。以降 1 週間間隔で追加免疫を合計 2回行った。最終免疫については 5あるいは 50 gZ匹 となるように PBSに希釈し尾静脈内に投与した。 PTX3タンパク質をコートしたィムノ プレートを用いた ELISAにより PTX3に対する血清中の抗体価が飽和しているのを 確認後、マウスミエローマ細胞 P3U1とマウス脾臓細胞を混合し、 PEG1500 (ロシュ 'ダイァグノスティック、 cat # 783 641)により細胞融合を行った。 96穴培養プレート に播種し、翌日より HAT培地で選択後培養上清を ELISAでスクリーニングした。陽 性クローンについては限界希釈法によりモノクローンィ匕した後、拡大培養を行い培養 上清を回収した。 ELISAによるスクリーニングは、 PTX3タンパク質との結合活性を 指標に行 、、強 、結合能を有する抗 PTX3抗体を多数得た。
[0090] モノクローナル抗体の精製は Hi Trap ProteinG HP (Amersham CAT # 17 -0404-01)を用いて行った。ハイプリドーマ培養上清を直接カラムにチャージし、 結合バッファー (20mM リン酸ナトリウム (PH7. 0) )にて洗浄後、溶出バッファー（0 . 1M グリシン HCl (pH2. 7) )で溶出した。溶出液は中和バッファー（1M Tris— HCl (pH9. 0) )をカ卩えたチューブに採取し、直ちに中和した。抗体溶出画分をブー ルした後、 0. 05%Tween20ZPBSで一昼夜透析を行いバッファー置換した。精製 された抗体は 0. 02%となるように NaNを添加した後、 4°Cで保管した。 [0091] 抗 PTX3モノクローナル抗体のァイソタイピングは次のように行った。
抗体濃度はャギ抗マウス IgG (gamma) (ZYMED CAT# 62— 6600)とアル力 リホスファターゼ一ャギ抗マウス IgG (gamma) (ZYMED CAT # 62— 6622)を用い たマウス IgGサンドイッチ ELISAを行い、市販の精製マウス IgGl抗体（ZYMED C AT# 02— 6100)をスタンダードとして定量した。抗 PTX3抗体のァイソタイピング は、 ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit II (PIERCE CA T# 37502)を用い、方法は添付のマニュアルに従った。ァイソタイピングの結果、 I gGl、 IgG2a、 IgMクラスの抗体が得られた。
[0092] 実施例 7 抗 PTX3ポリクローナル抗体の作製
10週令、体重 2kgのニュージーランドホワイトゥサギに免疫を行った。初回免疫に は PTX3蛋白質を 100 gZ匹となるように調製し、 FCA (フロイント完全アジュバント (H37 Ra)、 Difco (3113— 60)、ベタトンディッキンソン（cat # 231131) )を用いて ェマルジヨンィ匕したものを皮下に投与した。 2週間後に 100 gZ匹となるように調製 したものを FIA (フロイント不完全アジュバント、 Difco (0639—60)、ベタトンディツキ ンソン（cat # 263910) )でェマルジヨン化したものを皮下に投与した。その後も 2週 間間隔で 100 gZ匹の FIAェマルジヨンを皮下投与し、合計 5回免疫を行った。 5 回免疫後に部分採血を行い、ゥサギ血清中の抗体価を、 96ゥエルプレートに抗原を コートした ELISA法にて評価した。その後全採血を行い、血清分離した後、 Protein Gカラム精製により抗体を分画した。 0. 02%となるように NaNを添加し 4°Cで保管し
3
た。
[0093] 実施例 8 ELISA系の構築と測定
血中の PTX3を検出するため、 PTX3のサンドイッチ ELISA系を以下のように構築 した。すなわち、 96ゥエルプレートにコートする抗体には PPMX0101 (FERM P— 1 9697)、 PPMX0102、 PPMX0112、 PPMX0148等のモノクローナル抗体を、こ れらに結合した PTX3を検出する抗体としてピオチンで標識したポリクローナル抗体（ ALEXIS社または実施例 7で作製した抗体)を用いた。尚、抗体のピオチンィ匕には Pi erce社の Sulfo— NHS— LC Biotin (CAT# 21335)を用いておこなった。
[0094] 96ゥエルィムノプレートに 10 μ gZmLとなるように抗 ΡΤΧ3抗体を PBS (—）で希釈 したものをコートし、 4°Cでー晚インキュベートした。翌日 300 LZwellの洗浄バッフ ァー（0. 05% (v/v)Tween20, PBS)で 3回洗浄後、 ABI社のィムノアッセイスタビ ライザ一（ABI # 10— 601— 001)を 150 μ Lカロえ、ブロッキングを行った。室温で数 時間後、あるいは 4°Cで一晩保管後、精製蛋白質、ヒト血清などを、動物血清などを 含む希釈バッファー（50mM Tris-Cl pH8. 0, 0. 15M NaCl)で適当に希釈し たものをカ卩ぇ 2時間室温でインキュベートした。次いで、動物血清などを含む PBS (— )で 20 μ gZmLとなるように希釈したピオチン標識した抗 PTX3抗体を加え 2時間室 温でインキュベートした。反応液を捨てた後、動物血清を適当量含んだ Cygnus社の Stab-ELISA-r (Cygnus # 1—030)を用いて、 Vector社のストレプトアビジン H RPO (Vector # SA— 5004)を 3 μ gZmLに希釈したものをカ卩え、 0. 5時間室温 でインキュベートした。 300 LZwellの洗浄バッファーで 5回洗浄した後、添付のプ ロトコールに従 、Scytek社の TMB (Cat # TM4999)を用いて発色させ、マイクロ プレートリーダーで吸光度を測定した。
[0095] サンプル中の PTX3タンパク質濃度の換算には、表計算ソフト GlaphPad PRISM
(GlaphPad software Inc. ver. 3. 0)を用いて解析した。精製 PTX3を用いてス タンダードカーブを作製した結果、より低 、濃度の PTX3タンパク質の測定を可能に した複数の測定系を構築することができた (図 2)。
[0096] 実施例 9 従来の測定系との標準曲線の比較
ELISAの標準曲線は濃度検定された PTX3タンパク質標準品 (ALEXIS社)を用 ヽて、 30、 10、 3、 1、 0. 3、 0. 1、 0. 03、 0.
Figure imgf000025_0001
ヽて 作製した。さらに、 ELISAの感度比較のために非特許文献 3の抗体すなわち ALEX IS社より購入の MNB4抗体を用いて上記と同様に標準曲線を求めた。今回作製し た測定系と非特許文献 3の抗体による測定（図 3)との比較において、明らかに新規 測定系の感度がすぐれていることが確認できた。
[0097] 実施例 10 スタチン投与試験
スタチン投与開始前に採血を行い、次にアト口パスタチンを 1日 1回夕食後に 1週間 投与した後に採血を行った。採血した血液サンプルは、 37°C、 2時間のインキュベー シヨンの後、 1000rpm、 10分間の血清分離を行った。血清上清成分を回収し 80 °Cにて保存した。これらの血清を用いて新規に構築した ELISA系にて血清中 PTX3 タンパク質濃度の測定を行った。その結果 6例中 6例にて血清中 PTX3蛋白濃度の 減少が認められた (表 1)。さらに t検定の結果、アト口パスタチン 1週間投与後の PTX 3濃度が有意に (pく 0. 01)下がる結果となった。
[0098] [表 1] 血清中 P T X 3濃度 （ng/ml)
No. 投与前 投与後
1 0. 31 0. 26
2 0. 40 0. 23
3 0. 35 0. 20
4 0. 36 0. 14
5 0. 44 0. 12
6 0. 42 0. 10
[0099] 実施例 11 血液サンプルの選択
従来、血液成分の測定における血液サンプルとして、血清および血漿 (タエン酸、 E DTA、へパリン）が使用されている。本特許においては、最も一般的な採血方法であ る血清を用いて検討した。今回、採血方法による血中 PTX3濃度の差異を PPMX01 12モノクローナル抗体を用いた ELIS A系にて標準品の PTX3の添加試験にて検討 したところ、表 2に示すように EDTAによる採血方法が最適であることが明ら力となつ た。
[0100] [表 2]
Figure imgf000026_0001
実施例 12 血液サンプルの安定性試験
多くの血液成分は凍結保存において安定である。し力しながら、物質によっては安 定性が確保できない場合もあることから、 80°Cにおける血漿中 PTX3の安定性を P PMX0112モノクローナル抗体使用 ELISA系にて標準品の PTX3の添加試験にて 検討した。その結果、表 3に示すように保存により測定値の低下が確認された。
[0102] [表 3]
Figure imgf000027_0001
[0103] 実施例 13 測定条件の改良
実施例 12にて、 80°Cにおける PTX3の保存性が確保できな 、ことが判明したが、 その原因として PTX3の劣化のみならず他の血漿成分の変化に基づくことが推察さ れた。後者の解決のため、 PPMX0112モノクローナル抗体を用ぃたELISA系にて 測定時使用緩衝液への EDTAあるいはプロテアーゼ阻害剤の添加を検討した。そ の結果、 EDTAの添カ卩により測定値の改善が認められた (表 4)。さらに、 EDTA存 在下 Tween20および Bridje等の各種界面活性剤を血漿サンプルに添カ卩した。表 5 に示すように、 EDTAのみでは不十分であった改善効果が Tween20により充分な 改善効果を得ることができた。
この結果から、保存期間中の PTX3含量の低下は、 PTX3以外の血漿成分の変化に よるものと推察された。
[0104] [表 4]
Figure imgf000027_0002
[0105] [表 5]
Figure imgf000028_0001
[0106] 実施例 14 ELISA測定用モノクローナル抗体の選択
実施例 6で作製したモノクローナル抗体およびピオチン標識ポリクローナル抗体を 用いて、実施例 13の改良測定条件下における最適の抗体の選択を行った。すなわ ち、 EDTAおよび界面活性剤を添加した緩衝液で EDTA採血血漿を希釈する。次 いで、各種モノクローナル抗体をプレコートしたプレートに希釈検体を添加する。洗 浄後、ピオチン標識ポリクローナル抗体を添加する方法によりモノクローナル抗体を 選択した。その結果、最適な抗体として PPMX0102が選択されたことから、そのモノ クローナル抗体を FERM AP— 20395として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒 305— 8566 茨城県つくば巿東 1—1— 1 中央第 6)へ寄 託した。
[0107] 実施例 15 従来測定系および新規構築測定系による健常者血漿への PTX3の添加 回収試験ならびに凍結保存後の安定性試験
従来測定系である ALEXIS社より購入の MNB4を用いた測定系、 PPMX0112を 用いた測定系および新規作製 PPMX0102 (FERM AP— 20395)を用いた測定 系を用いて、健常者血漿による PTX3の添カ卩回収試験を実施した。すなわち、 5ng ZmLの PTX3を健常者ボランテァ EDTA採血血漿に添加、混和後の濃度を測定し た。その結果は表 6に示すように、 PPMX0112において 86%の回収率であるのに 対し、他の測定系においてはほぼ添カ卩量にあった測定結果であった。一方、 PTX3 添加血漿を 80°C、 1日保存後解凍後の測定値は、新規作製 PPMX0102 (FERM AP— 20395)を用いた測定系では、ほぼ 100%の回収が得られたのに対し、 MNB 4を用いた測定系では添加した PTX3の回収が 87%に過ぎなかった (表 7)。
[0108] [表 6] パネル検体 PPMX0112 PPMX102 MNB4
PTX3添加濃度 (PTX3ng/mL) (PTX3ng/mL) (PTX3ng/mL)
Ong/mL 1.21 1.02 1.32
5ng/mL 5.52 6.32 6.66
[0109] [表 7]
Figure imgf000029_0001
[0110] 実施例 16 心疾患患者血液中 PTX3の測定
各種心疾患患者から採血をし、 PPMX0102 (FERM AP— 20395) を用いた E LISAにて PTX3濃度を測定することにより、病態による PTX3の変動を検討した。す なわち、冠動脈 (CA)での正常冠動脈群 (ANCA) 25名、安定狭心症群 (AP) 9名、 不安定狭心症群 (UAP) 3名、心筋梗塞群 (AMI) 3名の 4群に分け、血漿中 PTX3 濃度を測定し、群間比較を行った。その結果、 UAP CA群では ANCA CA群に 比べ、 PTX3値は有意に増加し、また AMI CA群では ANCA CA群、 AP CA群 に比べ、 PTX3値は有意に増加した。図 4に示すように、安定狭心症、不安定狭心症 、心筋梗塞と病態の悪ィ匕につれ PTX3の濃度が増加することが明ら力となった。この ことから、心疾患の悪ィ匕の程度は血管障害の悪ィ匕の程度に比例しているものと思わ れる。従って、血漿中 PTX3濃度を測定することにより血管障害の結果として生ずると 考えられる心疾患のモニター、病態の管理、治療方針策定に役立つことが期待出来 る。
[0111] 実施例 17 感冒患者における血液中濃度
PTX3と同じくペントラキシンファミリーに属する炎症性タンパクである CRPが感冒 の診断として使用されている。 PTX3の産生細胞が CRPの肝細胞と異なり、内皮およ び平滑筋細胞等の血管構成細胞に限局されており、 PTX3の血管特異性を証明す るため、感冒患者 3名における血液中濃度を測定した。その結果、表 8に示すように 発症前値 0. 67—1. 15、平均で 0. 92ngZmLであるのに対し、発症後は 0. 79— 1. 06、平均で 0. 90ngZmLであり、ほぼ同様の測定値であった。この結果より、 PT X3が全身性の炎症反応の診断マーカーではなぐ血管に特異性の高いマーカーで あり、血管の障害の程度を知るに有用であることを確認した。
[表 8]
PTX3 ng/mL
サンプノレ 1 サンプノレ 2 サンプル 3 健康時 0.67 1.15 0.93
風邪 0.79 1.06 0.84
PER0002 30
PCT
紙面による写し（注意:！;子データが原本となります）
[この用紙は、国際出顔の一部を構成せず、国際出頼の用紙の枚数に算入しない]
Figure imgf000031_0001
1 下記の表示は発明の詳細な説明中に記載
された微生物又は生物材料に関連している
1-1 段落番号 0093
1-3 寄託の表示
1-3-1 寄託機関の名称 I POD 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄 託センター（I P0D)
1-3-2 寄託機関のあて名 〒305-8566 曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6
1-3 - 3 寄託の日付 2004年 02月 20日 (20. 02. 2004)
1-3-4 受託番号 I POD I POD FER P-19697
1-4 追加の表示 ョ一口ッパ特許庁については、 寄託微生物試料は E P
(規制2 8 ( 4 ) に従って、 ヨーロッパ特許が発行さ れる迄、 請求人が指定した専門家に対してのみ入手可 能とされることを要請する。
1-5 この表示を行うための指定国 すべての指定国
1-6 追加事項の表示の届け出 なし
右記の表示は後に国際事務局に届け出る
予定である。
2 下記の表示は発明の詳細な説明中に記載
された微生物又は生物材料に関連している
2-1 段落番号 0106
2-3 寄託の表示
2-3-1 寄託機関の名称 I POD 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄 託センター（I P0D)
2-3-2 寄託機関のあて名 〒305-8566 日本国茨城県つくぱ市東 1丁目 1番地 1 中央第 6
2-3-3 寄託の日付 2005年 02月. 10曰 (10. 02. 2005)
2-3-4 受託番号 I POD I POD FERM AP-20395
2-4 追加の表示 ョ一口ツバ特許庁については、 寄託微生物試料は E P 〇規制2 8 ( 4 ) に従って、 ヨーロッパ特許が発行さ れる迄、 請求人が指定した専門家に対してのみ入手可 能とされることを要請する。
2-5 この表示を行うための指定国 すべての指定国
2-6 追加事項の表示の届け出 なし
右記の表示は後に国際事務局に届け出る
予疋である。
差眷え用紙 (m

Claims

請求の範囲 .
[1] 被検試料中の PTX3濃度を測定することを特徴とする血管障害の程度の判定方法
[2] 血管障害の程度が、心疾患の程度または脳血管疾患の程度である請求項 1記載 の判定方法。
[3] 被検試料が、血液、血清または血漿である請求項 1または 2記載の判定方法。
[4] 抗 PTX3抗体を用いて被検試料中の PTX3タンパク質濃度を測定するものである 請求項 1〜3のいずれか 1項記載の判定方法。
[5] 支持体に固定した抗 PTX3抗体と標識物質で標識された抗 PTX3抗体を用いる請 求項 4記載の判定方法。
[6] 標識物質がピオチンである請求項 5記載の判定方法。
[7] 抗 PTX3抗体が全長 PTX3およびそのペプチド断片を認識する抗体である請求項
4〜6のいずれかの 1項記載の判定方法。
[8] 抗 PTX3抗体を含有する血管障害の程度の診断薬。
[9] 支持体に固定した抗 PTX3抗体と、標識物質で標識された抗 PTX3抗体を含むも のである請求項 8記載の診断薬。
[10] 動物または細胞に被験物質を投与または接触させ、 PTX3タンパク質又は PTX3 遺伝子量の変化を測定することを特徴とする血管障害治療薬のスクリーニング方法。
[11] 血管障害が、心疾患または脳血管疾患である請求項 10記載のスクリーニング方法
差替え ^瓿 m )
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