JP2007534951A - タンパク質ptx3測定用の単クローン抗体、ハイブリドーマ、改良方法、及び前記測定用キット - Google Patents
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Abstract
Description
a)96-ウェルのELISAのプレート(Nunc Roskilde(ヌン・ロスキレ)、Denmark(デンマーク国))を、100μlのラットの単クローン抗体NMB4(腹水(ascites)として、1:5000に、被覆のために用いる緩衝剤において希釈する)により被覆し、及び一夜の間4℃でインキュベートした工程;
b)プレートを、次いで、ダルベッコ(Dulbecco)のリン酸塩緩衝剤塩類溶液(phosphate buffer saline)であって、0.05%のトゥイーン(Tween)20を含有するもの(washing buffer、洗浄緩衝剤)、及び200μlの5%の粉乳により洗浄して、非-特異結合部位をブロックした工程;
c)2時間の間の周囲温度でのインキュベート後、プレートを再度3回洗浄緩衝剤により洗浄した工程;
d)50μlの標準組換えヒトPTX3(100pg/mlから10ng/mlまでのもの)であって、RPMI 1640媒体(Seromed(セロムド)、Berlin(ベルリン)、Germany(ドイツ国))及び2%ウシ血清アルブミン(Sigma Chemicals(シグマ・ケミカルズ社)、St. Louis(セントルイス)、MO(米国、ミズーリ州))において希釈したもの、又は試験血漿の試料を、3通り(in triplicate)で、各ウェルにおいて配置(placed)し、及びプレートを2時間の間37℃でインキュベートした工程;
e)プレートを、3回、洗浄緩衝剤により洗浄し、及び100μlの抗-TPX3のラビットの血清であって、ビオチンと複合化し(conjugated with、共役させ)、洗浄緩衝剤において1:2000に希釈したものを添加した工程;
f)プレートを、1時間の間37℃でインキュベートし、及び次いで、3回、200μlの洗浄緩衝剤により洗浄した工程;
g)100μlのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼであって、デキストラン基質と複合化したもの(Amdex(アムデックス社)、Copenhagen(コペンハーゲン)、Denmark)であり、1:4000に希釈したものを、各ウェルに添加し、及びプレートを1時間の間周囲温度でインキュベートした工程;
h)プレートを4回洗浄した後、100μlの色素生産性(chromogenic)基質ABTS Microwell Peroxidase Substrate System(マイクロウェル・ペルオキシダーゼ・サブストレート・システム)(Kirkegaard and Perry Laboratories(キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ)、Gaithersburg(ゲイサーズバーグ)、MD(米国、メリーランド州))を添加した工程;
i)プレートを、405nmで、自動読取機により読み取った工程
を包含する。
i)96-ウェルのELISAのプレートを、ラットの単クローン抗体を含有する100μlの溶液により被覆し、及び一夜の間、4℃でインキュベートする工程;
ii)次いで、プレートを、緩衝剤溶液(buffer solution)及び非-特異結合部位をブロックし得る溶液により洗浄する工程;
iii)2時間の間の周囲温度でのインキュベーションの後、プレートを、再び(更に)洗浄緩衝剤により洗浄する工程;
iv)繰り返して、50μlの、適切な媒体において希釈する標準組換えヒトPTX3又は試験下の生物学的流体の試料を、各ウェルにおいて配置し、及びプレートを2時間の間37℃でインキュベートする工程;
v)プレートを洗浄緩衝剤により繰り返し洗浄し、及び次いで洗浄緩衝剤における25ng/mlのビオチン化した抗-PTX3のラビットのIgGの100μlを、各ウェルに添加する工程;
vi)プレートを1時間の間37℃でインキュベートし、及び次いで洗浄緩衝剤により繰り返し洗浄する工程;
vii)100μlの希釈したストレプトアビジン-ペルオキシダーゼを各ウェルに添加し、及びプレートを1時間の間周囲温度でインキュベートする工程;
viii)プレートを洗浄緩衝剤により繰り返し洗浄した後、100μlの色素生産性基質を各ウェルに添加する工程;
ix)プレートを短時間に周囲温度でインキュベートし、停止溶液(stop solution)を添加し、及びプレートを405nmで自動読取機により読み取る工程
を含み;
改善は、
-工程(i)において用いるラットの単クローン抗体が、ハイブリドーマMNB10(受託番号(access No.、受入番号)ABC/ PD04001)からのか、又はハイブリドーマPen(ペン)-3(受託番号ABC/ PD01004)から得られる抗体であり;
-工程(vii)において用いるストレプトアビジン-ペルオキシダーゼが1:8000に希釈され;及び
-工程(viii)において用いる色素生産性基質がテトラメチルベンジジン(TMB)である
という事実にある。
図1は、心不全(cardiac decompensation)を有する患者の血漿に及ぼすEDTAの効果を例証する図である。
(ハイブリドーマ)
(免疫化)
Lewis(ルイス)のラットを、200μgのPTX3により皮下に3回、15日の間隔で免疫化する。抗体の反応のELISAアッセイによっての評価後、融合を、最も高い抗体の表題(antibody title)を有する動物により遂行する。
(方法)
a)(脾細胞の調製)
-予め免疫化したラットの脾臓を、滅菌条件下に取り出し、及び3回の10mlのDMEMにより洗浄し、プラスチック製ペトリ皿で3mlのDMEM培地(媒体)を含有するものに移し、及び針を用いて脱凝集させ(disaggregated)、及び/又は注射筒ピストンにより押しつぶす(crushed);
-細胞懸濁物を試験管に移し、DMEM培地により50mlにまで補い、及び70μmのスクリーンによりろ過して細胞凝集物を除去する;
-脾細胞を2回の50mlのDMEM培地により洗浄する;
-Turk(ターク)において計数する。
b)(骨髄腫“SP2/0”の調製)
-骨髄腫細胞は、対数増殖期(exponential growth phase)でなければならず、及び停滞期(プラト)であってはならない。
-細胞を2回の50mlのDMEM培地により洗浄する。
-それらを計数する
c)(融合)
-SP2/0の細胞を脾細胞に添加して、脾細胞及び骨髄腫の間で(5:1)の比率を得る;
-DMEMにより50mlにまで補い、及び1700rpmで7分間遠心分離する;
-パスツールピペット(Pasteur pipette)により、上清を、それがすべて除去されるように取り除く;
-沈降した細胞を撹拌し、試験管を指により振とうし、及び次いで37℃に維持したDMEMにおける37%PEGの0.6mlを添加する;
-パスツールピペットにより、細胞を極めて緩徐に再懸濁させ、PEGを添加したときから2分待ち、及び次いで800rpmで6分間遠心分離する;
-上清をパスツールピペットにより除去する。細胞を再懸濁し、試験管を緩やかに指により振とうし、及び37℃に維持したDMEMを、少しずつ(drop by drop)、20ml容量まで添加する;
-1300rpmで10分間遠心分離する;
-上清を除去し、及び細胞の塊(ペレット)を、極めて緩徐に、HAT-DMEMにより、パスツールピペットを用いて、再懸濁する;
-それらを、1.25×106×mlの濃度にまで希釈し、及び次いでそれらの0.2mlを平底の96-ウェルのプレートにおいてウェル当りに播種し、ウェル当り2.5×105細胞を持つようにする;
-プレートを37℃でウェル加湿インキュベータ(well humidified incubator)においてインキュベートし、及びコロニーの存在を1週間後に検査する;
-融合後7日に、培地を取り除き、及び200μlの新鮮HAT-DMEMを添加する;
-融合後10日目及び15日目の間で選別を遂行する;
-次いで、HT-DMEM培地において陽性のハイブリドーマをクローン化し;
-第2のクローン化後、HT-DMEM培地をハイブリドーマについてのDMEMにより置換することができる。
(DMEM培地)
(1×)DMEM 500ml
L-グルタミン 5ml
ゲンタマイシン 0.5ml
(1×)DMEM 500ml
*FCS 50ml
非-必須AAs 5ml
ピルビン酸ナトリウム 5ml
L-グルタミン 5ml
ゲンタマイシン 0.5ml
骨髄腫用培地+ヒポキサンチン+アミノプテリン+チミジン
(HT-DMEM)
骨髄腫用培地+ヒポキサンチン+チミジン
7.4gのPEG(Serva(セルバ社)のcode(コード)の33132)を、パイレックスボトルにおいてオートクレーブする。それが固化する前に(およそ55℃)、FCSを含まない12.6mlのDMEMを添加し、及びよく混合する。0.2μmのフィルタによりろ過し、試験管当り1mlを等分し(aliquot)、及び冷蔵室において貯える。
(プロテインG結合-セファロース(Sepharose)を用いる単クローン抗体の精製)
(材料)
-Ca及びMgを有するPBS:450mlの蒸留水+50mlのPBS(10×)+3mlの1MのNaOH;
-Sepharose Protein G 4 fast flow(セファロース・プロテインG4・ファスト・フロー)(Pharmacia(ファルマシア社)、cat.(カタログ)、17-0618-01):樹脂を4回PBSにより、傾斜法(デカンテーション)又は軽微な遠心分離によって洗浄し、次いで、それを10%にまでPBS+0.1%アジ化ナトリウムにより希釈し、及びそれを冷蔵室において貯える;
-グリシン-0.1MのHCl緩衝剤pH2.8:750mgのグリシンを100mlの蒸留水において溶解し、及びpH2.8にまで、280μlの37%HClにより調節する;
-1.5MのTRIS(トリス)-HCl緩衝剤pH8.8:18.17gのTRISを100mlの蒸留水において溶解し、及びpH8.8にまで37%HClにより調節する;
-1種の7mlプラスチック製のミニカラム。
-カラムで3ml容量にまで樹脂セファロース・プロテインG4・ファスト・フローを負荷する;
-20mlのPBSにより、樹脂が乾ききらないように洗浄する;
-腹水又は血清をPBSにより1:3に希釈し、及び0.2μmのフィルタ上でろ過する;
-樹脂を4回通過させ、及びその最後で樹脂のレベルでの流れを停止させる;
-30mlのPBSにより洗浄する;
-9mlのpH2.8グリシン-HCl緩衝剤を添加し(1回に3ml)、及び3種の試験管において溶出物を収集する;
-直ちに、pH7にまで、100から150μlまでのpH8.8のTRIS-HCl緩衝剤を添加することによって調節する;
-合計のタンパク質を測定し、及び必要なら、それらをCentriplus(セントリプラス) 50又は100により濃縮する;
-PBSに対して透析し、等分し、及び凍結する。
(患者の血漿におけるPTX3のレベルを決定するための方法)
-96-ウェルのELISAのプレート(Nunc MaxiSorp(マキシソープ) 446612)を、100μlの被覆緩衝剤溶液(15mM炭酸塩緩衝剤、pH9.6)であって、精製したMNB10抗体を含有するもの(700ng/ml)により被覆し、及び一夜の間、4℃でインキュベートした;
-プレートを、3回、300μl/ウェルの洗浄緩衝剤溶液(PBS+0.05%トゥイーン20)により洗浄し、及び次いで300μlの洗浄緩衝剤であって、5%粉乳を有するものを添加して、非-特異結合部位をブロックした;
-2時間の間の周囲温度でのインキュベートの後、プレートを、3回洗浄緩衝剤により洗浄した;
-繰り返して、50μlの標準組換えヒトPTX3(75pg/mlから1.2ng/mlまで)、及びPBS+2%BSA+0.19%K3-EDTAにおいて希釈する試験下の血漿の試料を、各ウェルにおいて配置し、及びプレートを2時間の間37℃でインキュベートした;
-プレートを5回洗浄緩衝剤により洗浄し、及び洗浄緩衝剤における25ng/mlのビオチン化したラビットの抗-PTX3のIgGの100μlを、各ウェルに添加した;
-プレートを1時間の間37℃でインキュベートし、及び次いで5回、300μlの洗浄緩衝剤により洗浄した;
-100μlのセイヨウワサビペルオキシダーゼ-複合化ストレプトアビジンのAmdex(RPN 4401 Amersham、Copenhagen、Denmark)であって、1:8000に希釈したものを各ウェルに添加し、及びプレートを1時間の間、周囲温度でインキュベートした;
-プレートを5回洗浄緩衝剤により洗浄した後、100μlのTMB(テトラメチルベンジジン)の基質溶液を各ウェルに添加した;
-プレートを5分間の間、周囲温度でインキュベートした;
-50μlの停止溶液(H2SO4、1M)を各ウェルに添加した;
-405nmで吸光度を反応の停止から30分以内に読み取った。
(キット)
ヒトの生物学的流体においてPTX3のレベルを測定するためのキットは、次のものを含む:
1.マイクロプレート:12×8ウェルのラット抗-PTX3抗体MNB10を被覆したもの。
2.リン酸塩緩衝剤溶液におけるビオチン化ラビット抗-PTX3 IgG。
3.リン酸塩緩衝剤溶液におけるセイヨウワサビペルオキシダーゼ-複合化ストレプトアビジン。
4.標準品:緩衝剤溶液において2.4、1、0.5、0.2及び0.05ng/mlでの精製組換えPTX3。
5.洗浄緩衝剤溶液:リン酸塩緩衝剤塩類溶液(PBS)の溶液。
6.希釈剤(試験下のヒトの生物学的流体を希釈するためのもの):リン酸塩緩衝剤塩類溶液の溶液における1%ウシ血清アルブミン及び0.19%K3-EDTA。
7.基質:0.05モル/lのクエン酸塩緩衝剤(pH3.8)における安定化した0.26mg/mlのテトラメチルベンジジン及び0.01%のH2O2。
8.停止溶液:1MのH2SO4。
Claims (23)
- 生物学的流体の試料におけるPTX3タンパク質のレベルを定めるための方法であって、次の工程:
i)96-ウェルのELISAのプレートを、ラットの単クローン抗体を含有する100μlの溶液により被覆し、及び一夜の間、4℃でインキュベートする工程;
ii)次いで、プレートを、緩衝剤溶液及び非-特異結合部位をブロックし得る溶液により洗浄する工程;
iii)2時間の間の周囲温度でのインキュベートの後、プレートを、更に(再び)洗浄緩衝剤により洗浄する工程;
iv)繰り返して、50μlの、適切な媒体において希釈する標準組換えヒトPTX3又は試験下の生物学的流体の試料を、各ウェルにおいて配置し、及びプレートを2時間の間37℃でインキュベートする工程;
v)プレートを洗浄緩衝剤により繰り返し洗浄し、及び次いで洗浄緩衝剤における25ng/mlのビオチン化した抗-PTX3のラビットのIgGの100μlを、各ウェルに添加する工程;
vi)プレートを1時間の間37℃でインキュベートし、及び次いで洗浄緩衝剤により繰り返し洗浄する工程;
vii)100μlの希釈したストレプトアビジン-ペルオキシダーゼを各ウェルに添加し、及びプレートを1時間の間周囲温度でインキュベートする工程;
viii)プレートを洗浄緩衝剤により繰り返し洗浄した後、100μlの色素生産性基質を各ウェルに添加する工程;
ix)プレートを短時間に周囲温度でインキュベートし、停止溶液を添加し、及びプレートを405nmで自動読取機により読み取る工程
を含み;
改善は、
-工程(i)において用いるラットの単クローン抗体が、ハイブリドーマMNB10(受託番号ABC/ PD04001)からのか、又はハイブリドーマPen-3(受託番号ABC/ PD01004)から得られる抗体であり;
-工程(vii)において用いるストレプトアビジン-ペルオキシダーゼが1:8000に希釈され;及び
-工程(viii)において用いる色素生産性基質がテトラメチルベンジジン(TMB)である
という事実にある
ことを特徴とする、方法。 - 工程(i)における溶液において、ラットの単クローン抗体の濃度が、約700ng/mlであることを特徴とする、請求項1の方法。
- 工程(i)における溶液が被覆緩衝剤溶液であることを特徴とする、請求項1又は2の方法。
- 前記緩衝剤溶液が15mMの炭酸塩緩衝剤を含有し、及びそのpHが9.6であることを特徴とする、請求項3の方法。
- 工程(ii)において用いる緩衝剤溶液が、PBS(リン酸塩緩衝剤塩類溶液)+0.05%のトゥイーン20から構成されることを特徴とする、請求項1〜4の何れか1項の方法。
- 前記溶液を約300μl/ウェルの量において用いることを特徴とする、請求項5の方法。
- 工程(ii)において用いる非-特異結合部位をブロックし得る溶液が、PBS+0.05%のトゥイーン20からなる緩衝剤溶液における粉乳の5%溶液から構成されることを特徴とする、請求項1〜6の何れか1項の方法。
- 非-特異結合部位をブロックし得る前記溶液を、約300μl/ウェルの量において用いることを特徴とする、請求項7の方法。
- 工程(iii)において特定する洗浄を、好ましくは3回繰り返し、毎回に約300μlの溶液を各ウェルについて用いることを特徴とする、請求項1〜8の何れか1項の方法。
- 工程(iv)において、用いる標準組換えヒトPTX3を、ウェルにおいて、75pg/mlから1.2ngまでに増加する量で配置することを特徴とする、請求項1〜9の何れか1項の方法。
- 試験血漿試料を希釈するのに用いる媒体が、PBS+2%のBSA(ウシ血清アルブミン)+0.18%のEDTAから構成されることを特徴とする、請求項1〜10の何れか1項の方法。
- 抗-PTX3のラットの単クローン抗体を生産し得るハイブリドーマであって、前記ハイブリドーマが、MNB10[ブダペスト条約に従い、イタリア国のジェノバ所在のアドバンスド・バイオテクノロジ・センタ(ABC)に、2004年4月16日付けで受託された、受託番号PD04001]及びPen-3[ブダペスト条約に従い、イタリア国のジェノバ所在のアドバンスド・バイオテクノロジ・センタ(ABC)に2001年8月2日付けで受託された、受託番号PD01004]を備える群より選ばれる、ハイブリドーマ。
- ラットの単クローン抗体の特異的な抗-PTX3であって、ハイブリドーマMNB10及びPen-3によって生産される単クローン抗体の群から選ばれる抗体。
- 生物学的流体におけるPTX3タンパク質のレベルを定めるためのキットであって、前記キットがラットの抗-PTX3の単クローン抗体を含むことを特徴とする、キット。
- それがまた、ラビットの抗-PTX3多クローン性抗体を含むことを特徴とする、請求項14のキット。
- それがまた、精製組換えPTX3タンパク質を含むことを特徴とする、請求項14又は15のキット。
- それがまた、セイヨウワサビペルオキシダーゼと複合化したストレプトアビジンを含むことを特徴とする、請求項14〜16の何れか1項のキット。
- それがまた、洗浄緩衝剤溶液を含むことを特徴とする、請求項14〜17の何れか1項のキット。
- それがまた、アッセイすべき生物学的流体の試料のための希釈剤を含むことを特徴とする、請求項14〜18の何れか1項のキット。
- 前記希釈剤にEDTAが包含されることを特徴とする、請求項19のキット。
- それがまた、色素原を含むことを特徴とする、請求項14〜20の何れか1項のキット。
- 色素原がテトラメチルベンジジン(TMB)の溶液から構成されることを特徴とする、請求項21のキット。
- それがまた、停止溶液を含むことを特徴とする、請求項14〜20の何れか1項のキット。
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