CN1947018A - 单克隆抗体、杂交瘤、测定ptx3蛋白质的改进方法以及用于上述测定的试剂盒 - Google Patents

单克隆抗体、杂交瘤、测定ptx3蛋白质的改进方法以及用于上述测定的试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种用于测定生物流体样品中PTX3蛋白质水平的方法；一种能够产生大鼠抗PTX3单克隆抗体的杂交瘤，其中上述的杂交瘤选自MNB10和Pen－3；从杂交瘤MNB10和Pen－3产生的单克隆抗体中筛选得到的特异的抗PTX3大鼠单克隆抗体；测定生物流体中PTX3蛋白质水平的试剂盒，其中所述试剂盒包含大鼠抗PTX3单克隆抗体。

Description

单克隆抗体、杂交瘤、测定PTX3蛋白质的改进 方法以及用于上述测定的试剂盒
本发明涉及大鼠抗PTX3单克隆抗体，产生上述抗体的杂交瘤，一种改进的用于测定生物流体中PTX3蛋白质水平的方法和执行上述测定方法的试剂盒。
更具体而言，上述方法、上述大鼠抗PTX3的单克隆抗体和上述试剂盒可用于早期诊断患有心血管和/或脑血管疾病的人类个体的死亡风险。
五聚环蛋白(pentraxins)，因其五聚结构而得名，是一群包括C反应性蛋白质(CRP)和血清淀粉状蛋白P(SAP)的蛋白质，由肝脏对炎症介质的反应而产生。其血清中的水平会因不同的刺激反应而升高，且已经被用于监测感染、炎症状况和组织损坏。
PTX3是此类家族中的一个新成员，发现于由白细胞介素-1(IL-1)刺激的内皮细胞中。PTX3为一类典型的长链五聚环蛋白，含有一个与经典五聚环蛋白同源的203个氨基酸的C端区域，和一个缺乏同源性的178个氨基酸的N端区域。与CRP和SAP相反，PTX3可产生于各种类型的细胞中，主要是在内皮细胞和单核吞噬细胞中；它应激于IL-1和肿瘤坏死因子(TNF)而产生，但不能应激于IL-6而产生。另外，PTX3由单核细胞应激于分枝杆菌细胞壁组分以及由类风湿性关节炎病人的非刺激滑膜细胞产生。
早在1992年就已经鉴定了PTX3蛋白质(Breviario F等人，″Cloning of a new gene related to C-reactive protein and serumamyloid P component″J.Biol.Chem.1992，267：22190-22197)。
众所周知的是，它在细菌中的生产见如Vidal Alles V.等人″Inducible expression of PTX3，a new member of the pentraxinfamily，in human mononuclear phagocytes.″Blood 1994，84：3483-3493中所描述，而它在真核细胞(CHO)中的生产已经由BottazziB.等人″Multimer formation and ligand recognition by the longpentraxin PTX3-Similarities and differences with the shortpentraxin C-reactive protein and serum amyloid component.″J.Biol.Chem.1997，272：32817-32823中所描述。
然而，尚未完全清楚PTX3蛋白质的生物学功能。
新近的研究已经阐明，在患有急性或慢性炎症性疾病如脓毒症或心肌梗塞的病人中PTX3蛋白质的水平会上升。具体而言，Peri等人已经报道了在心肌梗塞病人进入医院冠心病监护室7.5小时后，其PTX3蛋白质水平达到峰值，为6.94±11.26ng/ml(Circulation 2000，102：636-641)。
更近期一些，人们观测到心肌梗塞病人中的PTX3蛋白质水平能预示该时期后三个月内的死亡风险(Latini R.等人，″Prognosticsignificance of the long pentraxin PTX3 in acute myocardialinfarction：comparison with C-reactive protein，NT-proBNP andtroponin T.″abstract 3091，Supplement IV，page 680，Circulation 2003，108(17).)。更具体而言，该文作者报道了代表性数量的患有心肌梗塞和ST段升高的病人，其急性阶段的PTX3蛋白质水平提供了能预示死亡风险的独立信息。基于C-反应性蛋白质(短链的五聚环蛋白)或其它的生物心脏标记分子(如NT-proBNP或肌钙蛋白-T)的水平则不能做出同样的预测。
更进一步，这些发明者意识到，脑中风病人的实验数据显示，PTX3蛋白质的水平与中枢神经系统所受的损害成比例。
文献中报道的PTX3的测定[见Peri等人，loc.cit.；Muller B.等，″Circulating levels of the long pentraxin PTX3 correlatewith severity of infection in critically ill patients″Crit.Care Med.2001，29(7)：1404-1407；Fazzini F.等，″PTX3 insmall-vessel vasculitides-An independent indicator of diseaseactivity produced at sites of inflammation″Arthritis andRheumatism 2001，44(12)：2841-2850]，是采用了一种ELISA方法，其基于特异针对PTX3蛋白质的单克隆抗体和生物素标记的特异针对PTX3蛋白质的多克隆兔IgG。上述的单克隆抗体在文献中鉴定为MNB4，但公众不能得到与之相应的杂交瘤。
具体而言，上述的方法在Muller B等人loc.cit.的论文中已经描述，并包含以下步骤：
a)在96-孔ELISA平板(丹麦Nunc Roskilde公司)用100μl的大鼠单克隆抗体NMB4(腹水，在缓冲液中按1∶5000稀释用作包被)包被，并在4℃孵育过夜；
b)然后用含有0.05％Tween20的Dulbecco磷酸缓冲盐(清洗缓冲液)和200μl 5％奶粉完全清洗该平板，封闭非特异性结合位点；
c)在环境温度下孵育2小时后，再用清洗缓冲液清洗该平板3次；
d)在RPMI 1640培养基(Seromed，Berlin，Germany)和2％牛血清白蛋白(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)中稀释的50μl标准重组人PTX3(从100pg/ml到10ng/ml)，或测试血浆样品，放置于每个孔中(一式三份)，再将平板在37℃孵育2小时；
e)将平板用清洗缓冲液清洗3次，加入100μl在清洗缓冲液中1∶2000稀释的与生物素缀合的抗TPX3兔血清；
f)将平板在37℃温育1小时，然后用200μl清洗缓冲液清洗3次；
g)在每个孔中加入100μl 1∶4000稀释的与葡聚糖(Amdex，Copenhagen，Denmark)缀合的链霉亲和素-过氧化物酶，将平板在环境温度下孵育1小时；
h)将平板清洗4次之后，加入100μl生色底物ABTS MicrowellPeroxidase Substrate System(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)；
i)用自动读数器在405nm为平板读数。
本发明者已经观察到上述众所周知的方法中存在很多的缺点。
已知方法的第一个缺点包含下列：在一些病人的血浆中，不同稀释倍数的测试血浆样品下测定的PTX3水平与实施的稀释倍数不成比例。本发明者已经发现，令人惊讶的是，向测试血浆样品中添加EDTA可以克服这个缺点。尽管该发现的原理还没有完全阐明，本发明者假定(但并不希望限制本发明的范围)，观察到的效果是因为EDTA有结合Mg2+和Ca2+的能力，因而使用其它配位试剂可以获得相同的结果。
第二个缺点包含下列：在大约5％的正常受试者中，已知方法的灵敏度(大约200pg/ml)不足以测定PTX3蛋白质。本发明者已经发现，通过使用新的单克隆抗体(步骤a)、改变链霉亲和素-过氧化物酶的浓度(步骤g)和使用不同的色原(步骤h)，该方法的灵敏度可以提高至75pg/ml。
其中的一个方面，本发明涉及一种在生物流体中测定PTX3蛋白质水平的方法，包含以下步骤：
i)将96-孔ELISA平板用100μl含有大鼠单克隆抗体的溶液包被，并在4℃温育一夜；
ii)然后将该平板用缓冲溶液和能够封闭非特异性结合位点的溶液进行清洗；
iii)在环境温度下温育2小时后，将该平板再度用清洗缓冲液清洗；
iv)将稀释于合适培养基中的50μl标准重组人PTX3或待测生物流体样品加入到每个孔中，一式两份，并将该平板在37℃温育2小时；
v)将平板用清洗缓冲液反复清洗，然后将100μl 25ng/ml生物素化抗PTX3兔IgG的清洗缓冲液加入到每个孔中；
vi)将平板在37℃温育1小时，然后用清洗缓冲液反复清洗；
vii)在每个孔中加入100μl稀释的链霉亲和素-过氧化物酶，并将平板在环境温度下温育1小时；
viii)将平板用清洗缓冲液反复清洗后，在每个孔中加入100μl的生色底物；
ix)将平板在环境温度下短暂温育，加入终止溶液，并使用自动读数器在405nm为平板读数。
其中的改进之处在于：
在步骤(i)中使用的大鼠单克隆抗体是从杂交瘤MNB10(登录号No.ABC/PD04001)或从杂交瘤Pen-3(登录号No.ABC/PD01004)中获得；
在步骤(vii)中使用的链霉亲和素-过氧化物酶以1∶8000稀释；并且，
在步骤(viii)中使用的生色底物是四甲基联苯胺(TMB)。
优选地，步骤(i)溶液中大鼠单克隆抗体的浓度为约700ng/ml。进一步地，在步骤(i)中使用的溶液优选由包被缓冲溶液组成。优选上述缓冲溶液含有15mM碳酸盐缓冲液，并且pH值为9.6。
一般而言，在步骤(ii)中使用的缓冲溶液由PBS(磷酸缓冲盐)和0.05％Tween 20构成。更为有利地，上述溶液的用量约为300μl/孔。
优选地，在步骤(ii)中使用的能够封闭非特异性结合位点的溶液由缓冲溶液(PBS和0.05％Tween 20)中的5％奶粉溶液构成。更为有利地，能够封闭非特异性结合位点的上述溶液的用量约为300μl/孔。
在步骤(iii)中详细说明的清洗步骤，优选为重复3次，每次每孔使用约300μl溶液。
优选地，在步骤(iv)中使用的标准重组人PTX3，将按照从75pg/ml至1.2ng的数量加入孔中。更为有利地，用于稀释待测血浆样品的培养基由PBS+2％BSA(牛血清白蛋白)+0.18％K3-EDTA构成。此溶液中EDTA的存在非常重要，因为如已经提到，本发明者已经发现，这使得PTX3的测定值与实施的稀释倍数成比例。
在步骤(v)中使用的生物素化的抗-TPX3兔IgG优选地根据Muller等人loc.cit.描述的获得。
在步骤(vii)中使用的链霉亲和素-过氧化物酶优选是辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素Amdex(RPN 4401 Amersham，Copenhagen，Denmark)。
一般而言，在步骤(ix)中使用的终止溶液是1M的硫酸溶液。
更为有利地，在步骤(xii)中使用的TMB底物溶液对应于Pharmingen公司的目录号2642KK。
另一方面，本发明涉及能够产生抗PTX3大鼠单克隆抗体的杂交瘤，其特征在于上述的杂交瘤选自MNB10(根据布达佩斯条约于2004年4月16日保藏于the Advanced Biotechnology Centre(ABC)ofGenoa，意大利，保藏号为PD04001)和Pen-3(根据布达佩斯条约于2001年8月2日保藏于the Advanced Biotechnology Centre(ABC)of Genoa，意大利，保藏号为PD01004)。
根据本发明，筛选上述产生抗PTX3大鼠单克隆抗体的杂交瘤可以通过例如下面实施例1中所描述的常规方法来完成。
另一方面，本发明涉及一种特异性抗PTX3大鼠单克隆抗体，该抗体选自上述的杂交瘤MNB10和Pen-3中产生的单克隆抗体。
从本发明的杂交瘤制备特异性抗PTX3大鼠单克隆抗体，并不受特别的限制，并且可以通过如实施例2中描述的那些常规方法来完成。
本发明的另一方面涉及一种测定生物流体中PTX3蛋白质水平的试剂盒，其特征在于包含抗PTX3的大鼠单克隆抗体。
在优选的实施方案中，在患有心血管和/或脑血管疾病的人类个体血清中测定PTX3蛋白质水平，对他们的死亡风险做出早期诊断。
优选地，上述的试剂盒还包含抗PTX3的兔多克隆抗体。
更有利地，上述的试剂盒还包含纯化的重组PTX3蛋白质。
在优选的实施方案中，上述的试剂盒还包含缀合了辣根过氧化物酶的链霉亲和素。
更有利地，上述的试剂盒还包含清洗缓冲液。
优选地，上述的试剂盒还包含用于待测定的生物流体样品的稀释液。
一般而言，上述的试剂盒还包含作为色原的四甲基联苯胺(TMB)溶液。
最后，上述的试剂盒还可以包含终止溶液。
下面的图1和接下来的实施例对本发明进行更多的说明，但并不限制本发明。
图1说明了EDTA对心失代偿患者血浆的作用。
在图1中，X轴表示全血浆的稀释倍数(1∶2，1∶4，1∶8和1∶16)。Y轴则显示光密度值。
如图所示，在心失代偿患者的全血浆中可检测到的PTX3蛋白质水平(在约1∶4(0.25)和1∶16(0.0625)之间的稀释区间)在不存在EDTA的情况下比实际存在的蛋白质水平低3倍左右。但是，加入EDTA可以获得与标准曲线基本上对应的水平。
                          实施例1
                           杂交瘤
免疫
用200μg PTX3对Lewis大鼠进行皮下免疫三次，每次间隔15天。用ELISA实验评估抗体反应之后，用产生抗体滴度最高的动物进行融合。
融合方案
方法
a)制备脾细胞
——在无菌条件下，将前面免疫的大鼠的脾脏移出，用10ml的DMEM清洗3次，转移到含有3ml的DMEM培养基的塑料培养皿中，用针头将其分散和/或用注射器活塞碾碎；
——将细胞悬浮物转移到测试试管中，加入DMEM培养基至50ml并用70μm筛子过滤除去细胞聚集物；
——将脾细胞用50ml DMEM培养基清洗2次；
——Turk计数。
b)制备骨髓瘤“SP2/0”
——该骨髓瘤必须处于指数生长期而非平台期。
——用50ml的DMEM培养基清洗细胞2次。
——对其计数
c)融合
——将SP2/0细胞加入到脾细胞中，使脾细胞和骨髓瘤细胞之间的比例为5∶1；
——加入DMEM至50ml并在1700rpm离心7分钟；
——用Pasteur吸液管去除上清液，注意要全部除去；
——搅动已沉淀的细胞，用手指摇晃试管，再加入0.6ml在37℃保温的DMEM中的37％PEG；
——用Pasteur吸液管，很轻地重悬细胞，在加入PEG之后等待2分钟，然后以800rpm离心6分钟；
——用Pasteur吸液管去除上清液。重新悬浮细胞，用手指轻轻摇晃试管，并逐滴加入保温在37℃的DMEM溶液，直至体积为20ml；
——以1300rpm离心10分钟；
——去除上清液，然后用Pasteur吸液管和HAT-DMEM非常小心地重新悬浮细胞沉淀物；
——将它们稀释为1.25×106×ml浓度，然后以每孔0.2ml接种在平底的96孔板上，使得每个孔有2.5×105个细胞；
——将平板在37℃良好潮湿的温箱中温育，并在一周后检查集落的存在；
——融合后7天，除去培养基并加入200μl的新鲜HAT-DMEM；
——在融合后10至15天进行筛选；
——然后在HT-DMEM培养基中克隆阳性杂交瘤；
——经过第二轮克隆之后，可以用DMEM代替HT-DMEM培养基培养杂交瘤。
材料
DMEM培养基
(1x)DMEM                      500ml
L-谷氨酰胺                    5ml
庆大霉素                      0.5ml
杂交瘤所用培养基(DMEM)
(1x)DMEM                      500ml
*FCS                          50ml
非必需AAs                     5ml
丙酮酸钠                      5ml
L-谷氨酰胺                     5ml
庆大霉素                       0.5ml
HAT-DMEM
骨髓瘤培养基+次黄嘌呤+氨基蝶呤+胸苷
HT-DMEM
骨髓瘤培养基+次黄嘌呤+胸苷
PEG 1550(聚乙二醇1550)37％
在硬质瓶中高压灭菌7.4g PEG(Serva code 33132)。在它固化之前(大约55℃)加入12.6ml不含FCS的DMEM并充分混合。
用0.2μm的滤器过滤，每个试管分装1ml，贮存于冰箱。
                          实施例2
           用结合琼脂糖的蛋白质G纯化单克隆抗体
材料
——含有Ca和Mg的PBS：450ml蒸馏水+50ml PBS(10x)+3ml 1M NaOH；
——Sepharose Protein G 4 fast flow(Pharmaciacat.17-0618-01)：用倾析或轻度离心将树脂用PBS清洗4次，然后将其用PBS+0.1％叠氮化钠稀释至10％并贮存于冰箱；
——甘氨酸-0.1M盐酸缓冲液pH2.8：将750mg甘氨酸溶解在100ml蒸馏水中，并用280μl 37％的盐酸调节pH值为2.8；
——1.5M TRIS-HCl缓冲液pH8.8：将18.17g TRIS溶解在100ml蒸馏水中，并用37％的盐酸调节pH值为8.8；
——一个7ml的塑料微型柱(minicolumn)
方法
——用树脂Sepharose Protein G 4 fast flow灌柱使其体积为3ml；
——用20ml PBS洗柱，注意不要让树脂干掉；
——将腹水或血清用PBS以1∶3稀释，并用0.2μm的滤器过滤；
——通过树脂共4次，最后在树脂水平停止流过；
——用30ml PBS清洗；
——加入9ml pH为2.8的甘氨酸-盐酸缓冲液(一次3ml)，并在3个试管中收集洗出物；
——立刻加入100至150μl的pH为8.8的TRIS-HCl缓冲液，调节pH值为7；
——测定总蛋白，并且如有必要，用Centriplus 50或100将它们浓缩；
——用PBS透析，分装并冻存。
                        实施例3
             用于测定患者血浆中PTX3水平的方法
——用含有纯化的MNB10抗体(700ng/ml)的100μl的包被缓冲溶液(15mM碳酸盐缓冲溶液，pH9.6)包被96孔ELISA平板(NuncMaxiSorp 446612)，4℃下孵育一夜；
——将该平板用缓冲溶液(PBS+0.05％Tween 20)以300μl/孔清洗3次，然后加入300μl含有5％奶粉的清洗缓冲液，以封闭非特异性结合位点；
——在环境温度下孵育2小时后，用清洗缓冲液清洗该平板；
——在每个孔中加入50μl稀释于PBS+2％BSA+0.19％K3-EDTA中的测试血浆样品和标准重组人PTX3(从75pg/ml至1.2ng/ml)，一式两份，将该平板在37℃孵育2小时；
——用清洗缓冲液清洗该平板5次，并在每个孔中加入100μl的25ng/ml生物素化的兔抗PTX3 IgG的清洗缓冲液；
——该平板在37℃温育1小时，然后用300μl的清洗缓冲液清洗5次；
——在每个孔中加入100μl按1∶8000稀释的辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素Amdex(RPN 4401 Amersham Copenhagen，Denmark)，并将平板在环境温度下温育1小时；
——将平板用清洗缓冲液清洗5次以后，在每个孔中加入100μl的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液；
——将平板在环境温度下温育5分钟；
——在每个孔中加入50μl终止溶液(1M硫酸)；
——在终止反应后的30分钟之内在405nm处读取吸光度。
                         实施例4
                          试剂盒
一种用来测试人类生物流体中PTX3水平的试剂盒，包含有：
1.微板(microplate)：12×8孔，用大鼠抗-PTX3抗体MNB10包被；
2.含有生物素化的兔抗-PTX3 IgG的磷酸缓冲溶液；
3.含有辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素的磷酸缓冲溶液；
4.标准品：含有纯化的重组PTX3(浓度为2.4，1，0.5，0.2和0.05ng/ml)的缓冲溶液；
5.清洗缓冲液：磷酸缓冲盐(PBS)溶液；
6.稀释液(用于稀释待测定的人类生物流体)：含有1％牛血清白蛋白和0.19％K3-EDTA的磷酸缓冲盐溶液；
7.底物：稳定于0.05mol/l柠檬酸盐缓冲液(pH3.8)中的0.26mg/ml四甲基联苯胺和0.01％的过氧化氢。
8.终止溶液：1M硫酸。

Claims (23)

1.一种测定生物流体样品中的PTX3蛋白质水平的方法，包含以下步骤：
i)将96-孔ELISA平板用100μl含有大鼠单克隆抗体的溶液包被，并在4℃温育一夜；
ii)然后将该平板用缓冲溶液和能够封闭非特异性结合位点的溶液进行清洗；
iii)在环境温度下温育2小时后，将该平板再度用清洗缓冲液清洗；
iv)将稀释于合适培养基中的50μl标准重组人PTX3或待测生物流体样品加入到每个孔中，一式两份，并将该平板在37℃温育2小时；
v)将平板用清洗缓冲液反复清洗，然后再将100μl的25ng/ml生物素化抗PTX3兔IgG的清洗缓冲液加入到每个孔中；
vi)将平板在37℃温育1小时，然后用清洗缓冲液反复清洗；
vii)在每个孔中加入100μl稀释的链霉亲和素-过氧化物酶，并将平板在环境温度下温育1小时；
viii)将平板用清洗缓冲液反复清洗后，在每个孔中加入100μl的生色底物；
ix)将平板在环境温度下短暂温育，加入终止溶液，并使用自动读数器在405nm为平板读数；
其中的改进之处在于：
——在步骤(i)中使用的大鼠单克隆抗体是从杂交瘤MNB10(登录号No.ABC/PD04001)或杂交瘤Pen-3(登录号No.ABC/PD01004)中获得的抗体；
——在步骤(vii)中使用的链霉亲和素-过氧化物酶以1∶8000稀释；并且
——在步骤(viii)中使用的生色底物是四甲基联苯胺(TMB)。
2.权利要求1的方法，其特征在于步骤(i)的溶液中大鼠单克隆抗体的浓度为约700ng/ml。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于步骤(i)的溶液是包被缓冲溶液。
4.权利要求3的方法，其特征在于所述缓冲溶液含有15mM碳酸盐缓冲溶液，且pH为9.6。
5.前面权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤(ii)中使用的缓冲溶液由PBS(磷酸缓冲盐)和0.05％的Tween 20构成。
6.权利要求5的方法，其特征在于所述溶液的使用量约为300μl/孔。
7.前面权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤(ii)中使用的能够封闭非特异性结合位点的溶液由缓冲溶液中的5％奶粉溶液构成，所述缓冲溶液由PBS+0.05％Tween 20构成。
8.权利要求7的方法，其特征在于上述能封闭非特异性结合位点的溶液的使用量约为300μl/孔。
9.前面权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤(iii)中所述的清洗优选重复3次，每次每孔使用约300μl的溶液。
10.前面权利要求中任一项的方法，其特征在于步骤(iv)中使用的标准重组人PTX3以75pg/ml至1.2ng的量置于小孔中。
11.前面权利要求中任一项的方法，其特征在于用于稀释待测血浆样品的培养基由PBS+2％BSA(牛血清白蛋白)和0.18％的EDTA构成。
12.一种能产生抗-PTX3大鼠单克隆抗体的杂交瘤，其中所述杂交瘤选自MNB10(根据布达佩斯条约于2004年4月16日保藏于theAdvanced Biotechnology Centre(ABC)of Genoa，意大利，保藏号为PD04001)和Pen-3(根据布达佩斯条约于2001年8月2日保藏于theAdvanced Biotechnology Centre(ABC)of Genoa，意大利，保藏号为PD01004)。
13.一种大鼠特异性抗-PTX3的单克隆抗体，其选自从杂交瘤MNB10和Pen-3产生的单克隆抗体。
14.一种测定生物流体中的PTX3蛋白质水平的试剂盒，其特征在于它包含大鼠抗PTX3单克隆抗体。
15.权利要求14的试剂盒，其特征在于它还包含兔抗-PTX3多克隆抗体。
16.权利要求14或15的试剂盒，其特征在于它还包含纯化的重组PTX3蛋白质。
17.权利要求14至16中任一项的试剂盒，其特征在于它还包含与辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素。
18.权利要求14至17中任一项的试剂盒，其特征在于它还包含清洗缓冲液。
19.权利要求14至18中任一项的试剂盒，其特征在于它还包含用于待测生物流体样品的稀释液。
20.权利要求19的试剂盒，其特征在于所述稀释液含有EDTA。
21.权利要求14至20中任一项的试剂盒，其特征在于它还包含色原。
22.权利要求21的试剂盒，其特征在于所述色原由四甲基联苯胺溶液(TMB)构成。
23.权利要求14至20中任一项的试剂盒，其特征在于它还包含终止溶液。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104231064A (zh) * 2013-06-07 2014-12-24 王育民 抑制ptx3治疗鼻咽癌的氨基酸序列
WO2018149185A1 (zh) * 2017-02-15 2018-08-23 中国医学科学院北京协和医院 一种acpa阴性的ra诊断标志物及其应用
WO2019056991A1 (zh) * 2017-09-19 2019-03-28 臻崴生物科技有限公司 单克隆抗体或其抗原结合片段及其用途
CN112739714A (zh) * 2018-09-14 2021-04-30 元健生物医药科技(苏州)有限公司 含单株抗体或其抗原结合片段的医药组合物及其用途

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7955807B2 (en) * 2005-11-11 2011-06-07 The University Of Tokyo Method of measuring PTX3 with high sensitivity
EP1966612B1 (en) 2005-12-29 2010-03-24 Humanitas Mirasole S.p.A. Diagnostic test for inflammatory endothelial dysfunctions in pregnancies
DE602006015727D1 (de) * 2006-12-22 2010-09-02 Humanitas Mirasole Spa Verfahren zur messung von plasmaspiegeln von pentraxin ptx3
WO2008099608A1 (ja) * 2007-02-15 2008-08-21 Saitama Medical University 炎症性腸疾患の診断方法
JP5832479B2 (ja) 2012-08-09 2015-12-16 日本特殊陶業株式会社 ガスセンサ
CN111024956A (zh) * 2019-12-31 2020-04-17 江苏美克医学技术有限公司 一种检测ptx3的时间分辨荧光免疫层析试剂盒
US20230251274A1 (en) * 2020-06-25 2023-08-10 Humanitas Mirasole S.P.A. Ptx3 as prognostic marker in covid-19

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05340945A (ja) * 1992-06-05 1993-12-24 Shiseido Co Ltd 微量物質測定方法及び測定キット
JPH0875737A (ja) * 1994-09-06 1996-03-22 Fuji Yakuhin Kogyo Kk ヒト前立腺特異抗原とヒトプロテインｃインヒビターとの複合体の測定方法および同測定用キット
JPH09220096A (ja) * 1996-02-16 1997-08-26 Meiji Milk Prod Co Ltd コレラトキシン及びその中和活性の新規 高感度測定法及び同キット
AU9498098A (en) * 1997-09-22 1999-04-12 Chiron Corporation Buffers for stabilizing antigens
JP2002014098A (ja) * 2000-06-28 2002-01-18 Fujirebio Inc 免疫測定方法及びそのためのキット
ITRM20020109A1 (it) 2002-02-28 2003-08-28 Sigma Tau Ind Farmaceuti Derivati funzionali della pentraxina lunga ptx3 per preparare un vaccino autologo per la cura dei tumori.
US20040137544A1 (en) * 2002-10-31 2004-07-15 Roberto Latini PTX3 as an early prognostic indicator of cardiovascular and cerebrovascular pathologies
JP4667372B2 (ja) * 2004-02-25 2011-04-13 株式会社ペルセウスプロテオミクス 血管障害の程度の判定方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104231064A (zh) * 2013-06-07 2014-12-24 王育民 抑制ptx3治疗鼻咽癌的氨基酸序列
WO2018149185A1 (zh) * 2017-02-15 2018-08-23 中国医学科学院北京协和医院 一种acpa阴性的ra诊断标志物及其应用
WO2019056991A1 (zh) * 2017-09-19 2019-03-28 臻崴生物科技有限公司 单克隆抗体或其抗原结合片段及其用途
WO2019057024A1 (zh) * 2017-09-19 2019-03-28 王育民 含单克隆抗体或其抗原结合片段的医药组成物及其用途
CN112739714A (zh) * 2018-09-14 2021-04-30 元健生物医药科技(苏州)有限公司 含单株抗体或其抗原结合片段的医药组合物及其用途
CN112739714B (zh) * 2018-09-14 2023-11-14 元健生物医药科技(苏州)有限公司 含单株抗体或其抗原结合片段的医药组合物及其用途

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