JPH09220096A - コレラトキシン及びその中和活性の新規 高感度測定法及び同キット - Google Patents
コレラトキシン及びその中和活性の新規 高感度測定法及び同キットInfo
- Publication number
- JPH09220096A JPH09220096A JP5254396A JP5254396A JPH09220096A JP H09220096 A JPH09220096 A JP H09220096A JP 5254396 A JP5254396 A JP 5254396A JP 5254396 A JP5254396 A JP 5254396A JP H09220096 A JPH09220096 A JP H09220096A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cholera toxin
- biotin
- measuring
- bound
- polystyrene beads
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ビーズ上に結合したＧＭ1と、ビオチン
−コレラトキシン結合物（Ｂ−ＣＴ−Ｂ）と反応させて
結合し、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｈ
ＲＰ−ＳＡ）を反応させて結合させた後、発色基質（例
えばＴＭＢＺ）を加えてＨＲＰが発色基質を分解して生
ずる色を比色定量する。 【効果】 コレラトキシンが高感度で測定できるのみで
なく、その中和活性も高感度で測定できる。
−コレラトキシン結合物（Ｂ−ＣＴ−Ｂ）と反応させて
結合し、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｈ
ＲＰ−ＳＡ）を反応させて結合させた後、発色基質（例
えばＴＭＢＺ）を加えてＨＲＰが発色基質を分解して生
ずる色を比色定量する。 【効果】 コレラトキシンが高感度で測定できるのみで
なく、その中和活性も高感度で測定できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エンザイムアッセ
イ、更に詳細には、コレラトキシン及びその中和活性の
新規高感度測定法に関するものであり、また、それに用
いる測定用キットに関するものである。
イ、更に詳細には、コレラトキシン及びその中和活性の
新規高感度測定法に関するものであり、また、それに用
いる測定用キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】コレラトキシン（以下、ＣＴということ
もある）は、別名コレラ毒素又はコレラゲンとも呼ば
れ、コレラ菌（ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈ
ｏｌｅｒａｅ））が産生する毒性タンパク質である。ま
た本分子は、ＡＤＰリポシル化活性をもつＡサブユニッ
ト１個と、腸管細胞表面上のレセプターであるモノシア
ロガングリオシドＧＭ1と認識・結合する能力を持つ５
−６個のＢサブユニットから成る分子量８４，０００の
タンパク質である。ＣＴの示す毒性の本体は、Ａサブユ
ニットが発現し、Ｂサブユニットは細胞表面にまず始め
にトキシン分子を接着・結合させる重要な働きを有して
いる。
もある）は、別名コレラ毒素又はコレラゲンとも呼ば
れ、コレラ菌（ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈ
ｏｌｅｒａｅ））が産生する毒性タンパク質である。ま
た本分子は、ＡＤＰリポシル化活性をもつＡサブユニッ
ト１個と、腸管細胞表面上のレセプターであるモノシア
ロガングリオシドＧＭ1と認識・結合する能力を持つ５
−６個のＢサブユニットから成る分子量８４，０００の
タンパク質である。ＣＴの示す毒性の本体は、Ａサブユ
ニットが発現し、Ｂサブユニットは細胞表面にまず始め
にトキシン分子を接着・結合させる重要な働きを有して
いる。
【０００３】つまり、コレラ菌が腸管感染し、増殖した
菌体の生産するコレラトキシン（ＣＴ）は、腸管に存在
する糖脂質（モノシアロガングリオシドＧＭ1、以下単
にＧＭ1ということもある）を認識・結合して毒性を発
現するのであるが、これは、トキシン分子中のＢサブユ
ニットがＧＭ1中の結合糖鎖の非還元末端に位置するシ
アル酸分子を主として認識し結合することに始まり、つ
いで、トキシン中のＡサブユニットが細胞内に進入し、
アデニレート・サイクラーゼの継続的な活性化が起こ
り、最終的にサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の濃度上
昇により重篤な症状を呈することが知られている。しか
しながら、完全な毒性発現機構は解明されていない。そ
こで、食品衛生学的視点からのみならず、医学・薬学的
視点からも、トキシン活性の微量高感度検出システムの
構築が切望されている。
菌体の生産するコレラトキシン（ＣＴ）は、腸管に存在
する糖脂質（モノシアロガングリオシドＧＭ1、以下単
にＧＭ1ということもある）を認識・結合して毒性を発
現するのであるが、これは、トキシン分子中のＢサブユ
ニットがＧＭ1中の結合糖鎖の非還元末端に位置するシ
アル酸分子を主として認識し結合することに始まり、つ
いで、トキシン中のＡサブユニットが細胞内に進入し、
アデニレート・サイクラーゼの継続的な活性化が起こ
り、最終的にサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の濃度上
昇により重篤な症状を呈することが知られている。しか
しながら、完全な毒性発現機構は解明されていない。そ
こで、食品衛生学的視点からのみならず、医学・薬学的
視点からも、トキシン活性の微量高感度検出システムの
構築が切望されている。
【０００４】一方、この反応初期におけるＣＴ−ＧＭ1
間の認識・結合を競合的に阻害する成分が、反応系に仮
に存在する場合には、この毒性の発現は中和・低減され
ることになる。この成分は、「コレラトキシン中和活性
成分」と呼ばれている。本成分は、基本的にはＧＭ1に
結合する糖鎖構造と近似した糖鎖アナログを持つ糖タン
パク質成分等であり、牛乳中にはκ−カゼインやそのキ
モシン消化に伴い生成するカゼイノグリコペプチド（Ｃ
ＧＰ）がコレラトキシン中和活性を示すことが既に知ら
れている。従来の本中和成分の示すＣＴ中和活性の測定
法には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の
異形化や、ｃＡＭＰの亢進を検出する方法、およびＧＭ
1を直接コートしペルオキシダーゼ標識コレラトキシン
Ｂサブユニット（以下、Ｐ−ＣＴ−Ｂということもあ
る）を用いたマイクロプレートによる競合阻害法が既に
報告されている（以下、マイクロプレート法ということ
もある：Kawasaki et al., Biosci. Biotech. Bioche
m., 56(2), 1992）。
間の認識・結合を競合的に阻害する成分が、反応系に仮
に存在する場合には、この毒性の発現は中和・低減され
ることになる。この成分は、「コレラトキシン中和活性
成分」と呼ばれている。本成分は、基本的にはＧＭ1に
結合する糖鎖構造と近似した糖鎖アナログを持つ糖タン
パク質成分等であり、牛乳中にはκ−カゼインやそのキ
モシン消化に伴い生成するカゼイノグリコペプチド（Ｃ
ＧＰ）がコレラトキシン中和活性を示すことが既に知ら
れている。従来の本中和成分の示すＣＴ中和活性の測定
法には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の
異形化や、ｃＡＭＰの亢進を検出する方法、およびＧＭ
1を直接コートしペルオキシダーゼ標識コレラトキシン
Ｂサブユニット（以下、Ｐ−ＣＴ−Ｂということもあ
る）を用いたマイクロプレートによる競合阻害法が既に
報告されている（以下、マイクロプレート法ということ
もある：Kawasaki et al., Biosci. Biotech. Bioche
m., 56(2), 1992）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、食品衛生学
的視点のみならず、医学・薬学的視点から、ＣＴ活性の
微量高感度検出システムの構築が切望されている当業界
の技術の現状に鑑み、感度の高いすぐれたＣＴ測定シス
テムを新たに開発する目的でなされたものである。
的視点のみならず、医学・薬学的視点から、ＣＴ活性の
微量高感度検出システムの構築が切望されている当業界
の技術の現状に鑑み、感度の高いすぐれたＣＴ測定シス
テムを新たに開発する目的でなされたものである。
【０００６】また、本発明は、正確な数値化によりＣＴ
中和成分間の相対評価が必要であるとの視点から、そし
てまた新規ＣＴ中和成分つまり新規ＣＴ解毒剤の開発な
いしスクリーニングという視点から、感度の高いすぐれ
たＣＴ中和活性測定システムを新たに開発する目的でな
されたものである。
中和成分間の相対評価が必要であるとの視点から、そし
てまた新規ＣＴ中和成分つまり新規ＣＴ解毒剤の開発な
いしスクリーニングという視点から、感度の高いすぐれ
たＣＴ中和活性測定システムを新たに開発する目的でな
されたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、従来法について検
討したが、先ず、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞の異形化による方法は、現象面の特徴を捉える
方法であって、定量はできないし、また、ｃＡＭＰの亢
進を検出する方法は、やはり細胞を用いるために実験設
定が煩雑であり、しかも結果が出るまでに長時間を要す
る。
成するためになされたものであって、従来法について検
討したが、先ず、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞の異形化による方法は、現象面の特徴を捉える
方法であって、定量はできないし、また、ｃＡＭＰの亢
進を検出する方法は、やはり細胞を用いるために実験設
定が煩雑であり、しかも結果が出るまでに長時間を要す
る。
【０００８】一方、川崎らにより既に報告されている、
マイクロプレート法は、研究室にマイクロプレートリー
ダーがあれば、比較的短時間に簡便に定量的なデータを
得ることが可能である。彼らの方法では、ＧＭ1を直接
コートしたマイクロプレートを用意し、ＣＴを含む試料
を反応させ、発色させたのち、マイクロプレートリーダ
ーで読みとる方法であって、すぐれた方法である。本発
明者らは、このマイクロプレート法の利点に着目し、更
に詳細に検討の結果、後記するようにマイクロプレート
法にも未だ改良すべき点が各種存在することを認め、そ
してこれらの改良に成功し、目的とする高感度測定シス
テムの開発に成功するとともに、このシステムを利用す
ることによって中和活性の高感度測定も可能となること
も発見し、遂に本発明の完成に至ったものである。
マイクロプレート法は、研究室にマイクロプレートリー
ダーがあれば、比較的短時間に簡便に定量的なデータを
得ることが可能である。彼らの方法では、ＧＭ1を直接
コートしたマイクロプレートを用意し、ＣＴを含む試料
を反応させ、発色させたのち、マイクロプレートリーダ
ーで読みとる方法であって、すぐれた方法である。本発
明者らは、このマイクロプレート法の利点に着目し、更
に詳細に検討の結果、後記するようにマイクロプレート
法にも未だ改良すべき点が各種存在することを認め、そ
してこれらの改良に成功し、目的とする高感度測定シス
テムの開発に成功するとともに、このシステムを利用す
ることによって中和活性の高感度測定も可能となること
も発見し、遂に本発明の完成に至ったものである。
【０００９】すなわち、本発明におけるＣＴの測定方法
の基本原理は、ＣＴ分子中のＢサブユニット（以下、Ｃ
Ｔ−Ｂということもある）がレセプターＧＭ1に特異的
に結合する特性を利用するものである。図１にレセプタ
ーＧＭ1糖鎖の化学構造を示したが、コレラトキシンＢ
サブユニットは、本糖鎖中の点線で示したシアル酸とガ
ラクトースの結合部位（エピトープ部位）を特に良く認
識し、結合するものである。本発明に係る測定法の基本
原理は、上記した特性を利用したものであって、このレ
セプターＧＭ1を特定の担体に結合させておき、そこに
ＣＴが含まれていることが予想される試料を加え、結合
したＣＴ量を量特異的に発色に導き、比色定量すること
により間接的にＣＴ結合量を知ることからなる。
の基本原理は、ＣＴ分子中のＢサブユニット（以下、Ｃ
Ｔ−Ｂということもある）がレセプターＧＭ1に特異的
に結合する特性を利用するものである。図１にレセプタ
ーＧＭ1糖鎖の化学構造を示したが、コレラトキシンＢ
サブユニットは、本糖鎖中の点線で示したシアル酸とガ
ラクトースの結合部位（エピトープ部位）を特に良く認
識し、結合するものである。本発明に係る測定法の基本
原理は、上記した特性を利用したものであって、このレ
セプターＧＭ1を特定の担体に結合させておき、そこに
ＣＴが含まれていることが予想される試料を加え、結合
したＣＴ量を量特異的に発色に導き、比色定量すること
により間接的にＣＴ結合量を知ることからなる。
【００１０】マイクロプレート法を改良するため、以下
のような検討を行った。すなわち、レセプターＧＭ1を
結合させる方法、素材、レセプター以外へのＣＴの非特
異的結合を防止するためのブロッキング剤と必要時間の
検討、ＣＴの標識方法の検討、最終的な発色基質の選択
等の検討を行った。なお、この際には、実験の安全性を
考慮して、ＣＴとしては、ＣＴ分子全体を使用しない
で、Ｂサブユニット（ＣＴ−Ｂ）のみを使用することと
した。具体的検討項目は、次のとおりである。
のような検討を行った。すなわち、レセプターＧＭ1を
結合させる方法、素材、レセプター以外へのＣＴの非特
異的結合を防止するためのブロッキング剤と必要時間の
検討、ＣＴの標識方法の検討、最終的な発色基質の選択
等の検討を行った。なお、この際には、実験の安全性を
考慮して、ＣＴとしては、ＣＴ分子全体を使用しない
で、Ｂサブユニット（ＣＴ−Ｂ）のみを使用することと
した。具体的検討項目は、次のとおりである。
【００１１】検討項目 （１）レセプターＧＭ1吸着基材の検討 本発明では、レセプターＧＭ1を吸着・固定化する必要
性があり、川崎らの報告しているマイクロプレートへの
直接塗沫法および免疫化学分野で汎用されているポリス
チレンビーズへのコーティング法の優劣を検討した。こ
の実験結果は、図４に示した。 （２）ＧＭ1溶解溶媒の検討 レセプターＧＭ1を完全に溶解させ、定量的に分注させ
るためには、最適な溶解溶媒の選択が不可欠である。溶
解溶媒には、蒸留水、メタノール、エタノール、５０％
エタノールの４種の優劣を検討した。 （３）ブロッキング剤およびブロッキング時間の検討 レセプターＧＭ1を吸着・結合させた場合でも、必ず結
合していない部位が存在している。この様な部位を、反
応に関与しない安全な他の分子によりマスキングをして
おかないと、次の反応において、非特異的な吸着が起こ
り、ＣＴの定量性は失われる。このような際に必要な操
作を「ブロッキング」といい、用いる試薬を「ブロッキ
ング剤」と呼ぶ。ブロッキング剤には、この分野で汎用
されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン（１、
３、５％）、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、
ＥＩＡグレード、０．０２５、０．０５および０．１％
になるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）に溶
解）等を検討した。また、ブロッキング時間は０、１、
３および２０時間を検討した。これらの実験結果は、図
５に示した。 （４）ポリスチレンビーズの洗浄回数の検討 ＰＢＳを用いて１〜１０回洗浄し、比較検討した。 （５）ＣＴ−Ｂの標識方法の検討 本実験には、安全のためＣＴのＢサブユニット（ＣＴ−
Ｂ）を用いた。すなわち、ＣＴ−Ｂを低分子のビオチン
で標識し、ついでアビジンと反応させる方法（ビオチン
・アビジンシステム）と、ＣＴ−Ｂを直接ペルオキシダ
ーゼ標識する２法について、その安定性、反応性、保存
性等の優劣を検討した。 （６）ポリスチレンビーズとＣＴ−Ｂとの反応性の検討 ポリスチレンビーズとビオチニル化ＣＴ−Ｂ（Ｂ−ＣＴ
−Ｂ）を１０分、１時間、６、１２および２０時間反応
させ発色性の優劣を検討した。 （７）西洋わさびペルオキシダーゼ標識−ストレプトア
ビジン（ＨＲＰ−ＳＡ）希釈条件の検討 ＣＴ−Ｂをビオチンで標識させた場合のみ、次の反応と
してアビジンを結合させる。本実験では、ビオチンに卵
白ではなく微生物から調製したストレプトアビジン（Ｓ
Ａ）を、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識
した西洋わさびペルオキシダーゼ標識・ストレプトアビ
ジン（ＨＲＰ−ＳＡ）を用いた。本試薬の希釈溶媒に
は、蒸留水またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）の２種を検討
した。また、ＨＲＰ−ＳＡ原液試薬（市販品）を１００
０、２０００、４０００、６０００および８０００倍希
釈したのちの、保存性および発色性を検討した。 （８）ＨＲＰ−ＳＡの反応温度条件の検討 ＧＭ1ビーズにＢ−ＣＴ−Ｂを反応させ、６０００倍希
釈のＨＲＰ−ＳＡを加え、室温または３７℃で３０分反
応させて、発色性を検討した。 （９）発色基質の検討 最終的に、ストレプトアビジンの結合量により、ＣＴ−
Ｂの結合量を定量するのが、本発明の測定原理である。
ストレプトアビジンの結合量は、過酸化水素水を添加し
た発色試薬の呈色度をマイクロプレートリーダーで測定
することで、定量データを得る。
性があり、川崎らの報告しているマイクロプレートへの
直接塗沫法および免疫化学分野で汎用されているポリス
チレンビーズへのコーティング法の優劣を検討した。こ
の実験結果は、図４に示した。 （２）ＧＭ1溶解溶媒の検討 レセプターＧＭ1を完全に溶解させ、定量的に分注させ
るためには、最適な溶解溶媒の選択が不可欠である。溶
解溶媒には、蒸留水、メタノール、エタノール、５０％
エタノールの４種の優劣を検討した。 （３）ブロッキング剤およびブロッキング時間の検討 レセプターＧＭ1を吸着・結合させた場合でも、必ず結
合していない部位が存在している。この様な部位を、反
応に関与しない安全な他の分子によりマスキングをして
おかないと、次の反応において、非特異的な吸着が起こ
り、ＣＴの定量性は失われる。このような際に必要な操
作を「ブロッキング」といい、用いる試薬を「ブロッキ
ング剤」と呼ぶ。ブロッキング剤には、この分野で汎用
されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン（１、
３、５％）、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、
ＥＩＡグレード、０．０２５、０．０５および０．１％
になるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）に溶
解）等を検討した。また、ブロッキング時間は０、１、
３および２０時間を検討した。これらの実験結果は、図
５に示した。 （４）ポリスチレンビーズの洗浄回数の検討 ＰＢＳを用いて１〜１０回洗浄し、比較検討した。 （５）ＣＴ−Ｂの標識方法の検討 本実験には、安全のためＣＴのＢサブユニット（ＣＴ−
Ｂ）を用いた。すなわち、ＣＴ−Ｂを低分子のビオチン
で標識し、ついでアビジンと反応させる方法（ビオチン
・アビジンシステム）と、ＣＴ−Ｂを直接ペルオキシダ
ーゼ標識する２法について、その安定性、反応性、保存
性等の優劣を検討した。 （６）ポリスチレンビーズとＣＴ−Ｂとの反応性の検討 ポリスチレンビーズとビオチニル化ＣＴ−Ｂ（Ｂ−ＣＴ
−Ｂ）を１０分、１時間、６、１２および２０時間反応
させ発色性の優劣を検討した。 （７）西洋わさびペルオキシダーゼ標識−ストレプトア
ビジン（ＨＲＰ−ＳＡ）希釈条件の検討 ＣＴ−Ｂをビオチンで標識させた場合のみ、次の反応と
してアビジンを結合させる。本実験では、ビオチンに卵
白ではなく微生物から調製したストレプトアビジン（Ｓ
Ａ）を、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識
した西洋わさびペルオキシダーゼ標識・ストレプトアビ
ジン（ＨＲＰ−ＳＡ）を用いた。本試薬の希釈溶媒に
は、蒸留水またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）の２種を検討
した。また、ＨＲＰ−ＳＡ原液試薬（市販品）を１００
０、２０００、４０００、６０００および８０００倍希
釈したのちの、保存性および発色性を検討した。 （８）ＨＲＰ−ＳＡの反応温度条件の検討 ＧＭ1ビーズにＢ−ＣＴ−Ｂを反応させ、６０００倍希
釈のＨＲＰ−ＳＡを加え、室温または３７℃で３０分反
応させて、発色性を検討した。 （９）発色基質の検討 最終的に、ストレプトアビジンの結合量により、ＣＴ−
Ｂの結合量を定量するのが、本発明の測定原理である。
ストレプトアビジンの結合量は、過酸化水素水を添加し
た発色試薬の呈色度をマイクロプレートリーダーで測定
することで、定量データを得る。
【００１２】そこで、以下の３種類の発色基質を用い、
安定性および感度等を比較検討した。 基質１；０．０５％過酸化水素水：０．０８％５−アミ
ノサリチル酸＝９：１、ＮａＯＨでｐＨ６．０に調整。
波長４５０ｎｍでの吸光度測定。 基質２；０．１％２，２′アジノビス（３−エチレンベ
ンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、０．
００３％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．０）、波長４０５ｎｍでの吸光度測定。 基質３；ＴＭＢＺ（住友ベークライト（株）製、ＭＬ−
１１２０Ｔ）、波長４５０ｎｍでの吸光度測定 基質１は、他の２つと比べて、極めて呈色性が低かった
ので、基質２と３を比較検討した。この実験結果は、図
６に示した。
安定性および感度等を比較検討した。 基質１；０．０５％過酸化水素水：０．０８％５−アミ
ノサリチル酸＝９：１、ＮａＯＨでｐＨ６．０に調整。
波長４５０ｎｍでの吸光度測定。 基質２；０．１％２，２′アジノビス（３−エチレンベ
ンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、０．
００３％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．０）、波長４０５ｎｍでの吸光度測定。 基質３；ＴＭＢＺ（住友ベークライト（株）製、ＭＬ−
１１２０Ｔ）、波長４５０ｎｍでの吸光度測定 基質１は、他の２つと比べて、極めて呈色性が低かった
ので、基質２と３を比較検討した。この実験結果は、図
６に示した。
【００１３】上記した各反応条件の詳細な検討により、
以下の条件がＣＴの測定及び中和活性の測定に適してい
ることが示唆された。
以下の条件がＣＴの測定及び中和活性の測定に適してい
ることが示唆された。
【００１４】すなわち、ＣＭ1吸着基材にはポリスチレ
ンビーズが、マイクロプレートよりも吸着能が約５倍程
度強く、かつ非特異的結合の極めて少ない点などが優れ
ていた。マイクロプレートに直接ＧＭ1をコーティング
する川崎らの方法では、特にこのウエルに対するＣＴ−
ＢやＨＲＰ−ＳＡの非特異的な吸着が防げず、高いバッ
クグラウンドと感度の低さに繋がることが判明し、ポリ
スチレン法が大変優れていると考えられてた。また、Ｇ
Ｍ1溶解溶媒については１００％エタノールが、最も安
定した溶解性と定量的なコーティング性を示し、優れて
いた。ブロッキング剤は３％ＢＳＡを含むＰＢＳが最も
ブロッキング効果が高く、また３時間のブロッキング時
間が最適であった。ビーズの洗浄剤にはＰＢＳが適して
おり、洗浄回数の検討の結果では、３回洗浄が適当であ
った。ＣＴ−Ｂの標識法としてはビオチン標識が同分子
を直接ペルオキシダーゼ標識する方法よりも感度や保存
性において優れていた。ビオチンと特異的に反応するＨ
ＲＰ−ＳＡの希釈方法では、ＰＢＳによる６０００倍希
釈、反応は室温で行うので最適であった。重要な発色基
質の選択については、最近開発されたＴＭＢＺが最も安
定かつ高感度に検出できることが確認された。これらの
結果は、下記表１にまとめて示した。
ンビーズが、マイクロプレートよりも吸着能が約５倍程
度強く、かつ非特異的結合の極めて少ない点などが優れ
ていた。マイクロプレートに直接ＧＭ1をコーティング
する川崎らの方法では、特にこのウエルに対するＣＴ−
ＢやＨＲＰ−ＳＡの非特異的な吸着が防げず、高いバッ
クグラウンドと感度の低さに繋がることが判明し、ポリ
スチレン法が大変優れていると考えられてた。また、Ｇ
Ｍ1溶解溶媒については１００％エタノールが、最も安
定した溶解性と定量的なコーティング性を示し、優れて
いた。ブロッキング剤は３％ＢＳＡを含むＰＢＳが最も
ブロッキング効果が高く、また３時間のブロッキング時
間が最適であった。ビーズの洗浄剤にはＰＢＳが適して
おり、洗浄回数の検討の結果では、３回洗浄が適当であ
った。ＣＴ−Ｂの標識法としてはビオチン標識が同分子
を直接ペルオキシダーゼ標識する方法よりも感度や保存
性において優れていた。ビオチンと特異的に反応するＨ
ＲＰ−ＳＡの希釈方法では、ＰＢＳによる６０００倍希
釈、反応は室温で行うので最適であった。重要な発色基
質の選択については、最近開発されたＴＭＢＺが最も安
定かつ高感度に検出できることが確認された。これらの
結果は、下記表１にまとめて示した。
【００１５】
【表１】
【００１６】すなわち本発明は、これらの検討結果を基
礎とし、更に研究の結果完成されたものであって、ＧＭ
1吸着素材にマイクロプレートではなくポリスチレンビ
ーズを使用し、ＣＴ−Ｂの標識方法としてビオチン標識
を新たに採用し、より高度なアビジン−ビオチンシステ
ムの導入、及び最近開発された高感度基質を、それぞれ
新たに採用しただけでなく、これらを有機的に組み合わ
せたことを特徴とするものである。
礎とし、更に研究の結果完成されたものであって、ＧＭ
1吸着素材にマイクロプレートではなくポリスチレンビ
ーズを使用し、ＣＴ−Ｂの標識方法としてビオチン標識
を新たに採用し、より高度なアビジン−ビオチンシステ
ムの導入、及び最近開発された高感度基質を、それぞれ
新たに採用しただけでなく、これらを有機的に組み合わ
せたことを特徴とするものである。
【００１７】本発明は、上記した基本的特徴を有するも
のであり、本発明に係るコレラトキシン測定法の基本的
ステップは次のとおりである（図２）。
のであり、本発明に係るコレラトキシン測定法の基本的
ステップは次のとおりである（図２）。
【００１８】（１）コレラトキシンと結合するレセプタ
ー分子であるガングリオシドＧＭ1をポリスチレンビー
ズ上にコーディングする。 （２）ビーズ上に結合したＧＭ1と、事前にビオチンを
結合させたコレラトキシン（ビオチン標識コレラトキシ
ンＢサブユニット）を反応させて結合させる。 （３）ビオチンにアビジンが結合する性質を利用して、
前もってペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させたスト
レプトアビジンをビーズ上のビオチン−コレラトキシン
結合物と反応させて結合させる。 （４）最終的には、ここで結合したペルオキシダーゼが
発色基質を分解して生ずる色を比色定量することによっ
て、コレラトキシンの量が測定できることになる。
ー分子であるガングリオシドＧＭ1をポリスチレンビー
ズ上にコーディングする。 （２）ビーズ上に結合したＧＭ1と、事前にビオチンを
結合させたコレラトキシン（ビオチン標識コレラトキシ
ンＢサブユニット）を反応させて結合させる。 （３）ビオチンにアビジンが結合する性質を利用して、
前もってペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させたスト
レプトアビジンをビーズ上のビオチン−コレラトキシン
結合物と反応させて結合させる。 （４）最終的には、ここで結合したペルオキシダーゼが
発色基質を分解して生ずる色を比色定量することによっ
て、コレラトキシンの量が測定できることになる。
【００１９】本発明に係るコレラトキシン中和活性測定
法の基本的ステップは、図３に示したように、上記ステ
ップ（２）の反応を行う前に、コレラトキシンと結合す
る性質を持つと思われる試験成分（この場合カゼイノグ
リコペプチド）を混合して反応させる。その後、ステッ
プ（３）以下の反応を行わせる。すると、前もって試験
成分を結合したコレラトキシンはポリスチレンビーズ上
のＧＭ1と結合できなくなるため、最終的なコレラトキ
シン測定値が低下する。この低下分が試験成分のコレラ
トキシン中和活性値となる。
法の基本的ステップは、図３に示したように、上記ステ
ップ（２）の反応を行う前に、コレラトキシンと結合す
る性質を持つと思われる試験成分（この場合カゼイノグ
リコペプチド）を混合して反応させる。その後、ステッ
プ（３）以下の反応を行わせる。すると、前もって試験
成分を結合したコレラトキシンはポリスチレンビーズ上
のＧＭ1と結合できなくなるため、最終的なコレラトキ
シン測定値が低下する。この低下分が試験成分のコレラ
トキシン中和活性値となる。
【００２０】
【発明の実施の形態】ＧＭ1を吸着する担体としては、
従来法のようにマイクロプレートではなく、ポリスチレ
ンビーズを用いる。ポリスチレンビーズとしては、市販
品を含め各種のポリスチレンビーズが適宜使用される。
従来法のようにマイクロプレートではなく、ポリスチレ
ンビーズを用いる。ポリスチレンビーズとしては、市販
品を含め各種のポリスチレンビーズが適宜使用される。
【００２１】該ビーズ上のビオチン−コレラトキシン結
合物と反応、結合せしめるアビジンとしては、卵白由来
のアビジンのほか、微生物由来のストレプトアビジン
（以下、ＳＡということもある）等各種のアビジンが適
宜使用される。
合物と反応、結合せしめるアビジンとしては、卵白由来
のアビジンのほか、微生物由来のストレプトアビジン
（以下、ＳＡということもある）等各種のアビジンが適
宜使用される。
【００２２】アビジンには酵素を結合する。酵素として
は、エンザイムアッセイに常用される酵素が広く使用さ
れ、例えば（西洋ワサビ）ペルオキシダーゼ、（大腸
菌）β−ガラクトシダーゼ、（ウシ小腸）アルカリホス
ファターゼ等が広く使用できる。これら酵素の発色基質
としては、β−ガラクトシダーゼの場合は、Ｏ−ニトロ
フェニル−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフ
ェリル−ガラクトピラノシド等が使用され、アルカリホ
スファターゼの場合は、ｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト、４−メチルウンベリフェリル−ホスフェート等が使
用される。
は、エンザイムアッセイに常用される酵素が広く使用さ
れ、例えば（西洋ワサビ）ペルオキシダーゼ、（大腸
菌）β−ガラクトシダーゼ、（ウシ小腸）アルカリホス
ファターゼ等が広く使用できる。これら酵素の発色基質
としては、β−ガラクトシダーゼの場合は、Ｏ−ニトロ
フェニル−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフ
ェリル−ガラクトピラノシド等が使用され、アルカリホ
スファターゼの場合は、ｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト、４−メチルウンベリフェリル−ホスフェート等が使
用される。
【００２３】ペルオキシダーゼの発色基質としては、Ｏ
−フェニレンジアミン、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、
２，２′−アジノビス（３−エチレンベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、等既知の物質が使用
できるほか、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジ
ジン（ＴＭＢＺ）、同、ジハイドロクロライド、ジハイ
ドレート（ＴＭＢＺ・ＨＣｌ）、Ｎ−（３−スルホプロ
ピル）−３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジ
ン、ナトリウム塩（ＴＭＢＺ・ＰＳ）が使用できる。本
発明においては、特に酵素として西洋のワサビペルオキ
シダーゼ（以下、ＨＲＰということもある）を用い、発
色基質として特にＴＭＢＺ原物質及び同誘導体を用いた
場合に、すぐれた高感度測定が達成された。
−フェニレンジアミン、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、
２，２′−アジノビス（３−エチレンベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、等既知の物質が使用
できるほか、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジ
ジン（ＴＭＢＺ）、同、ジハイドロクロライド、ジハイ
ドレート（ＴＭＢＺ・ＨＣｌ）、Ｎ−（３−スルホプロ
ピル）−３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジ
ン、ナトリウム塩（ＴＭＢＺ・ＰＳ）が使用できる。本
発明においては、特に酵素として西洋のワサビペルオキ
シダーゼ（以下、ＨＲＰということもある）を用い、発
色基質として特にＴＭＢＺ原物質及び同誘導体を用いた
場合に、すぐれた高感度測定が達成された。
【００２４】以下、本発明の実施例について述べる。
【００２５】
【実施例１】コレラトキシンが含まれるモデル試料とし
てＣＴ−Ｂを用い、これをビオチン標識した結合物（Ｂ
−ＣＴ−Ｂ）とし、Ｂ−ＣＴ−Ｂについて、以下により
測定を行った。
てＣＴ−Ｂを用い、これをビオチン標識した結合物（Ｂ
−ＣＴ−Ｂ）とし、Ｂ−ＣＴ−Ｂについて、以下により
測定を行った。
【００２６】（１）先ずはじめに、使用する市販のポリ
スチレンビーズ（直径３．２ｍｍ、和光純薬工業（株）
製、Ｎｏ．１６３−１１２９）をメタノール中で６０
℃、３０分間振とうし、事前洗浄した。 （２）ビーズへの均質かつ定量的なレセプターＧＭ1の
吸着方法は、試験管に５０個のビーズを入れ、これに３
ｍｌのエタノールと１．２５μｇのＧＭ1を加え、３７
℃で３時間振とうすることにより行った。 （３）ＧＭ1吸着ビーズを、マイクロプレート（住友ベ
ークライト、平底９６穴、ＭＳ−８０９６Ｆ）の各ウエ
ルに１個ずつ入れ、各ウエルに３％ＢＳＡを含むブロッ
キング剤を３３０μｌ加えビーズおよびプレートウエル
におけるＧＭ1の非吸着部位をブロッキングした。 （４）０．２５％ＢＳＡおよび０．１７５Ｍ ＮａＣｌ
を含むＰＢＳにビオチニル化ＣＴ−Ｂ（Ｂ−ＣＴ−Ｂ）
を溶解し、各ウエルに１００μｌずつ加え、振とうして
ビーズに吸着させた。 （５）ビーズをＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ−ＳＡ（ＺＹＭ
ＥＤ社製、Ｎｏ．４３−４３２３）をＰＢＳで６０００
倍希釈した溶液を１００μｌ加え、３０分間反応させ
た。 （６）ビーズをＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢＺ基質溶液を１
００μｌ加え、室温で１時間振とうして発色させ、マイ
クロプレートリーダーを用いて吸光度（４５０ｎｍ）を
測定した。
スチレンビーズ（直径３．２ｍｍ、和光純薬工業（株）
製、Ｎｏ．１６３−１１２９）をメタノール中で６０
℃、３０分間振とうし、事前洗浄した。 （２）ビーズへの均質かつ定量的なレセプターＧＭ1の
吸着方法は、試験管に５０個のビーズを入れ、これに３
ｍｌのエタノールと１．２５μｇのＧＭ1を加え、３７
℃で３時間振とうすることにより行った。 （３）ＧＭ1吸着ビーズを、マイクロプレート（住友ベ
ークライト、平底９６穴、ＭＳ−８０９６Ｆ）の各ウエ
ルに１個ずつ入れ、各ウエルに３％ＢＳＡを含むブロッ
キング剤を３３０μｌ加えビーズおよびプレートウエル
におけるＧＭ1の非吸着部位をブロッキングした。 （４）０．２５％ＢＳＡおよび０．１７５Ｍ ＮａＣｌ
を含むＰＢＳにビオチニル化ＣＴ−Ｂ（Ｂ−ＣＴ−Ｂ）
を溶解し、各ウエルに１００μｌずつ加え、振とうして
ビーズに吸着させた。 （５）ビーズをＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ−ＳＡ（ＺＹＭ
ＥＤ社製、Ｎｏ．４３−４３２３）をＰＢＳで６０００
倍希釈した溶液を１００μｌ加え、３０分間反応させ
た。 （６）ビーズをＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢＺ基質溶液を１
００μｌ加え、室温で１時間振とうして発色させ、マイ
クロプレートリーダーを用いて吸光度（４５０ｎｍ）を
測定した。
【００２７】本法は、従来のマイクロプレート法と比較
して、主として以下の点において相違しており、すぐれ
ている。 （１）レセプターＧＭ1を、マイクロプレートに直接塗
沫せず、ポリスチレンビーズの表面にコーティングし
た。これにより、非特異的な吸着によるバックグラウン
ドの高まりを抑えることが出来た。 （２）ＣＴ試料は、直接ＨＲＰで標識せず、ビオチンに
より標識した。これにより、反応ステップは、一段階多
くなるが、感度は向上した。すなわち、ビオチン−アビ
ジン反応により、より高感度にＣＴを検出することが出
来た。 （３）発色基質に、より高感度のＴＭＢＺを用いたこと
で、感度を向上させることが出来た。
して、主として以下の点において相違しており、すぐれ
ている。 （１）レセプターＧＭ1を、マイクロプレートに直接塗
沫せず、ポリスチレンビーズの表面にコーティングし
た。これにより、非特異的な吸着によるバックグラウン
ドの高まりを抑えることが出来た。 （２）ＣＴ試料は、直接ＨＲＰで標識せず、ビオチンに
より標識した。これにより、反応ステップは、一段階多
くなるが、感度は向上した。すなわち、ビオチン−アビ
ジン反応により、より高感度にＣＴを検出することが出
来た。 （３）発色基質に、より高感度のＴＭＢＺを用いたこと
で、感度を向上させることが出来た。
【００２８】
【実施例２】ＣＴ中和活性を有する物質として既知の
「カゼイノグリコペプチド（ＣＧＰ）」をモデル中和活
性物質として用い、ＣＴの毒性を中和・低減化する現象
が、本発明で開発された新コレラトキシン測定法により
正当に評価できることを、以下により確認した。
「カゼイノグリコペプチド（ＣＧＰ）」をモデル中和活
性物質として用い、ＣＴの毒性を中和・低減化する現象
が、本発明で開発された新コレラトキシン測定法により
正当に評価できることを、以下により確認した。
【００２９】（１）３％ＢＳＡで３時間ブロッキングし
たウエルに０．２５％ＢＳＡ、０．１７５Ｍ ＮａＣｌ
を含むＰＢＳに各種濃度に溶解したＣＧＰ溶液、同Ｂｕ
ｆｆｅｒにＣＧＰ溶液と同濃度に溶解したＢ−ＣＴ−Ｂ
溶液を５０μｌずつ加え室温で６時間振とうし反応させ
た。Ｂ−ＣＴ−Ｂ濃度は０．１、０．５、１及び５μｇ
／ｍｌで行った。 （２）ブロッキング済みのＧＭ1吸着ビーズを各ウエル
に１個ずつ加え、さらに６時間振とうさせた。 （３）ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで６０００倍希
釈したＨＲＰ−ＳＡを１００μｌ加え３０分静置した。 （４）３回洗浄後、ＴＭＢＺを１００μｌ加え室温で１
５分振とうし、マイクロプレートリーダーを用いて４５
０ｎｍにおける吸光度を測定した。
たウエルに０．２５％ＢＳＡ、０．１７５Ｍ ＮａＣｌ
を含むＰＢＳに各種濃度に溶解したＣＧＰ溶液、同Ｂｕ
ｆｆｅｒにＣＧＰ溶液と同濃度に溶解したＢ−ＣＴ−Ｂ
溶液を５０μｌずつ加え室温で６時間振とうし反応させ
た。Ｂ−ＣＴ−Ｂ濃度は０．１、０．５、１及び５μｇ
／ｍｌで行った。 （２）ブロッキング済みのＧＭ1吸着ビーズを各ウエル
に１個ずつ加え、さらに６時間振とうさせた。 （３）ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳで６０００倍希
釈したＨＲＰ−ＳＡを１００μｌ加え３０分静置した。 （４）３回洗浄後、ＴＭＢＺを１００μｌ加え室温で１
５分振とうし、マイクロプレートリーダーを用いて４５
０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３０】中和活性は、次のようにして評価した。 中和活性（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００ Ａ：試料＋（Ｂ−ＣＴ−Ｂ）＋ビーズの吸光度 Ｂ：（Ｂ−ＣＴ−Ｂ）＋ビーズの吸光度
【００３１】実験結果を図７に示した。この結果から明
らかなように、本検出法では、１μｇ／ｍｌ以下のＣＧ
Ｐ濃度の場合でも、ＣＴを中和する能力を有することを
確認することができ、本検出法が中和活性測定法として
きわめてすぐれていることが立証された。本測定法によ
れば、このように中和活性成分の中和活性が効率よくし
かも正確に測定できるだけでなく、未知の中和活性成分
を本測定法によってスクリーニングすることも可能とな
り、本測定法を利用することによって新規ＣＴ解毒剤の
開発も大いに可能である。なお、本測定法においては、
中和活性成分量よりも多量にＢ−ＣＴ−Ｂを使用するこ
とが必要である。
らかなように、本検出法では、１μｇ／ｍｌ以下のＣＧ
Ｐ濃度の場合でも、ＣＴを中和する能力を有することを
確認することができ、本検出法が中和活性測定法として
きわめてすぐれていることが立証された。本測定法によ
れば、このように中和活性成分の中和活性が効率よくし
かも正確に測定できるだけでなく、未知の中和活性成分
を本測定法によってスクリーニングすることも可能とな
り、本測定法を利用することによって新規ＣＴ解毒剤の
開発も大いに可能である。なお、本測定法においては、
中和活性成分量よりも多量にＢ−ＣＴ−Ｂを使用するこ
とが必要である。
【００３２】
【発明の効果】本発明によって、コレラトキシン及びそ
の中和活性を測定するための高感度測定法がはじめて確
立され、コレラトキシン及びその中和活性を迅速且つ正
確に測定することが可能となり、また、本発明によれば
新規な中和活性のスクリーニングも可能となる。
の中和活性を測定するための高感度測定法がはじめて確
立され、コレラトキシン及びその中和活性を迅速且つ正
確に測定することが可能となり、また、本発明によれば
新規な中和活性のスクリーニングも可能となる。
【００３３】更に本発明によれば、ＧＭ1、ポリスチレ
ンビーズ、ビオチン、酵素結合（ストレプト）アビジ
ン、発色基質及び他の必要成分をセットにしたコレラト
キシンまたはその中和活性測定キットを組むことがで
き、上記した測定法の確立と相まって、すぐれた測定シ
ステムを確立することができる。
ンビーズ、ビオチン、酵素結合（ストレプト）アビジ
ン、発色基質及び他の必要成分をセットにしたコレラト
キシンまたはその中和活性測定キットを組むことがで
き、上記した測定法の確立と相まって、すぐれた測定シ
ステムを確立することができる。
【図１】モノシアロガングリオシドＧＭ1（コレラトキ
シンレセプター）における結合糖鎖の化学構造を示し、
破線部分は、コレラトキシンＢサブユニットの認識・結
合するエピトープ部位を示す。
シンレセプター）における結合糖鎖の化学構造を示し、
破線部分は、コレラトキシンＢサブユニットの認識・結
合するエピトープ部位を示す。
【図２】コレラトキシンの新高感度測定法の模式図であ
る。
る。
【図３】モデル中和活性物質ＣＧＰを用いてのコレラト
キシン中和活性測定法の模式図である。
キシン中和活性測定法の模式図である。
【図４】吸着基材の検討図である。
【図５】ブロッキング剤の検討図である。
【図６】発色基質の検討図である。
【図７】モデル中和活性物質ＣＧＰを用いてのコレラト
キシン中和活性の測定図であって、Ｂ−ＣＴ−Ｂ濃度の
反応に及ぼす影響を示した図面である。
キシン中和活性の測定図であって、Ｂ−ＣＴ−Ｂ濃度の
反応に及ぼす影響を示した図面である。
Claims (6)
- 【請求項１】 次の工程からなることを特徴とするコレ
ラトキシンの測定方法： （ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ1をポリスチレン
ビーズに結合する； （ｂ）ポリスチレンビーズ上に結合したモノシアロガン
グリオシドＧＭ1と、あらかじめビオチンを結合させた
コレラトキシンとを反応させて両者を結合する； （ｃ）前もって酵素を結合したアビジンまたはストレプ
トアビジンを、該ビーズ上のビオチン−コレラトキシン
結合物と反応させて結合する； （ｄ）発色基質を加えて、酵素分解によって生じる色を
比色する。 - 【請求項２】 酵素としてペルオキシダーゼを用い、発
色基質として３，３′，５，５′−テトラメチルベンチ
ジン（ＴＭＢＺ）、同塩酸塩（ＴＭＢＺ・ＨＣｌ）又は
同スルホプロピル誘導体（ＴＭＢＺ・ＰＳ）を使用する
ことを特徴とする請求項１の方法。 - 【請求項３】 請求項１において、（ｂ）工程を行う前
に、中和活性物質をあらかじめ加えて、ビオチン結合コ
レラトキシンと反応させて両者を結合させておく工程を
更に包含すること、を特徴とするコレラトキシンの中和
活性測定方法。 - 【請求項４】 コレラトキシンとしてコレラトキシンま
たはそのＢサブユニットを中和活性成分よりも過剰量用
い、測定値の低下分をコレラトキシン中和活性値とする
ことを特徴とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 モノシアロガングリオシドＧＭ1、ポリ
スチレンビーズ、ビオチン、酵素結合アビジン（または
ストレプトアビジン）及び発色基質を含有することを特
徴とするコレラトキシンまたはその中和活性測定用キッ
ト。 - 【請求項６】 更に、中和活性測定の場合には、ビオチ
ン結合したコレラトキシンＢサブユニットを含有するこ
と、を特徴とする請求項５に記載のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5254396A JPH09220096A (ja) | 1996-02-16 | 1996-02-16 | コレラトキシン及びその中和活性の新規 高感度測定法及び同キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5254396A JPH09220096A (ja) | 1996-02-16 | 1996-02-16 | コレラトキシン及びその中和活性の新規 高感度測定法及び同キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09220096A true JPH09220096A (ja) | 1997-08-26 |
Family
ID=12917709
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5254396A Pending JPH09220096A (ja) | 1996-02-16 | 1996-02-16 | コレラトキシン及びその中和活性の新規 高感度測定法及び同キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09220096A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006284330A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-19 | Gunma Univ | アシアロｇｍ１の免疫学的測定キット並びに抗アシアロｇｍ１抗体の免疫学的測定キット |
| JP2007534951A (ja) * | 2004-04-29 | 2007-11-29 | ファーマ ディヴェロップメント ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | タンパク質ｐｔｘ３測定用の単クローン抗体、ハイブリドーマ、改良方法、及び前記測定用キット |
-
1996
- 1996-02-16 JP JP5254396A patent/JPH09220096A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007534951A (ja) * | 2004-04-29 | 2007-11-29 | ファーマ ディヴェロップメント ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | タンパク質ｐｔｘ３測定用の単クローン抗体、ハイブリドーマ、改良方法、及び前記測定用キット |
| JP2006284330A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-19 | Gunma Univ | アシアロｇｍ１の免疫学的測定キット並びに抗アシアロｇｍ１抗体の免疫学的測定キット |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2726793B2 (ja) | 免疫アッセイ | |
| US10203344B2 (en) | Compositions and methods for detecting vitamin D | |
| US5525524A (en) | Crosstalk inhibitors and their uses | |
| US5187107A (en) | B12 enzyme imunoassay and sample pretreatment | |
| US11913942B2 (en) | Homogenous immunoassay with compensation for background signal | |
| Serchenya et al. | Direct conjugation of penicillins and cephalosporins with proteins for receptor assays of beta-lactam antibiotics | |
| JPH0242982A (ja) | 安定なペルオキシダーゼ組成物及び安定な抗体組成物 | |
| CN109239368A (zh) | 测定孕酮的方法及试剂盒 | |
| JP4299332B2 (ja) | 酵素免疫検定方法およびこれに用いる展開用組成物 | |
| Burkin et al. | Hapten modification approach for switching immunoassay specificity from selective to generic | |
| JPH09220096A (ja) | コレラトキシン及びその中和活性の新規 高感度測定法及び同キット | |
| JP3474391B2 (ja) | コレラトキシン及びその中和活性の新規高感度測定法及び同キット | |
| US20180356428A1 (en) | Stabilized liquid formulations containing receptors | |
| CN108490195A (zh) | 一种维生素b12免疫法测定方法及其试剂 | |
| US6777190B1 (en) | Crosstalk inhibitors and their uses | |
| JP3400507B2 (ja) | 特異的結合パートナーと炭水化物含有蛋白質から構成される複合体の製造方法 | |
| JP2960628B2 (ja) | 標識サイロニンハプテン類似体を用いたイムノアッセイ | |
| JPS6228666A (ja) | 生物学的試料中の抗原及び抗体検出法及び検出用支持体 | |
| JP3022942B2 (ja) | 新規標識カルバマゼピン類似体 | |
| US7422864B2 (en) | Method for measuring oxidized LDL-CRP complex and measurement kit | |
| JP3685815B2 (ja) | 溶液中のペルオキシダーゼの安定化方法 | |
| Lombardi et al. | A method for selective conjugation of an analyte to enzymes without unwanted enzyme–enzyme cross-linking | |
| Kawakami et al. | Development of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitumor agent MKT 077 | |
| JPH0792456B2 (ja) | カテコ−ルアミン酸性代謝物の酵素標識体 | |
| WO2003036297A1 (en) | Non-immunological assays for the detection and determination of c-reactive protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20060228 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060725 |