JP3474391B2 - コレラトキシン及びその中和活性の新規高感度測定法及び同キット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エンザイムアッセ
イ、更に詳細には、コレラトキシン及びその中和活性の
新規高感度測定法に関するものであり、また、それに用
いる測定用キットに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】コレラトキシン（以下、ＣＴということ
もある）は、別名コレラ毒素又はコレラゲンとも呼ば
れ、コレラ菌（ビブリオ・コレレ（Vibrio cholera
e））が産生する毒性タンパク質である。また本分子
は、ＡＤＰリボシル化活性をもつＡサブユニット１個
と、腸管細胞表面上のレセプターであるモノシアロガン
グリオシドＧＭ₁と認識・結合する能力を持つ５個のＢ
サブユニットから成る分子量８４，０００のタンパク質
である。ＣＴのサブユニット構造モデルを図１に示し
た。ＣＴの示す毒性の本体は、Ａサブユニットが発現
し、Ｂサブユニットは細胞表面にまず始めにトキシン分
子を接着・結合させる重要な働きを有している。

【０００３】つまり、コレラ菌が腸管感染し、増殖した
菌体の生産するコレラトキシン（ＣＴ）は、腸管に存在
する糖脂質（モノシアロガングリオシドＧＭ₁、以下単
にＧＭ₁ということもある）を認識・結合して毒性を発
現するのであるが、これは、トキシン分子中のＢサブユ
ニットがＧＭ₁中の結合糖鎖の非還元末端に位置するシ
アル酸分子を主として認識し結合することに始まり、つ
いで、トキシン中のＡサブユニットが細胞内に進入し、
アデニレート・サイクラーゼの継続的な活性化が起こ
り、最終的にサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の濃度上
昇により重篤な症状を呈することが知られている。しか
しながら、完全な毒性発現機構は解明されていない。そ
こで、食品衛生学的視点からのみならず、医学・薬学的
視点からも、トキシン活性の微量高感度検出システムの
構築が切望されている。

【０００４】一方、この反応初期におけるＣＴ−ＧＭ₁
間の認識・結合を競合的に阻害する成分が、反応系に仮
に存在する場合には、この毒性の発現は中和・低減され
ることになる。この成分は、「コレラトキシン中和活性
成分」と呼ばれている。本成分は、基本的にはＧＭ₁に
結合する糖鎖構造と近似した糖鎖アナログを持つ糖タン
パク質成分等であり、牛乳中にはκ−カゼインやそのキ
モシン消化に伴い生成するカゼイノグリコペプチド（Ｃ
ＧＰ）がコレラトキシン中和活性を示すことが既に知ら
れている。従来の本中和成分の示すＣＴ中和活性の測定
法には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の
異形化や、ｃＡＭＰの亢進を検出する方法、およびＧＭ
₁を直接コートしペルオキシダーゼ標識コレラトキシン
Ｂサブユニット（以下、Ｐ−ＣＴ−Ｂということもあ
る）を用いたマイクロプレートによる競合阻害法が既に
報告されている（以下、マイクロプレート法ということ
もある：Kawasaki et al., Biosci. Biotech. Bioche
m., 56, 195-198, (1992））。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、食品衛生学
的視点のみならず、医学・薬学的視点から、ＣＴ活性の
微量高感度検出システムの構築が切望されている当業界
の技術の現状に鑑み、感度の高いすぐれたＣＴ測定シス
テムを新たに開発する目的でなされたものである。

【０００６】また、本発明は、正確な数値化によりＣＴ
中和成分間の相対評価が必要であるとの視点から、そし
てまた新規ＣＴ中和成分つまり新規ＣＴ解毒剤の開発な
いしスクリーニングという視点から、感度の高いすぐれ
たＣＴ中和活性測定システムを新たに開発する目的でな
されたものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、従来法について検
討したが、先ず、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞の異形化による方法は、現象面の特徴を捉える
方法であって、定量はできないし、また、ｃＡＭＰの亢
進を検出する方法は、やはり細胞を用いるために実験設
定が煩雑であり、しかも結果が出るまでに長時間を要す
る。

【０００８】一方、川崎らにより既に報告されている、
マイクロプレート法は、研究室にマイクロプレートリー
ダーがあれば、比較的短時間に簡便に定量的なデータを
得ることが可能である。彼らの方法では、ＧＭ₁を直接
コートしたマイクロプレートを用意し、ＣＴを含む試料
を反応させ、発色させたのち、マイクロプレートリーダ
ーで読みとる方法であって、すぐれた方法である。本発
明者らは、このマイクロプレート法の利点に着目し、更
に詳細に検討の結果、後記するようにマイクロプレート
法にも未だ改良すべき点が各種存在することを認め、そ
してこれらの改良に成功し、目的とする高感度測定シス
テムの開発に成功するとともに、このシステムを利用す
ることによって中和活性の高感度測定も可能となること
も発見し、遂に本発明の完成に至ったものである。

【０００９】すなわち、本発明におけるＣＴの測定方法
の基本原理は、ＣＴ分子中の５量体であるＢサブユニッ
ト（以下、ＣＴ−Ｂということもある）のひとつがレセ
プターＧＭ₁に特異的に結合する特性を利用するもので
ある。図２にレセプターＧＭ₁糖鎖の化学構造を示した
が、コレラトキシンＢサブユニットは、本糖鎖中の実線
で囲んだシアル酸とガラクトースの結合部位（エピトー
プ部位）を特に良く認識し、結合するものである。ＣＴ
−Ｂは５量体であるため、シアル酸との結合部位は５ヶ
所存在することになる。

【００１０】本発明に係るＡ法の基本原理は、上記した
特性を利用したものであって、このレセプターＧＭ₁を
特定の担体に結合させておき、そこにＣＴ又はＣＴ−Ｂ
が含まれていることが予想される試料を加え、ここでプ
ローブと反応させ、結合したプローブ量を量特異的に発
色に導き、比色定量することにより間接的にＣＴ結合量
を知ることからなる（図３）。

【００１１】一方、本発明に係るＢ法の基本原理は、Ｇ
Ｍ₁を特定の担体に結合させておき、このＧＭ₁をＣＴ−
Ｂを用いて飽和させる。ついで中和活性物質が含まれて
いることが予想される試料を加え、プローブを反応さ
せ、結合したプローブ量を量特異的に発色に導き、比色
定量することにより中和活性値を知ることからなる（図
４）。

【００１２】マイクロプレート法を改良するため、以下
のような検討を行った。すなわち、レセプターＧＭ₁を
結合させる方法、素材、レセプター以外へのＣＴの非特
異的結合を防止するためのブロッキング剤と必要時間の
検討、ＣＴの標識方法の検討、最終的な発色基質の選択
等の検討を行った。なお、この際には、実験の安全性を
考慮して、ＣＴとしては、ＣＴ分子全体を使用しない
で、Ｂサブユニット（ＣＴ−Ｂ）のみを使用することと
した。具体的検討項目は、次のとおりである。

【００１３】コレラトキシン中和活性の新規高感度検出
法（Ｂ法）検討項目

【００１４】（１）レセプターＧＭ₁吸着基材の検討 本発明では、レセプターＧＭ₁を吸着・固定化する必要
性があり、川崎らの報告しているマイクロプレートへの
直接塗抹法および免疫化学分野で汎用されているポリス
チレンビーズへのコーティング法の優劣を検討した。こ
の実験結果は、図５に示した。したがって、以降の基材
にはポリスチレンビーズを使用することとした。

【００１５】（２）ＧＭ₁溶解溶媒の検討 レセプターＧＭ₁を完全に溶解させ、定量的に分注させ
るためには、最適な溶解溶媒の選択が不可欠である。溶
解溶媒には、蒸留水、メタノール、エタノール、５０％
エタノールの４種の優劣を検討した。

【００１６】（３）コレラトキシンＢサブユニット（Ｃ
Ｔ−Ｂ）による飽和結合時間の検討 レセプターＧＭ₁をコーティングしたビーズに対して、
ＣＴ−ＢのＰＢＳ溶液（１０μｇ／ｍｌ）を加えて、室
温で３〜７時間保持し、その結合量の推移を検討した。
この実験結果は、図６に示した。

【００１７】（４）ブロッキング剤およびブロッキング
時間の検討 レセプターＧＭ₁をポリスチレンビーズに吸着・結合さ
せた場合でも、必ず結合していない部位が存在してい
る。この様な部位を、反応に関与しない安全な他の分子
によりマスキングをしておかないと、次の反応におい
て、非特異的な吸着が起こり、ＣＴの定量性は失われ
る。このような際に必要な操作を「ブロッキング」とい
い、用いる試薬を「ブロッキング剤」と呼ぶ。ブロッキ
ング剤には、この分野で汎用されるウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）、ゼラチン（１、３、５％）、非イオン性界
面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、ＥＩＡグレード、０．０２
５、０．０５および０．１％になるようにリン酸緩衝液
（ＰＢＳ，０．１５ＭのＮａＣｌを含む、ｐＨ７．３）
に溶解）等を検討した。また、ブロッキング時間は０、
１、３および２０時間を検討した。これらの実験結果
は、図７に示した。

【００１８】（５）ポリスチレンビーズの洗浄回数の検
討 各反応終了後に、ポリスチレンビーズをＰＢＳを用いて
１〜１０回洗浄し、その洗浄効果を比較検討した。

【００１９】（６）ビオチン標識シアル酸結合プローブ
濃度の検討 プローブをＰＢＳに０．０００１、０．００１、０．０
０５、０．０１および０．１％（ｗ／ｖ）になるように
溶解し、ＣＴ−Ｂ飽和ＧＭ₁ビーズに１００μｌずつ添
加し、室温で３０分間反応させた。この実験結果を図８
に示した。

【００２０】（７）西洋わさびペルオキシダーゼ標識−
ストレプトアビジン（ＨＲＰ−ＳＡ）希釈条件の検討 ＣＴ−Ｂをビオチンで標識させた場合のみ、次の反応と
してアビジンを結合させる。本実験では、ビオチンに卵
白ではなく微生物から調製したストレプトアビジン（Ｓ
Ａ）を、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識
した西洋わさびペルオキシダーゼ標識・ストレプトアビ
ジン（ＨＲＰ−ＳＡ）を用いた。本試薬の希釈溶媒に
は、蒸留水またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）の２種を検討
した。また、ＨＲＰ−ＳＡ原液試薬（市販品）を１，０
００、２，０００、４，０００、６，０００および８，
０００倍希釈したのちの、保存性および発色性を検討し
た。

【００２１】（８）ＨＲＰ−ＳＡの反応温度条件の検討 ＧＭ₁ビーズにＢ−ＣＴ−Ｂを反応させ、６，０００倍
希釈のＨＲＰ−ＳＡを加え、室温または３７℃で３０分
間反応させて、発色性を検討した。

【００２２】（９）発色基質の検討 最終的に、ストレプトアビジンのプローブ上のビオチン
への結合量により、コレラトキシン中和活性物質を定量
するのが、本発明の測定原理である。ストレプトアビジ
ンの結合量は、過酸化水素水を添加した発色試薬の呈色
度をマイクロプレートリーダーで測定することで、定量
データを得る。

【００２３】そこで、 以下の３種類の発色基質を用
い、安定性および感度等を比較検討した。 基質１；０．０５％過酸化水素水：０．０８％５−アミ
ノサリチル酸＝９：１、ＮａＯＨでｐＨ６．０に調整。
波長４５０ｎｍでの吸光度測定。 基質２：０．１％２，２′アジノビス（３−エチレンベ
ンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、０．
００３％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．０）、波長４０５ｎｍでの吸光度測定。 基質３：ＴＭＢＺ（テトラメチルベンジジン：住友ベー
クライト（株）製、ＭＬ−１１２０Ｔ）、波長４５０ｎ
ｍでの吸光度測定 基質１は、他の２つと比べて、極めて呈色性が低かった
ので、基質２と３を比較検討した。この実験結果は、図
９に示した。

【００２４】上記した各反応条件の詳細な検討により、
以下の条件がＣＴの測定及び中和活性の測定に適してい
ることが示唆された。

【００２５】すなわち、ＧＭ₁吸着基材にはポリスチレ
ンビーズが、マイクロプレートよりも吸着能が約５倍程
度強く、かつ非特異的結合の極めて少ない点などが優れ
ていた（図５）。マイクロプレートに直接ＧＭ₁をコー
ティングする川崎らの方法では、特にこのウエル表面に
対するＣＴ−ＢやＨＲＰ−ＳＡの非特異的な吸着が防げ
ず、高いバックグラウンドと感度の低さに繋がることが
判明し、ポリスチレンビーズ法が大変優れていると考え
られた。また、ＧＭ₁溶解溶媒については１００％エタ
ノールが、最も安定した溶解性と定量的な基材へのコー
ティング性を示し、優れていた。ＣＴ−Ｂによるビーズ
上のＧＭ₁に対する飽和結合時間としては、６時間が適
当と考えられた（図６）。

【００２６】ブロッキング剤は３％ＢＳＡを含むＰＢＳ
が最もブロッキング効果が高く、また３時間のブロッキ
ング時間が最適であった（図７）。ビーズの洗浄剤には
ＰＢＳが適しており、洗浄回数の検討の結果では、３回
洗浄が適当であった。また、プローブ濃度は、０．００
１％（ｗ／ｖ）が吸光度０．３付近を与え、適当であっ
た（図８）。ビオチンと特異的に反応するＨＲＰ−ＳＡ
の希釈方法では、ＰＢＳによる６,０００倍希釈、反応
は室温で行うので最適であった。重要な発色基質の選択
については、最近開発されたＴＭＢＺが最も安定かつ高
感度に検出できることが確認された（図９）。これらの
結果は、下記表１にまとめて示した。

【００２７】

【表１】

【００２８】すなわち本発明は、これらの検討結果を基
礎とし、更に研究の結果完成されたものであって、ＧＭ
₁吸着素材にマイクロプレートではなくポリスチレンビ
ーズを使用し、新たにプローブを導入し、より高感度ア
ビジン−ビオチンシステムの導入、及び最近開発された
高感度基質を、それぞれ新たに採用しただけでなく、こ
れらを有機的に組み合わせたことを特徴とするものであ
る。

【００２９】本発明は、上記した基本的特徴を有するも
のであり、本発明に係るコレラトキシン測定法（Ａ法）
の基本的ステップは次のとおりである（図３）。

【００３０】（１）コレラトキシンと結合するレセプタ
ー分子であるガングリオシドＧＭ₁をポリスチレンビー
ズ上にコーティングする。 （２）ビーズに結合したＧＭ₁と、コレラトキシン（Ｃ
Ｔ）が含まれることが予想される試料（培養液など）を
反応させて結合させる。 （３）ビオチン標識シアル酸結合プローブを反応させ
る。 （４）ビオチンにアビジンが結合する性質を利用して、
前もってペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させたスト
レプトアビジン（ＳＡ）をビーズ上のプローブ−コレラ
トキシン結合物と反応させて結合させる。 （５）最終的には、ここで結合したペルオキシダーゼが
発色基質を分解して生ずる色を比色定量することによっ
て、試料に含まれていたコレラトキシンの量が測定でき
ることになる。

【００３１】本発明に係るコレラトキシン中和活性測定
法（Ｂ法）の基本的ステップは、図４に示した。基本的
な反応ステップは次のとおりである。

【００３２】（１）コレラトキシンレセプター分子であ
るＧＭ₁をポリスチレンビーズにコーティングする。 （２）ビーズ上のＧＭ₁にコレラトキシンＢサブユニッ
ト（ＣＴ−Ｂ）を飽和状態に結合させる。 （３）試料とビーズを反応させる。 （４）以下、上記したＡ法のステップ３以降の反応を順
次行う。 （５）試料中にコレラトキシン中和活性物質が存在する
場合は、プローブの結合量は対照より減少する。この吸
光度の低下分がコレラトキシン中和活性値を示す。

【００３３】

【発明の実施の形態】ＧＭ₁を吸着する担体としては、
従来法のようにマイクロプレートではなく、ポリスチレ
ンビーズを用いる。ポリスチレンビーズとしては、市販
品を含め各種のポリスチレンビーズが適宜使用される。

【００３４】該ビーズ上のビオチン標識シアル酸結合プ
ローブ−コレラトキシン結合物と反応、結合せしめるア
ビジンとしては、卵白由来のアビジンのほか、微生物由
来のストレプトアビジン（以下、ＳＡということもあ
る）等各種のアビジンが適宜使用される。

【００３５】アビジンには酵素を結合する。酵素として
は、エンザイムアッセイに常用される酵素が広く使用さ
れ、例えば（西洋ワサビ）ペルオキシダーゼ、（大腸
菌）β−ガラクトシダーゼ、（ウシ小腸）アルカリホス
ファターゼ等が広く使用できる。これら酵素の発色基質
としては、β−ガラクトシダーゼの場合は、ο−ニトロ
フェニル−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフ
ェリル−ガラクトピラノシド等が使用され、アルカリホ
スファターゼの場合は、ｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト、４−メチルウンベリフェリル−ホスフェート等が使
用される。

【００３６】ペルオキシダーゼの発色基質としては、ο
−フェニレンジアミン、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、
２，２′−アジノビス（３−エチレンベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、等既知の物質が使用
できるほか、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジ
ジン（ＴＭＢＺ）、同、ジハイドロクロライド、ジハイ
ドレート（ＴＭＢＺ・ＨＣｌ）、Ｎ−（３−スルホプロ
ピル）−３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジ
ン、ナトリウム塩（ＴＭＢＺ・ＰＳ）が使用できる。本
発明においては、特に酵素として西洋のワサビペルオキ
シダーゼ（以下、ＨＲＰということもある）を用い、発
色基質として特にＴＭＢＺ原物質及び同誘導体を用いた
場合に、すぐれた高感度測定が達成された。

【００３７】以下、本発明の実施例について述べる。

【００３８】

【実施例１】 コレラトキシンの新規高感度測定法（Ａ法） コレラトキシンが含まれるモデル試料として毒性のない
コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴ−Ｂ）を用い、ビ
オチン標識シアル酸結合プローブ（以下、プローブ）を
用いて、以下により測定を行った。

【００３９】（１）先ずはじめに、使用する市販のポリ
スチレンビーズ（直径３．２ｍｍ、和光純薬工業（株）
製、Ｎｏ．１６３−１１２９）をメタノール中で６０
℃、３０分間振とうし、事前洗浄した。 （２）ビーズへの均質かつ定量的なレセプターＧＭ₁の
吸着方法は、試験管に５０個のビーズを入れ、これに３
ｍｌのエタノールと１．２５μｇのＧＭ₁を加え、３７
℃で３時間振とうすることにより行った。 （３）ＧＭ₁吸着ビーズを、マイクロプレート（住友ベ
ークライト、平底９６穴、ＭＳ−８０９６Ｆ）の各ウエ
ルに１個ずつ入れ、各ウエルに３％ＢＳＡを含むブロッ
キング剤を３３０μｌ加えビーズおよびプレートウエル
におけるＧＭ₁の非吸着部位をブロッキングした。 （４）各ウエル中のビーズに、０．１〜１０μｇ／ｍｌ
濃度のＣＴ−Ｂ溶液（１００μｌ）を加え、室温で１時
間反応させた。 （５）０．２５％ ＢＳＡおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌ
を含むＰＢＳにプローブを溶解し（０．００１％（ｗ／
ｖ））、各ウエルに１００μｌずつ加え、振とうしなが
ら室温で３０分間反応させた。 （６）ビーズをＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ−ＳＡ（ＺＹＭ
ＥＤ社製、Ｎｏ．４３−４３２３）をＰＢＳで６，００
０倍希釈した溶液を１００μｌ加え、３０分間反応させ
た。 （７）ビーズをＰＢＳで洗浄後、新たなマイクロプレー
トウエルに移し替えてからＴＭＢＺ基質溶液を１００μ
ｌ加え、室温で１時間振とうして発色させ、マイクロプ
レートリーダーを用いて吸光度（４５０ｎｍ）を測定し
た。

【００４０】本法は、従来のマイクロプレート法と比較
して、主として以下の点において相違しており、優れて
いる。 （１）レセプターＧＭ₁を、マイクロプレートに直接塗
抹せず、ポリスチレンビーズの表面にコーティングする
ことで、ＧＭ₁結合量が約５倍に増加した。また、最後
の発色時に、ビーズを新たなウエルに移動させること
で、ウエル表層へのＨＲＰ−ＳＡの非特異的な吸着によ
るバックグラウンドの高まりを抑えることが出来た。 （２）プローブは、直接ＨＲＰで標識せず、ビオチンに
より標識した。これにより、反応ステップは、一段階多
くなるが、検出感度は向上した。すなわち、ビオチン−
アビジン反応により、より高感度に極微量に試料中に存
在するＣＴも検出することが可能となった。 （３）発色基質に、より高感度のＴＭＢＺを用いたこと
で、ＣＴの検出感度を向上させることが出来た。

【００４１】

【実施例２】 コレラトキシン中和活性の新規高感度測定法（Ｂ法） ＣＴ中和活性を有する物質として既知の「カゼイノグリ
コペプチド（ＣＧＰ）」をモデル中和活性物質として用
い、ＣＴの毒性を中和・低減化する現象が、本発明で開
発されたＢ法により正当に評価できることを、以下によ
り確認した。

【００４２】（１）市販のポリスチレンビーズをメタノ
ールを用いて加温洗浄した。 （２）ビーズにレセプターＧＭ₁を吸着させた。 （３）ビーズに１０μｇ／ｍｌ濃度のＣＴ−Ｂ溶液１０
０μｌを加え、室温で６時間反応させ、ＧＭ₁を飽和さ
せた。 （４）ＣＧＰを含む試料（１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを
加え、室温で１時間反応させた。 （５）３％ ＢＳＡを含むＰＢＳで３時間ブロッキング
した。 （６）０．００１％（ｗ／ｖ）濃度のプローブ１００μ
ｌを加え、３０分間反応させた。 （７）ＰＢＳで６，０００倍希釈したＨＲＰ−ＳＡを１
００μｌ加え、３０分間静置した。 （８）ＴＭＢＺを１００μｌ加え、室温で１５分間振と
うし、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍに
おける吸光度を測定した。各反応ステップでは、ビーズ
をＰＢＳで３回くり返して洗浄した。

【００４３】中和活性は、次のようにして評価した。 中和活性（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００ Ａ：吸光度（試料測定時） Ｂ：吸光度（対照、試料未添加）

【００４４】実験結果を図１０に示した。ロットの異な
る４種のＣＧＰ（１〜４）では、２５〜３０％のコレラ
トキシン中和活性を示した。一方、シアル酸を除去した
アシアロＣＧＰ（ａ−ＣＧＰ）では、５％以下の中和活
性値しか示さず、シアル酸の量依存的な中和活性が認め
られた。

【００４５】本検出法では、１μｇ／ｍｌ以下のＣＧＰ
濃度の場合でも、ＣＴを中和する能力を有することを確
認することができ、本検出法が中和活性測定法としてき
わめてすぐれていることが立証された。

【００４６】本測定法によれば、このように中和活性成
分の中和活性が効率よくしかも正確に測定できるだけで
なく、未知の中和活性成分を本測定法によってスクリー
ニングすることも可能となり、本測定法を利用すること
によって新規ＣＴ解毒剤の開発も大いに可能である。

【００４７】

【発明の効果】本発明によって、コレラトキシン及びそ
の中和活性を測定するための高感度測定法がはじめて確
立され、コレラトキシン及びその中和活性を迅速且つ正
確に測定することが可能となり、また、本発明によれば
新規な中和活性物質のマススクリーニングも可能とな
る。

【００４８】更に本発明によれば、ＧＭ₁、ポリスチレ
ンビーズ、ビオチン標識シアル酸結合プローブ、酵素結
合（ストレプト）アビジン、発色基質及び他の必要成分
をセットにしたコレラトキシンまたはその中和活性測定
キットを組むことができ、上記した測定法の確立と相ま
って、すぐれた測定システムを確立することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】コレラトキシンのサブユニット構造モデルを示
す。分子は毒性の本体であるＡサブユニットと、ＧＭ₁
結合性を有する５つのＢサブユニットから成る。

【図２】モノシアロガングリオシドＧＭ₁（コレラトキ
シンレセプター）における結合糖鎖の化学構造を示し、
実線部分は、コレラトキシンＢサブユニットの認識・結
合するエピトープ部位を示す。

【図３】コレラトキシンの新規高感度測定法（Ａ法）の
模式図である。

【図４】モデル中和活性物質ＣＧＰを用いてのコレラト
キシン中和活性測定法（Ｂ法）の模式図である。

【図５】吸着基材の検討図である。

【図６】コレラトキシンＢサブユニットによるビーズ上
のＧＭ₁に対する飽和結合時間の検討図である。

【図７】ブロッキング剤の検討図である。

【図８】ビオチン標識シアル酸結合プローブの濃度検討
図である。

【図９】発色基質の検討図である。

【図１０】モデル中和活性物質ＣＧＰ（４種）およびア
シアロＣＧＰを用いてのコレラトキシン中和活性の測定
結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 C12Q 1/28 G01N 33/566

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の工程からなることを特徴とするコレ
   ラトキシン中和活性の測定方法。 （ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ₁をポリスチレン
   ビーズに結合させる； （ｂ）モノシアロガングリオシドＧＭ₁を５量体である
   コレラトキシンＢサブユニットで飽和結合させる； （ｃ）コレラトキシン中和活性物質を含む可能性のある
   試料を反応させる； （ｄ）ビオチン標識シアル酸結合プローブ（以下、プロ
   ーブ）を反応させる； （ｅ）前もって酵素を結合したアビジンまたはストレプ
   トアビジンを、該ビーズ上のプローブ−コレラトキシン
   結合物と反応させる； （ｆ）発色基質を加えて、酵素分解によって生じる色を
   比色する。
2. 【請求項２】 酵素としてペルオキシダーゼを用い、発
   色基質として３，３’、５，５’−テトラメチルベンチ
   ジン（ＴＭＢＺ）、同塩酸塩（ＴＭＢＺ・ＨＣｌ）又は
   同スルホプロピル誘導体（ＴＭＢＺ・ＰＳ）を使用する
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 プローブの添加量をコレラトキシンまた
   はそのＢサブユニット量よりも過剰量に用い、測定値の
   低下分をコレラトキシン中和活性値とすること、を特徴
   とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 モノシアロガングリオシドＧＭ₁、ポリ
   スチレンビーズ、５量体であるコレラトキシンＢサブユ
   ニット、ビオチン標識シアル酸結合プローブ、酵素結合
   アビジン（またはストレプトアビジン）及び発色基質を
   含有することを特徴とするコレラトキシン中和活性測定
   用キット。