JP2002544493A - 環状ヌクレオチドモノホスフェートのための競合的化学ルミネセンス検定 - Google Patents

環状ヌクレオチドモノホスフェートのための競合的化学ルミネセンス検定

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Abstract

(57)【要約】 環状アデノシンモノホスフェートのような環状ヌクレオチドの濃度を測定するための競合的検定法は、捕獲抗体を供給する反応室中で、ｃＡＭＰまたは他の環状ヌクレオチドに対する抗体、検定しようとするサンプル及びｃＡＭＰとアルカリ性ホスファターゼとの結合体を混合する。この混合物をインキュベートして洗浄し、さらに洗浄後、前記結合体のアルカリ性ホスファターゼと接触して分解を誘発する１，２−ジオキセタンを加える。分解によって起こる発光は、環状ヌクレオチドの濃度と反比例の関係にあるシグナルの強度で測定される。場合によっては、発光をさらに増大させるため、エンハンスメント剤を高分子オニウム塩として加えることもある。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 発明の領域 本発明は、環状ヌクレオチドモノホスフェートの存在を検出するための、競合
的化学ルミネセンス検定に関する。通常、環状ヌクレオチドホスフェートは、化
学的構造を考慮すればモノホスフェートとしてのみ存在する。これらの中でも、
おそらく環状アデノシンモノホスフェートが、様々な細胞、細胞内及び細胞間経
路における第一または第二メッセンジャーとしての意味を持つ、最もよく知られ
たものであろう。本発明の利点は、従来技術が出くわした感度及び動的範囲の問
題点を克服する、化学ルミネセンス１，２−ジオキセタン試薬の高感度にある。
【０００２】 従来技術の背景 広く様々な代謝応答は、細胞間のｃAＭＰ放出がその鍵を握っている。多くの
場合これらの応答は、ｃAＭＰが高いレベルで存在した際に多種多様な反応活性
化の引き金となる、ｃAＭＰ−依存プロテインキナーゼによって媒介されている
。ｃAＭＰが鍵を握る最もよく知られた代謝応答の中に、肝臓におけるグリコー
ゲンからグルコースへの変換があるが、同様にこのグリコーゲン／グルコースエ
ネルギーサイクルには、様々な活性が鍵となっている。このサイクルにおいて、
ｃAＭＰの上昇を誘発する重要なホルモンがエピネフリンである。しかしながら
、ｃAＭＰ放出の引き金ともなる他のホルモンも多種あり、これがキナーゼを媒
介とする代謝応答の鍵となる場合もある。これらのホルモンには、ＡＣＴＨ、Ｆ
ＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨ、上皮小体ホルモン、バソプレッシン及びプロスタグランジ
ンＩが含まれる。従って、人を含めた哺乳動物の特定の細胞において、ｃAＭＰ
のレベルが、様々なホルモン作用及び相互作用の重要な指標となりうることは明
らかである。
【０００３】 ｃAＭＰは、唯一最もよく知られた環状ヌクレオチドである。通常、環状ヌク
レオチドはモノホスフェートとして存在する。グアノシンモノホスフェート（ｃ
ＧＭＰ）、ウリジンモノホスフェート（ｃＵＭＰ）及びシチジンモノホスフェー
ト（ｃＣＭＰ）は全て、広く様々なホルモン作用及び細胞間相互作用において重
要な役割を担う可能性を有しており、好ましいことに、それらは測定可能である
。ｃAＭＰは、これらの“メッセンジャー”環状ヌクレオチドの内で最も研究が
なされている。
【０００４】 競合的エリザ検定を含め、ｃAＭＰの検定は既知である。広く報告されている
検定は、Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎから入手可能で、これが比色検定である。他
の免疫学的検定製品は、ＩＧＥＮ及びＮＥＮと同様、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｍｅｄ
−Ｐｈｙｓｉｃｓ社より入手可能（放射免疫定量）である。Ａｓｓａｙ Ｄｅｓ
ｉｇｎの態様には、競合的エリザ検定の典型的な例に出てくる検定キット（商標
Ｂｉｏｍｏｌでも入手可能）が用いられており、ここでのシグナルの強度は、存
在する環状ヌクレオチドの濃度と反比例する。Ｂｉｏｍｏｌによるキットは、吸
光度の測定用である。蛍光検定のキットは、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓより入手可能である。
【０００５】 様々な細胞サンプルの中には、検定に必要とされる環状ヌクレオチドの量が極
少量のこともあり、そのため、高い感度が要求される。ｃAＭＰ用に市販されて
いる検定製品の多くは、それ自体この感度を持ち合わせておらず、より高い感度
を得るには、ｃAＭＰをアセチル化する（抗体結合をより高めるため）必要があ
る。
【０００６】 従って、高感度で、幅広い動的範囲を提供し、アセチル化を行わないことを含
めた単純な方法により手に入れることの出来る試薬を用いる、競合的免疫学的検
定を見出すと言う技術熟練者のゴールが残されている。
【０００７】 発明の要約 上記目的、及び下でさらに詳細に検討する他の目的は、１，２−ジオキセタン
の高い化学ルミネセンス感度を頼みとする、化学ルミセンス競合的エリザ検定に
より満たされる。本文に関する共同の譲受人であり、Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓの一部であるＴｒｏｐｉｘ社により開発されたこれらのジオキセタンは、広
く様々な米国特許の主題である。特許を請求する本発明に有用な１，２−ジオキ
セタンは、通常、式Ｉの一般構造を有している：
【０００８】
【化１】
【０００９】 式Ｉ中におけるＹ1、Ｙ2及びＸは、様々な電子−活性部位であり、その際、そ
れらは電子を供与するか、または電子を吸引している。具体的な群には、ハロゲ
ン、特に塩素、アルコキシ、特にメトキシ、アミン、アルキル等が含まれる。別
法において、これらの群は水素である。Ｙ1、Ｙ2またはＸのいずれか一つ以上が
水素以外であることは可能で、またはそれら全てが水素であってもよい。置換基
Ｒは、アルキル、アラルキル、環状アルキル、Ｏ、Ｎ、ＰまたはＳの部位を含む
ヘテロアルキルであり、それらの炭素原子は一般に２０個未満である。Ｒはアル
キルであるのが好ましい。Ｒは、反応性と同様に溶解性を高めるような基で置換
が可能であり、それには、一個以上のフッ素原子のようなハロゲン置換基、カル
ボキシ（ＣＯＯ）置換基、スルホニル置換基等が含まれうる。溶解性を高める同
一の置換基が、Ｙ1、Ｙ2またはＸ上に存在することも可能である。Ａｒとはアリ
ール部位のことで、通常はフェニルまたはナフチルであり、フェニルが最も好ま
しい。Ｚは酵素によって開裂する結合を含む部位のことで、その開裂の際には、
アリール部位に付いているＯまたはＮのいずれかが開裂する。この陰イオンがジ
オキセタンを不安定にし、その分解へと導く。分解の際、ジオキセタンは発光す
る。本発明の趣旨において、Ｚはホスフェート部位であり、リン酸二ナトリウム
が好ましい。このタイプのジオキセタンは、米国特許４，９６２，１９２；４，
９３１，５６９；５，１１２，９６０；５，１４５，７７２及び５，６５４，１
５４に報告があり、同様に他にも多々報告がある。前記特許は全て、本文中に参
考のため記載してある。例えば、米国特許５，１１２，９６０の中で報告されて
いるように、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−ト
リシクロ［３．３．１．１3.7］デカン−４−フェニルホスフェート及びその塩
（ＡＭＰＰＤ）のような酵素発光性ジオキセタンは、このタイプの高い有効性を
持つレポーター分子である。この“置換されていない”１，２−ジオキセタンに
、そのアダマンチル環上に塩素原子のような置換基を誘導することにより（ＣＳ
ＰＤ）、その性能を劇的に向上させることが可能になる。同様に、酵素で開裂可
能な置換基と隣り合わせのフェニル基上、特にその３位またはメタ位に置換基を
導入すると、さらに収率が改善される。本来化学ルミネセンスであるこれらのレ
ポーター分子を酵素発光性ジオキセタンと呼ぶ。特許を請求する本発明において
、その役割を果たす各酵素は、Ｚがホスフェート部位である先に選定したアルカ
リ性ホスファターゼである。
【００１０】 本文中に参考として記載もした米国特許５，１４５，７７２及び米国特許５，
３３６，５９５において記載されているように、エンハンサー分子として高分子
オニウム塩（アンモニウム、ホスフォニウム及びスルホニウム）を用いると、分
解時のジオキセタンからの発光の度合いを高める結果になる。このことは、これ
らの高分子ポリマーが、化学ルミネスンス発光を最大限にする非水の“ミクロ環
境”において、高い疎水性のジオキセタン陰イオンを隔離する性質を持つことに
よるものである。さらに米国特許５，１４５，７７２において報告されているよ
うに、これらのジオキセタンは、フルオレセインのようにエネルギーを受容する
蛍光性分子と併用することも可能であり、そうすることで、分解時にジオキセタ
ンから放出されたエネルギーは蛍光受容体へと移行し、その蛍光が検出される。
本発明の検定は、特に化学ルミネセンス発光に適している。
【００１１】 １，２−ジオキセタンも、その製法またはそれ自体の用途も、エンハンスメン
ト剤を単独で用いるか、米国特許５，５４７，８３６で触れられているもののよ
うな第二のエンハンスメント剤と一緒に用いるかということも、それ自体、本発
明の一局面を成すものではない。
【００１２】 本発明の検定において、ミクロ滴定用ウェルまたは同様な“反応室”は、例え
ばヤギの抗ラビットＩｇＧ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘを含む広く様々な
所から入手可能）のような捕獲抗体で被覆されている。
【００１３】 本発明に従い、ｃＡＭＰとアルカリ性ホスファターゼとの結合体を調製し、こ
れを、ｃＡＭＰ（または他の環状ヌクレオチド）に対する抗体及び検査しようと
するサンプル（または標準物質）と共にウェルに入れる。この反応混合物をイン
キュベートして洗浄する。次に、ＣＳＰＤのようなアルカリ性ホスファターゼ発
光性（triggered）１，２−ジオキセタンを、好ましくはポリ（ビニルベンジル
トリブチルアンモニウムクロリド）のようなエンハンサー、または他のエンハン
スメント剤の存在下で加える。このジオキセタンをインキュベートし、好ましく
はルミノメーターまたは他種の感光装置を用いて、反応室の化学ルミネセンスシ
グナルを検査する。そのシグナルが強ければ強いほど、サンプル中の環状ヌクレ
オチドの濃度は低い。
【００１４】 本発明の詳細な説明 本発明の検定プロトコルは、他の競合的免疫学的検定のそれと類似しており、
検出されたシグナルの強度と環状ヌクレオチドの濃度との間には反比例の関係が
あることを示している。本発明は、通常、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ｃＣＭＰ、ｃＵ
ＭＰ、ｃＩＭＰ及びｃＴＭＰを含めた環状ヌクレオチドに適応可能であるが、し
ばしば広く様々な生物物理学的経路において一直線の反比例関係を示す、ｃＡＭ
Ｐ及びｃＧＭＰが最も注目を集めている。ｃＡＭＰが最もよく研究され、最も特
色のある環状ヌクレオチドであることは明らかであり、従って本発明は、ｃＡＭ
Ｐ及びｃＡＭＰ検出試薬を用いて例示する。他の環状ヌクレオチド用に、試薬、
特に第一抗体、好ましくは単クローン性抗体を換えることは、本文の記載にある
ように技術熟練者にとっては簡単なことであり、容易に達成される。
【００１５】 また本発明は、上記一般式Ｉにおいて、そのアダマンチル基が１個の塩素原子
で置換され、Ｘが水素であり、Ｒがメチルであり、さらにＺがホスフェートであ
るＣＳＰＤを用いて例示される。一般式Ｉに対応する、他のアルカリ性ホスファ
ターゼ発光性１，２−ジオキセタンを適宜用いることもある。
【００１６】 また本発明は、Ｔｒｏｐｉｘ社から入手可能なエンハンスメント剤を用いて例
示した例もある。エンハンスメント剤の例として、ポリ（ビニルベンジルトリブ
チルアンモニウムクロリド）を選んだ。エンハンスメント剤は好ましいが、本発
明の実施に必要なものではない。ウシ血清アルブミンを含めた巨大プロテインの
ような疎水性の高分子と同様、他の四級オニウムポリマーも同じように用いるこ
とができる。
【００１７】 本発明を実施するにあたり、まず、通常のミクロ滴定用プレートのウェルまた
は類似の反応室を捕獲抗体で被覆する。本発明の具体例における捕獲抗体はヤギ
のアンチラビット抗体である。プレートのウェルは捕獲抗体を調製したもので被
覆し、一晩インキュベートした後に洗浄する。非特定の結合を避けるため、プレ
ートの残り部分を処理することにより、そこでの相互作用は抑制可能となる。こ
れに従い、洗浄後、各プレートをスーパーブロックブロック緩衝液（Ｐｉｅｒｃ
ｅより入手可能）または類似薬剤で処理する。その後プレートは乾燥させる。こ
の工程は図１に記載されている。
【００１８】 調製したプレートは、これで競合的検定に用いる反応室またはウェルとしての
準備ができた。ｃＡＭＰの供給源は、標準値を設定するために特定の稀釈液に調
製した標準物質、または、検査用のサンプルを提供するためにある種の刺激を与
え、その後溶解させた細胞のいずれかである。このようにして細胞の溶解物また
はｃＡＭＰの標準物質を、ｃＡＭＰとアルカリ性ホスファターゼの結合体と共に
、本文中で後に記載するウェルに入れる。最後に、第一抗体、すなわちｃＡＭＰ
の抗体を反応混合物に加える。ｃＡＭＰに対しては、多クローン性及び単クロー
ン性抗体のいずれも可能である。どちらかを有効に用いることができる。ラビッ
トの抗ｃＡＭＰ抗体は、抗原と同様、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社
から入手可能である。他の抗体も同様に入手可能である。被覆したウェルの中で
反応体を混合した後、抗体が十分結合するまでインキュベートする。通常、イン
キュベーションは室温、約１時間で行う。次にインキュベートした反応混合物を
洗浄緩衝液で繰り返し洗浄するのだが、その緩衝液は、ｐＨが約８．０−１１．
０（実例の値は約９．６である）で、０．０５Ｍのカーボネートビカーボネート
及び０．０５％のトウィーン−２０であってもよい。出願者は推測して望んでい
たわけではなかったのだが、この洗浄緩衝液のアルカリ性は、アルカリ性ホスフ
ァターゼの性能を高めることも可能である。検定の緩衝液それ自体は、検定に好
都合なｐＨ、すなわち約５．５から６．０の間、好ましくは５．８のｐＨで、酢
酸ナトリウム（０．０５モル）と混合したＢＳＡ（０．０２％）である。技術熟
練者は、ミクロ滴定用ウェルの被覆に用いられる緩衝液と同様、ブロック緩衝液
、洗浄緩衝液及び検定の緩衝液が同一であるということ、それ自体は本発明の確
固たる特徴ではなく、むしろそれは普通の技術熟練者によって様々に変えること
が可能であり、それでもなお特許を請求する本発明を使用できると認識するであ
ろう。
【００１９】 洗浄後、ジオキセタンを、もし入れるとすればエンハンサーと共に加える。続
いて、化学ルミネセンスジオキセタンからの発光が増大して一定のレベルに達す
るよう、さらに室温で３０分間インキュベーションし、その化学ルミネセンスシ
グナルを、トロピックス７１７またはノーススタールミノメーター検出器（ＣＣ
Ｄ）のような検出器で読み取る。この検定プロトコルそれ自体を図２に示す。
【００２０】 本検定が、高い処理量を提供する自動化されたロボットによる検定システムに
最適であることは明らかであろう。図２に示したように、１時間のインキュベー
ションが標準的なプロトコルである。感度及び動的範囲に関する結果は、インキ
ュベーション期間中、そのミクロ滴定用プレートまたは反応室を振盪すると、著
しく向上させることができる。振盪した検定と振盪しなかった検定との性能の比
較が後記の図３に記してある。
【００２１】 本検定は、広く様々な条件下で使用するのに適している。その高められた感度
及び広げられた動的範囲が、適用を様々な変数と矛盾のないものにしている。標
準が設定されている場合、本発明に従って検定されるサンプルは、哺乳類の付着
及び非付着細胞系を溶解することによって得ることができる。広範囲にわたる細
胞濃度において最適な実施が可能であり、その範囲は、細胞の種類によって決ま
るが、９６−ウェルプレートの場合、１ウェルにつき細胞は１，０００−１００
，０００の範囲である。ウェルの数がより多い他のプレートも使用可能である。
化学ルミネセンスシグナル（発光）の検出には、ルミノメーターの使用がお勧め
である。ルミノメーターを使用する場合、測定単位は１ウェルにつき１秒が適当
である。別法として、ルミノメーターの代わりに、商標トップカウントとして入
手可能なもののようなシンチレーション計数計を使用することも可能である。感
度が落ち、化学ルミネセンスを直接測定するために同時進行回路を切ることが必
要なこともある。
【００２２】 本検定の“競合的”である所以は、ｃＡＭＰとアルカリ性ホスファターゼとの
結合体（ｃＡＭＰ−ＡＰ結合体）の使用にある。アルカリ性ホスファターゼ−開
裂性ジオキセタンを開裂させるのは、ｃＡＭＰに特異的な抗体によって捕獲され
たこのｃＡＭＰ−ＡＰ結合体のアルカリ性ホスファターゼである。従って、溶解
させたサンプル中のｃＡＭＰの濃度が低ければ低いほど、第一抗体によって捕獲
されるｃＡＭＰ／ＡＰ結合体が多くなり、よりシグナルが大きくなる。結合体の
調製は簡単で、これにはアルカリ性ホスファターゼと共に、ＮＨＳ活性化ｃＡＭ
Ｐが（１モルのＡＰに対して活性化ｃＡＭＰ４モルの比で）合わせ含まれている
。この調整法は図４に示してある。
【００２３】 上記のように、標準物質を設定することは必要であり、それによって、設定し
た濃度を基に溶解したサンプル中の実際の濃度が測定可能となる。代表的な標準
曲線を集めたものを図６に記してあるが、これは本検定の非常に優れた性能を示
している。
【００２４】 ｃＡＭＰ検出の様々な検定に関する感度及び動的範囲を開示してきた。様々な
検出システムの感度及び動的範囲を図７に示す。ジオキセタンの化学ルミネセン
ス技術をｃＡＭＰ−特異的免疫学的検定技術と合わせることによって得られた感
度及び動的範囲における予想外の向上が、たとえアセチル化をしなくても、予想
しえなかった極めて優れた成果をもたらしたことは明らかである。
【００２５】 前述のように、本発明の環状ＡＭＰの化学ルミネセンス検定は、ルミノメータ
ーにより検出するのが好ましい。例として二つのルミノメーター、ＴＲ７１７対
オリオンＣＣＤを図８で比較している。どちらも、本発明によってもたらされた
より優れた成果を示している。
【００２６】 本発明を包括的に、そして特定の実施例に関して開示してきた。特定の実施例
は、そのような表示がない限り、限定の意味も持たなければ、そう解釈されるも
のでもない。特に、普通の技術熟練者にとって、発明の技術を用いることなく、
ジオキセタンの性質、緩衝液の成分、シグナルの検出装置、プロトコルの時間、
温度及び条件等に変化が生じることもあろう。前記特許請求の範囲の詳説によっ
て除外されない限り、それらの変化も本発明の範疇にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の被覆したプレートまたは反応室の製法を図示したフロー
チャートである。
【図２】 本発明の検定のステップを図示したフローチャートである。
【図３】 インキュベーションの期間中に、反応混合物を振盪することによ
って得たシグナルと、振盪しなかった対照のシグナルとの比較を図示して表にし
たデータである。
【図４】 本発明のアルカリ性ホスファターゼ／環状ヌクレオチド結合体の
製法を図示したものである。
【図５】 省略する。
【図６】 様々な濃度のｃＡＭＰに対する標準的なシグナルを図示したもの
である。
【図７】 特許を請求する本発明の感度及び動的範囲を、他に市販されてい
るｃＡＭＰの検定と比較した表である。
【図８】 本明細書の本発明に従い、異なる二種のルミノメーターで得たデ
ータを比較したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 パーマー，マイケル・エイ・ジェイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02174， アーリントン，メドフォード・ストリート 87 (72)発明者 ヴォイタ，ジョン・シー アメリカ合衆国マサチューセッツ州01776， サドバリー，メイナード・ファーム・ロー ド 99 Ｆターム(参考） 2G054 AA06 CA22 EA01 GB02

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 サンプル中の環状ヌクレオチドホスフェートの濃度を測定す
    るための競合的検定において； 捕獲抗体を提供する反応室中で、（１）前記環状ヌクレオチドホスフェートと
    アルカリ性ホスファターゼとの結合体、（２）前記捕獲抗体により結合を受け、
    その結合の際には前記環状ヌクレオチドホスフェートと結合する第一抗体、及び
    （３）前記サンプル、以上を混合すること、及びそれらを前記第一抗体と前記結
    合体とが結合するようインキュベートすること、 前記のインキュベートした反応混合物を洗浄し、未結合の結合体または抗体を
    除去すること、 前記の洗浄した反応混合物に、前記結合体中のアルカリ性ホスファターゼと接
    触して分解及び発光を誘導する、アルカリ性ホスファターゼ発光性１，２−ジオ
    キセタンを加えること、及び、 前記反応混合物によって発せられた化学ルミネセンスシグナルを検出すること
    、以上を含む検定方法。
  2. 【請求項２】 前記捕獲抗体が、反応室の表面上で供給される、請求項１に
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記反応室が、ミクロ滴定量用プレートのウェルである、請
    求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記ジオキセタンと共に高分子オニウム塩のエンハンサーを
    加えることで、発光開始時の前記ジオキセタンによる発光量が、そのエンハンサ
    ー不在下での発光量と比べて高くなるようにする、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記化学ルミネセンスシグナルをルミノメーターによって検
    出する、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記反応混合物を、前記１，２−ジオキセタンのインキュベ
    ーション期間中に少なくとも一回振盪する、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記捕獲抗体を供給していない、前記ミクロ滴定量用プレー
    トの壁の部分が、反応混合物の成分と反応しないようにブロックされている、請
    求項３に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記環状ヌクレオチドホスフェートが、環状アデノシンモノ
    ホスフェート（ｃＡＭＰ）、環状グアノシンモノホスフェート（ｃＧＭＰ）、環
    状ウリジンモノホスフェート（ｃＵＭＰ）、または環状シチジンモノホスフェー
    ト（ｃＣＭＰ）である、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記環状ヌクレオチドホスフェートがｃＡＭＰである、請求
    項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 環状ヌクレオチドホスフェートの濃度を測定する競合的免
    疫学的検定を行うためのキットにおいて； 前記環状ヌクレオチドホスフェートとアルカリ性ホスファターゼとの結合体； 前記環状ヌクレオチドホスフェートと結合する抗体、及び、アルカリ性ホスフ
    ァターゼの存在下で分解し発光するアルカリ性ホスファターゼ発光性１，２−ジ
    オキセタン、以上を含む前記キット。
  11. 【請求項１１】 前記キットが、そのキットを用いて行う検定において、前
    記ジオキセタンの分解による発光量を、高分子オニウム塩不在下での発光量と比
    べて高める、高分子オニウム塩をさらに含む、請求項１０に記載のキット。
  12. 【請求項１２】 前記キットがさらに反応室を含む、請求項１０に記載のキ
    ット。
  13. 【請求項１３】 前記反応室が捕獲抗体で被覆されている、請求項１２に記
    載のキット。
  14. 【請求項１４】 前記検定を実行し、試薬と接触させる際、前記反応室の捕
    獲抗体を供給していない部分が、試薬と反応しないようブロックされている、請
    求項１３に記載のキット。
  15. 【請求項１５】 前記環状ヌクレオチドホスフェートと結合する前記抗体が
    、単クローン性抗体である、請求項１０に記載のキット。
  16. 【請求項１６】 前記環状ヌクレオチドホスフェートが、ｃＡＭＰ、ｃＧＭ
    Ｐ、ｃＵＭＰ、またはｃＣＭＰである、請求項１５に記載のキット。
  17. 【請求項１７】 前記環状ヌクレオチドホスフェートがｃＡＭＰである、請
    求項１６に記載のキット。
  18. 【請求項１８】 前記洗浄ステップが、ｐＨ８．０−１１．０の緩衝液を用
    いて行われる、請求項１に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記洗浄ステップの緩衝液が、カーボネートビカーボネー
    ト及びトウィーン２０を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 活性酵素としてのアルカリ性ホスファターゼを用いる反応
    ウェルから未結合の反応体を洗浄する際に使用する、ｐＨ８．０−１１．０のカ
    ーボネートビカーボネート及びトウィーン２０を含む緩衝液。
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