JP2000180448A - 酵素免疫測定法 - Google Patents
酵素免疫測定法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として
用い、新規な化学発光系により抗原又は抗体を免疫学的
に測定する方法を提供する。 【解決手段】 ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として
用いる酵素免疫測定法において、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする
化学発光試薬又はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カル
ボン酸アミド化合物及び特定アミノアルコール化合物を
主成分とする化学発光試薬を用いる化学発光酵素免疫測
定法により、抗原又は抗体を高感度に測定する方法。
用い、新規な化学発光系により抗原又は抗体を免疫学的
に測定する方法を提供する。 【解決手段】 ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として
用いる酵素免疫測定法において、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする
化学発光試薬又はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カル
ボン酸アミド化合物及び特定アミノアルコール化合物を
主成分とする化学発光試薬を用いる化学発光酵素免疫測
定法により、抗原又は抗体を高感度に測定する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、化学発光法を利用
する酵素免疫測定法に関するものであり、更に詳しく
は、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、特定
の新規化学発光試薬を用いる抗原又は抗体の免疫学的測
定方法に関するものである。
する酵素免疫測定法に関するものであり、更に詳しく
は、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、特定
の新規化学発光試薬を用いる抗原又は抗体の免疫学的測
定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】酵素免疫測定法は、標識物質に放射性同
位元素を使用しないので、良好な測定環境を保持するこ
とが可能であり、人体に対して危険性の少ない免疫測定
法として開発され、種々の物質の測定系に利用されてい
る。この酵素免疫測定法においては、ぺルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及
びグルコースオキシダーゼ等の種々の酵素が使用されて
いる。これらの酵素を用いた酵素標識抗体又は抗原の酵
素活性を検出する方法としては、過酸化水素／ｏ−フェ
ニレンジアミン、４−ニトロフェニル−ホスフェ−ト、
２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド等の酵素基質の
酵素による分解反応に伴い生成する発色性物質の発色量
を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を
有する抗体又は抗原の量を定量する比色法が一般的であ
る。
位元素を使用しないので、良好な測定環境を保持するこ
とが可能であり、人体に対して危険性の少ない免疫測定
法として開発され、種々の物質の測定系に利用されてい
る。この酵素免疫測定法においては、ぺルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及
びグルコースオキシダーゼ等の種々の酵素が使用されて
いる。これらの酵素を用いた酵素標識抗体又は抗原の酵
素活性を検出する方法としては、過酸化水素／ｏ−フェ
ニレンジアミン、４−ニトロフェニル−ホスフェ−ト、
２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド等の酵素基質の
酵素による分解反応に伴い生成する発色性物質の発色量
を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を
有する抗体又は抗原の量を定量する比色法が一般的であ
る。
【０００３】しかしながら、臨床化学分析においては、
その測定対象が生体試料（主として血清、尿等）であ
り、その測定値は病態の診断、又は経過観察等に用いら
れることが多く、そのために、より高感度及び高精度な
測定が求められているが、比色法によりこの要求を完全
に満足させるのはは難しい。
その測定対象が生体試料（主として血清、尿等）であ
り、その測定値は病態の診断、又は経過観察等に用いら
れることが多く、そのために、より高感度及び高精度な
測定が求められているが、比色法によりこの要求を完全
に満足させるのはは難しい。
【０００４】そこで、この要求を満たすことを目的とし
て蛍光法が提案されている。蛍光法とは、標識に用いた
酵素の触媒活性により、４−ヒドロキシフェニル酢酸、
４−メチルウムベリフェリル−β−ガラクトシド、４−
メチルウムベリフェリル−ホスフェート等の蛍光基質を
分解して蛍光を発生させた後、この蛍光強度を測定して
酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体
又は抗原の量を定量する方法である。しかし、蛍光法で
は、励起光の散乱が存在するため上記の要求を満たすに
は充分とは云い難い。また、比色法及び蛍光法では、キ
セノンランプ等の光源が必要であり、光源からの光に由
来する迷走現象や溶媒に由来するラマン光が原因とな
り、バックグラウンドのレベルを上昇させてしまうの
で、比色法及び蛍光法による測定の高感度化は原理的に
困難である。
て蛍光法が提案されている。蛍光法とは、標識に用いた
酵素の触媒活性により、４−ヒドロキシフェニル酢酸、
４−メチルウムベリフェリル−β−ガラクトシド、４−
メチルウムベリフェリル−ホスフェート等の蛍光基質を
分解して蛍光を発生させた後、この蛍光強度を測定して
酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体
又は抗原の量を定量する方法である。しかし、蛍光法で
は、励起光の散乱が存在するため上記の要求を満たすに
は充分とは云い難い。また、比色法及び蛍光法では、キ
セノンランプ等の光源が必要であり、光源からの光に由
来する迷走現象や溶媒に由来するラマン光が原因とな
り、バックグラウンドのレベルを上昇させてしまうの
で、比色法及び蛍光法による測定の高感度化は原理的に
困難である。
【０００５】近年、比色法及び蛍光法を上回る高感度な
酵素免疫測定法として、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬ
ＥＩＡ）が開発され、注目されている。ＣＬＥＩＡは、
酵素の触媒活性によって化学発光物質が中間体を経て励
起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出さ
れる発光量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性
と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する方法であ
り、化学反応により化学発光性物質を発光させるため光
源が不要であり、光源に起因するバックグラウンドの上
昇等がないため測定の高感度化が可能である。ＣＬＥＩ
Ａに用いられる酵素としては、ぺルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ等が挙げられるが、
取り扱い易さ、入手し易さ等の点でぺルオキシダーゼが
好適に用いられ、化学発光物質にルミノールを用い、発
光増強剤にｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が
開発され、種々の物質が化学発光法により免疫学的に高
感度に定量することが可能になっている。しかしなが
ら、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質とするＣＬＥＩＡ
においては、測定対象物質の低濃度領域での定量性を更
に高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダー
ゼ酵素を標識物質とするＣＬＥＩＡの更なる高感度化が
望まれていた。
酵素免疫測定法として、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬ
ＥＩＡ）が開発され、注目されている。ＣＬＥＩＡは、
酵素の触媒活性によって化学発光物質が中間体を経て励
起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出さ
れる発光量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性
と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する方法であ
り、化学反応により化学発光性物質を発光させるため光
源が不要であり、光源に起因するバックグラウンドの上
昇等がないため測定の高感度化が可能である。ＣＬＥＩ
Ａに用いられる酵素としては、ぺルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ等が挙げられるが、
取り扱い易さ、入手し易さ等の点でぺルオキシダーゼが
好適に用いられ、化学発光物質にルミノールを用い、発
光増強剤にｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が
開発され、種々の物質が化学発光法により免疫学的に高
感度に定量することが可能になっている。しかしなが
ら、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質とするＣＬＥＩＡ
においては、測定対象物質の低濃度領域での定量性を更
に高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダー
ゼ酵素を標識物質とするＣＬＥＩＡの更なる高感度化が
望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、上
記事情に鑑み、測定対象物質をより高感度で測定可能な
化学発光法による新規な免疫測定系を利用した化学発光
酵素免疫測定法を提供することを課題とする。
記事情に鑑み、測定対象物質をより高感度で測定可能な
化学発光法による新規な免疫測定系を利用した化学発光
酵素免疫測定法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、化
学発光系としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアク
リジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カル
ボン酸アミド化合物からなる化学発光試薬、又はＮ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電
荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及
び特定アミノアルコール化合物からなる化学発光試薬を
用い、更に、必要に応じて、発光増強剤として特定のフ
ェノール性化合物を用いる化学発光系が、化学発光試薬
にルミノールを用いる化学発光系より高感度に測定対象
物質を免疫学的に定量することが可能なことを見い出
し、これらの知見に基づいて本発明に到達した。
上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、化
学発光系としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアク
リジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カル
ボン酸アミド化合物からなる化学発光試薬、又はＮ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電
荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及
び特定アミノアルコール化合物からなる化学発光試薬を
用い、更に、必要に応じて、発光増強剤として特定のフ
ェノール性化合物を用いる化学発光系が、化学発光試薬
にルミノールを用いる化学発光系より高感度に測定対象
物質を免疫学的に定量することが可能なことを見い出
し、これらの知見に基づいて本発明に到達した。
【０００８】すなわち、本発明の第一は、ペルオキシダ
ーゼ酵素標識した抗体若しくは抗原を試料中の測定すべ
き抗原若しくは抗体、又はそれらの凝集物と混合し、抗
原抗体反応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体
錯体からなる免疫複合体を形成させた後、これを分離し
て、下記一般式（１）
ーゼ酵素標識した抗体若しくは抗原を試料中の測定すべ
き抗原若しくは抗体、又はそれらの凝集物と混合し、抗
原抗体反応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体
錯体からなる免疫複合体を形成させた後、これを分離し
て、下記一般式（１）
【０００９】
【化４】 （上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、それぞ
れアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素
原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリー
ロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互
いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘ・は前駆体ビ
スアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残
基である酸ラジカルを示す。）で表わされるＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体、及び下記一般式（２）
れアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素
原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリー
ロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互
いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘ・は前駆体ビ
スアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残
基である酸ラジカルを示す。）で表わされるＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体、及び下記一般式（２）
【００１０】
【化５】 （上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数
１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
ミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ
3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていて
もよく、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それぞれが
結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒
素原子と共に環を形成していてもよい。）で表わされる
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする
化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下において化学
発光させ、その発光強度を測定することにより試料中の
抗原又は抗体の量を定量することを特徴とする化学発光
酵素免疫測定法に関するものである。
１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
ミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ
3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていて
もよく、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それぞれが
結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒
素原子と共に環を形成していてもよい。）で表わされる
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする
化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下において化学
発光させ、その発光強度を測定することにより試料中の
抗原又は抗体の量を定量することを特徴とする化学発光
酵素免疫測定法に関するものである。
【００１１】また、本発明の第二は、ペルオキシダーゼ
酵素標識した抗体若しくは抗原を試料中の測定すべき抗
原若しくは抗体、又はそれらの凝集物と混合し、抗原抗
体反応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体
からなる免疫複合体を形成させた後、これを分離して、
請求項１に記載の化学発光試薬に下記一般式（３）
酵素標識した抗体若しくは抗原を試料中の測定すべき抗
原若しくは抗体、又はそれらの凝集物と混合し、抗原抗
体反応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体
からなる免疫複合体を形成させた後、これを分離して、
請求項１に記載の化学発光試薬に下記一般式（３）
【００１２】
【化６】 （上記一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価
の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整数を表わ
す。）で表わされるアミノアルコール化合物を添加して
なる化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下において
化学発光させ、その発光強度を測定することにより試料
中の抗原又は抗体の量を定量することを特徴とする化学
発光酵素免疫測定法に関するものである。
の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整数を表わ
す。）で表わされるアミノアルコール化合物を添加して
なる化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下において
化学発光させ、その発光強度を測定することにより試料
中の抗原又は抗体の量を定量することを特徴とする化学
発光酵素免疫測定法に関するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明につき更に詳しく説
明する。本発明の化学発光酵素免疫測定法は、ペルオキ
シダーゼ酵素標識した抗体又は抗原を試料中の測定すべ
き抗原若しくは抗体、又はそれらの凝集物と混合し、抗
原抗体反応により測定すべき抗原又は抗体をペルオキシ
ダーゼ酵素標識した免疫複合体として捕捉する免疫反応
段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する
標識酵素を用いる化学発光法により測定する化学発光反
応段階とからなる。
明する。本発明の化学発光酵素免疫測定法は、ペルオキ
シダーゼ酵素標識した抗体又は抗原を試料中の測定すべ
き抗原若しくは抗体、又はそれらの凝集物と混合し、抗
原抗体反応により測定すべき抗原又は抗体をペルオキシ
ダーゼ酵素標識した免疫複合体として捕捉する免疫反応
段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する
標識酵素を用いる化学発光法により測定する化学発光反
応段階とからなる。
【００１４】免疫反応段階を構成する抗原抗体反応の方
法は任意であり、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物からなる化学発光試薬、又はＮ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電
荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及
び特定アミノアルコール化合物からなる化学発光試薬を
用いることができるものであれば、いずれの方法も採用
することができる。
法は任意であり、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物からなる化学発光試薬、又はＮ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電
荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及
び特定アミノアルコール化合物からなる化学発光試薬を
用いることができるものであれば、いずれの方法も採用
することができる。
【００１５】例えば、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
を捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗体を反応
させるサンドイッチ法、 サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体
と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンド
イッチ錯体に対して、更にこの抗体に対する標識第二抗
体を反応させる二抗体法、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる
競合法、 測定すべき抗原若しくは抗体を含有する試料にこれら
と特異的に反応する標識した抗体若しくは抗原を作用さ
せて凝集沈殿させた後、遠心分離して分離した免疫複合
体中の標識物質を検出する凝集沈殿法、 不溶性担体に結合した抗原に試料中の測定すべき抗体
をペルオキシダーゼ酵素標識抗ヒトガンマグロブリン抗
体を作用させる抗体検出法、更に、 ビオチン標識抗体にペルオキシダーゼ酵素標識アビジ
ンを反応させるビオチン−アビジン法等を非限定的に用
いることができる。
を捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗体を反応
させるサンドイッチ法、 サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体
と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンド
イッチ錯体に対して、更にこの抗体に対する標識第二抗
体を反応させる二抗体法、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる
競合法、 測定すべき抗原若しくは抗体を含有する試料にこれら
と特異的に反応する標識した抗体若しくは抗原を作用さ
せて凝集沈殿させた後、遠心分離して分離した免疫複合
体中の標識物質を検出する凝集沈殿法、 不溶性担体に結合した抗原に試料中の測定すべき抗体
をペルオキシダーゼ酵素標識抗ヒトガンマグロブリン抗
体を作用させる抗体検出法、更に、 ビオチン標識抗体にペルオキシダーゼ酵素標識アビジ
ンを反応させるビオチン−アビジン法等を非限定的に用
いることができる。
【００１６】本発明の化学発光酵素免疫測定法に用いら
れる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリ
ロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッ
カライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁
性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、
不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、
繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレー
ト、試験管等の種々の形状で用いることができる。更
に、これら不溶性担体への抗原若しくは抗体の固定化方
法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン
結合法等を用いることができる。
れる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリ
ロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッ
カライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁
性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、
不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、
繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレー
ト、試験管等の種々の形状で用いることができる。更
に、これら不溶性担体への抗原若しくは抗体の固定化方
法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン
結合法等を用いることができる。
【００１７】尚、本発明の化学発光酵素免疫測定法にお
いて用いられる抗体類は、モノクローナル抗体及びポリ
クローナル抗体のいずれを使うことも可能であり、その
形態としては全抗体或いはＦ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ等の
断片を用いることができる。また、抗体の起源は任意で
あるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来す
る抗体が好適に用いられる。
いて用いられる抗体類は、モノクローナル抗体及びポリ
クローナル抗体のいずれを使うことも可能であり、その
形態としては全抗体或いはＦ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ等の
断片を用いることができる。また、抗体の起源は任意で
あるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来す
る抗体が好適に用いられる。
【００１８】更に、本発明の化学発光酵素免疫測定法の
後段を構成する化学発光反応は、化学発光試薬として
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物とからなる化学発光試薬を用い、そして発光増強剤の
存在下に水素受容体を作用させて不溶性担体上に捕捉さ
れた標識物質であるペルオキシダーゼ酵素の活性を測定
するものであり、その測定方法は任意であるが、一般
に、化学発光物質及び発光増強剤を含有する測定試薬を
ペルオキシダーゼ酵素標識抗体又は抗原を免疫学的に捕
捉した不溶性担体に添加し、特定塩基性ｐＨ領域におい
て、水素受容体、例えば、過酸化水素水溶液を添加して
化学発光反応させ、その化学発光量を発光測定装置で測
定する方法等が行なわれている。
後段を構成する化学発光反応は、化学発光試薬として
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物とからなる化学発光試薬を用い、そして発光増強剤の
存在下に水素受容体を作用させて不溶性担体上に捕捉さ
れた標識物質であるペルオキシダーゼ酵素の活性を測定
するものであり、その測定方法は任意であるが、一般
に、化学発光物質及び発光増強剤を含有する測定試薬を
ペルオキシダーゼ酵素標識抗体又は抗原を免疫学的に捕
捉した不溶性担体に添加し、特定塩基性ｐＨ領域におい
て、水素受容体、例えば、過酸化水素水溶液を添加して
化学発光反応させ、その化学発光量を発光測定装置で測
定する方法等が行なわれている。
【００１９】次に、本発明の化学発光酵素免疫測定法に
用いられる化学発光試薬について具体的に説明する。化
学発光試薬は、必須成分として、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体およ
びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を、任意成分
としてさらにアミノアルコール化合物を添加してなるも
のである。Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩類の電荷移動錯体は、下記一般式（１）
用いられる化学発光試薬について具体的に説明する。化
学発光試薬は、必須成分として、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体およ
びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を、任意成分
としてさらにアミノアルコール化合物を添加してなるも
のである。Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩類の電荷移動錯体は、下記一般式（１）
【００２０】
【化７】 で表わされる。
【００２１】上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2
は、それぞれアルキル基、アリール基及びハロゲン化ア
リール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は
異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロ
ゲン化アリール基は、炭素数１〜２０を有するものであ
り、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものであ
る。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル
基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこ
れらの分岐状アルキル基を挙げることができる。また、
アリール基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例え
ば、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げるこ
とができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよ
い。アリール基としては、特に、フェニル基が好まし
い。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル
基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙
げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
は、それぞれアルキル基、アリール基及びハロゲン化ア
リール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は
異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロ
ゲン化アリール基は、炭素数１〜２０を有するものであ
り、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものであ
る。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル
基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこ
れらの分岐状アルキル基を挙げることができる。また、
アリール基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例え
ば、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げるこ
とができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよ
い。アリール基としては、特に、フェニル基が好まし
い。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル
基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙
げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００２２】一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5
及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２
０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。
例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル
基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリ
ーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロ
キシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。ま
た、一般式（１）において、Ｘ・は前駆体ビスアクリジ
ニウム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸
ラジカルを示す。
及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２
０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。
例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル
基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリ
ーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロ
キシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。ま
た、一般式（１）において、Ｘ・は前駆体ビスアクリジ
ニウム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸
ラジカルを示す。
【００２３】Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類の電荷移動錯体は、紫外吸収スペクトルに
おける５５０ｎｍ付近に極大をもつ巾広い吸収帯の出現
を分光光度計を用いる方法により測定することができ
る。上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニ
ウム塩類の電荷移動体の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ’
−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，
Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、
Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム
塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアク
リジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビ
スアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’
−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフ
ェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩等の電荷移動
錯体が挙げられるが、これらのなかで、特に、Ｎ，Ｎ’
−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレ
ート（ルシゲニン）の電荷移動錯体が好適に用いられ
る。
ジニウム塩類の電荷移動錯体は、紫外吸収スペクトルに
おける５５０ｎｍ付近に極大をもつ巾広い吸収帯の出現
を分光光度計を用いる方法により測定することができ
る。上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニ
ウム塩類の電荷移動体の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ’
−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，
Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、
Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム
塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアク
リジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビ
スアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’
−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフ
ェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩等の電荷移動
錯体が挙げられるが、これらのなかで、特に、Ｎ，Ｎ’
−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレ
ート（ルシゲニン）の電荷移動錯体が好適に用いられ
る。
【００２４】Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の対イオン
としては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、硝酸
イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン及びカ
ルボン酸イオン等が非限定的に挙げられる。Ｎ，Ｎ’−
ジ置換カルボン酸アミド化合物は、下記一般式（２）
ジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の対イオン
としては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、硝酸
イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン及びカ
ルボン酸イオン等が非限定的に挙げられる。Ｎ，Ｎ’−
ジ置換カルボン酸アミド化合物は、下記一般式（２）
【００２５】
【化８】 で表わされる。
【００２６】上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原
子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていて
もよい。Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選
択される。Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数
２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール
基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル
基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で
置換されていてもよい。また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに
結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素
原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していても
よい。
子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていて
もよい。Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選
択される。Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数
２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール
基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル
基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で
置換されていてもよい。また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに
結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素
原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していても
よい。
【００２７】上記一般式（２）のＮ，Ｎ−ジ置換カルボ
ン酸アミド化合物の具体例を例示すると、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプ
ロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−
メチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げられる。ま
た、アミノアルコール化合物は、下記一般式（３）
ン酸アミド化合物の具体例を例示すると、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプ
ロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−
メチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げられる。ま
た、アミノアルコール化合物は、下記一般式（３）
【００２８】
【化９】 で表わされる。
【００２９】上記一般式（３）において、Ｒは炭素数１
〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整
数を表わす。上記アミノアルコール化合物の具体例を例
示すると、モノエタノールアミン、ジエタノールアミ
ン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミ
ン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノール
アミン等を非限定的に挙げることができる。
〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整
数を表わす。上記アミノアルコール化合物の具体例を例
示すると、モノエタノールアミン、ジエタノールアミ
ン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミ
ン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノール
アミン等を非限定的に挙げることができる。
【００３０】本発明の化学発光免疫測定法に用いられる
化学発光試薬の一つは、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び特定のＮ，
Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を必須成分とするも
のであるが、その成分の一つであるＮ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の前
駆体であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩類は、もう一つの成分であるＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物の存在により自然光等により容易
に電荷移動錯体に転化する現象が認められる。また、こ
のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、生成した
電荷移動錯体のラジカルの安定性にも寄与していると考
えられ、求核性の弱い酸からなるＮ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の形
成及び安定化の必須成分として作用している。また、本
発明の化学発光免疫測定法に用いられるもう一つの化学
発光試薬は、上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カル
ボン酸アミド化合物とからなる化学発光試薬へ特定のア
ミノアルコール化合物を添加することにより得られるも
のであるが、このアミノアルコール化合物の添加は、発
光反応のブランク値を低下させると共に、より廣いペル
オキシダーゼ濃度範囲において安定した化学発光反応を
実現することが可能になる。このアミノアルコール化合
物の添加効果については必ずしもはっきりはしていない
が、対イオンからアクリジン環への電荷移動に関与して
その反応を促進すると共に、生成する電荷移動錯体の有
するラジカルを一層安定化して発光反応時における溶存
酸素との反応を阻止してブランク値を高める要因を排除
することにより、ブランク値の低い安定した高感度測定
を可能にしているものと考えられる。
化学発光試薬の一つは、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び特定のＮ，
Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を必須成分とするも
のであるが、その成分の一つであるＮ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の前
駆体であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩類は、もう一つの成分であるＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物の存在により自然光等により容易
に電荷移動錯体に転化する現象が認められる。また、こ
のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、生成した
電荷移動錯体のラジカルの安定性にも寄与していると考
えられ、求核性の弱い酸からなるＮ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の形
成及び安定化の必須成分として作用している。また、本
発明の化学発光免疫測定法に用いられるもう一つの化学
発光試薬は、上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カル
ボン酸アミド化合物とからなる化学発光試薬へ特定のア
ミノアルコール化合物を添加することにより得られるも
のであるが、このアミノアルコール化合物の添加は、発
光反応のブランク値を低下させると共に、より廣いペル
オキシダーゼ濃度範囲において安定した化学発光反応を
実現することが可能になる。このアミノアルコール化合
物の添加効果については必ずしもはっきりはしていない
が、対イオンからアクリジン環への電荷移動に関与して
その反応を促進すると共に、生成する電荷移動錯体の有
するラジカルを一層安定化して発光反応時における溶存
酸素との反応を阻止してブランク値を高める要因を排除
することにより、ブランク値の低い安定した高感度測定
を可能にしているものと考えられる。
【００３１】上記化学発光試薬の製造方法は任意である
が、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム
塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミ
ド化合物を主成分とする化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ
置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を等モル以上
のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と混合して自
然光の下に放置することにより得られるが、電荷移動錯
体の生成は光により触媒されているので、光照射下に反
応を行なうのが好ましい。この光照射に用いる光源とし
ては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可
視部が用いられ、特に、約４００〜８００ｎｍの範囲の
可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀
灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限
定的に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用い
られる。
が、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム
塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミ
ド化合物を主成分とする化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ
置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を等モル以上
のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と混合して自
然光の下に放置することにより得られるが、電荷移動錯
体の生成は光により触媒されているので、光照射下に反
応を行なうのが好ましい。この光照射に用いる光源とし
ては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可
視部が用いられ、特に、約４００〜８００ｎｍの範囲の
可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀
灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限
定的に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用い
られる。
【００３２】また、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物との混合比としては、Ｎ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を
１〜１万倍モル、好ましくは１〜５千倍モルの割合で用
いることができる。
アクリジニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物との混合比としては、Ｎ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を
１〜１万倍モル、好ましくは１〜５千倍モルの割合で用
いることができる。
【００３３】本発明に用いられるもう一つの化学発光試
薬は、上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カルボンア
ミド化合物からなる化学発光試薬に特定のアミノアルコ
ール化合物を添加すことにより得られる。アミノアルコ
ール化合物はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類の電荷移動反応時及び／又は反応後に添加
することができるが、電荷移動反応後に添加するのが好
ましい。ここで、電荷移動反応時の添加には電荷移動反
応前の添加も含む。上記アミノアルコール化合物の添加
量は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウ
ム塩類の電荷移動錯体に対して、１〜１万倍モル、好ま
しくは１〜２千倍モルの量でよい。
薬は、上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カルボンア
ミド化合物からなる化学発光試薬に特定のアミノアルコ
ール化合物を添加すことにより得られる。アミノアルコ
ール化合物はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類の電荷移動反応時及び／又は反応後に添加
することができるが、電荷移動反応後に添加するのが好
ましい。ここで、電荷移動反応時の添加には電荷移動反
応前の添加も含む。上記アミノアルコール化合物の添加
量は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウ
ム塩類の電荷移動錯体に対して、１〜１万倍モル、好ま
しくは１〜２千倍モルの量でよい。
【００３４】本発明の化学発光免疫測定法において上記
の新規化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件
下で、過剰の水素受容体の存在下、ペルオキシダーゼの
濃度に依存した量で発光する。この発光は、フェノール
性化合物等の発光促進剤によって増強することが認めら
れる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒ
ドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−
クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニ
ル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノー
ル、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ
−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ
−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナ
フトール、ホタルルシフェリン等が非限定的に挙げられ
る。
の新規化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件
下で、過剰の水素受容体の存在下、ペルオキシダーゼの
濃度に依存した量で発光する。この発光は、フェノール
性化合物等の発光促進剤によって増強することが認めら
れる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒ
ドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−
クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニ
ル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノー
ル、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ
−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ
−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナ
フトール、ホタルルシフェリン等が非限定的に挙げられ
る。
【００３５】上記新規化学発光試薬を用いて化学発光分
析を行なう場合には、１０-8〜１Ｍ、好ましくは１０-6
〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量は１０
〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲でよ
い。また、発光促進剤の使用量は、化学発光試薬の０．
０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの
範囲であり、その濃度としては、１０-6〜１Ｍ、好まし
くは１０-4〜１０-2Ｍの範囲が採用される。
析を行なう場合には、１０-8〜１Ｍ、好ましくは１０-6
〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量は１０
〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲でよ
い。また、発光促進剤の使用量は、化学発光試薬の０．
０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの
範囲であり、その濃度としては、１０-6〜１Ｍ、好まし
くは１０-4〜１０-2Ｍの範囲が採用される。
【００３６】また、化学発光反応に用いられる水素受容
体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るも
のであれば特に限定されるものではなく、無機過酸化
物、有機過酸化物等が任意に用いられるが、過酸化水素
が特に好ましい。水素受容体は化学発光試薬に対して充
分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は
化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましくは１０
〜１０００倍モルの範囲で採用される。
体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るも
のであれば特に限定されるものではなく、無機過酸化
物、有機過酸化物等が任意に用いられるが、過酸化水素
が特に好ましい。水素受容体は化学発光試薬に対して充
分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は
化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましくは１０
〜１０００倍モルの範囲で採用される。
【００３７】また、ペルオキシダーゼを標識物質として
抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合に
は、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼ
として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ま
しく用いられる。化学発光反応に用いる塩基性緩衝液と
しては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、
炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任
意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度として
は１ｍＭ〜１Ｍの範囲が望ましい。また、反応時には界
面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることが
できる。
抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合に
は、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼ
として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ま
しく用いられる。化学発光反応に用いる塩基性緩衝液と
しては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、
炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任
意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度として
は１ｍＭ〜１Ｍの範囲が望ましい。また、反応時には界
面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることが
できる。
【００３８】
【実施例】以下、参考例と共に実施例等を示し、本発明
を具体的に説明する。もっとも、本発明は実施例等によ
り限定されるものではない。尚、参考例及び実施例中の
％は重量％を意味する。
を具体的に説明する。もっとも、本発明は実施例等によ
り限定されるものではない。尚、参考例及び実施例中の
％は重量％を意味する。
【００３９】［参考例１］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセ
トアミドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反
応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータ
ーを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固さ
せ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物
を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を
得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に
９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してか
ら、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾
燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の
収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採
り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加え
て溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコ
ピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の
電荷移動錯体を含有する化学発光試薬を得た。尚、電荷
移動錯体の生成は、紫外吸収スペクトルにおける５５０
ｎｍ付近に極大をもつ幅広い吸収帯の出現を分光光度計
を用いる方法により測定して確認した。
沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセ
トアミドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反
応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータ
ーを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固さ
せ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物
を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を
得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に
９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してか
ら、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾
燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の
収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採
り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加え
て溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコ
ピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の
電荷移動錯体を含有する化学発光試薬を得た。尚、電荷
移動錯体の生成は、紫外吸収スペクトルにおける５５０
ｎｍ付近に極大をもつ幅広い吸収帯の出現を分光光度計
を用いる方法により測定して確認した。
【００４０】［参考例２］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
沃化水素酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセト
アミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の
調製 参考例１で得られた化学発光試薬１ｍｌにトリエタノー
ルアミン０．５ｍｌを添加し混合することにより化学発
光試薬を得た。
沃化水素酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセト
アミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の
調製 参考例１で得られた化学発光試薬１ｍｌにトリエタノー
ルアミン０．５ｍｌを添加し混合することにより化学発
光試薬を得た。
【００４１】［参考例３］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ
−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、
３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時
間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−
ビスアクリジニウム硝酸塩の電荷移動錯体を含有する化
学発光試薬を得た。
硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ
−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、
３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時
間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−
ビスアクリジニウム硝酸塩の電荷移動錯体を含有する化
学発光試薬を得た。
【００４２】［参考例４］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
塩酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製 参考例３で得られた化学発光試薬１ｍｌにトリエタノー
ルアミン０．５ｍｌを添加し混合することにより化学発
光試薬を得た。
塩酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製 参考例３で得られた化学発光試薬１ｍｌにトリエタノー
ルアミン０．５ｍｌを添加し混合することにより化学発
光試薬を得た。
【００４３】［参考例５］不溶性担体固定化ポリクローナル抗体の調製 抗原に特異的反応性を有する兎等の動物由来のポリクロ
ーナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
(pH7.4) に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を、白
色マイクロプレート（ラボシステム社）の各ウェルに
０．１ｍｌずつ加え、３７℃の温度で１時間放置した
後、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）水溶液を０．３ｍｌずつ加えて３７℃の温度
で１時間放置してポストコーティング処理を実施してポ
リクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得た。
ーナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
(pH7.4) に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を、白
色マイクロプレート（ラボシステム社）の各ウェルに
０．１ｍｌずつ加え、３７℃の温度で１時間放置した
後、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）水溶液を０．３ｍｌずつ加えて３７℃の温度
で１時間放置してポストコーティング処理を実施してポ
リクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得た。
【００４４】［参考例６］ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体の調製 抗原に特異的反応性を有するマウス由来等のモノクロー
ナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(p
H7.4) に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液１ｍｌ
に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイ
ミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のジメ
チルホルムアミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５℃の温
度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセ
ファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１
Ｍリン酸緩衝液(pH6.0) でゲル濾過を行ない、マレイミ
ド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ
・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍｇ／ｍｌのＰ
ＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジ
ルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１０ｍｇ／ｍｌ
の濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃の温度で３０
分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデッ
クスＧ−２５を充填したカラムを用い、１０ｍＭ酢酸緩
衝液(pH4.5) でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィ
ド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオン
バック中において氷冷下に約１０倍に濃縮した。次に、
これに０．１Ｍジチオスレイトールを含有する０．１Ｍ
酢酸緩衝生理食塩水(pH4.5) １ｍｌを添加して、２５℃
の温度で３０分間攪拌してＨＲＰ分子中に導入したピリ
ジルジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセ
ファデックスＧ−２５を充填したカラムを用いてゲル濾
過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。次に、
マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰと
を混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に４ｍｇ／
ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で一昼夜放置した
後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰＲＡＣＯＲ社）を
充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ
酵素標識モノクローナル抗体を得た。
ナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(p
H7.4) に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液１ｍｌ
に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイ
ミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のジメ
チルホルムアミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５℃の温
度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセ
ファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１
Ｍリン酸緩衝液(pH6.0) でゲル濾過を行ない、マレイミ
ド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ
・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍｇ／ｍｌのＰ
ＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジ
ルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１０ｍｇ／ｍｌ
の濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃の温度で３０
分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデッ
クスＧ−２５を充填したカラムを用い、１０ｍＭ酢酸緩
衝液(pH4.5) でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィ
ド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオン
バック中において氷冷下に約１０倍に濃縮した。次に、
これに０．１Ｍジチオスレイトールを含有する０．１Ｍ
酢酸緩衝生理食塩水(pH4.5) １ｍｌを添加して、２５℃
の温度で３０分間攪拌してＨＲＰ分子中に導入したピリ
ジルジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセ
ファデックスＧ−２５を充填したカラムを用いてゲル濾
過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。次に、
マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰと
を混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に４ｍｇ／
ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で一昼夜放置した
後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰＲＡＣＯＲ社）を
充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ
酵素標識モノクローナル抗体を得た。
【００４５】［実施例１］参考例１で調製した化学発光試薬を用いる同時サンドイ
ッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロティン（ＡＦ
Ｐ）の測定 参考例５の方法で調製した兎抗ヒトＡＦＰポリクローナ
ル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製した
ヒトＡＦＰ（標準物質）を０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲
で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌ
と参考例６の方法で調製したペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4)
１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベ
ートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウ
ェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに
参考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩
衝液(pH7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、こ
の発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナ
スＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、こ
の値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、
図１に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検
量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを０．０１ｎｇ／
ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。
ッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロティン（ＡＦ
Ｐ）の測定 参考例５の方法で調製した兎抗ヒトＡＦＰポリクローナ
ル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製した
ヒトＡＦＰ（標準物質）を０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲
で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌ
と参考例６の方法で調製したペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4)
１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベ
ートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウ
ェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに
参考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩
衝液(pH7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、こ
の発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナ
スＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、こ
の値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、
図１に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検
量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを０．０１ｎｇ／
ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。
【００４６】［実施例２］参考例２で調製した化学発光試薬を用いる同時サンドイ
ッチ法ＣＬＥＩＡによるヒトプロラクチン（ＰＲＬ）の
測定 参考例５の方法で調製した兎抗ヒトＰＲＬポリクローナ
ル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製した
ヒトＰＲＬ（標準物質）を０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲
で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌ
と参考例６の方法で調製したペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4)
１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベ
ートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去し、ウェ
ル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍＭ
トリス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに参
考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．
００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩衝液
(pH7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、この発
光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣ
Ｔ−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、この値
を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図２
に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線
を用いて血清検体中のヒトＰＲＬを０．０１ｎｇ／ｍｌ
の濃度まで測定することが可能であった。
ッチ法ＣＬＥＩＡによるヒトプロラクチン（ＰＲＬ）の
測定 参考例５の方法で調製した兎抗ヒトＰＲＬポリクローナ
ル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製した
ヒトＰＲＬ（標準物質）を０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲
で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌ
と参考例６の方法で調製したペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4)
１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベ
ートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去し、ウェ
ル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍＭ
トリス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに参
考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．
００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩衝液
(pH7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、この発
光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣ
Ｔ−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、この値
を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図２
に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線
を用いて血清検体中のヒトＰＲＬを０．０１ｎｇ／ｍｌ
の濃度まで測定することが可能であった。
【００４７】［実施例３］参考例３で調製した同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによ
るヒト絨毛性ゴナドトロピンβ鎖（βｈＣＧ）の測定 参考例５の方法で調製した兎抗ヒトｈＣＧポリクローナ
ル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製した
βｈＣＧ（標準物質）を０〜１００ｍＩＵ／ｍｌの範囲
で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌ
と参考例５の方法で調製したペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ／ｍｌ
の濃度で含む２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) １００
μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートし
た。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウェル内
を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに参考例
１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００
１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH
7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、この発光
量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ
−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、この値を
標準物質濃度に対してプロットすることにより、図３に
示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を
用いて血清検体中のβｈＣＧを０．０１ｍＩＵ／ｍｌの
濃度まで測定することが可能であった。
るヒト絨毛性ゴナドトロピンβ鎖（βｈＣＧ）の測定 参考例５の方法で調製した兎抗ヒトｈＣＧポリクローナ
ル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製した
βｈＣＧ（標準物質）を０〜１００ｍＩＵ／ｍｌの範囲
で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌ
と参考例５の方法で調製したペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ／ｍｌ
の濃度で含む２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) １００
μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートし
た。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウェル内
を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに参考例
１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００
１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH
7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、この発光
量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ
−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、この値を
標準物質濃度に対してプロットすることにより、図３に
示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を
用いて血清検体中のβｈＣＧを０．０１ｍＩＵ／ｍｌの
濃度まで測定することが可能であった。
【００４８】［実施例４］参考例４で調製した化学発光試薬を用いる同時サンドイ
ッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロティン（ＡＦ
Ｐ）の測定 参考例５の方法で調製した兎抗比とＡＦＰポリクローナ
ル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製した
ヒトＡＦＰ（標準物質）を０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲
で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌ
と参考例６の方法で調製したペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4)
１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベ
ートする。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウ
ェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに
参考例４で調製した化学発光試薬１００μｌ及び０．０
０１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(p
H7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、この発光
量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ
−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、この値を
標準物質濃度に対してプロットすることにより、図４に
示される濃度依存性を有する検量線を得た。この検量線
を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを０．０１ｎｇ／ｍｌ
の濃度まで測定することが可能であった。
ッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロティン（ＡＦ
Ｐ）の測定 参考例５の方法で調製した兎抗比とＡＦＰポリクローナ
ル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製した
ヒトＡＦＰ（標準物質）を０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲
で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌ
と参考例６の方法で調製したペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4)
１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベ
ートする。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウ
ェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに
参考例４で調製した化学発光試薬１００μｌ及び０．０
０１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(p
H7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、この発光
量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ
−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、この値を
標準物質濃度に対してプロットすることにより、図４に
示される濃度依存性を有する検量線を得た。この検量線
を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを０．０１ｎｇ／ｍｌ
の濃度まで測定することが可能であった。
【００４９】［比較例１］ルミノールを用いる同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによ
るα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定 兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を
０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標
識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.
4) １００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキ
ュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した
後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに
ｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌを加え、これ
にルミノールを５．６×１０-5Ｍの濃度で含有する０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌ、及び０．０
０３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.
4) ５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノ
メーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００
Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃
度に対してプロットすることにより、図５に示される濃
度依存性を有する検量線を得た。この検量線を用いて血
清検体中のヒトＡＦＰを２．０ｎｇ／ｍｌの濃度まで測
定することが可能であった。
るα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定 兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を
０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標
識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.
4) １００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキ
ュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した
後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに
ｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌを加え、これ
にルミノールを５．６×１０-5Ｍの濃度で含有する０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌ、及び０．０
０３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.
4) ５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノ
メーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００
Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃
度に対してプロットすることにより、図５に示される濃
度依存性を有する検量線を得た。この検量線を用いて血
清検体中のヒトＡＦＰを２．０ｎｇ／ｍｌの濃度まで測
定することが可能であった。
【００５０】
【発明の効果】本発明の化学発光酵素免疫測定法は、入
手が容易で取り扱いも比較的に容易なペルオキシダーゼ
酵素を標識物質として用い、安価で入手が容易であるル
シゲニン等を出発原料とし、且つ容易に製造できる新規
化学発光試薬を用いる化学発光法により測定対象物質で
ある種々の抗原又は抗体類を免疫学的に高感度に測定す
ることができる。
手が容易で取り扱いも比較的に容易なペルオキシダーゼ
酵素を標識物質として用い、安価で入手が容易であるル
シゲニン等を出発原料とし、且つ容易に製造できる新規
化学発光試薬を用いる化学発光法により測定対象物質で
ある種々の抗原又は抗体類を免疫学的に高感度に測定す
ることができる。
【図１】 実施例１記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。
【図２】 実施例２記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトプロラクチン（標準物質）の濃度の
関数としてプロットして作成したヒトプロラクチン測定
用の検量線である。
た化学発光量をヒトプロラクチン（標準物質）の濃度の
関数としてプロットして作成したヒトプロラクチン測定
用の検量線である。
【図３】 実施例３記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をβｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数とし
てプロットして作成したβｈＣＧ測定用の検量線であ
る。
た化学発光量をβｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数とし
てプロットして作成したβｈＣＧ測定用の検量線であ
る。
【図４】 実施例４記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。
【図５】 比較例１記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年２月１７日（２０００．２．１
７）
７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】［参考例３］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ
−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、
３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時
間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−
ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体を含有する
化学発光試薬を得た。
硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ
−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、
３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時
間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−
ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体を含有する
化学発光試薬を得た。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４２】［参考例４］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製 参考例３で得られた化学発光試薬１ｍｌにトリエタノー
ルアミン０．５ｍｌを添加し混合することにより化学発
光試薬を得た。
硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製 参考例３で得られた化学発光試薬１ｍｌにトリエタノー
ルアミン０．５ｍｌを添加し混合することにより化学発
光試薬を得た。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４６】［実施例２］参考例２で調製した化学発光試薬を用いる同時サンドイ
ッチ法ＣＬＥＩＡによるヒトプロラクチン（ＰＲＬ）の
測定 参考例５の方法で調製した兎抗ヒトＰＲＬポリクローナ
ル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製した
ヒトＰＲＬ（標準物質）を０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲
で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌ
と参考例６の方法で調製したペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4)
１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベ
ートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去し、ウェ
ル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍＭ
トリス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに参
考例２で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．
００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩衝液
(pH7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、この発
光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣ
Ｔ−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、この値
を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図２
に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線
を用いて血清検体中のヒトＰＲＬを０．０１ｎｇ／ｍｌ
の濃度まで測定することが可能であった。
ッチ法ＣＬＥＩＡによるヒトプロラクチン（ＰＲＬ）の
測定 参考例５の方法で調製した兎抗ヒトＰＲＬポリクローナ
ル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製した
ヒトＰＲＬ（標準物質）を０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲
で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌ
と参考例６の方法で調製したペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4)
１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベ
ートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去し、ウェ
ル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍＭ
トリス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに参
考例２で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．
００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩衝液
(pH7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、この発
光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣ
Ｔ−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、この値
を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図２
に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線
を用いて血清検体中のヒトＰＲＬを０．０１ｎｇ／ｍｌ
の濃度まで測定することが可能であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４７】［実施例３］参考例３で調製した同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによ
るヒト絨毛性ゴナドトロピンβ鎖（βｈＣＧ）の測定 参考例５の方法で調製した兎抗ヒトｈＣＧポリクローナ
ル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製した
βｈＣＧ（標準物質）を０〜１００ｍＩＵ／ｍｌの範囲
で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌ
と参考例５の方法で調製したペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ／ｍｌ
の濃度で含む２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) １００
μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートし
た。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウェル内
を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに参考例
３で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００
１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH
7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、この発光
量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ
−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、この値を
標準物質濃度に対してプロットすることにより、図３に
示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を
用いて血清検体中のβｈＣＧを０．０１ｍＩＵ／ｍｌの
濃度まで測定することが可能であった。
るヒト絨毛性ゴナドトロピンβ鎖（βｈＣＧ）の測定 参考例５の方法で調製した兎抗ヒトｈＣＧポリクローナ
ル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製した
βｈＣＧ（標準物質）を０〜１００ｍＩＵ／ｍｌの範囲
で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌ
と参考例５の方法で調製したペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ／ｍｌ
の濃度で含む２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4) １００
μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートし
た。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウェル内
を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに参考例
３で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００
１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH
7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、この発光
量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ
−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、この値を
標準物質濃度に対してプロットすることにより、図３に
示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を
用いて血清検体中のβｈＣＧを０．０１ｍＩＵ／ｍｌの
濃度まで測定することが可能であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 荒谷 弦一郎 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 細越 未央 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 Ｆターム(参考） 2G054 AA06 AB04 AB10 CE02 CE08 CE10 EA01 FA34 GE01 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ79 QQ96 QR02 QR41 QR48 QR50 QR51 QR54 QR66 QR82 QR84 QS03 QS33 QX02
Claims (8)
- 【請求項１】 ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体
若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原若しくは抗体、
又はそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペル
オキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合
体を形成させた後、これを分離して、下記一般式（１） 【化１】 （上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、それぞ
れアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素
原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリー
ロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互
いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘ・は前駆体ビ
スアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残
基である酸ラジカルを示す。）で表わされるＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体、及び下記一般式（２） 【化２】 （上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数
１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
ミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ
3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていて
もよく、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それぞれが
結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒
素原子と共に環を形成していてもよい。）で表わされる
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする
化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下において化学
発光させ、その発光強度を測定することにより試料中の
抗原又は抗体の量を定量することを特徴とする化学発光
酵素免疫測定法。 - 【請求項２】 ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体若
しくは抗原を試料中の測定すべき抗原若しくは抗体、又
はそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペルオ
キシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体
を形成させた後、これを分離して、請求項１に記載の化
学発光試薬に下記一般式（３） 【化３】 （上記一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価
の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整数を表わ
す。）で表わされるアミノアルコール化合物を添加して
なる化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下において
化学発光させ、その発光強度を測定することにより試料
中の抗原又は抗体の量を定量することを特徴とする化学
発光酵素免疫測定法。 - 【請求項３】 前記抗原抗体反応を不溶性担体に固定
化した抗体の存在下に行ない、標識化された免疫複合体
を該不溶性担体上に形成させる請求項１又は２に記載の
化学発光酵素免疫測定法。 - 【請求項４】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビ
スアクリジニウム塩類の電荷移動錯体がＮ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート
（ルシゲニン）の電荷移動錯体である請求項１〜３のい
ずれかに記載の化学発光酵素免疫測定法。 - 【請求項５】 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
化合物がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はＮ，Ｎ−ジ
メチルアセトアミドである請求項１〜４のいずれかの請
求項に記載の化学発光酵素免疫測定法。 - 【請求項６】 前記水素受容体が過酸化水素又は過酸
化水素源である請求項１〜５のいずれかの請求項に記載
の化学発光酵素免疫測定法。 - 【請求項７】 前記化学発光反応を行なう際に、更
に、発光増強剤を含有させてなる請求項１〜６のいずれ
かの請求項に記載の化学発光酵素免疫測定法。 - 【請求項８】 前記発光増強剤がフェノール性化合物
である請求項７に記載の化学発光酵素免疫測定法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36156998A JP4177498B2 (ja) | 1998-12-18 | 1998-12-18 | 酵素免疫測定法 |
| DE69933850T DE69933850T2 (de) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemilumineszenzmittel und chemilumineszenzanalyseverfahren mit deren verwendung |
| CA002306752A CA2306752C (en) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemiluminescent reagent and chemiluminescent analysis using the same |
| PCT/JP1999/004401 WO2000009626A1 (fr) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Reactifs chimioluminescents et procedes d'analyse par chimioluminescence dans lesquels on utilise lesdits reactifs |
| US09/529,546 US6395503B1 (en) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same |
| EP99937071A EP1038939B1 (en) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36156998A JP4177498B2 (ja) | 1998-12-18 | 1998-12-18 | 酵素免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000180448A true JP2000180448A (ja) | 2000-06-30 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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