JP2000139496A - 新規化学発光試薬及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 過酸化水素等の存在下にペルオキシダー
ゼ酵素の活性測定が可能であり、ペルオキシダーゼ標識
により各種物質の検出及び定量分析等に利用できる新規
化学発光試薬及びその製造方法を提供する。 【解決手段】 Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアク
リジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化
合物及びギ酸の存在下で光照射下に反応させることによ
り得られる、過酸化水素等の存在下にペルオキシダーゼ
酵素活性の高感度測定が可能な新規化学発光試薬及びそ
の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、制御された化学発
光が可能であり、化学発光分析による種々の物質の検出
及び定量等に用いられる新規な化学発光試薬及びその製
造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】化学発光試薬として、古くから用いられ
ているルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビ
スアクリジニウムジナイトレート）は、アルカリ性水溶
液中で微光を呈し、過酸化水素を加えると強く発光する
ことが知られており、種々の微量分析に利用されてい
る。しかしながら、ルシゲニンは過酸化水素とアルカリ
の存在で定量的に発光するので、過酸化水素の定量には
利用することができるが、この反応による発光を制御し
て発光量で酵素活性を測定する化学発光酵素免疫測定法
（ＣＬＥＩＡ）等には利用し難いと云う問題点がある。
この問題点を解決する手段として、標識酵素にグルコー
スオキシダーゼを用いて、グルコースの酸化反応により
生成する過酸化水素をアルカリ存在下にルシゲニンに作
用させることにより、測定対象物質の濃度に依存した化
学発光を行なう方法等が行なわれている。

【０００３】しかしながら、グルコースオキシダーゼを
標識酵素とするＣＬＥＩＡは、試薬の調製及び発光系の
操作が煩雑である。また、安定性にも優れ、取り扱いが
比較的に容易なペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬ
ＥＩＡに利用できる化学発光試薬としてルミノールが用
いられているが、発光促進剤を併用しても感度の点で必
ずしも充分とは云えない。

【０００４】従って、試薬の調製及び発光系の操作が容
易で、かつ高感度測定が可能な、ペルオキシダーゼを標
識酵素とするＣＬＥＩＡに利用できる化学発光試薬の開
発が望まれていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
の事情に鑑み、過酸化水素を基質とするペルオキシダー
ゼのモル数に依存して化学発光する新規な化学発光試薬
及びその製造方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、ル
シゲニン等のＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスジアク
リジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボンアミド化合
物及びギ酸の存在下において光照射することにより得ら
れる反応生成物を含有する化学発光試薬が、特定アルカ
リ性ｐＨ条件下において、過酸化水素とは反応せず、過
酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダ
ーゼのモル数に依存して化学発光することを見い出し、
これらの知見に基づいて本発明の完成に到達したもので
ある。従って、本発明の第一は、下記一般式（１）

【０００７】

【化５】 （上記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² はアルキル
基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群よ
り選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、
Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、水素原子、アルキル基、
アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲ
ン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異
なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１
又は２である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，
９’−ビスアクリジニウム塩類を、下記一般式（２）

【０００８】

【化６】 （上記一般式（２）において、Ｒ₁ は水素原子、炭素数
１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
ミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
₂ はメチル基又はエチル基であり、Ｒ₃ は炭素数１〜１
０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭
素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該
アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基
及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ
₁ 及びＲ₃ は互いに結合して、それぞれが結合している
カルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に
環を形成していてもよい。）で表わされるＮ，Ｎ−ジ置
換カルボン酸アミド化合物及びギ酸の存在下において光
照射下に反応させることにより得られる反応生成物を含
有してなることを特徴とする化学発光試薬に関するもの
である。また、本発明の第二は、下記一般式（１）

【０００９】

【化７】 （上記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² はアルキル
基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群よ
り選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、
Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、水素原子、アルキル基、
アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲ
ン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異
なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１
又は２である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，
９’−ビスアクリジニウム塩類を、下記一般式（２）

【００１０】

【化８】 （上記一般式（２）において、Ｒ₁ は水素原子、炭素数
１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
ミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
₂ はメチル基又はエチル基であり、Ｒ₃ は炭素数１〜１
０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭
素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該
アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基
及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ
₁ 及びＲ₃ は互いに結合して、それぞれが結合している
カルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に
環を形成していてもよい。）で表わされるＮ，Ｎ−ジ置
換カルボン酸アミド化合物及びギ酸の存在下において光
照射下に反応させることを特徴とする化学発光試薬の製
造方法に関するものである。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明につき更に詳しく説
明する。本発明の化学発光試薬の製造に用いられるＮ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、
上記一般式（１）で表わされる化合物である。

【００１２】上記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ²
はアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリ
ール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、好まし
いアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、
メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル
基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及
びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐状ア
ルキル基を挙げることができる。また、アリール基は炭
素数６〜２０のものが好ましく、例えば、フェニル基、
トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらに
アルキル基で置換されたものでもよい。アリール基とし
ては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリー
ル基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル
基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特
に、クロロフェニル基が好ましい。

【００１３】一般式（１）において、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵
及びＲ⁶ は、各々、水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２
０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。
例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル
基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリ
ーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロ
キシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。

【００１４】また、一般式（１）において、Ｘはｎ価の
陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとして
は、特に限定されるものではなく、硝酸イオン、ハロゲ
ンイオン（例えば、塩素イオン、フッ素イオン、臭素イ
オン等）、リン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオ
ン等を挙げることができる。これらの陰イオンのなか
で、特に硝酸イオンが好ましい。

【００１５】上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチ
ル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエ
チル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ
プロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’
−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、
Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウム
塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジフェニル−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，
９’−ビスアクリジニウム塩等を挙げることができる。
これらのなかで、特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’
−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）が
好適である。

【００１６】本発明の化学発光試薬の製造に用いられる
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、上記一般式
（２）で表わされる化合物である。

【００１７】上記一般式（２）において、Ｒ₁ は水素原
子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等からなる群より選
択される基で置換されていてもよい。Ｒ₂ はメチル基及
びエチル基からなる群より選択され、Ｒ₃ は炭素数１〜
１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び
炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、
アリール基は、アルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ
基及びハロゲン原子等からなる群より選択される基で置
換されていてもよい。Ｒ₁ 及びＲ₃ のアルキル基として
は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル
基、ノニル基、デシル基等の直鎖状アルキル基又はこれ
らの分岐状アルキル基のものを挙げることができる。ま
た、Ｒ₁ 及びＲ₃ は互いに結合して、それぞれが結合し
ているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子
と共に環を形成していてもよい。

【００１８】上記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアク
リルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，
Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリド
ン等を挙げることができる。

【００１９】本発明の化学発光試薬におけるギ酸の存在
は、得られた化学発光試薬の発光反応時において発光強
度を大幅に増大させる効果を有し、光照射による反応に
おいて化学発光性物質の生成量を増大させる作用を示す
ものと考えられる。この作用はギ酸に特異的であり、酢
酸、プロピオン酸、安息香酸等の他の有機酸類やホルム
アルデヒド、アセトアルデヒド、ベンズアルデヒド等の
アルデヒド類にはその効果は全く認められない。

【００２０】本発明の化学発光試薬の製造に用いられる
光照射用の光源としては、波長領域が約２９０〜８００
ｎｍの範囲の紫外可視部を挙げることができ、特に、約
４００〜８００ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これら
の光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍
光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができる
が、白熱電灯が好ましく用いられる。この光照射により
得られる化学発光試薬は、光源を用いずに自然光の下で
製造した化学発光試薬に較べて、同じ原料ルシゲニン濃
度で製造し同量で使用した場合に短時間で非常に高い発
光強度を示すことと、この反応を光遮蔽下に実施した場
合にはペルオキシダーゼ濃度依存性を有する化学発光試
薬が得られないことから、化学発光性化合物の生成には
光照射が重要な役割を担っていることが認められる。

【００２１】上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類は、ｐＨ８付近では過酸化水素ともペ
ルオキシダーゼ存在下の過酸化水素とも顕著な発光反応
は起こさないが、これはＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウムカチオンが対イオン、特に硝酸イオ
ンと安定な塩を形成しているためと考えられる。しか
し、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物等の極性の
高い化合物の存在下で光照射を行なうことにより、Ｎ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオン
への対アニオンからの電荷移動が促進され、イオン性の
高い塩類からラジカル性を有する電荷移動錯体に変化
し、この錯体がＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物
の配位又は溶媒和によって安定化され、この安定化され
たビラジカル性化合物が、過酸化水素の酵素分解により
生成する活性酵素と反応して、励起状態のジオキセタン
構造を経て発光するのでペルオキシダーゼ濃度に依存し
た発光強度が得られるものと考えられる。

【００２２】この発光反応におけるギ酸の作用について
は、明確な反応機構は不明であるが、Ｎ，Ｎ’−ジ置換
−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンへの電荷移動
に関与してその反応を促進する作用を有するものと考え
られる。

【００２３】これらＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
化合物及びギ酸の使用割合としては、Ｎ，Ｎ’−ジ置換
−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対してＮ，Ｎ−
ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モルの量で
用い、ギ酸を１〜１万倍モル、好ましくは１０〜１千倍
モル、さらに好ましくは５０〜５００倍モルの量で用い
ることができる。さらに、同種及び／又は異種のＮ，Ｎ
−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び／又はその他の溶
媒を反応溶媒として用いることもできる。

【００２４】本発明の新規化学発光試薬は、ｐＨ７．５
〜１３の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存
在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光す
る。この発光は、フェノール性化合物等の発光促進剤に
よって増強することが認められる。このようなフェノー
ル性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェ
ニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノー
ル、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４
−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノー
ル、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、
２，４−ジクロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒド
ロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシ
フェリン等が非限定的に挙げられる。

【００２５】本発明の新規化学発光試薬は、化学発光分
析を行なう場合には、１０^-8〜１Ｍ、好ましくは１０^-6
〜１０^-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量は１０
〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲で用
いるのが望ましい。

【００２６】前記発光促進剤の使用量は、化学発光試薬
の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍
モルの範囲であり、その濃度は、１０^-6〜１Ｍ、好まし
くは１０^-4〜１０^-2Ｍの範囲で用いるのが望ましい。

【００２７】また、化学発光反応に用いられる水素受容
体としての過酸化水素の量は化学発光試薬に対して充分
に過剰な量が必要であり、その使用量は化学発光試薬に
対して３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１千倍モルの
範囲で用いるのが望ましい。

【００２８】また、ペルオキシダーゼを標識物質として
抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合に
は、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼ
として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ま
しく用いられる。

【００２９】化学発光反応に用いられる塩基性緩衝液と
しては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、
炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を挙
げることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１
Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、発光反応時に界
面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることも
できる。

【００３０】

【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
する。もっとも、本発明は下記実施例等に限定されるも
のではない。 ［実施例１］化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．０ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド２ｍｌ及びギ酸２０μｌを加えて
均一に溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗ
のコピーランプを２時間照射することにより化学発光性
物質を含有する化学発光試薬を得た。

【００３１】ペルオキシダーゼ活性の測定 この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.4)２．９５ｍｌと混合した後、この
溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して
化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マ
イクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに
溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次
注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメータ
ー（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で
０〜５秒間積算した結果、表１に示すような発光強度が
得られ、ギ酸を添加せずに発光反応を行なった比較例１
に較べて感度及び発光強度において大幅な改善が認めら
れた。

【００３２】

【表１】

【００３３】［比較例１］化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３
０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間
照射することにより化学発光性物質を含有する化学発光
試薬を得た。

【００３４】ペルオキシダーゼ活性の測定 この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.4)２．９５ｍｌと混合した後、この
溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して
化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マ
イクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに
溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次
注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメータ
ー（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で
０〜５秒間積算した結果、表２に示すような発光強度が
得られた。

【００３５】

【表２】

【００３６】［実施例２］化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．０ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド２ｍｌ及びギ酸２０μｌを加えて
均一に溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗ
のコピーランプを５時間照射することにより化学発光性
物質を含有する化学発光試薬を得た。

【００３７】ペルオキシダーゼ活性の測定 この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.4)２．９５ｍｌと混合した後、この
溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して
化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マ
イクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに
溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次
注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメータ
ー（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で
０〜５秒間積算した結果、表３に示すような発光強度が
得られ、ギ酸を添加せずに発光反応を行なった比較例２
に較べて発光強度において大幅な改善が認められた。

【００３８】

【表３】

【００３９】［比較例２］化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３
０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間
照射することによりルシゲニン−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセ
トアミド複合体を含有する化学発光試薬を得た。

【００４０】ペルオキシダーゼ活性の測定 この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.4)２．９５ｍｌと混合した後、この
溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して
化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マ
イクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに
溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次
注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメータ
ー（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で
０〜５秒間積算した結果、表４に示すような発光強度が
得られた。

【００４１】

【表４】

【００４２】［実施例３］化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．０ｍｇを試験管に採り、これにＮ−メチ
ル−２−ピロリドン２ｍｌ及びギ酸２０μｌを加えて均
一に溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗの
コピーランプを２時間照射することにより化学発光性物
質を含有する化学発光試薬を得た。

【００４３】ペルオキシダーゼ活性の測定 この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.4)２．９５ｍｌと混合した後、この
溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して
化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マ
イクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに
溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次
注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメータ
ー（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で
０〜５秒間積算した結果、表５に示すような発光強度が
得られ、ギ酸を添加せずに光反応を行なった比較例３に
較べて発光強度において大幅な改善が認められた。

【００４４】

【表５】

【００４５】［比較例３］化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ−メチ
ル−２−ピロリドン１ｍｌを加えて溶解させた後、３０
℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを１時間照
射することにより化学発光性物質を含有する化学発光試
薬を得た。

【００４６】ペルオキシダーゼ活性の測定 この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.4)２．９５ｍｌと混合した後、この
溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して
化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マ
イクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに
溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次
注入して発光反応させた後、この発光量をルミノメータ
ー（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で
０〜５秒間積算した結果、表６に示すような発光強度が
得られた。

【００４７】

【表６】

【００４８】

【発明の効果】本発明により提供される新規化学発光試
薬は、安価な製造原料を用いて比較的に短時間で容易に
製造することができ、過酸化水素とペルオキシダーゼの
存在下に、ペルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光
する性質を利用して、ペルオキシダーゼ酵素を高感度で
検出することができる。さらに、ペルオキシダーゼを標
識物質として抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識物
を用いて、酵素免疫測定法により抗体、抗原等を、ウェ
スタンブロット法により蛋白質を、サザーン及びノーザ
ンブロット法によりＤＮＡ及びＲＮＡを、そして酵素標
識核酸プローブを用いて核酸を各々特異的に、且つ高感
度で測定することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 荒谷 弦一郎 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 細越 未央 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 Ｆターム(参考） 2G054 AB10 CE01 EA01 4B063 QA01 QQ22 QQ42 QQ52 QQ79 QQ96 QR41 QR50 QR56 QR66 QR90 QS02 QX02

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（１） 【化１】 （上記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² はアルキル
   基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群よ
   り選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、
   Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、水素原子、アルキル基、
   アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲ
   ン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異
   なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１
   又は２である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，
   ９’−ビスアクリジニウム塩類を、下記一般式（２） 【化２】 （上記一般式（２）において、Ｒ₁ は水素原子、炭素数
   １〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
   及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
   れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
   ミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
   ₂ はメチル基又はエチル基であり、Ｒ₃ は炭素数１〜１
   ０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭
   素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該
   アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基
   及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ
   ₁ 及びＲ₃ は互いに結合して、それぞれが結合している
   カルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に
   環を形成していてもよい。）で表わされるＮ，Ｎ−ジ置
   換カルボン酸アミド化合物及びギ酸の存在下において光
   照射下に反応させることにより得られる反応生成物を含
   有してなることを特徴とする化学発光試薬。
2. 【請求項２】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビ
   スアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，
   ９’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項
   １に記載の化学発光試薬。
3. 【請求項３】 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
   化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジ
   メチルアセトアミド及びＮ−メチル−２−ピロリドンか
   らなる群より選択される少なくとも一種の化合物である
   請求項１又は２に記載の化学発光試薬。
4. 【請求項４】 前記光照射に用いられる光源が、可視
   光を発する光源である請求項１〜３のいずれかの１項に
   記載の化学発光試薬。
5. 【請求項５】 下記一般式（１） 【化３】 （上記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² はアルキル
   基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群よ
   り選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、
   Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、水素原子、アルキル基、
   アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲ
   ン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異
   なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１
   又は２である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，
   ９’−ビスアクリジニウム塩類を、下記一般式（２） 【化４】 （上記一般式（２）において、Ｒ₁ は水素原子、炭素数
   １〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
   及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
   れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
   ミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
   ₂ はメチル基又はエチル基であり、Ｒ₃ は炭素数１〜１
   ０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭
   素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該
   アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基
   及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ
   ₁ 及びＲ₃ は互いに結合して、それぞれが結合している
   カルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に
   環を形成していてもよい。）で表わされるＮ，Ｎ−ジ置
   換カルボン酸アミド化合物及びギ酸の存在下において光
   照射下に反応させることを特徴とする化学発光試薬の製
   造方法。
6. 【請求項６】 前記光照射に用いられる光源が、可視
   光を発する光源である請求項５に記載の化学発光試薬の
   製造方法。