JPH02174694A - パーオキシダーゼ活性の化学発光測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、パーオキシダーゼ活性の化学発光測定法に関
する。更に詳しくは、本発明は基質としてルミノールま
たはイソルミノールと過酸化水素とを用いるパーオキシ
ダーゼ活性の測定法において、下記一般式（Ｉ）で表さ
れる化合物（式中Ｒ１は、水酸基又は水酸基のアルカリ
塩、置換又は無置換のアミノ基、ハロゲン原子又は置換
低級アルキル基、ＲｔおよびＲ３は水素原子又はハロゲ
ン原子、Ｒ４およびＲ２は、水素原子、置換又は無置換
の低級アルキル基又は低級アルコキシ基を表す） および下記一般式（ｎ）で表される化合物Ｒ４ （式中、Ｘは酸素原子又はイオウ原子を示し、Ｙは同−
又は相異なって炭素原子又は窒素原子を示し、Ｙ″は同
−又は相異なってＣ１１又は窒素原子を示し、Ｒ，は同
−又は相異なって置換又は無置換の０１〜Ｃ４のアルキ
ル基、アルキレン基又はハロゲン原子を示し、Ｒ，、Ｒ
，、Ｒ，およびＲ１゜は同−又は相異なって水素原子、
置換又は無置換の０１〜Ｃ４のアルキル基、アルキレン
基又はハロゲン原子を示す。） をパーオキシダーゼ活性増幅物質として用いることを特
徴とする該パーオキシダーゼ活性の化学発光測定法に関
する。

（従来の技術） 近年、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）は、高感度化への技
術開発が目ざましい。当然「化学発光法」がその目的達
成のための有力な手段であることは言うまでもなく、た
とえば、ルミノールを用いた「化学発光法」では、パー
オキシダーゼ検出感度が１０−”　ｍｏｌであるとの報
告がなされている（蛋白質核酸酵素別冊に３１　５１〜
６３ページ（Ｉ９８７））。

この検出感度は、ＡＢＴＳを基質として用いた比色法の
パーオキシダーゼ検出感度のｌ　０−１Ｓａ＋ｏｌ　。

又はｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸を基質として
用いた蛍光法のその検出感度の１０”１４ａｉｏｌと比
べ、高い結果をもたらしている。

しかしながら、化学発光法は、発光時間が短いなどの欠
点を有しているため汎用されていないのが現状である。

そこで、更なる高感度化を成すことにより欠点を補なお
うとする試みがなされた。例えば、ｐ　−ヨードフェノ
ールをパーオキシダーゼ活性増幅物質として用いた前記
化学発光法である。

（Ｈ，ＡＩＩａｎ、　Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｊｏｌｏｇｙ　
Ａｐｒ、＋　６３０〜６　＋　３５゜（Ｉ９８Ｂ）　）
　。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、Ｐ−ヨードフェノールを用いた前記化学
発光法は、ある程度高感度化は達成されたものの同時再
現性が悪く、一定の測定結果が得られないという欠点を
有していた（下記比較例参照）。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は、高感度かつ安定した測定結果が得られる
化学発光ＥＩＡ法を見い出すべく鋭意研究した結果、前
記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）で表わされる化合物を添
加することにより、発光が安定的に増幅されることを見
い出し、本発明を完成した。

前記一般式（Ｉ）および（Ｉｔ）で表される化合物は、
フェノールインドフェノール誘導体、フェノキサジン誘
導体およびフェノチアジン誘導体である。一般式（Ｉ）
においてＲ，で表される基としては、水酸基又はナトリ
ウム、カリウム又はカルシウムなどのアルカリ金属、ア
ミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基またはジ
エタノールアミノ基などの置換又は無置換のアミノ基、
塩基、臭素又はヨウ素などのハロゲン原子又はナトリウ
ムプロパン−３−スルホネート基などの置換低級アルキ
ル基である。Ｒ２およびＲ４で表される基としては、水
素原子又は前記と同じハロゲン原子であり、Ｒ４および
Ｒ２で表される基としては水素原子、メチル基、エチル
基又はナトリウムプロパン−３−スルホネートなどの置
換又は無置換の低級アルキル基又はメトキシ基、エトキ
シ基などの低級アルコキシ基である。さらに具体的に例
示すればフェノールインドフェノール、２．６−シクロ
ロフエノールインドフエノール、２．６−シクロロフエ
ノールー〇−クレゾール、フェノールインドアニリンな
どである。

また、前記一般式（Ｉｌ）において、Ｘは酸素原子また
はイオウ原子である。Ｙは同−又は相異なって炭素原子
又は窒素原子であり、Ｙ”は同−又は相異なってＣＨ又
は窒素原子である。Ｒａはメチル基、エチル基、プロピ
ル基、ブチル基、ナトリウム　プロパン−３−スルホネ
ート基またはナトリウム、２．４−ジメチル−１，３−
ブタジェンスルボネート基、メチルカルボニル基、メト
キシ基、プロピルスルホネート基などの置換又は無置換
の低級アルキル基、塩基、臭素などのハロゲン原子であ
る。Ｒ，、Ｒ，、Ｒ，およびＲＩＧは水素原子、メチル
基、エチル基、プロピル基、ナトリウム　プロパン−３
−スルホネート基またはナトリウム、２．４−ジメチル
−１，３−ブタジェンスルホネート基、メチルカルボニ
ル基、メトキシ基、プロピルスルホネート基などの置換
又は無置換の低級アルキル基、塩基、臭素などのハロゲ
ン原子である。さらに具体的に例示すればＮ−メチルフ
ェノチアジン、Ｎ−エチルフェノチアジン、Ｎ−プロピ
ルフェノチアジン、ナトリウムフェノチアジン−１ｏイ
ルプロパンスルフオネート、ナトリウムフェノチアジン
−１０イル−２，４−ジメチル−１，３−ブタジェンス
ルホネート、１−メチルフェノチアジン−ＩＯイル−プ
ロピルスルホネート、３−メチルフェノチアジン−１Ｏ
イル−プロピルスルホネート、６−メチルフェノチアジ
ン−１０イループロピルスルホネート、８−メチルフェ
ノチアジン−１０イループロピルスルホネ−１−１１，
３−ジメチルフェノチアジン−１０イル−プロピルスル
ボネート、１．６−ジメチルフェノチアジン−１０イル
−プロピルスルホネート、ｌ、８−ジメチルフェノチア
ジン−１０イル−プロピルスルホネート、３．６−ジメ
チルフェノチアジン−１０イループロビルスルボネー）
、３．８−ジメチルフェノチアジン−１０イル〜プロピ
ルスルホネート、６．８−ジメチルフェノチアジン−１
０イル−プロピルスルホネート、１．３．６−ドリメチ
ルフエノチアジンーｌＯイル〜プロピルスルホネート、
１，３．８−　）ツメチルフェノチアジン−１０イル−
プロピルスルホネート、１，６．８−　）リフチルフェ
ノチアジン−１０イル−プロピルスルボネート、１−エ
チルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート
、３−エチルフェノチアジン−１０イル−プロピルスル
ボネート、６−エチルフェノチアジン−１０イループロ
ピルスルボネート、８−エチルフェノチアジン−１０イ
ル−プロピルスルホネート、ｌ、３−ジエチルフェノチ
アジン−１０イルーブロピルスルホネー）、１．６−ジ
エチルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルボネー
ト、１．８−ジエチルフェノチアジン＝ｌｏイル−プロ
ピルスルホネート、３．６−ジエチルフェノチアジン−
１０イル−プロピルスルホネート、３．８−ジエチルフ
ェノチアジン−１Ｏイル−プロピルスルホネート、６．
８−ジエチルフェノチアジン−１０イル−プロピルスル
ホネート、１．３．６−１−リエチルフエノチアジンー
１０イル−プロピルスルボネート、１，３．８−　）リ
エチルフェノチアジンー１ｏイルプロピルスルホネート
、１，６．８−　）ジエチルフェノチアジン−１０イル
−プロピルスルボネート、ｌ−プロピルフェノチアジン
−１０イル−プロピルスルホネート、３−プロピルフェ
ノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、６−プ
ロピルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルボネー
ト、８−プロピルフェノチアジン−１０イル−プロピル
スルホネート、１．３−ジプロピルフェノチアジン−１
Ｏイル−プロピルスルボネート、１．６−ジプロビルフ
エノチアジンー１０イループ口ピルスルホネート、１．
８−ジプロピルフェノチアジン−１０イル−プロピルス
ルホネート、３．６−ジプロピルフェノチアジン−１０
イル−プロピルスルホネート、３．８−ジプロピルフェ
ノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、６．８
−ジプロピルフェノチアジン−１Ｏイル−プロピルスル
ホネート、１，３゜６−ドリブロビルフエノチアジンー
１０イル−プロピルスルホネート、１，３．８−　トリ
プロピルフェノチアジン−１Ｏイル−プロピルスルホネ
ート、１．６゜８−トリプロピルフェノチアジン−１Ｏ
イル−プロピルスルホネート、ｌ−ブチルフェノチアジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、３−ブチルフェ
ノチアジン−１Ｏイル−プロピルスルホネート６−ブチ
ルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、
８−ブチルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホ
ネート、１．３−ジブチルフェノチアジン−１０イル−
プロピルスルホネート、１．６−シブチルフェノチアジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、１．８−ジブチ
ルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、
３．６−シブチルフェノチアジン−１０イル−プロピル
スルホネート、３．８−ジブチルフェノチアジン−１Ｏ
イル−プロピルスルホネート、６．８−ジブチルフェノ
チアジン−１０イル−プロピルスルホネート、１，３．
６−トリブチルフェノチアジン−１０イル−プロピルス
ルホネート、１，３．８−　トリブチルフェノチアジン
１０イル−プロピルスルホネート、１．６．８−トリブ
チルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート
、 Ｎ−メチルフェノキサジン、Ｎ−エチルフェノキサジン
、Ｎ−プロピルフェノキサジン、ナトリウムフェノキサ
ジン−１０イループし１パンスルフオネート、ナトリウ
ムフェノキサジン−１０イル−２，４−ジメチル−１，
３−ブタジェンスルホネート、１−メチルフェノキサジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、３−メチルフェ
ノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、６−メ
チルフェノキサジン−１０イループロピルスルホネート
、８−メチルフェノキサジン−１Ｏイル−プロピルスル
ホネート、１．３−ジメチルフェノキサジン−１０イル
−プロピルスルホネート、１．６−ジメチルフェノキサ
ジン−１０イル−プロピルスルホネート、１．８−ジメ
チルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート
、３．６−シメチルフエノキサジンーｌＯイル−プロピ
ルスルホネート、３，８−ジメチルフェノキサジン−１
０イル−プロピルスルホネート、６．８−ジメチルフェ
ノキサジン−１Ｏイル−プロピルスルホネート、１，３
．６−　トリメチルフェノキサジン−１Ｏイル−プロピ
ルスルホネート、１，３゜８−トリメチルフェノキサジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、１，６．８−ト
リメチルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネ
ート、１−エチルフェノキサジン−１０イル−プロピル
スルホネート、３−エチルフェノキサジン−１０イル−
プロピルスルホネート、６−エチルフェノキサジン−１
０イループロピルスルホネート、８−エチルフェノキサ
ジン−１０イル−プロピルスルホネート、１．３−ジエ
チルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート
、１．６−ジエチルフェノキサジン−１０イル−プロピ
ルスルホネート、１，８−ジエチルフェノキサジン−１
０イル−プロピルスルホネート、３．６−ジエチルフェ
ノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、３，８
−ジエチルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホ
ネート、６．８−ジエチルフェノキサジン−１Ｏイル−
プロピルスルホネート、１．３．６−　）リエチルフェ
ノキサジンーｌＯイル−プロピルスルホネート、１３．
８−　）ジエチルフェノキサジン−１０イル−プロピル
スルホネート、１，６．８−　）ジエチルフェノキサジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、１−プロピルフ
ェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、３−
プロピルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネ
ート、６−ブロビルフエノキサジン１０イル−プロピル
スルホネート、８−プロピルフェノキサジン−１０イル
−プロピルスルホネート、１．３−ジプロピルフェノキ
サジン−１０イル−プロピルスルホネート、１．６−ジ
プロピルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネ
ート、１，８−ジプロビルフエノキサジン−１０イル−
プロピルスルホネート、３．６−ジプロピルフェノキサ
ジン−１０（ループロピルスルホネート、３，８−ジプ
ロピルフェノキサジン−１０イループ口ピルスルホネ−
）、６．８−ジプロピルフェノキサジン−１０イル−プ
ロピルスルホネート、１，３．６−　）リブロピルフェ
ノキサジンー１０イル−プロピルスルホネート、！、３
．８−トリプロピルフェノキサジン−１０イル−プロピ
ルスルホネート、　１，６．８−１−リブロピルフェノ
キサジンー１０イル−プロピルスルホネート１−ブチル
フェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、３
−ブチルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネ
ート、６−ブチルフェノキサジン−１０イル−プロピル
スルホネート、８−ブチルフェノキサジン−１０イル−
プロピルスルホネート、１．３−ジブチルフェノキサジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、１．６−シプチ
ルフエノキザジンー１０イル−プロピルスルホネート、
ｌ、８−ジブチルフェノキサジン−１０イル−プロピル
スルホネート、３，６−シプチルフエノキサジンーＩＯ
イル−プロピルスルホネート、３，８−ジブチルフェノ
キサジン−１０イル−プロピルスルホネート、６．８−
ジブチルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネ
ート、１．３．６−ドリブチルフエノキサジンー１０−
イル−プロピルスルホネート、１．３．８−　）リブチ
ルフェノキサジン−１０−イル−プロピルスルホネート
、１．６．８−　）リブチルフェノキサジン−１Ｏ−イ
ル−プロピルスルホネート、Ｎ−メチルピリミジルフェ
ノチアジン、Ｎ−エチルピリミジルフェノチアジン、Ｎ
−プロピルピリミジルフェノチアジン、ナトリウムピリ
ミジルフェノチアジン−１０イル−プロパンスルフォネ
ート、ナトリウムピリミジルフェノチアジン−１０イル
−２，４−ジメチル−１，３−ブタジェンスルホネート
、ｌ−メチルピリミジルフェノチアジン−１Ｏイル−プ
ロピルスルホネート、３−メチルピリミジルフェノチア
ジン−１０イル−プロピルスルホネート、６−メチルピ
リミジルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネ
ート、８−メチルピリミジルフェノチアジン−１０イル
−プロピルスルホネート、１．３−ジメチルピリミジル
フェノチアジン−１０イル〜プロピルスルホネート、１
３６−シメチルビリミジルフエノチアジンー１０イル−
プロピルスルホネート、１．８−ジメチルピリミジルフ
ェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、３，
６−シメチルビリミジルフエノチアジンー１０イル−プ
ロピルスルホネート、３，８−ジメチルピリミジルフェ
ノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、６．８
−ジメチルピリミジルフェノチアジン−１０イル−プロ
ピルスルホネート、１．３．６−トリメチルピリミジル
フェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、１
．３．８−　！−リメチルピリミジルフエノチアジンー
１０イル−プロピルスルホネート、！、６．８−　）ジ
エチルピリミジルフェノチアジン−１０イル−プロピル
スルホネート、１−エチルピリミジルフェノチアジン−
１０イル−プロピルスルホネート、３−エチルピリミジ
ルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、
６−ニチルビリミジルフエノチアジンー１０イル−プロ
ピルスルホネート、８−エチルピリミジルフェノチアジ
ン−１Ｏイル−プロピルスルホネート、１．３−ジエチ
ルピリミジルフェノチアジン−１Ｏイル−プロピルスル
ホネート、１．６−ジニチルビリミジルフエノチアジン
ー１０イル−プロピルスルホネート、１．８−ジエチル
ピリミジルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホ
ネート、３．６−ジニチルビリミジルフエノチアジンー
１０イル−プロピルスルホネート、３．８−ジエチルピ
リミジルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネ
ート、６．８−ジエチルピリミジルフェノチアジン−１
０イル−プロピルスルホネート、１．３．６−トリエチ
ルピリミジルフェノチアジン−１０イループロビルスル
ホネー’−、１１３１８−）ジエチルとりミジルフエノ
チアジン＝１０イループロピルスルホネート、１．６．
８−トリエチノ“Ｉピリミジルフェノチアジン−１０イ
ル−プロピルスルホネート、１−プロピルピリミジルフ
ェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、３−
プロピルと１１ミジルフエノチアジン−１０イル−プロ
ピルスルホネート、６−プロピルピリミジルフェノチア
ジン−１０イル−プロピルスルホネート、８−プロビル
ピリミジルフエッチアジン−１０イル−プロピルスルホ
ネート、１．３−ジプロピルピリミジルフェノチアジン
−１０イル−プロピルスルホネート、１．６−ジプロピ
ルピリミジルフェノチアジン−１０イル−プロピル、Ｚ
、ＪＬ／ホネート、１．８−ジプロピルピリミジルフェ
ノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、３．６
−ジプロピルピリミジルフェノチアジン−１０イル−プ
ロピルスルホネート、３．８−ジプロピルピリミジルフ
ェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、６，
８−ジプロピルピリミジルフェノチアジン−１０イル−
プロピルスルホネート、１．３．６−　）リブロビリミ
ジルジルフエノチアジン−１０イル−プロピルスルホネ
ート、１．３．８−トリプロピリミジルジルフェノチア
ジン−１０イル−プロピルスルホネート、１，６．８−
１−リブロビリミジルジルフエノチアジン−１０イル〜
プロピルスルホネート、１−ブチルピリミジルフェノチ
アジン−１０イル−プロピルスルホネート、３−ブチル
ピリミジルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホ
ネート、６−ブチルピリミジルフェノチアジン−１０イ
ル−プロピルスルホネート、８−ブチルピリミジルフェ
ノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、１．３
−ジブチルピリミジルフェノチアジン−１０イル−プロ
ピルスルホネート、ｌ。

６〜ジブチルピリミジルフエノチアジン−１０イルプロ
ピルスルホネート、１．８−ジブチルピリミジルフェノ
チアジン−１Ｏイル−プロピルスルホネート、３，６−
シブチルピリミジルフェノチアジン−１０イル−プロピ
ルスルホネート、３．８−ジブチルピリミジルフェノチ
アジン−１０イルーブ口ビルスルホネ−１・、６．８−
ジブチルピリミジルフェノチアジン−１Ｏイル−プロピ
ルスルホネート、１，３゜６−トリブチルピリミジルフ
ェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、ｉ、
３．８−　）リブチルピリミジルフェノチアジン−１０
イル−プロピルスルホネート、１，６．８−１−リブチ
ルピリミジルフェノチアジン−１０イル−プロピルスル
ホネート、Ｎ−メチルピリミジルフェノキサジン、Ｎ−
エチルピリミジルフェノキサジン、Ｎ−プロピルピリミ
ジルフェノキサジン、ナトリウムピリミジルフェノキサ
ジン−１Ｏイル−プロパンスルフォネート、ナトリウム
ピリミジルフェノキサジン−１０イル−２，４−ジメチ
ル−１，３−ブタジェンスルホネート、ｌ−メチルピリ
ミジルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネー
ト、３−メチルピリミジルフェノキサジン−１Ｏイル−
プロピルスルホネート、６−メチルピリミジルフェノキ
サジンー　１０イル−プロピルスルホネート、８−メチ
ルピリミジルフェノキサジン−１０イル−プロピルスル
ホネート、１．３−ジメチルピリミジルフェノキサジン
−１０イル−プロピルスルホネート、１．６−シメチル
ビリミジルフエノキサジンー１０イル−プロピルスルホ
ネート、１．８−ジメチルピリミジルフェノキサジン−
１Ｏイル−プロピルスルホネート、３．６−シメチルビ
リミジルフエノキサジンーｌＯイル−プロピルスルホネ
ート、３．８−ジメチルピリミジルフェノキサジン−１
０イル−プロピルスルホネート、６．８−ジメチルピリ
ミジルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネー
ト、１，３．６−ドリメチルビリミジルフエノキサジン
ー１０イルプロピルスルホネート、１．３．８−　トリ
メチルピリミジルフェノキサジン−ＩＯイル−プロピル
スルホネート、１，６．８−　トリメチルピリミジルフ
ェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、１−
エチルビリミジルフエノキサジン−１０イル−プロピル
スルホネート、３−エチルピリミジルフェノキサジン−
１０イル−プロピルスルホネート、６−エチルピリミジ
ルフェノキサジン−１０イルプロピルスルホネート、８
−エチルピリミジルフェノキサジン−１０イル−プロピ
ルスルホネート、１．３−ジエチルピリミジルフェノキ
サジン−１０イル−プロピルスルホネート、１．６−ジ
ニチルビリミジルフエノキサジンー１０イル−プロピル
スルホネート、１，８−ジエチルピリミジルフェノキサ
ジン−１Ｏイル−プロピルスルホネート、３．６−ダニ
チルピリミジルフェノキサジン−１０イル−プロピルス
ルホネート、３１８−ジエチルピリミジルフェノキサジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、６．８−ジエチ
ルピリミジルフェノキサジン−１０イル−プロピルスル
ホネート、１．３．６−トリエチルピリミジルフェノキ
サジンー１０イル−プロピルスルホネート、１，３．８
−　）リブチルピリミジルフェノキサジン−１Ｏイル−
プロピルスルホネート、１．６．８−　トリエチルピリ
ミジルフェノキサジン−１Ｏイル−プロピルスルホネー
ト、■−プロピルピリミジルフェノキサジン−１０イル
−プロピルスルホネート、３−プロピルピリミジルフェ
ノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、６−プ
ロピルピリミジルフェノキサジン−１０イル−プロピル
スルホネート、８−プロピルピリミジルフェノキサジン
−１０イル−プロピルスルホネート、１．３−ジプロピ
ルピリミジルフェノキサジン−１０イル−プロピルスル
ホネート、１１６−ジプロピルピリミジルフェノキサジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、１．８−ジプロ
ピルピリミジルフェノキサジン−１０イル−プロピルス
ルホネート、３．６−ジプロピルピリミジルフェノキサ
ジン−１０イル−プロピルスルホネート、３．８−ジプ
ロピルピリミジルフェノキサジン−１０イル−プロピル
スルホネート、６．８−ジプロピルピリミジルフェノキ
サジン−１０イル−プロピルスルホネート、１，３゜６
−ドリプロビルビリミジルフエノキサジンー１０イル−
プロピルスルホネート、１，３．８−トリプロピルピリ
ミジルフェノキサジン−１Ｏイル−プロピルスルホネー
ト、１，６．８−１−ジプロピルピリミジルフェノキサ
ジン−１０イル−プロピルスルホネート、ｌ−ブチルピ
リミジルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネ
ート、３−ブチルピリミジルフェノキサジン−１Ｏイル
−プロピルスルホネート、６−ブチルピリミジルフェノ
キサジン１０イル−プロピルスルホネート、８−ブチル
ピリミジルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホ
ネート、１．３−ジブチルピリミジルフェノキサジン−
１０イル−プロピルスルホネート、１．６−シブチルピ
リミジルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネ
ート、１３８−ジブチルピリミジルフェノキサジン−１
Ｏイル−プロピルスルホネート、３．６−シブチルピリ
ミジルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネー
ト、３．８−ジブチルピリミジルフェノキサジン−１Ｏ
イル−プロピルスルホネート、６．８−ジブチルピリミ
ジルフェノキサジン１０イル−プロピルスルホネート、
１，３．６−　）リブチルピリミジルフェノキサジン−
１０イル−プロピルスルホネート、１．３．８−トリブ
チルピリミジルフェノキサジン−１０イル〜プロピルス
ルホネート、１．６．８−トリブチルピリミジルフェノ
キサジン−１０イル−プロピルスルホネート、Ｎ−メチ
ルビリジルフェノチアジン、Ｎ−エチルピリジルフェノ
チアジン、Ｎ−プロピルピリジルフェノチアジン、ナト
リウムピリジルフェノチアジン−１０イル−プロパンス
ルフォネート、ナトリウムピリジルフェノチアジン−１
０イル−２゜４−ジメチル−１，３−ブタジェンスルホ
ネート、３−メチルビリジルフェノチアジン−１Ｏイル
−プロピルスルホネート、６−メチルビリジルフェノチ
アジン−１０イル−プロピルスルホネート、８−メチル
ビリジルフェノチアジン−ＩＯイル−プロピルスルホネ
ート、３．６−ジメチルビリジルフェノチアジン−１０
イル−プロピルスルホネート、３，８ジメチルピリジル
フエノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、６
．８−ジメチルピリジルフェノチアジン−１０イル−プ
ロピルスルホネート、３−エチルピリジルフェノチアジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、６−エチルビリ
ジルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート
、８−エチルピリジルフェノチアジン−１０イルプロピ
ルスルホネート、３．６−ジニチルビリジルフエノチア
ジン＝ｌＯイル−プロピルスルホネート、３．８−ジエ
チルピリジルフェノチアジン−１０イル−プロピルスル
ホネート、６．８−ジエチルピリジルフェノチアジン−
１０イル−プロピルスルホネート、３−プロピルピリジ
ルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、
６−ブロビルビリジルフエノチアジンーｌＯイル−プロ
ピルスルホネート、８−プロピルピリジルフェノチアジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、３．６−ジプロ
ピルピリジルフェノチアジン−１０イル−プロピルスル
ホネート、３，８−ジプロピルピリジルフェノチアジン
−１０イル−プロピルスルホネート、６．８−ジプロピ
ルピリジルフェノチアジン−１０イループロピルスルホ
ネート、３−ブチルピリジルフェノチアジン−１０イル
−プロピルスルホネート、６−ブチルピリジルフェノチ
アジン−１０イルプロピルスルホネート、８−ブチルピ
リジルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネー
ト、３．６−シブチルピリジルフェノチアジン−１０イ
ル−プロピルスルホネート、３，８−ジブチルピリジル
フェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、６
．８−ジブチルピリジルフェノチアジン−１０イル−プ
ロピルスルホネート、 Ｎ−メチルピリジルフェノキサジン、Ｎ−エチルピリジ
ルフェノキサジン、Ｎ−プロピルピリジルフェノキサジ
ン、ナトリウムピリジルフェノキサジン−１０イル−プ
ロパンスルフォネート、ナトリウムピリジルフェノキサ
ジン−１Ｏイル−２゜４−ジメチル−１，３−ブタジェ
ンスルホネート、３−メチルビリジルフェノキサジン−
１０イル−プロピルスルホネート、６−メチルピリシル
フェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、８
−メチルビリジルフェノキサジン−１０イル−プロピル
スルホネート、３．６−ジメチルピリジルフェノキサジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、３．８−ジメチ
ルピリジルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホ
ネート、６．８−ジメチルピリジルフェノキサジン−１
０イル−プロピルスルホネート、３−エチルピリジルフ
ェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、６−
エチルビリジルフェノキサジン−１０イル−プロピルス
ルホネート、８−エチルピリジルフェノキサジン−１Ｏ
イル−プロピルスルホネート、３．６−ジエチルビリジ
ルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、
３．８−ジエチルピリジルフェノキサジン−１０イル−
プロピルスルホネート、６，８−ジエチルピリジルフェ
ノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、３−プ
ロピルピリジルフェノキサジン−１０イル−プロピルス
ルホネート、６−プロピルピリジルフェノキサジン−１
０イル−プロピルスルホネート、８−プロビルピリジル
フェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、３
．６−ジプロピルピリジルフェノキサジン−１０イル−
プロピルスルホネート、３、トジプロビルビリジルフエ
ノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、６，８
−ジプロピルピリジルフェノキサジン−１０イル−プロ
ピルスルホネート、３−ブチルピリジルフェノキサジン
−１０イル−プロピルスルホネート、６−ブチルピリジ
ルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、
８−ブチルピリジルフェノキサジン−１０イループ口ピ
ルスルホネ−１−１３，６−シブチルピリジルフェノキ
サジン−１０イル−プロピルスルホ２−ト、３゜８−ジ
ブチルピリジルフェノキサジン−１Ｏイル−プロピルス
ルホネート、６．８−ジブチルピリジルフェノキサジン
−１０イル−プロピルスルホネート、Ｎ−メチルジビラ
ジノフエノチアジン、Ｎ−エチルジビラジノフエノチア
ジン、Ｎ−プロビルジピラジノフェノチアジン、ナトリ
ウムジビラジノフエノチアジン−１０イル−プロパンス
ルフォネート、ナトリウムジピラジノフエノチアジン−
１Ｏイル−２，４−ジメチル−１，３−ブタジェンスル
ホネート、３メチルジピラジノフエノチアジン−１０イ
ル−プロピルスルホネート、６−メチルジピラジノフエ
ノチアジンー１０イル−プロピルスルホネート、３．６
−シメチルジピラジノフエノチアジンー１０イル−プロ
ピルスルホネート、３−エチルジピラジノフェノチアジ
ンー１０イル−プロピルスルホネート、６−ニチルジピ
ラグノフエノチアジンーｌＯイループロビルスルホネ−
１−１３，６−ジニチルジピラジノフエノチアジンー１
０イル−プロピルスルホネート、３−プロビルジピラジ
ノフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート、
６−プロビルジピラジノフェノチアジン−１０イル−プ
ロピルスルホネート、３１６−ジプロビルジビラジノフ
エノチアジンー　１０イル−プロピルスルホネート、３
−プチルジピラジノフエノチアジンー１０イル−プロピ
ルスルホネート、６−プチルジピラグノフエノチアジン
＝ｌＯイル−プロピルスルホネート、３．６−シプチル
ジピラジノフエノチアジンー１０イル−プロピルスルホ
ネート、Ｎ−メチルビリジルフェノキサジン、Ｎ−エチ
ルピリジルフェノキサジン、Ｎ−プロビルジピラジノフ
ェノキサジン、ナトリウムジピラジノフェノキサジン−
１０イル−プロパンスルフォネート、ナトリウムジビラ
ジノフェノキサジン−１Ｏイル−２，４−ジメチル−１
，３−ブタジェンスルホネート、３−メチルジビラジノ
フェノキサジンー１０イル−プロピルスルホネート、６
−メチルシヒラグノフエノキサジンーｌＯイル−プロピ
ルスルホネート、３．６−シメチルジピラジノフエノキ
サジンー１０イル−プロピルスルホネート、３−エチル
ジピラジノフエノキサジンー１０イル−プロピルスルホ
ネート、６−ニチルジビラジノフエノキサジンー１０イ
ル−プロピルスルホネート、３．６−ジニチルジピラジ
ノフエノキサジンー１０イル−プロピルスルホネート、
３−プロビルジピラジノフェノキサジン−１Ｏイル−プ
ロピルスルホネート、６−ブロビルジピラグノフエノキ
サジンーｌＯイル−プロピルスルホネート、３．６−ジ
プロビルジビラジノフエノキサジンー１０イル−プロピ
ルスルホネート、３−プチルジビラジノフエノキサジン
ー１Ｏイル−プロピルスルホネート、６−プチルジピラ
ジノフエノキサジンー１０イル−プロピルスルホネート
、３．６−シプチルジピラジノフエノキサジンー１０イ
ル−プロピルスルホネート、１−クロロフェノチアジン
−ＩＯイル−プロピルスルホネート、３−クロロフェノ
チアジン−１０イル−プロピルスルホネート、６−クロ
ロフェノチアジン−１０イループロピルスルホネート、
８−クロロフェノチアジン−１Ｏイル−プロピルスルホ
ネート、１−ブロモフェノチアジン−ＩＯイル−プロピ
ルスルホネート、３−ブロモフェノチアジン−１０イル
−プロピルスルホネート、６−７’ロモフエノチアジン
−１０イル−プロピルスルホネート、８−プロモフヱノ
チアジンーｌＯイループロピルスルホネート、１−クロ
ロフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、
３−クロロフヱノキサジン−１０イル−プロピルスルホ
ネート、６−クロロフニノキサジンーｌＯイループロピ
ルスルホネート、８−クロロフェノキサジン−１０イル
−プロピルスルホネート、１−ブロモフェノキサジン＝
ｌＯイループロピルスルホネート、３−ブロモフェノキ
サジン−１０イルプロピルスルホネート、６−プロモフ
エノキサジンーｔｏイループロピルスルホネート、８−
ブロモフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネー
ト、１−クロロピリミジルフェノチアジン−１０イル−
プロピルスルホネート、３−クロロピリミジルフェノチ
アジン−１０イル−プロピルスルホネート、６−クロロ
ビリミジルフヱノチアジンー１０イル−プロピルスルホ
ネート、８−クロロピリミジルフェノチアジン−１０イ
ル−プロピルスルホネート、１−ブロモピリミジルフェ
ノチアジン−１Ｏイル−プロピルスルホネート、３−ブ
ロモピリミジルフェノチアジン−１０イループロビルス
ルーホネート、６−ブロモピリミジルフェノチアジン−
１０イル−プロピルスルホネート、８−ブロモピリミジ
ルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート ェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、３−
クロロピリミジルフェノキサジン−ＩＯイル−プロピル
スルホネート、６−クロロピリミジルフェノキサジン−
１０イル−プロピルスルホネート、８−クロロピリミジ
ルフェノキサジン−ｌＯイル−プロピルスルホネート、
１−ブロモピリミジルフェノキサジン−１０イル−プロ
ピルスルボネート、３−ブロモピリミジルフェノキサジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、６−ブロモピリ
ミジルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネー
ト、８−ブロモピリミジルフェノキサジン−ｌＯイル−
プロピルスルホネート、３−クロロピリジルフェノチア
ジン−ＩＯイル−プロピルスルホネート、６−クロロピ
リジルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネー
ト、８−クロロピリジルフェノチアジン−１０イル−プ
ロピルスルホネート、３−ブロモピリジルフェノチアジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、６−ブロモピリ
ジルフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネート
、８−ブロモピリジルフェノチアジン−１０イル−プロ
ピルスルホネート、３−クロロピリジルフェノキサジン
−１０イル−プロピルスルホネート、６−クロロピリシ
ルフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネート、
８−りコロピリジルフェノキサジン−１０イル−プロピ
ルスルホネート、３−ブロモピリジルフェノキサジン−
１０イル−プロピルスルホネート、６−プロモピリジル
フエノキサジンーＩＯイル−プロピルスルホネート、８
−ブロモピリジルフェノキサジン−１Ｏイル−プロピル
スルホネート、３−クロクジビラジノフェノチアジン−
１０イル−プロピルスルホネート、６−クロロジピラグ
ノフエノチアジンーｌＯイル−プロピルスルホネート、
３−プロモジビラジノフエノチアジンーＩＯイル−プロ
ピルスルホネート、６−プロモジピラジノフェノチアジ
ン−１０イル−プロピルスルホネート、３−クロロンビ
ラジノフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホネー
ト、６−クロロジピラグノフエノキサジンーＩＯイル−
プロピルスルホネート、３−ブロモジピラジノフェノキ
サジン−１０イル−プロピルスルホネート、６−プロモ
ジピラジノフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホ
ネート、等をあげることができる。

本発明を実施するには、まず抗原抗体反応させる。例え
ば固定化抗体上に抗原を反応させその抗原にパーオキシ
ダーゼを標識した抗体を反応させ、そのパーオキシダー
ゼ活性を過酸化水素の分解で生じるルミノールとまたは
イソルミノールの反応の結果得られる化学発光によりパ
ーオキシダーゼを測定するものであって、更に前記一般
式（Ｉ）および（ｎ）で表される化合物をパーオキシダ
ーゼ活性増幅物質として添加させておくことにより、化
学発光を増幅させ測定するものである。

本発明に用いるパーオキシダーゼ、ルミノールおよびイ
ソルミノールは市販のものを好適に用いることができる
。

実施にあたっては、前記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）で
表される化合物は５〜３００μＨ好ましくは１０〜２０
０　ｕＭ用いることがより効率よく発光を増幅すること
ができる。

測定は、緩衝液、例えばトリシン−ＮａＯ）１緩衝液中
ｐＨ８〜ｐＨ８，５において、前記抗原抗体反応後ルミ
ノールまたはイソルミノールを５０〜１０００μに、好
ましくは２００〜３００μＨ用いる過酸化水素を１００
〜１０００μ門、好ましくは２００〜３００μｈ用い行
うことができる。

前記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）で表わされる化合物は
前記基質を添加後直ちに加えることが好ましい。その時
の緩衝液の温度は２０〜４０°Ｃ１好ましくは２５〜３
７°Ｃである。

一般に発光量の測定は、測定試薬の入った容器例えば試
験管をフォトカウンターの中に入れ測定を行うが、固相
例えばポリスチレンビーズなどを用いる測定の際には、
このビーズを洗浄して取り出し、新たな試験管に入れ測
定を行うことが可能である。

本願発明の方法による測定対象物は、ＡＦＰ、インシュ
リン、フェリチンなどのタンパク質、癌胎児性抗原（Ｃ
ＥＡ）などの各種癌関連抗原、ＨＢｓなどの抗原、甲状
腺刺激ホルモン（ＴＳ）ｌ）などの各種ホルモン、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＭなどの抗体をあげることができる。

（作　用） 本発明の前記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される化
合物は、パーオキシダーゼ活性測定におけるルミノール
あるいはイソルミノールと過酸化水素との反応を極めて
効率よく増幅する作用を有し、これを化学発光ＥＩＡに
利用することができる。

以下、参考例および実施例により本発明を更に詳しく説
明する。

１ｕｌｌ　ｌ　　パーオキシダーゼ標識抗α−フェトプ
ロティン（抗ＡＦＰ）の作製 マウスより得られた抗体を先ず常法（酵素免疫測定法　
医学書院　第３版ページ８６〜）に従いペプシン消化し
、Ｆ　（ａｂ’　）　ｚを得た。次に、この抗体１　ｍ
ｌを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．３１　ｍＭＥＤ
ＴＡ含有）に対して透析し、このものに０．２Ｍの２−
メルカプトエチルアミン５０μｆ加え、３７°Ｃに３時
間放置した。その後Ｇ−２５（ファルマシア社製）で脱
塩し、Ｆａｂ　’を得た。

パーオキシダーゼ２０■／　ｍｌ２　（０，１Ｍ−リン
酸緩衝溶液（ｐＨ＝　７．０　）　）にサクンミジル４
−（Ｎ−マレインイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボキシレート（ＳＭＣＣ）のジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）溶液（Ｉ０■／１５０μｐ−＞を加え３０゛
Ｃで撹拌しながら反応した。

その後沈殿物を遠心除去し、前記と同様にＧ−２５で脱
塩した。先に得られたＦａｂ’とＭＣＣ化パーオキシダ
ーゼをモル比１；２の割合で混合し４°Ｃで一昼夜反応
させた後ゲルクロマトグラフィーにより精製し、パーオ
キシダーゼ標識抗ＡＦＰを得た。

参考例２　パーオキシダーゼ活性測定試薬液の調製 （ア）　パーオキシダーゼ活性増幅物質としてＮ、Ｎ−
ジメチルインドアニリン、２．６−シクロロフエノール
インドー〇−クレゾール、フェノールインドフェノール
、Ｎ−メチルフェノチアジンのジメチルスルフォキサイ
ド（ＤＭＳＯ）溶液を調製時初期濃度がそれぞれ、１〜
１００μ門となるようにペレックス０Ｔ−Ｐ　（花王ア
トラス社製）０゜０２％を含むｐＨ＝８．４．５０ｍＭ
）リシン−Ｎ　ａ　ＯＨ１１衝液に加え、試薬液を調製
した。

（イ）　ルミノールＤＭＳＯ？＠液を調製時初期濃度が
７５０μＨとなるように１．ｍＭの過酸化水素水溶液に
加え調整した。

実施例１　各種増幅物質を用いた発光測定参考例１で作
製したパーオキシダーゼ標識抗ＡＦＰに０．２％ＢＳＡ
（牛血清アルブミン）リン酸緩衝溶液を加え濃度が１．
５　Ｘｌ０−’ｎ＋ｇ／　ｔａｎとなるよう調整した。

この希釈溶液５０μ２を小試験管に入れ、次に、この中
に参考例２で作製したパーオキシダーゼ活性測定試薬（
ア）を２００μ！、更に（イ）を１３５μ！加え、３７
℃の恒温槽で３０分間保留した。その後フォトンカウン
ター（ベルトールド社製モデル９５００）に入れ１分間
の発光を測定した。１０秒間の測定の内４秒間の発光を
積算した。

パーオキシダーゼ増幅物質としてＮ、Ｎ−ジメチルイン
ドアニリン、２．６−シクロロフエノールインドー〇−
クレゾール、フェノールインドフェノールより選ばれる
物質を用いたとき、第１表に示す発光量の結果を得た。

参考例３　　ＡＦＰ抗体結合ポリスチレンビーズの作製 マウスより得られたＡＦＰ抗体をＰ：ｉｔＩ度２０〜５
０ｕｇ／ｍ　ｌになるようにｐＨ＝１．０のリン酸緩衝
液に加えた。この溶液に十分に洗浄されたポリスチレン
ビーズを投入し、４°Ｃで一昼夜緩やかに撹拌した。そ
の後抗体溶液からビーズを取り出し、ρ１１＝７．０の
リン酸緩衝液で十分に洗浄し、次に、このビーズを０．
２％カゼイン溶液に投入し、室温で３時間ブロッキング
を行った。ブロッキング終了後、リン酸緩衝液で十分に
洗浄し、抗体結合ポリスチレンビーズを得た。

参考例４　パーオキシダーゼ活性測定試薬液の調製 Ｎ−メチルフェノチアジン、フェノールインドフェノー
ルの各ＤＭＳＯ溶液を調製時初期濃度がそれぞれ９８μ
ｈ、１９μｉとなるよう参考例２の（ア）と同様に緩衝
液を加えた。

実施例２　　ＡＦＰの測定 各濃度のＡＦＰ標準液を２０μｌを２０穴のトレーに分
注し、次に酵素標識抗体を３００μ２ずっ加えた。各人
（ウェル）に参考例３で作製したＡＦＰ抗体結合ポリス
チレンビーズをピンセットで１個ずつ順序よく加え、ト
レーにカバーシールをし、軽く叩いて混和し、３７°Ｃ
の恒温槽で３０分間反応させた。抗原抗体反応終了後、
各ウェル内の反応液をアスピレータ−で吸引除去し、生
理食塩液１〜３　ｍｌずつ加え、これを再び吸引除去し
た。この操作を３回行い洗浄後トレーのビーズを小試験
管に移し、さらにこの小試験管に参考例４で調製してお
いたパーオキシダーゼ活性測定試薬を２００μ２加えた
。次に参考例２で調整した溶液（イ）を１３５μｌ加え
３７°Ｃで３０分間反応させた。その後フォトンカウン
ターに入れパーオキシダーゼの活性を測定した。１０秒
間の測定の内４秒間に於ける発光を積算した。この測定
の結果、第１図に示す標準曲線を得た。

実施例３　パーオキシダーゼの測定 パーオキシダーゼ標識抗Ａ　Ｆ　Ｐ　（０，１５ｍｇ／
　ｒｓ　１バ一オキシダーゼ濃度換算で）を１０−’倍
ずっ０．２％Ｂ　Ｓ　Ａ　Ｕン酸緩衝溶液で希釈し、１
０−”ｍｇ／ｍｌになるまで行った。この希釈溶液５０
μ！を小試験管に入れ、次に、この中に参考例４で調整
したバーオキダーゼ活性測定試薬を２００μｌ加え、更
に参考例２で作製した溶液（イ）を１３５μ！加え、３
７°Ｃの恒温槽で３０分間保温する。その後フォトンカ
ウンターに入れ１０秒間の発光を測定した。１０秒間の
測定の内４秒間の発光を積算し、パーオキシダーゼ量と
発光量の関係を得た。

この結果を第２図に示した。

参考例５　パーオキシダーゼ活性測定用試薬の調製 フェノールインドフェノールのＤＭＳＯ溶液を調製時初
期濃度が、４３μ台、となるようにペレックＯＴ　　Ｐ
　　０．０２％ヲ含ムｐＨ＝８゜４．５ｏＩＩＭトリシ
ンーＮａＯＨｖ＆街液に加えた。

実施例４　パーオキシダーゼの測定 参考例５で調整した溶液を用い、実施例３と同様の操作
を行い、パーオキシダーゼ量と発光量の関係を得た。そ
の結果を第３図に示した。

参考例６　パーオキシダーゼ活性測定試薬の調製Ｎ−メ
チルフェノチアジンのＤＭＳＯ溶液を調製時初期濃度が
、９８μＨ１となるようにペレノク０Ｔ−Ｐ　　Ｏ，０
２％を含むｐＨ＝　８．４．５０　ｍＭ　トリシン−Ｎ
ａＯｌｌ緩衝液に加える。

実施例５　パーオキシダーゼの測定 参考例６で調整した溶液を用い、実施例３と同様の操作
を行い、パーオキシダーゼ量と発光量の関係を得た。そ
の結果を第４図に示した。

実施例６　従来の化学発光法との比較 参考例２においてパーオキダーゼ活性増幅物質としてｐ
−ヨードフェノールを用い同様の操作を行った。その結
果を第５図に示した。

参考例７　パーオキシダーゼ標識抗甲状腺刺激ポルモン
（抗ＴＳＨ）の作製 マウスより得られた抗体を先ず常法（酵素免疫測定法　
医学書院　第３版ページ８６〜）に従いペプシン消化し
、Ｆ（ａｂ”）ｚを得た。次に、この抗体１　ｍｌを０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．３１　ｍＭ　ＥＤＴＡ
含有〕に対して透析し、このものに０．２Ｍの２−メル
カプトエチルアミン５０μ！加え、３７°Ｃに３時間放
置した。その後Ｇ−２５（ファルマシア社製）で脱塩し
、Ｆａｂ’を得た。

パーオキシダーゼ２０ｍｇ／　ｍｌ　（０，１Ｍ−リン
酸緩衝溶液（ｐＨ＝　７．０　）　）にサクシミジル４
−（Ｎ−マレインイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボキシレート（ＳＭＣＣ）のジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）溶液（Ｉ０ｍｇ／１５０μｊ２）を加え３０
°Ｃで撹拌しながら反応した。

その後沈殿物を遠心除去し、前記と同様にＧ−２５で脱
塩した。先に得られＦａｂ　　′とＭＣＣ化パーオキシ
ダーゼをモル比１：２の割合で混合し４°Ｃで一昼夜反
応させた後ゲルクロマトグラフィーにより精製し、パー
オキシダーゼ標識抗ＴＳＨを得た。

参考例８　　ＴＳＨ抗体結合ポリスチレンビーズの作製 マウスより得られたＴＳＨ抗体を終濃度２０〜５０μＨ
ａｔｓ　ＥになるようにｐＨ＝７．０のリン酸緩衝液に
加えた。この溶液に十分に洗浄されたポリスチレンビー
ズを投入し、４°Ｃで一昼夜緩やかに撹拌した。その後
抗体溶液からビーズを取り出し、ρＩ（＝７．０のリン
酸緩衝液で十分に洗浄し、次に、このビーズを０．２％
カゼイン溶液に投入し、室温で３時間ブロッキングを行
った。ブロッキング終了後、リン酸緩衝液で十分に洗浄
し、抗体結合ポリスチレンビーズを得た。

参考例９　パーオキシダーゼ活性測定用試薬の調製 １．０＋Ｍフェノチアジン−１０イル−プロピルスルホ
ネートおよび０．１　ｍＭのフェノールインドフェノー
ルを含むようにトリシン−ＮａＯＩＩ緩衝液（ｐＨ＝８
．４．５０ｍＭ）に加える。

実施例７　血清ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）の測定 検体（血清）あるいは各種濃度の標準液、それぞれ２０
μ！を２０穴のトレーに分注し、次に参考例７で調製し
たパーオキシダーゼ標識抗Ｔ　Ｓ　Ｈ抗体溶液を３００
μ！加える。この状態で１０分間放置し、１０分移替考
例８で調製したＴＨ３抗体結合ポリスチレンビーズをビ
ンセットで一個づつ順序よく加え、更に１０分間室温で
反応させる。

抗原抗体反応終了後、各ウェル内の反応液をアスピレー
タ−で吸引除去し、生理食塩水１〜３　ｔａｎづつ加え
、これを再び吸引除去した。この操作を３回行い洗浄後
トレーのビーズを小試験管に移し、さらにこの小試験管
に参考例９で調製しておいたパーオキシダーゼ活性測定
試薬を２００μ！加えた。次に参考例２で調製した溶液
（イ）を１３５μｌ加え室温で２０分間酵素反応させた
。その後フォトンカウンターに入れパーオキシダーゼの
活性を測定した。この測定の結果、第６図に示す標準曲
線を得た。

また、検体（血清）を末法で測定したＴＳＨ値とＲｒＡ
で求めたＴＳＨ値との相関関係を第７図に示す。

参考例１０　パーオキシダーゼ活性測定用試薬の調製 ０．２ｍＭフェノキサジン−１０イル−プロピルスルホ
ネートおよびＯ，１ｍＭのフェノールインドフェノール
を含むようにトリシン−Ｎ　ａ　ＯＨ緩衝液（ｐＨ＝８
．４．５０１Ｍ）に加える。

実施例８　血清ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）の測定 検体（血清）あるいは各種濃度の標準液、それぞれ２０
μｌを２０穴のトレーに分注し、次に参考例７で調製し
たパーオキシダーゼ標識抗Ｔ　Ｓ　Ｈ抗体溶液を３００
μ！加える。この状態で１０分間放置し、１０分移替考
例８で調製したＴＳＨ抗体結合ポリスチレンビーズをピ
ンセットで一個づつ順序よく加え、更に１０分間室温で
反応させる。

抗原抗体反応終了後、各ウェル内の反応液をアスピレー
タ−で吸引除去し、生理食塩水１〜３　ｍｌづつ加え、
これを再び吸引除去した。この操作を３回行い洗浄後ト
レーのビーズを小試験管に移し、さらにこの小試験管に
参考例１０で調製しておいたパーオキシダーゼ活性測定
試薬を２００ｕｌ加えた。次に参考例２で調製した溶液
（イ）を１３５μｌ加え室温で２０分間酵素反応させた
。その後フォトンカウンターに入れパーオキシダーゼノ
活性を測定した。この測定の結果、第８図に示す標準曲
線を得た。

また、検体（血清）を末法で測定したＴＳＨ値とＲＩＡ
で求めたＴＳＨ値との相関関係を第９図に示す。

（発明の効果） 本発明は従来の高感度発色ＡＢＴＳを用いる比色法の例
に比べＳ／Ｎ比で３００〜７５０倍、検出感度で約１０
００倍にもなった。さらに、従来のパーオキシダーゼ活
性増幅物質で検出限界の高いとされるｐヨードフェノー
ルを用いる方法に比べ低濃度まで同時再現性よく高感度
に測定できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、パーオキシダーゼ活性増幅物質としてＮ−メ
チルツェナチアジン、フェノールインドフェノールを用
いたときの各ＡＦＰ濃度溶液の発光量を測定したもので
あり、第２図は各種濃度のパーオキシダーゼ標識抗ＡＦ
Ｐ溶液を用い、発光量を測定したときの図である。第３
図はパーオキシダーゼの測定においてパーオキシダーゼ
活性増幅物質としてフェノールインドフェノールを用い
たときの発光量を測定したときの図であり、第４図は、
Ｎ−メチルツェナチアジンを用い同様に測定した時の図
である。第５図は、従来の化学発光法におけるパーオキ
シダーゼ活性増幅物質であるｐ−ヨードフェノールと実
施例２の方法の発光量を比較したときの図であり、第６
図は、フェノチアジン−１０イル−プロピルスルホネー
トを用いたときの各ＴＳＨ濃度溶液の発光量を測定した
ものであり、第７図は検体（血清）を末法で測定したＴ
ＳＨ値とＲＩＡで求めたＴＳＨ値の相関関係を示す図で
ある。第８図は、フェノキサジン−１Ｏイル−プロピル
スルホネートを用いたときの各ＴＳＨＩ度溶液の発光量
を測定したものであり、第９図は検体（血清）を末法で
測定したＴＳＨ値とＲＩＡで求めたＴ　Ｓ　Ｈ値の相関
関係を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 基質としてルミノール又はイソルミノールと過酸化水素
   とを用いるパーオキシダーゼ活性の測定法において、下
   記一般式（ I ）で表される化合物▲数式、化学式、表
   等があります▼（ I ） （式中Ｒ＿１は水酸基または水酸基のアルカリ塩、置換
   又は無置換のアミノ基、ハロゲン原子又は置換低級アル
   キル基、Ｒ＿２およびＲ＿３は水素原子又はハロゲン原
   子、Ｒ＿４およびＲ＿５は、水素原子、置換又は無置換
   の低級アルキル基又は低級アルコキシ基を表わす。） および下記一般式（II）で表される化合物 ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｘは酸素原子又はイオウ原子を示し、Ｙは同一
   又は相異なって炭素原子又は窒素原子を示し、Ｙ’は同
   一又は相異なってＣＨ又は窒素原子を示し、Ｒ＿６は同
   一又は相異なって置換又は無置換のＣ＿１〜Ｃ＿４のア
   ルキル基、アルキレン基又はハロゲン原子を示し、Ｒ＿
   ７、Ｒ＿８、Ｒ＿９およびＲ＿１＿０は同一又は相異な
   って水素原子、置換又は無置換のＣ＿１〜Ｃ＿４のアル
   キル基、アルキレン基又はハロゲン原子を示す。） をパーオキシダーゼ活性増幅物質として用いることを特
   徴とする該パーオキシダーゼ活性の化学発光測定法。