JPS59500252A

JPS59500252A - 増強ルミネツセンスおよび発光分析

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Publication number: JPS59500252A
Application number: JP83500837A
Authority: JP
Inventors: カ−タ−，テイモシ−・ジヨゼフ・ニコラス; グラウカツト，キヤロル・ジヤクリ−ン; ストツト，リチヤ−ド・アンドリユウ・ウイツトフイ−ルド; ソ−プ，ギヤリ−・ハロルド・グレゴリ−・ヘンリ−; ホワイトヘツド，ト−マス・パタ−ソン
Original assignee: ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・リミテッド
Priority date: 1982-03-03
Filing date: 1983-02-25
Publication date: 1984-02-23
Also published as: ZA831389B; FI70728C; FI834024A0; WO1983003104A1; JPH0453518B2; EP0087959A1; DE3360857D1; FI70728B; EP0087959B1; AU6619986A; AU558939B2; NZ203435A; US4842997A; AU1228583A; FI834024A; CA1200486A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】増強ルミネッセンスおよび発光分析本発明は増強ルミ不）センス（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ａａｓａｙ　）もしくは発光分析（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ　）、％にイムノアッセイに関し、さらに分析を容易化するよう設計した診断用キットに関するものである。

イムノアッセイは、臨床試験室において最も広く使用さ扛ている分析技術の１つである。現在、イムノアッセイの大部分は、放射性同位元素、特に沃素−１２５を標識として使用する。しかしながら、放射性同位元素は多くの主たる欠点を有する。第１に、標識法は、高度の放射能を有し、したがって極めて危険な試薬の使用を含んでいる。第２に、放射能標識した物質の味存寿命は、しばしにそのａ買にＬり放射性同位元素が連続的に戎設するだけでなく放射能標識さｎ７？：蛋白質がしばしば不安定であるたり、比較的短かいものである０第３に、感度艮くかっ迅速に伏出しうる試薬を与える程充分に蛋白質を標識するのほしにしは困姫でるる。第４に、放射能標識さ扛た切買の処分が不滅で、ある。

こｎらの欠点は、放射能標識に対する契机可能な代替吻の探索を要求している。

慄繊として適するためには、ｖ！Ｊ質は少なくトモ次の３つの要件を満たさねばならない：ａ、たとえば抗原または抗体のようなりガントに付着した澹迅速かつ極めて少量で検出できねばならない。

ｂ、たとえは抗原または抗体の工うなりガントに対し、測定に影響を与えることなく、付着させうるものでなければならな（旭。

Ｃ０付看さｎた後、リガンドの性質を有意に変化させてはならない。

最も有望な代替標識化付物としての幾つかは、反応に関与してルミネッセンス光を発光しうる物質、または適当に処理するとルミネッセンス反応に関与しうる化合物を生成するｇＪｌＫのいｆｎ刀島でろる。ルミネッセンス反応（ルミネッセンスｉ’を発光する化学反応）は一般に充分な持続時間を有して、発光を検出しかつ測定することを可能にし、そｎにより似、Ｉｔｖ！Ｊ員の足型を町ｎ目にするものである。他力、ルミネッセンスの測定は迅速な方法でろって、一般に放射症を測定するために数分間を必妥とするものと異なり、数秒間で完了することができる。

ルミネッセンスは、３榎の主たるルミネッセンスもしくは発光免疫分析方式で使用Ｇｎている：ａ、有慎ルミネッセンスもしくμＭ機発元分析。この＠汗、ルミネッセンス反応に直接に関与しくすなわち励起状態に変　ゝ侠され、次いで光子を放出して非励起状態に復帰する）化学ルミネッセンスもしくは生物ルミネッセンス化付物を使用して、たとえば蛋白質、ホルモン、ハプテン、ステロイド、核ば、代謝物、抗原お工び／または抗体のようなりガントを標識する。過する化合物の例はルミノールお工ひイソルミノールを民含する：ｂ、ルミネッセンス触媒モしくはコファクターイムノアッセイ。この揚曾、ルミネッセンス反応の触媒もしくはコファクターを標識として１吏用する。通する触媒の例はペルオキシダーゼ４累である、ｃ、ｄ素箱会イムノアッセイ。この場汁、ルミネッセンス反応を使用して、迩する曇質に対する爵累慄識の１千用によって生成さｎた生成吻を決定する。この種の免疫分析の例は抗体狛汗したグルコースオキシダーゼの測定でりって、酵系／尻坏試栗をグルコースと反応させて過ば化水素を生成させ、次イテ制を卸栄佇下テルミノールｋ　麻／ＩＩ］してルミネッセンス反応を開炬、さぜることにエフ生成さｎた壇鍍化水素の量を測定する。

上記イムノアッセイの感度は、機成または標識の生圧物を俣出する下限によって一部決定される。ルミネッセンスまたは発光免疫分析の場曾、この方式の感度はルミネッセンス反応において標識勧賞の年位童当シに放出ざ扛る光に一部依存する。本発明の一目的は、増強した感度を石するルミネッセンスもしくは発光免疫分析を提供することであり、標識物質または標識の生産物を改良さｎたルミネッセンス反応を介して測定することにより達成さｎる〇本発明の改良さ扛たルミネッセンス反応は、イムノアッセイ標識またはその生産物の測定において特に有用でるるか、決し□　てこの用途のみに１坂定されない。′したがって、さらに本発明の目的は、向上した感鍵をＭするルミネッセンスもしくは発光分析（イムノアッセイもしくはその他の分析）全提供することであり、不発明の改良さｎたルミネッセンス反応を分析過程に組み入ｎることにエリ達成、される。

イムノアッセイでなく、本発明のルミネッセンス反応ｔｍみ入れ得る分析の例′ は次のものｔ色言する：ａ、不溶注のペルオキシダーゼ−エラスチン８１１！　 ’Ａ　＠　２７”　’）のペルオキシダーゼの数量に基づく二２スターセ分析す、共固足化ざｎたグルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼとに丞づくグルコース分徘Ｃ，ペルオキシダーゼ酵素、２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、６ −ヒドロキシベンゾチアゾール、ｌたはたとえば過酸化水素の工つな酸化剤の分析。この楠片、これら物質は標識でも標識の生産物でもない。

したがって、広義における本発明に１扛ば、ルミネッセンス反応がペルオキシダーゼ酵素、峡化剤、６−ヒドロキシベンゾチアゾールと化学ルミネッセンス２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンとの間で生ずる増強さｎたルミネッセンスもしくは発光分析が提供さｎる。

好１しくは、この分析はイムノアッセイである。本発明に、扁ろくことに、成る徳の６−ヒドロキシベンゾチアゾールヲ公知の２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン／ｍ化剤／ペルオキシダーゼ系へ添７ＩＯすると、生ずるルミネッセンス反応の感度が者しく瑠燻さｎるという知見に示ついている。

不明、ｆｌＩ８優において、「増強」という用語は、本光明のルミネッセンス反応の全先光２工び／ｌたに不発明のルミネッセンス反応に２ける信号／バックグランド比が、６−ヒドロキシベンゾチアゾールの不妊在Ｆで２．３−ジヒドロ− １，４−ブタンジンジオン／ハ１こ酌／ペルオキシーダーゼ系にエリ達成さ扛るｔのニジも大きいことｔ＊床する。この工うに１−項預」さ扛たルミネッセンス反応を組み込んだ分析のみが本発明の乾囲内でるる。

本発明の格別の利点は、６−ヒドロキシベンゾチアゾールの添加に工すもたらされる増強が、ペルオキシダーゼ酵素を用いる反応に対し特異的であることでるる。

本発明による化学ルミネッセンス２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン（ＤＰＤ）Ｕ、化学ルミネッセンス反応に２いて励起状態までに侠さｎかつ次いで光を放出して非励起状態まで復帰するような任意のＤＰＤとすることができる。

好Ｅしくは、２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンは、一般式１：〔式中、Ｒ１はアミノ＋シ＜は直換アミノでめ９、Ｒａ　−Ｒｓお工び亀のそれぞれは水素、適宜置換さｎｆｃｃ、−Ｃａアルキルもしくはアルクニル、ヒドロキシル、Ｃ，−Ｃ−アルコキシル、カルボキシル、アミノもしくは置換アミンでるり、または島はアミノもしくは置換アミノでありかつ＾ｅ　Ｒ１お工び曳のそｎぞ扛は水素、適宜置換さｎたＣ、　−Ｃ，アルキルもしくはアルクニル、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ，アルコキシル、カルボキシル、アミノもしくは置換アミノでるり、または鳥お工び鳥は一緒になってベンゾ基のアミノもしくは置換ア′ミノ誘導体でありかつ島およびへのそｎぞｎは水素、適宜直換さ扛たＣ、　−Ｃ，アルキル４　Ｌ＜ｔ；ｊ：アルクニル、ヒドロキシル、Ｃ，−Ｃ，アルコキシル、カルボキシル、アミンまたは置換アミンである〕を有する。

本明細書において、置換アミノはアミドを巳言する。

化学ルミネッセンスＤＰＤが本発明のルミネッセンス反応に関与する型式は、問題とする分析の棟畑に依存する。フタラジンジオンを標識として・ｉテ用する、たとえば有機ルミネッセンス％Ｌ＜は有機発光免疫分析の工うな分析の場会、化学ルミネッセンスＤＰＤは２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンの置換アミノ誘導体であり、９の場♂アミノ蟇はたとえば盪白買、ホルモン、ハプテン、ステロイド、核叡、代謝物、抗原もしくは抗体の工うなリカンドに結合される。アミノ基（−１リガンドに直接に帖曾することかでさ、或いは朱憫アームを介して結きすることができる。通する栄橘アームは、たとえは英国付計第２．００８，２４７Ａ号オニび米ｍＰＰ！ｊｐ第４１０４０２９号公報ニ記載さｎた工うに、当東肴に周矧さｎている。好適な架橋アームはヘミコハク教、ヘミグルタル酸、ヘミマレイン酸、カルボキシメチル、グルクロン酸、メル刀ブト酢咳２工ひカルボキシルメチルの誘導体から得らｎるものを也含する。アミン基は、任東適当な周知の方法でリガンドへ藷片することがでさ、こわらの方法も英国将許第２００８２４７ＡＱ＆−よび米国特許第４１０４０２９号公＠（、Ｃ記載さｎている。好適な結合方法は、混合無水物、カルボジイミド２よひ／または活性エステルの史用金言ひ。

フタラジンジオン全標識として用いる分析に使用するのに適した化学ルミネッセンスＤＰＤはアミノ基がリガンドに結合さｎている２、３−ジヒドロ−１，４− フタラジンジオンの任意の置換アミン誘導体とすることもできるが、好適＠買ｔｒｉ５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン（ルミノール）２工ひ６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン（イソルミノールノでめす、そｎ−ｅｎの揚台アミノ＋ｎリガンド、荷に抗体に結合さｎている。

フタラジンジオンを標識として用いる以外の分析の揚会、化学ルミネッセンスＤＰＤｔｆＸ、脣にリガンドとして結合さ扛ていない上記好適種類の２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンである。この＠寸、化学ルミネッセンス１）ＰＤは浴敢中に遊４さ扛ていても、或いはマトリックス上に自足化されていても良い。特に好適な物質６１ルミノールおよびイソルミノールである。

本発明による６−ヒドロキシベンゾチアゾールは、ベルオキシグーゼ／ハ化剤／　２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンのルミネッセンス反応を促進する任意の６−ヒドロキシベンゾチアゾール（置換もしくは未置侠のもの）である。しかしながら、好ましくは６−ヒドロキシベンゾチアゾールは、一般式ｌ：〔式中、ＲはＨ，ＣＮまたは適宜置換さｎたチアゾールであり、Ｘｔ　ＸａのそｎぞｎはＨ２迩宜置侠さ扛たＣ、−Ｃ，アルキルもしくにアルケニル、ヒドロキシル、［７ヒドロキシル、Ｃ，−Ｃ。

アルコキシル、カルボキシル、アミンもしくは置換アミノで本発明の分析の符に好適な具体例に２いて、入−為のそｎぞＡはＨまたはＣ，−Ｃ，アルキルでめ９、かつＲはＨｌＣＮまたは−収式Ｉ：〔式中、為はＣ０ＯＨであシ、為−にのそｎぞｎはＨまたはＣＩ　−０６アルキルであり、または為および為は一緒になってＯであシかつＸａ　Ｘｔのそ扛ぞ扛はＨまたはＣ１ｃ、アルキルである〕のチアゾール置換基である。特に好ましくは、ＸｌＸ５のそれぞれおよび必要に応じＸｓ　ＸｙのそｎぞｎはＨである。こｎらの好適な６−ヒドロキシベンゾチアゾールは、特に化学ルミネッセンスｆ）ＰＤがルミノールまたはイソルミノールである場合、特に高レベルの感度同上を与えることが判明した。

２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、特にルミノールのルミネッセンス反応を触媒する任意のペルオキシダーゼ酵素〔インターナシナル・ユニオン・オプ拳）くイオケミストリーにエリトーナー、過酸化水素、オキシドレダクターゼ（ＥＥＣ４１，１１，１，７）として定義さｎる〕を、本発明のルミネッセンス反応に１天用丁ゐことができる。例としては、種物ペルオキシダーゼがこ含ざする。好ましくは、４累は西洋ワ、サビのペルオキシダーゼ（ＥＣ４６１，１１，１，７）でめる。

ペルオキシダーゼげ累が本発明のルミネッセンス反応に関与する型式は、問題とする分析の種類に依存する。ペルオキシダーゼを標識として使用する分析、特に免役分析の場合、こｎはたとえば蛋白質、ホルモン、ハプテン、ステロイド、残数、代謝物、抗原または抗体のようなりガントにだ合さｎる。一般に、ペルオキシダーゼは架橋アームを介してリガンドに結合さｎる◇−ＪＭする架橋アームおよび結合方法は、化学ルミネッセンス１）ＰＤにつき上記したものである。

ペルオキシダーゼ勿標識として使用する″以外の分析の場合、酵素は溶液甲で遊離型で６つでも、或いはマトリックス上に固定さｎるかリガンドに結合されなくても艮い。

２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、特にルミノールもしくａインルミノールと反応してＤＰＤｆ励起ぜせ、ルミネッセンス反応に２いて元を発する任意の酸化剤？、本発明のルミネッセンス反応に使用することができる。符に好適なば化剤は、過Ｓ改イオン２工び過酸化水素でめる〇リガンド用の標識として２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンまたはペルオキシダーゼ酵素を用いる分析、符にイムノアッセイに２いては、既知量の酸化剤を一叡に適当なｇ軒からの反応混合物へ加える。しかしながら、成る種の他の分析においては、存在させる酸化剤、一般に過酸化水素の童は未知である。この第２の種類の分析において、標識は′基質から酸化剤へたとえば、この場合、本発明のルミネッセンス反応を使用して、ルミネッセンス反応混合物におけるば化剤一度の測定により標識リガンドの量を決定する〇本発明のルミネッセンス反応からの発光は、主としてペルオキシダーゼ、酸化剤、６−ヒトロキシベンゾテアゾールお工びイビ学ルミネッセンスＤＰＤの選択に依存するが、たとえは温度、−１試薬＃度、混合速度および光測定力法のような二次的ファクタによって決足さｎる。本発明の方式の感度ｋｍ大化させるには、こｎらの二次的ファクタを調整して、再現可能かつ容易に測定しうる方法で、できる疋は高い信号／バックグランド比にて束大の発光を得ねぼならない。

選択さｎる条件は、一般にペルオキシダーゼの＃累もしくは触媒活性、反応の速度編、使用する装置、信号／バックグランド比お工ひ必要とする感度ｖｉ−＆含する妥協点である。

今回、最適帖来を侍るには、本発明のルミネッセンス反応を７〜９の範囲の−という緩和な粂件下で行なうべきであることを見出した。本発明の方法に対する適当な緩衝物質は燐ば堰・トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２−アミノ −２−メチル−１，３−プロパンジオール、炸戚塩、炭眩塩２工び硼ば塩である。

一般に、測定子べさ物質全９」外として、ルミネッセンス反応混合物における試薬の濃度は一足に保たれる。たとえば可変ファクタは標識リガンド、標識の生理物、ば止剤または禾結合ペルオキシダーゼの濃度でろる。

本発明のルミネッセンス反、芒に使用するには次の試薬濃度が特−過している：ペルオキシダーゼ　０．１μリー５０００　、Ｉ！７／Ａば止剤　１０　ｔｔｍｏＬ−３００’ｍｍｏＬ／１６−ヒドロキシベンゾチアゾール　０．０１ｍｍｏｔ−４ｍｍｏｔ／Ｌ化学ルミネッセンス１）ＰＤ　Ｏ，５μｍｏｔ／　２０　、Ｏｍｍｏｔ／を本発明のルミネッセンス反応を行なうに除し、４種の必須試系の幾つか（ただし少ｆ４　（ともｌ徨を省く）を臥、恢看甲に入れる。次いで、ルミネッセンス反応を、残余の必須試粱ｔ”ＥＪＪ曽へ添７ＪＯすることに工り開姑さぜる。兜元さｒ′した光ｔ、たとえは光電子増位管のような憾準測足装置にエリ定型し、その１ｇ号を記碌肘、オシロスコープまたは計測器に供給してそこに表示または記録する。さらに、成る場合には元金内眼にエリ観察し、或いは写真版上に記録することもできる。しη為しながら、“好ましくはこの光を英国特許出願第２０２５６０９Ａ号明細膏に記載された種類のルミノメータで定量する。

本発明のルミネッセンス反応は３．ｆｌの主な、′ａ＠のイムノアッセイに使用することができ、そｔぞ扛の特徴はリガンドに付着さｎる標識の種類である。これら標識は次のものである：ａ、　アミノ基がリガンドに結合されている２、３ −ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンの置侠アミノ誘導体。

ｂ、ペルオキシダーゼ酵素、およびＣ０上記ａお工びｂに記載した種類以外の物質、および一般に本発明のルミネッセンス反応に工９測定しうるＷ質への基質の笈漠に関与するたとえばグルコースオキシダーゼまたは乳眼デヒドロゲナーゼのよう・２酵素（二股に過酸化水素もしくはペルオキシダーゼ）。

上ＭＧのイムノアッセイに２いて、分子ｒすべき窃買またはこのｖＩ賞に対する抗体の標識がＯ１罷でおる。使用する慄緘の１里須に応じて、分析は異質でのっても同質でうっても艮い。前者の場Ｃ，たとえは血清の工うな峡片漱τ分析することもできるが、後者の場合には予備的な佃出もしくは樗製工程が必要でるる。

典型的な異質および同質のルミネッセンスもしくは発光免役分析をＦ記に貌明する：１、異質ルミネッセンスもしくは発光免役分析この種の免役分析に２いては、分析丁べき切質をこｎに対する抗体と反応させる。次いで、遊離抗体を結＠−尻体から分離する。抗体、分析すべき物質、ｌたけ分離後に遊崖もしくは結合部分と反応しうる他の分子を標識することにより、反応を定量この場合は、分析丁べき物質の未矧量を、標識と結合した前記ｖＩＪ頁の耽知量ｈｘびこれに対する抗体の既知所定量と混合する。抗体に対する標識物質と未標識ｗＪ買との間の脱会反応を生ぜしめる。抗体と未標識ＷＩ質との間ならひに抗体と４織吻寅との間の説合体を、遊離の標識物置２工ひ禾標識吻質から分離する。

抗体に鮎貧した標識物置の蛍に、分析される浴液中の未標識？Ｉ貿の菫に相関する。こｎらの重は、抗体に粕会した標識の量を測定するか、或いは残留する遊離の標識物置の菫を測定するス試鱗管の壁部を介して内相に結合さｎている種類の分析の例は、英国特許第２０４４９２７Ａ号公報に記載さｎている。

３、「２部位」異實発光免侵分析この種の免役分析に２いては、分析丁べさｇＪ質を先ずこｎに対する未標識抗体へ結合させ、こｎを次いでたとえばプラスチックのような同相支持体に結合させる。次いで、複合体（抗体と物質との間）を標識抗体で処理する。

次いで、得らｎた固体複合体に２ける標識抗体の分析ｔ、浴［から固朱複寸体を分離し、次いで分離ざｎた固体複合体に存在する標識の童を決定するか、ｌたは溶液中に溶解した残留標識抗体に存在する標識の賃金測定して行なうことができる。

この釉の免役分析の他の具体例において、分析丁べさ物質を標識抗体２工び未標識の固体支併抗体へ順次に結合させる刀）、或いは標識抗体と未標識抗体との両者に一工程で結合ざぞるこアミノ訪碑坏もしくは直俣アミノ誘専坏でるる兎没分町に適用することができる。こｎに、問題とする遊離の標戚吻實（ｌたｖｘ；ｆ：ｎに対する抗体）から発光さｎる異なる頻度の光ｌたは間嗜とする結合した標識ｍ質（互たはそｎに対する抗体）から発光される光の匝長に依存する。

一例において、（プロゲステロン−インルミノール誘導体）複合体とヘム触媒と週鍍化水素との反応から発てる光の頻度は仇プロゲステロンＩｇＧの存在下で行なわｎる同じ反応りりも低い強変であることが判明した。

したがって、この分析に２いては、未知のプロゲステロン試料を先ず既知量の抗グロゲステロンＩｇＧと一緒に培養するっ平衡に達した後、既知量の（プロゲステロン−イソルミノール誘導体）復会坏を加え、次いで既知量のヘムお工びｘＡ眩化水素を加える・発光した元を測定し、未知試料に存在するプロゲステロンのｔを標準曲線から決定する。（未知試料に存在するプロゲステロンが多い程、遊離のＩｇＱが平衡に２いてよジ少なく残存しかつルミネッセンス反応に２げる光収率がニジ低い）このようにして、プロゲステロンの測定を分離工程の必要なしに達成することができる。

上記全ての免役分析に２いて定量、恢出または恒置次定工程ｔ、本発明のルミネッセンス反応とすること、ノ；できる。

上記免役分析に開用する抗体は市販さｔている刀）、或いは公知の免役学的孜術にニジ調製することがでさる。こｎらの仇゛体は抗体の複会混会物であっても、或いは１棟もしくはそｎ以上のモノクローナル抗体であっても良ソ・。一般に、多室の抗体しか必要とされず、その活性に適切な−、イオン頻度２工び温度に維持さｎる。

限定はしないが次の１画一の物質に対する抗体を、本発明のルミネッセンス反応を用いる免役分析に有用に使用することができる：たとえばインシュリン、α− ブエトプロテインおよびフェリチンの工うな蛋白質：成長ホルモン、上皮小体ホルモン、卵胞刺戟ホルモン、黄体ホルモン、甲状腺刺戟ホルモン、向側腎皮質ホルモン、グルカゴン゛、プロラクチンおよびカルシトニンの工つなホルモン：たとえはエストリオール、プロゲステロン２よびコルチゾールの工うなノーブテン／ステロイド：たとえはジゴキシンの工うな渠吻：たとえば細／＠表面抗原および発癌性胚芽抗原のような抗原：ならびにたとえは茸下腺炙ウィルス抗体、ひと完投グロブリンＧ　（ＩｇＧ）、うざきＩｇＧ、手ＩｇＧ、モルモツ）ＩｇＧ、ロバＩｇＧ’　Ｂ工びひと免役グロブリンＥお工びＭの工うな抗体が也含さする。

不発明のルミネッセンス反応は、上記の免疫分析以外の分析にも使用することができる。こｎらａ仄のものを包百する：１、　不浴注ペルオキシダーゼエラスチン調表物からのペルオキシダーゼの放出に基づくエラスターゼの分析この分析に２いては、面体のエラスチン−ペルオキシダーゼ複合体を、種々の重のエラスターゼと共に培養する。所定時間の鎌、未反応の複合体を遠心分離により除去し、上瀝液を未結合ペルオキシダーゼにつき分析する。

上？ず液に存在する未結合ペルオキシダーゼの′量は、試験試料甲のエラスターゼ活性に相関する。

この分析に２いては、同定化された脅威ペプチド基質、丁なわ５アフイーゲｋ　ｌ　Ｏ−１％ｔａ　＝　Ａｈａ　−Ａｈａ　−Ｐｈｅ−イソルミノールを、種々の量のグロテナーゼで処理する。”所定時間の後、未反応基買を遠心分離にエリ除去し、上澄液をイソルミノールにつぎ分析する。上げ液中に存在するイソルミノールのＴｔｕｆｊｉ嫉試料に２げるプロテナーゼ活性に相関する。

この分析においては、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼとを支持体、たとえにセファローズｌたはプラスチックチューブに共固定化させる。こｎへ、ルミノールお工ひ６−ビドロキシベンゾチアゾールの溶液を刃口える。最後に、グルコースの溶液を加え、発光を記録する。この発光は、溶液中のグル之−ス量に直接に相関する。

本発明の分析およびルミネッセンス反応の主たる用途は、臨床試験および外科手術である。この棟の試験お工び／または外科手術に２いては、所定の分析法で使用すべき物質全分析用キットの形態で得ることが一般的である。

したがって、本発明はさらに本発明の増強ルミネッセンスもしくは発光分析に使用するための分析用キッＩｔ−提供し、こｎは：ａ、ペルオキシダーゼ酵素、ｂ、６−ヒドロキシベンゾチアゾールおよび、Ｃ０化学ルミネッセンス２．３− ジヒドロ−１，４−フタラジンから構成さ扛ている。

ざらに、この試恢キットに酸化剤をも含Ｍするが、多くの場せこの物質は別途に供給しても或いは分析丁べき＠質でろっても良い。

りましくに、ペルオキシダーゼ＃話、酸化剤、６−ヒドロキシベンゾチアゾールお・工び化学ルミネッセンスＬ）ＰＤｒｉ、本発明の分析に使用するのに好適なものとして上記したものでめる〇本発明の分析用キットに２ける荷に好適な具体例において、ペルオキシダーゼ酵系および化学ルミネッセンスｏＰＤの少なくとも一刀？、分析丁べさ吻員に対する抗体へ結合させる。

必要に応じ、分析用キットはさらに分析すべき籾質の既知量を含有するｌ釉もしくはそれ以上の標準浴液お工び／または好適緩衝浴液の１種もしくは七ｎ以上をも含有することができる。

さらに、便利には分析用キットは、この分析を実施する過程で発する元を画定するための装置と一緒にザ用するのに適した反応容器をも含むことができる。さらに、試渠の充分な混合を確保するのに使用するため、混合装置をこの分析用キットに含ませることもできる。

本発明のルミネッセンス分析、ルミネッセンス反応および分析用キットを、添付図面を参照して実施レリ、につき説明する。

第１図はペルオキシダーゼ標識さ扛た仇ＡＦＰの希釈曲線であり、第２図Ｆｉ壷ルシフェリンの存在下２工ひ不任任下に−一けるＡＦＰＫ粕汁さ社、抗体ｆ！援ビーズに回定化さ扛たうさざ抗−ひとＡＦＰ／ｄＲＰの発光を示すグラフでめシ、第３図ｒ［Ａ　Ｆ　Ｐのルミネッセンス＃Ｊ足と比芭測足とに関する信号／バックグランド比の比較であり、績度を増加させた場合の発光および吸光変化の比較である。

西洋５ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：純１［（Ａ４０３対Ａ２５　Ｇ（ｉり比）　：　ＲＺ約１．０〕は、英国拳エセックス州・ロム７オード在、ヒユー・アンド−ヒユー社から得、こｆ’Ｌｔ２．６！Ｘ４０　ｔ、Ｎ（ｒ）　ＡｃＡ　３４　力ｔム（英国・サリー州・丈ウス・クロイドン社・ＬＫＢインストルー・メント社）を用いてゲル濾過にＬ９ｍａｔした。０．１５モル／　Ｌ　ＮａＣｔｆ言Ｍする０−０，１５モル／を燐酸塩緩＃液（−ｙ、ｚ）を用いてカラムを浴出させた。得られた積装ペルオキシダーゼに約３．０のＲ２ｔ有した。

α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、うさき′仇−ひとａＦＰ（、−に１００−００８）２工ひうさざ抗−ひとＡＦＰ／ＨＲＰ複曾体は、サリー州−ビルフオードロード拳ウェストバイフリート・クエイブリッジ在、プロフード　ハウスのダコグロダクッ・メリカ・プロケート社から入手した。

チロキシン（Ｔ４）・　うさぎ仇−Ｔ４扱覆ビン２工ひ、’Ｊ、／ＨＲＰ懐合体は、英国・セサックス州・レベス在・ベーリンガ社から入手した。

風疹ウィルス（ひと）［６ｆしたビーズ２Ｌび抗ひとＩｇＧ（やｆ）／ＨＲＰ便合体は、ハンプシャー州舎パシングストーク・ブライト・ヒル・バレート在のアボット・ラボラドリース社、診断薬部門から入手した。

Ｄ−螢ルジアニリン（４，５−ジヒドロ−２−（６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾリル）−４−チアゾールカルボン咳、製品−％Ｌ　９５０４、せ成垢品物）、牛血ｆｉフルプミ：ｙ　（Ｂ　Ｓ　Ａ　＊製品番号Ａ４５０３）おＬび２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰ：製品番号Ａ９７５４）は、英国−ドルセット州・プール在拳シクマ・ケミカル社から入手した。

ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）およびイソルミノール（６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）は、英国・ドルセット州・プール任・ファンシーロード、シグマ・ケミカル社から人手した。

ルミノールの一ナトリウム塩は、上記した工うに胴衣した〔ハム寺、アナリチ力ルーレターズ、１９７９第１２巻、第５３５シト〔式１に２いて山および鳥ぼ一緒になってジメチルアミノ置洟さ扛たベンゾ基であり、Ｒ３および曳はＨである）は、べ一すンガー■マンハイム社から入手した０Ｎ−（６−アミンへキシル− Ｎ−エチル）イソルミノールは、フィンランド国・ＬＫＢ社から入手した。

ツイーン２０は、英国・ブックス州・コルンプルック在・コツホ−ライト・ラボラドリース社から入手した。

２．２′−アジン’；−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホネー）　）（ＡＰＴＳ）は、英国・サセックス州−レベス在。べ−リンガー社から入手した。

エラスチン、工テスターゼお工ひグルコースオキシダーゼは、ドルセット州・シグマ・ケミカル社から入手した。臭化シアノゲンは、ギリングハム在嗜アルドリッヒ・ケミカル社から入手した。

６−ヒドロキシベンゾチアゾールは、バーミングハム大学、化学部からの寄贈物として人手した。

２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール２よびテヒドロルシ・７エリンに、メソッド・オプーエンチモロジー、第ＬＶ■■巻、「ビオルミネッセンスお工びクミルミ不ツセンス」、エム・デルカー、アカデミツク・プレス仕・璽ンドン −１９７４１、第、１５−２８頁に配植さｎた方法で調製した。

オキジルシフェリンは、ヒト２−等、アーク・ビオケミカル・ビオフィジオロジー、１９５７．第７２巻、第３５８頁の方法にＬ９調製した。

他の全ての試験はできる眠り分析数のものとし、英国・ドルセット州・プール在・ＢＤＨ社により供給された。新たにフラスコ蒸留した水を、さらにアンパライトＭＢ−１混合イオン父換倒ｑ＊（英国・ドルセット州・プール在−ＢＤＨ社）の２．６１×４０αカラムに通して積装した。

分析装置化学ルミネッセンス反応は、１０ｍＸ１０＋ｍの４ｔｎｔｇ重のプラスチック使い捨てキュベツト（英国・ライセスタ−Ｌｇ３φＩＵＱ在・ダブリュー・サルステッド社）で行なった。発光した光は・上Ｕピ（カーター寺、英国＃肝第２０２５６０９Ａ号）のルミノメータにより定重し、この楊片叡個のキュベツトｉ元電子壇活菅の九屯直談の削に正確かつ丹挽注をもって順次に配置する工う変更した。精米は、連速ポテンショメーメのチャート記録器（オランダ国・アインドホーベン在・フィリップ社、ＰＭ８２０２．ｄ、０．２５抄禾満のフルスクールデフレクション時間）に記禄した。

最初の実療に訃いては、工ｏμｔの螢ルシフェリン（１ｍｍｏｔ／ｌのＭｇＣ１＊　ｆ含有する０−１ｍｏｔ／　ｌのムＪＩ　Ｐ　ｗａｇ　（４ｓ　）Ｋ＞けるｏ、ｏｉ−ｔｏす／１）と−１０ｔｔｌｆ）ルミノール（０，０００３−３０’ Ｊ　／　を水）と、１０　ＪＩ　Ｌ　ｆ）　ＨｓＯ＊　（３−３００ｍｍｏ４／　を水〕と、　１０１ｔｔｆ）ＥＩ＆Ｐ　（０−Ｉ　ＳｍｏＬ／ｌのＮａｅＡと２９／ｌのＵＳＡと０−５す／ｌのツイーン２ｏとを含ｍする０−０１５ｍｏｔ／　ｔの専或塩緩衝ｇ（ｐｆｉｙ−２）におけるｏ、ｏｓ−ｓ　ｏ　ｏ　ｏ、“ ダ／１）とを、そ扛ぞれ混合することな（１０ｗＸ１０ｓｍのグラスチックキュベツトの別々の隅に設置した。次いで、ｌ−のａ請ｇ　（０，１ｍａｔ　／　Ｌグリシン−Ｎａｉｄ　ｐｉ（８，６〜１２．５．０．１　ｍｏｌ　／　ｌ、グ、リシルグリクン−ＮａＯＨｐＨ７，５〜９．０、トリス−ＨＣＬ、　ｐｔｌ　７．２〜８．５またｔｄ　Ｏ−ｉ　ｍｏｔ／　ＬのＡｎＰ、ｐｉ（７，５〜９．５）を注入することにエフルミネッセンス反応を開始させ、そして発光ピークを測定した。

上記の分析法を用いるとの分析にｆ用した試薬の訳度を厳選化させた麦、低いｉ（ＲＰ一度を測定するため間羊な分析法を用い之。ナトリワムルミノール（５０＝１）と廼ホ化水系（６２μｔ、３・θ％＝／ｖ　）とを、項化カリウム（０− １５ｍｏｔ／　Ｌ　）　’？ｒ。

官有Ｔるトリス（０，０１ｒｒ、ｏＬ　／　ｔ、　ｐｔｌ８．０　）　７４ｇの２００ｍへ加えた。この浴漱ン吠用する数時間前に調製し、そしてこｎを使用してルミネッセンス反応を開廻させた。トリス緩衝液（（１０１ｒｒｉｏｔ　／　ｌ、％ｐｔｉ’８．０　）におけるｌ・０μｔの螢ルシフェリンＣ１＃ｖ／ｌｄ）をキュベツトの１′隅に設置し、１０μｔの抗−ＡＦＰ−ｆ（ＲＰ複合体を他の隅に設置した。ルミノール／ｋｌ之Ｏｚ試系（０−９ｍｌ）を狂人して反応を開始させた。３０秒後の発光また／Ｉｉ発光ピークを測定した。

五施カー１実施例１の簡単な手順を反復したが、た疋し蛍ルシフェリンの代りにＤＭＳＯ中の６−ヒドロキシベンゾチアゾールヲ使用した。

実施例　３実施例１の簡単な手順を反復したが、ただし螢ルシフェリンの代りにＯＭ　Ｓ　Ｏ’Ｆの２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールを１吏用した。

実施例　４実施例１の簡単な手順を反復したが、ただしルミノールの代９にＮ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルインルミノールを１更用した。

匹ＩＬ！契施例■の量率７よ手順を反復したが、たたしルミノールの代りにイソルミノールを使用した□ １轟１−」実力例１の簡単な手順を反復したが、ただしルミノールの代りに７−ジメチルアミノ−ナフタレンー１．２−ジカルボン酸ヒドラジド（９−ジメチルアミン−２，３−ジヒドロベンゾ−［ｆ〕−フタラジン−１，４−ジオン）を使用し、かつフタラジンジオン／＆Ｏｔ　ｆ：使用前に１０倍に希釈した。

実施例　７実施例１の簡単な手順を反復したが、たてし過坂北水素の代りに過瀾酸ナトリウムを使用した。

！５カー」：区二ムｆ’Ｐ乙止生り豆盆生立止近ナトリウムルミノール（５０ｍｙ）と過鍍化水素（６２μｔ、３′０％ｗ／ｖ　）とｔ、塩化カリウム（０，ｌ　５　ｍｏＬ／　！、　）　ｔ”含有する２００ｄのトリス（０，Ｏ１ｍｏｔ／　Ｌ、　ｐｉｅｓ、　Ｏ）緩衝液へ加えた０この浴液を使用の数時間前に調製し、こルそ使用してルミネッセンス反応を開釦させた。トリス緩衝液（０，０１ｎ１ｏｔ／ｌ、ｐｔｔｓ−ｏ）における１０Ａｔの螢ルシフェリン・（１＋ダ／１ｄ）ｔキュベツトの１隅にｔき、η為つ１０μｔの抗−ＡＦＰ／ｋｍＰｆＪｉ甘坏を四の隅に直いせつルミノール／　＆Ｑｔ　試薬（０，９ｄ）を圧入して反応を開姑させた。３０抄験の発光または茜元ビーりを測定した〇ベルオキシグーゼ標識した抗−ＡＦＰの希釈ｌｆＢｆＭ’ｉ第１図に示す。この反応に関する信号／バックグランド比を第１表に示すＯ実施例　９：（比較）実施例８の手順にしたがったが、ただし螢ルシフェリンを使用しなかった。この反応に関する信号／バックグランド比を第１表に示す。

発光ビーク　試　科　１３．５　１４２０ブランク　１５　１７０信号／バックグランド比　９８．４３０秒段の　試　科　３５　’　５４０発元　ブランク　１５　２０倍号／バックグランド比　２．３　２７（ｍＶ）として測定した。使用した試料は、抗−ＡＦＰ／ＨＲＰ複合体の１：１０００Ｇの希釈物とした。、廷二」　３０秒後の発光の測定は、４螢ルシフエリンの不存在下における発光ピークで得られた信号／バックグランド比と比較して、３＋８だけ信号／バックグランド比ｔｍ大させうることカーａ、（１７５００ｍｌの広口ガラス瓶へ１２５−の／リシン／　ＮａＯＨ緩衝ｇ　（０，１ｍｏｔ／　ｌ、ｐｄ　８．８　）と０．２５９０ＢＳＡとを加えた。次いで、この溶液をローラミキサで２０℃にて２時間混台した。この時間の後、瓶（２工びぞの蓋）をグリシン緩１１１ｆ液（３，Ｘ５０ｄ）で洗浄して禾幀オのアルブミンを除去し、縦故に排液した。

＋２１　１０００１１４のポリスチレンビーズｆ’）プソル（登録商標、１％、５ｎｏｕｔ）で３０分間洗浄した。＃ｅ留水で洗浄した鏝、こ７しらビーズｆ２００ｄのグリシン緩衝液と共にブフナーフラスコに入れ、そして脱ガスした。

（３）　グリシン緩衝液（４ｏｏ−）ｔ、予備ｄ覆したガラス瓶に移し、そしてうさぎ抗−ひとＡＦ’Ｐ（１，５７り’ｉ加えた。

浴液全光分に濾片し、欠いで説ガスしたビーズを加えた。全体をローラミキサで２０℃にて６時間ｌＪ＆せしに０（４）・６４間後、グリシン緩衝故−抗体浴ａｔデカントし、ビーズを４００−のＰ　Ｂ　Ｓ　（０，０１５ｍａｔ／　Ｌ＠ｇｌ＠、０．１５ｍｏｔ／　Ｌ　ＮａＣ１、ｐｄ　７．２　）で２回洗浄した。第２回のｐｐｓ洗液、をデカントした後、ＰＢＳに２ける１３　Ｓ　Ａ　（、ｏ、　５　′Ｘンの、浴１（４００−ンを加えた。再び、全体をローラミキサで２０ ℃にて混脅し念。９０分後、ＰＢＳ−アルプミル溶液を除去し、ツイーン２Ｇ（登嘩商標、０．０１％）を含有する酢酸塩緩衝ｙ　（ｏ、１　ｍｏｔ／　ｌ、　ｐｆ（４，２、４ＱＯｒｄ）’に刀ａえｌヒ。

１０分間混合・し、仄いで昨戚項緩＃ｔＶｊ、を０．０５％のツイーンを含有するＰＢＳ緩新液（ｚｘ４ｏｏ４）で直侠した。最鎌に、ＰＢＳをデカントし、ビーズに１戸紙上で２０℃にて３０分間乾朦６ぜた。こｎらビーズをねじσき瓶に４℃で貯蔵した。

ｂ、ｔυ１ＰβｓＶｃ＞ｒｒる光分抗体横掘したビーズ（上記工程ａ）１’ｉ、１５〜３０分間説ガスした。

ｔ２１ＡＦＰ會言石する５ｏμｔの襟４吻葦たは試料’ｉ　０．９５−のＰｄ　Ｓ／Ｊ３ＳＡ／ツイーン（瞬緻４０．０１５　ｍａｔ　／Ｌ、ＮａＣＬ　Ｏ，１５ｍｏｔ／　１．　Ｂ　ＳＡ　Ｏ−２−％、ツイーン２Ｇ、０．０５％、−７，２）と共にキュベツトへ刃口え之。この浴液を３７℃まで加温し、次いでビーズと共に１時間培養した。

（３）　次いで、浴液をデカントし、そしてビーズｉＰ　Ｂ　Ｓ／ツイーンで洗浄した（２００７！にて１５秒間、次いで２００ゴにて５分間〕。

（４）次いで、ビーズを０．９ゴの１：１０００希釈のうさぎ抗−ひとＡ　Ｆ　Ｐ　／　ＨＲＰ　ＰＪｊ　８体と共に１時間培養した（複合体はＰＢＳ／Ｊ３ＳＡ／ツイーンで希釈し、そしてビーズ゛へ加える前に３７℃まで刃口温した）。

Ｃ０（１）浴液を再びデカントし、そしてビーズを脱イオン化した蒸留水で２分間洗浄した。水をデカントしｆｃ後、ビーズを注意深くキュベツトへ移した（キュベツト１１固当り１１固）。

（２）　さ−うに、各キュベツトの隅ヘトリス緩衝液（Ｏ，Ｏｌｍａｔ　／　Ｌ　、　ｐＨ８，０）に２σる１、０ｔｔＬの螢ルシフェリン（ｌＩｎ９／ゴ）を入ｎた。

０．９−のルミノール／１（２０ｘ　ｆｎＲｃナトリウムルミノール（５０％’ ）、Ｈ２Ｏ２（６２Ａ　Ｌ、３０％ｗ／ｖ）、トリス（０，０１ｍｏｔ／　Ｌ、　ｐｔ１８．０．２００−）、塩化ガリウム（０，１５ｍｏｔ／ｌ）　〕’ｆ注入することにより、ルミネッセンス反応を開始させた。３０秒後の発光を測足し、こｎを第２図に示す。ＡＦＰ炭度を項大させた信号／バックグランド比の比較を第３図に示す。

実施例　ｚｔ：（比較）実施例１０の手順を反復したが、たたしルミネッセンス反応に螢ルシフェリンを使用しな刀）つた。３０砂醗の発光を測定し、第２図に示す。

実施例　１２：（比較）実施例ｉｏの手順を反復したが、ただし次の比色法によってベルオシダーゼ標識した抗ＡＦＰを測定した。

ＡＢＴＳ（０，５５２）を０．０１％のツイーン２０を官有する咋咳塩緩衝液（５００ｄ、０．１ｄ／４　、聞４．２）に溶解させた。

過叡化水素（２，，８３−ｌＯＯ容童部、３０％Ｗ／Ｖ）’ｘ蒸留水で１００７まで希釈した。この抹存浴液を４℃にて貯蔵した。

１挺用直前に１ｍｌのＨｙｒ（ｈ　浴液を１００−のＡＢＴＳ浴敢と混会し、０．９−の侍らｔした混オ物を各ビーズ（夾弛例１０の工程Ｃ（υかも得らｎたもの）と共に３７℃にて攪拌しながら３０分間＠養した。この＠誉時同の鏝、４０５ｎｍに２ける吸光度を処理酵素暴買浴奴に対して測定した。ＡＦＰ磯度を増大さぜた、信ち／バックグランド比の比較を第３図に示す。

りにＤ　Ｍ　Ｓ　Ｏ中の６−ヒドロキシベンゾチアゾール全１更用した。

実施例　１４実施例１Ｏの分析を反復したが、たたし螢ルシフェリンの代りにＤＭＳＯ中の２ −シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールを使用した。

実施例　１５：Ｔ４の分析親会酵素結合免役吸収分析を用いてＴ４を分析した。未標識のＴ４（試料または標準ｖＩ）とＴ４／ｆ（ＲＰ複会体との混合物を、試＠當に伎覆された／９ｒ定量の仇Ｔ４と共に培養した。

平衡に達また優、試験管全洗浄して未結合の成分を除去し、次いでトリス緩衝液（０，０１ｎｎｏｔ／　ｔ、　ｐＨ８，０）に＞ｆｆる１０μｔの螢ルシフェリン（１η／−）を各試験管中に入ｎた。

０、９　ｄのルミノール／　ＨｔＯｘ　ｍ　ａ　Ｃナトリウムルミノール（５０１ｎ９）、Ｈ２ｏ２　（ｓ　２μｔ、３０％−／Ｖ　）、トリス（０，０１ｍｏｂ／Ｌ、ｐｄ８．０．２００ｒｄ）、項化カリウム（ｏ、　ｔ　ｓ　ｍｏｔ／ｌ）〕を注入してルミネッセンス反応を開始させた。３０秒後の発光を測定した。

Ｔ４曖度を槓刃口さぜた除の発光変化の比軟全第４競合誦系結台した免役・吸収分析にエリ゛ｒ４を分析した。Ｔ４（試料または標準ｇＪ）とＴ４／ＨＲＰ複合体との（混合物を・試験雪上に扱覆さｎた所定音のうさぎ抗−Ｔ４と共に培養した。

平衡に達したつ過剰の試薬を除去した鏝、９．１　ｍｍｏｔ／　ｔのＡＢＴＳと１．４７　ｍｍｏＬ　／　Ｌの過硼ぼナトリウムとを含有する１、０ゴの屏叡塩／クエン赦垣援衝液（［）Ｈ５，Ｏ，）を加え、こｎを１虻用して２５℃にて６０分間培養することにエリ各試朝管における抗体−Ｔ４−ＨＲＰ複合体の童を測定した。Ｔ４鏝度を増加させた際の４２０ｎｍｉＣＢける吸光度変化の比較を第４図に仇風疹ＩｇＧを含Ｍする試験試料を、風疹ワイルス（ひと）被櫃した床と共にトリス緩衝液中で培養した。洗浄して未反応成分全除去した後、ビーズ金抗ひとＩｇＧ　（やざ）／ＫＲＰ複合体と共ＶＣ丹ひトリス緩１＃液モで培養した。

この浴液をデカントし、そしてビーズを脱イオン蒸留水で洗浄した。洗浄したビーズを水から取出した畿、こｎらンキュベットへ移した（キュベラ）　１１１ｉＷ当！１１１１固）０ざらに、谷キュベツトの隅へ燐咳塩緩衝孜（０，１ｍａｔ　／　Ｌ、ρＩ（ｓ、ｏ）に：Ａ−σる１０μｔの螢ルシフェリン（１１，η／葱）を入（５０ダノ、Ｈ，０，（６２＃　ｔ、３０％−／、　）、トリス（０，０１ｍｏｔ／　Ｌ　、　ｐＨ８，０，２０Ｇ−）、垣化カリウム（０，１５ｍｏｔ／ｌ）〕を注入してルミネッセンス反応を開始させた。３０秒後の発光全測定し、第２表に示す。抗風疹ＩｇＧｍ度を増別させた際の信号／バックグランド比の比較を第３表に示す〇実施例　１８：（比較）抗風疹ＩｇＧを言Ｍする試験試料を、風疹ウィルス（ひと）で被覆したビーズと共にトリス緩衝液中で培養した。洗浄して未反応成分を除去しｆＣｆ＆、こｎらと−ズを抗ひとＩｇＧ　（やぎ）／ｆ（ＲＰ複合体と共に再びトリス緩衝液中で培養した。

この溶液をデカントし、ビーズを脱イオン化蒸留水で洗浄した。洗浄したビーズを水から春用した後、これらｔキュベツトへ移した（ｌキュベツト当ｖｉ個）。

各ビーズにＭ会した標識抗体の菫を、クエン酸塩−肩販項緩ｔＩ液中の０−フエニレ／ジアミン１山０ｘ　ｋキュベツトへ加、することにより測定した。０．５時間後、反応を堰咳の添別により停止させ、そして４’９２ｎｍにおσる吸光度を測定したＯその結果を第２表に示す。仇風疹ＩｇＧ一度を増大させた信号／ツクツクグランド比の比ｅを第３表に示す。

第２表抗−風疹工ｇＧの　ルミネッセンス　比　色直性比較　Ｂ　Ｏ，０６低陽性比較（ｕＩタイター約１０）　９２　０．４６高４性比較（ｆ（ＡＩタイター約８０）　４５５　１．５１陰性比較　１　１低褐性比収（ＨＡＩタイター約１０）　１１．２　８．５高−性比較（ｆＬＡ　Ｉタイター約８０）　５５　２８実汎例　１９：工２スターゼの分析西洋ワサビのペルオキシダーゼを、ジー・シー・サランダース等の方法〔アナリチカル・バイオフスミストリー、１９８２、第１２６巻、第１２２頁〕にエリ粉本化エラスチンへＭ会させた。１１ｒＬｔノエラステンーペルオキシダーゼ悪濁吻を虎浄し・かつＣａＣ４２（２ｍｍｏｔ／　Ｌ　Ｊ　’ｆｔ言Ｍする２−の０．０１　ｍｏｔ／　Ｌ　）リス緩衝液（−９）甲にて３７℃で０．５時間平衡化させた。納会したトリス−ＣａＣｔｌ緩衝液におけるエラ・スターゼ（０−ＩＱＱｎｇ／ｒａｔ　）を加え、そしてエラスチン−ＨＲＰと共に３７℃で培養した。６０分後、未反応ＭＡＰ複合体を運心分醍に工９除云し・上置液の一部を移した後、再遠心分飛した。２００μｔの上澄液を除去し、キュベツト中に入ｆ’Ｌ、０．９１−のルミノール／Ｈ＊Ｏ３／６−ヒドロキシベンゾチアゾール溶液〔ナトリウムルミノール（ｓＯ・ダノ、ｕｔｏｔ　（６２μｔ、３０％Ｗ／マ〕、６−ヒドロキシベンゾチアゾール（２ゴ、１．Ｖ／ゴ、ＤｍＳＯ甲）〕を添加することにより２００−のトリス緩衝液（０，’　１　ｍｏｌ　／　１−ｐＨ８，０）において発光を開始させた。３０砂後の発光を測定した。

太１けＬ−互上実力例１　’９の分析を反復したが、ただし６−ヒドロキシベン！直立−ムよ実ＭＦｌｌ１９のか析を反復したが、た疋し６−ヒドロキシベンゾチアゾールの代りに螢ルシフェリンｔｆ用した。

ルオキシダーゼに含つくグルコース分析クルコースオキシダーゼ（５ダ、シグマ社〕と西洋ワサビのペルオキシダーゼ（５η、シグマ社）とｔ、フォードおよびデル力の方法〔アナリチカル・バイオフミストリー、１９８１．ｇ１１０巻、第４３頁〕にニジ臭化シアノーグン活性化したセファロース（英国、ファルマシア社）に共固定化させた。この固定化した酵素ヲ燐酸塩緩１ｊＥｉ’ｌＩ（０，１ｍｏｌ／Ｌ、　ｐｉ４７．０　）に懸濁させた。固定化酵素の蝕濁吻（１００・Ｖ／ｌ、５０μｔ）をｌゴのルミノール水浴′ｔＬ（２５，ダ／１００ｄ）に加え、５０μｔの６−ヒドロキシベンゾチアゾール（１雫／７！、ＤＭＩＳＯ中）をキュベツト中に含有させた。次いで、グルコース貧有浴液の１０μＬ水性試料を加え、キュベツトの内容物を混合し、そして発光を記碌した。発光ピークｒ１５０〜５００　ｎｍｏｔのグルコーズの範囲において直線でｂった。或いは、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼとをプラスチック叉待体の表面上に固定化することもできる（たとえばレオン等、クリニカル・グミストリー、１９７７、第２３巷、第１５５６頁）。

実施例　２３ ’４４例２２の分析を反復したが、ただし６−ヒドロキシベンゾチアゾールの代りに２−シアノ−６−ヒトロキシベンゾテアゾーＮｅＡ更用した。

！呈上−ス」実施例２２の分析を反復したが、ただし６−ヒドロキシベンゾチアゾールの代シに螢ルシフェリンヲ１廻用した。

！ムΔ−ス］冥施例１の１聞単な分析を反復したが、たたし螢ルシフェリンの代りにオキシルシフェリンヲ使用した。

実施例　２６実施例１の間牢な分析紫反俊したが、ただし螢ルシフェリンの代りにデヒドロルンフェリン全１更用した。

３０手ケ後＊？＋’ｆｆ発光　（ｍＶ、　ＡＴ　ｔ２ｏｏ　ｖ）Ｉｎ１ａ＋＋＋ｉ１．ｅｎａｌ　Ａａ＋＋ｂｃａ＋、ｅ。え。ｐＣＴ／ＧＢ　８３１０００５８　２ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　Ｔｈｊ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　Ｏｒ４第１頁の続き

Claims

【特許請求の範囲】１．　ヘｈオキシＩ’−セ酵素、酸化剤、６−ヒドロキシベンゾチアゾールと化学ルミネッセンス２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンとをルミネッセンス反応において反応させて物質を定重し、検出しまたは位置決定することを特徴とする、物質の増強ルミネッセンスもしくは発光分析。 λ　化学ルミネッセンス２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンが一般式１：〔式中、Ｒ１はアミンもしくは置換アミンでるりかつ鳥、Ｒ１お工ひ曳のそれぞれはＨ，適宜置換さＣたＣ、−Ｃ，アル゛キルもしく）もしくは直侠アミノでありかつ鳥、馬および曳のそｎぞｎにＨ，適宜置換さｎたｃ、−’ｃ、アルキル゛もしくはアルクニル、ヒドロキシル、Ｃ，−Ｃ，アルコキシル、カルボキシル、アミンもしくは置換アミノでめジ、または鳥お工ひ島は一緒になってベンゾ基のアミンもしくは置換アミ２ｇ４体でありかつＲ。および曳のそれぞｎがＨ，Ｊ宜置換されたＣ１−　Ｃ，アルキルもしくはアルクニル、ヒドロキシル、ＣＩ−Ｃ，アルコキシル、カルボキシル、アミンもしくは置換アミンでるる〕を有する請求の範囲第１項に記載の分析。３、化学ルミネッセンス２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンをルミノールおよびイソルミノールエ９なる群から選択する請求の範囲第２項に記載の分析。４、−６−ヒドロキシベンゾチアゾールが一般式ｌ：〔式中、ＲはＨ，Ｃｉ”Ｊまたば遍亘直侠されたテアンールであり、刀為つＸＩ−為のそ扛ぞｎはＨ，適宜置換さｎたＣ、−Ｃ，アルキルモジくはアルケニル、ヒドロキシル、置換ヒドロキシル、Ｃ３−Ｃ６アルコキシル、カルボキシル、アミノもしくは直侠アミノである〕ｋｍする請求の範囲第１項に記載の分析。５、Ｘｌ−＆のそ扛ぞｎがＨまたはＣ，−Ｃ，アルキルで６９、か２ＲがＨ，ＣＮまたは一般式厘：〔式中−４はＣ０ＯＨでありかつＸＩ　Ｘｔのそｎぞ扛はＨもしくはＣ，−Ｃ，アルキルでるり、または４および為は一緒になって０であり、かつ為−にのそｎぞ７″ＬはＨもしくはＣ，−Ｃ，アルキルのチアゾールｇｔ換基でるる請求の範囲第４項に記載の分析。６、Ｘ３　Ｘｓのそれぞ扛がＨであり、適用できるならばＸ４　ＸｑのそｎぞれがＨでろる請求の範囲第５項に記載の分析。７、　ペルオキシダーゼ酵素が種物ペルオキシダーゼである請求の範囲第１項に記載の分析。８、　ペルオキシダーゼ酵素が西洋ワサビのペルオキシダーゼである請求の範囲第７項に記載の分析。９、ば化剤が過硼ばイオンｌｆｃは過戚化水素でめる請求の範囲第１項に記載の分析。・１０．　ペルオキシダーゼ酵素ｌたは化学ルミネッセンス２．３−ジヒドロ− １，４−７タラジンジオンのいずれかをりガントに粕盆ぢせる請求の範囲第１項に記載の分析。１１、ｊｊガントが抗体である請求の範囲第１０項に記載の分析。１２、リガンドを蛋白質、ホルモン、ハプテン、ステロイド、核酸、代謝物お工び抗原よシなる群から選択する請求の範囲第１０項記載の分析。１３、イムノアッセイである請求の範囲第１項に記載の分析。１４、　ｔａ）　ペルオキシダーゼ酵素と、（ｂ）　６−ヒドロキシベン／チアゾールと、（Ｃ）化学ルミネツセレス２．３−ジヒドロ−１，４フタラジンジオンとからなる請求の範囲第１項に記載の壇頻ルミネッセンスもしくは発光分析に使用する分析用キット。１５、化学ルミネッセンス２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンが一般式Ｉ：〔式中、Ｒ１はアミノもしくは置換アミノでありかつ鳥１　ｆ’ｌ、お工びＲ４のそ扛ぞｎＨ，，４宜置侠さ扛たＣ、−Ｃ，アルキルもしくはアルクニル、ヒドロキシル、Ｃ，−Ｃ，アルコキシル、カルホキもしくは置換アミンであシかっ鳥、鳥およびＲ４のそれぞ扛はＨ，１Ｎ宜置換されたＣ、　−Ｃ＠アルキルもしくはアルクニル・　ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ，アルコキシル、カルボキシル、アミンもしくは置換アミンであり、または鳥お工び烏は一緒になってベンゾ基のアミンもしくｔｒｉ、を換アミノ誘尋体でめりかっ−お工ヒＲ，のそｎぞれはＨ，適宜置換されたＣ、−Ｃ，アルキルモＬ＜ハアルクニル、ヒドロキシル、ＣＩ−Ｃ，アルコキシル、カルボキシル、アミノもしくは置換アミノである〕をＭする請求の範囲第１４項に記載の分析用キット。１６、化学ルミネッセンス＆３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンをルミノールお工ひイソルミノールよりなる群から選択する請求の４２１１１第１５項に記載の分析用キット。１７．６−ヒドロキシベンゾチアゾールが一般式１：〔式中、ＲはＨ，Ｃｉ”Ｊぽたは適宜置換さｎたチデゾールでめ９、かつＸ３ＸａのそｎぞれはＨ，適宜置換さｎたＣ、−Ｃ−アルキルもしくはアルクニル、ヒドロキシル、直侠ヒドロキシル、ＣＩ−Ｃ曝アルコキシル、カルボキシル、アミンもしく　ｔ′ｉ＊侠アミノアミノ〕を肩する請求の範囲第１項に記載の分析用キット。ｉｓ、Ｘｌ−ＸｓのそｎぞれがＨまたはＣＩ−Ｃ，アルキルであり、かつＲがＨ，ＣＮまたは一般弐皿：〔式中、為はＣ０ＯＨでありかつＸｓ　ＸｑのそれぞｎはＨまたはＣ０−Ｃ６アルキルでめり、ｌたｒｉｘ、　Ｂ工び為は一緒になって０でありかつ為−ＸｔのそｆＬ−ｆ：ｎにＨｌたにＣ，−Ｃ，アルキルである〕のチアゾール直侠基でりる請求の範囲第１７項に記載の分析用キット。１９、Ｘ、−為のそｎ−ｅｎがＨであり、堰用でさるなうはｋ　ＸｔのそＡｆ　ｆ′ＬがＨである請求の範囲第１８項に記載の分析用キット。２０、ベル、オキシダーゼ酵素が殖吻ベルオヤシダーゼでろる請求の範囲第１４項に記載の分析用キット。２１６　ベルオキシグーゼｍ累が西洋ワサビのペルオキシダーゼでろる請求の範囲第２０項に把柄の分析用キット。２２、敗北剤をさらに言んでなる請求の範囲第１４頂く記載の分析用キット。２３、酸化剤を過硼酸イオンお工び過酸化ボ素よシなる群から選択する請求の範囲第２２項に記載の分析用キット。２４、ヘルオキシダーゼ酵素または化学ルミネッセンス２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンを分薪丁べきｗＪ質に対する抗体へ納会させる請求の範囲第１４項に記載の分析用キット。