JPS6154453A - 増感した発光又は発光測定アツセイ - Google Patents

増感した発光又は発光測定アツセイ

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JPS6154453A
JPS6154453A JP60173084A JP17308485A JPS6154453A JP S6154453 A JPS6154453 A JP S6154453A JP 60173084 A JP60173084 A JP 60173084A JP 17308485 A JP17308485 A JP 17308485A JP S6154453 A JPS6154453 A JP S6154453A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、増感した発光又は発光測定アッセイ、特にイ
、ムノアツセイ及び該アッセイ用診断断キットに係る。
本発明に係る発光及び発光測定アッセイは、化学発光反
応（光を放射する化学反応）を利用するアッセイである
。一般に発光放射は、放射された光を検出又は測定し得
べく十分な持続時間をもち、従って分析物の検出又は定
量が可能である、 本発明に係る化学発光反応は、２．３−ジヒ１０−１，
４−フタラジンジオン（ＤＰＤ）特にルミノール又はイ
ソルミノールと酸化剤特に過酸化水素との反応であり、
酸化剤によるＤＰＤの酸化はペルオキシダーゼによって
触媒される。酸化に伴なって光が発生する。
従来の技術 として３つのタイプに分類される。
（ａｔ　　化学発光性化合物を用いてタンパク質、ホル
するアッセイ。
普通はルミノール又はイソルミノールの如キ化学発光性
ＤＰＤをリガンドに結合させる。
ペルオキシダーゼと酸化剤とを反応した結合体に添加し
て化学発光を検出し得る。
例えば英国特許公開第２０２６６９０号（マイルズ研究
所Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、　
）＋特に７ページと、＊　２００８２４７号（ウェルシ
ュ国立医学校Ｔｈｅ　Ｗｅｌａｈ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　
５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　）　＋特に８
ページ、実施例７を参照されたい。
（ｂｌ　　発光反応の触媒又は補助因子ｌ　（ｃｏｆａ
ｅｔｏｒ　）とラベルとして使用し発光反応を利用して
ラベルを検出又は定量するアッセイ。
通常は酵素、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
）をリガンドに結合させる。従って、ペルオキシダーゼ
ＥＬＩＳＡ法はこのタイプに含まれる。
（ｃｌ　　ペルオキシダーゼ以外の酵素ラベルを適当な
基質に作用させて形成された生成物を発光反応で測定す
るアッセイ。
このタイプのアッセイの一例としては、酵素／抗体試薬
をグルコースと反応させて過酸化水素を形成し、次に発
光反応を開始せしむべく調整された条件下でルミノール
とペルオキシダーゼとを加えて過酸化水素の生成量を測
定するステップから成る抗体結合グルコースオキシダー
ゼの定愈法がある。
イムノアッセイではないが発光反応を利用するアッセイ
としては以下のものがある。
ｆａｔ　　不溶ペルオキシダーゼ−エラスチン製剤から
のペルオキシダーゼの遊離を利用するエラスターゼアッ
セイ。
（ｂｌ　　同時に固定したグルコースオキシダーゼとペ
ルオキシダーゼとを利用するグルコースアッセイ、及び （ｃｌ　　ぺ々オキシダーゼ、２．３−ジヒドロ−１゜
４−フタラジンジオン又は酸化剤例えば過酸化水素を用
いるが、これらの物質をラベル又はラベル産物とはしな
いアッセイ。
発光及び発光測定アッセイについてはティー・−一・ホ
ワイトヘッド等（Ｔ　Ｐ　Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ　）　、
クリニカル・ケミストリイ（Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　）且１５３１−１５４６　（１９７９）
を参照するとよい。
光又は発光測定イムノアッセイの場合には、イムノアッ
セイの感度は、ラベルされた物質の単位量当りの発光ｔ
Ｋも成る程度左右される。
ペルオキシダーゼは、多数の有機化合物の酸化を触媒す
る。これらの反応を利用したアッセイでは１発色、ケイ
光に反応生成物に光が作用して生じる光ルミネセンス）
又は化学発光（暗中反応による光放出）を測定する。
多数の発色基質がリサーチ・ディスクロージャー　（Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ　）　ｉＦｘ　
１６０３４　、作者不明。
１９−２４　（１９７７年８月）Ｋ記載されている。こ
れらの例として、芳香族モノアミン例えばアニＩＪンと
その誘導体、ジアミン例えば。−及びｐ−フェニレンジ
アミン及びベンジジン、モノフェノール、ポリフェノー
ル、芳香駿、ロイコ色素（１ｅｕｃｏ　ｄｙａｓ　）　
＋有色色素例えば２．６−シクロロフエノールインドフ
エノール、種々の生物学的物質、ガム、種々のヨウ化物
、ビリルビン及び２．２′−７ジノージー（３−エチル
ベンズチアゾリン）−６−スルホネート色素（ＡＢＴＳ
　）と３，３′−ジアミノベンジジン色素がある。リサ
ーチ・ディスクロージャラ」；は上記以外の発色剤１例
えば（１）フェノール又は芳香族アミンの如きカップラ
と結合したＮ−複素環を含むスルホニルヒドラゾン及び
（２）トリアリールイミダゾールも記載されている。そ
れ以外の発色基質は、ディー・ジエー・力／ぐルデイ（
Ｄ　Ｊ　Ｃａｐａ−１ｄｉ　）等１分析生化学（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）１２９
３２９−３３６　（１９８３）に要約されている。
著者等は、レドックス基質ＡＢＴＳ及び０−ジアニシジ
ン（３，３’−ジメトキシベンジジン）及び発色性の化
合物の組合せくついて記載している。組合せの例として
は、４−アミノアンチピリンとフェノールの組合せ、３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴ
Ｈ’）とＮ、Ｎ−ジメチルアニリンスは２−ヒドロキシ
−３，５−ｕクロロベンゼンスルホネート又は３−（Ｎ
、Ｎ−ジメチルアミノ）安息香酸との組合せがある、４
−アミノアンチピリンとフェノールカップラとの使用は
シー・シー・アレン（Ｃ−Ｃ−Ａ１１ａｌｎ　）等、ク
リニカル・ケミストリイ（Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ　
−ｍｌｓｔｒｙ）２０，４７０〜４７５（１９７４）に
記載されており、４−７ミノアンチビリンとＮ、　Ｎ−
ジメチルアニリンカップラとの使用は、ティー・キクチ
（Ｔ　　Ｋｌｋｕｃｈｉ　）等、ケミカルアブストラク
ト（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔａ　）　９４
　、　１７９９ｖ（１９８１）とワイ・ットム（Ｙ　Ｔ
ｓｕｔｏｍｕ　）　、ケミカルアブストラクト（Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　）　９４　。
７９７５９６（１９８１）に記載されている。また、エ
ム・ツＫ　（Ｍ　　Ｔ＋＋ｕｄｏ　）　、ケミカルアブ
ストラクト（Ｃｈｅｒｈｌｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ
　）　９３　、６５４２３　ａ　（１９８０）及びアイ
ケンケミカル・リミテッド（Ｅｌｋａｎｃｈｅｍｌ　−
ｃａｌ　Ｌｔｄ　）　、９土　１３５５８９ｋ　（１９
８１）も参照するとよい。ピー・ジョセフィー（Ｐ　Ｊ
ｏｓａｐｈｙ　）等８Ｊ　Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｍ、　２５
７．３６６９−３６７５（１９８２）は発色化合物３．
５．３’、　５’−テトラメチルベンジジンのＨＲＰ触
媒酸化の研究について記載している。
Ｈ２Ｏ２及びペルオキシダーゼで酸化するとケイ元物質
を生じる化合物としては、チラミン（４−ヒトａキシ７
エネチルアはン）トホモバニル酸：ジーー？ツオカ（Ｋ
　Ｍａｔｓｕｏｋａ　）等、タム６フアーム、プル（Ｃ
ｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、　）　２７゜２３４５
−２３５０　（１９７９）、４−ヒドロキシ７エ＝ル酢
酸：ニス・ディー・リドフスキー（ＳＤＬｉｄｔｓｋｙ
　）等、ブロス、ナト、アカド、ザイ、米国（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ）１旦、
　１９０１−１９０５　（１９８０）、ａ々のフェノー
ル：シー・ザイツ（Ｋ　Ｚａｌｔａｕ　）等、アナリテ
ィカルバイオケミストリイ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　Ｉｔ）９　＊１０９−１
１３　（１９８０”）及びアミノ酸のテロシン：ジエー
・ウィリアムス（Ｊ　Ｗｌｌｌｉａｍｓ　）等、バイオ
ケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｊ　−）１
２１．２０３−２０９（１９７１’）がある、ＤＰＤ以
外の発光基質としてはポリフェノール例えばピロガロー
ル、ロフィン（２，４，５−トリフェニルイミダゾール
）があり、また、アクリジニウム化合物、シュウ酸ジア
リールエステルがある。これらに関しては、前出のティ
ー・ピー・ホワイトヘッドの論文を参照されたい。
程々の有機化合物のペルオキシダーゼ触媒酸化を種々の
エンハンサ（ｅｎｈａｎｃｅｒ　）　（反応速度の促進
、即ち測定される色又は光の強度の増加を行なうもの）
で増壱した結果を以下の表１及び表２に要約する。
表　　１ （グアイアコール）　　　　　　　　　　　　　又は硫
酸ナトリウム３．３′−ジメトキシベンジジン’　Ｈ２
Ｏ２／ＨＲＦ　　アンモニア及びアンモニウム塩、　Ｂ
ｐ−フェニレンジアミン／）ＩｚＯｉ／ＨＲＰ　　　　
ピリジン及びイミダゾールジアミノベンジジン／ＴｏＯ
２／ｌ［（ＲＰ　　　　　　イミダゾール　　　　　　
　　　ＣＡＢＴＳ及び他の発色及び　　　フェノール類
　　　　　Ｄ螢光物質 アスコルビン酸／　Ｈ２ｏｚ／Ｉ（ＲＰ　　　　　　　
　　ｏ−メトキシフェノール、Ｅｐ−ヒドロキシジフェ
ニル又ハ ｐ−メトキシフェノール ｐ−クレゾール　　　　　　　Ｆ １．３−ジヒドロキクシ（／→乙／　　　　Ｇ反応体　
　　　　　　　　　二ンノ・ンサ　　　参考文献アスコ
ルビン酸／ＨｚＯ２／ＨＲＰ　　　　　　　チロキ〃及
びチロキ〃　　　Ｈ類似物 エピネフリン／Ｈ２０ｚ／ＨＲＰ　　　　　　　　チロ
キ〃及びチロキシン　　　Ｈ類似物 フエロシアニ１″／ＨｓＣｈ／ＨＲＰ　　　　　　　　
ベンジヒドロキサミン酸　　　　　　Ｊｌ−アニリノ−
８−ナフタレン　　　　　　　　　ベンゾヒドロキナミ
ン？ｔ　　　　　　Ｋスルホネー）／ＩｋＣｈ／ＨＲＰ ２−ｐ−）ルイジニルナフチレンー ６−２（ルけり’Ｆ−）／）ｈｏｗ／１（ＲＰイア）’
−ルー３ｍイ麦／ＨａＯｚ／ＨＲＰ　　　　　２．４−
’／りｏルアｃ７−Ａ／　　　　　Ｌ表２ プルプロ心゛リン／ＨｚＯｔ　　　ｐ−フェニレンジア
ミン　　　　　Ｍピロガロール／ＨｘＣｈ　　　Ｏ−フ
ェニレンジアミン　　　　８表１及び表２の参考文献 Ａ　ジエイ・アール・７アイタツ力−等、バイオヒム１
バイオフイズ・アクタ（Ｊ　　ＲＷｈｉｔａｋｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ、。
Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｌ）ｈ３’ａ、　Ａｃｔａ）
　６２　、３１０−３１７　（１９６２）Ｂ　アイ・フ
リドヴイツヒ、ジエイ・パイオル・ケム（工Ｆｒ１ｄｏ
ｖｉｃｈ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２３８．　３
９２１−Ｃダブリニー・ストラウス、ジャーナル・オブ
・ヒストケム・サイトケム（Ｗ　５ｔｒａｕｓ　＋　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＸＩｉａｔｏｃｂｃｍ。
Ｃ７ｔｏｃｈｅｍ、）　３０　、４９１−４９３　（１
９８２）Ｄ　米国特許４，５２１，５１１号明細書（Ｅ
ｎｚ）’Ｉｎｎ　ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｍｐａｎｙ
）　１９８５年６月４日発行Ｅ、ビー・チャンス、アー
ク・バイオケム・パイオフイズ（Ｂ　Ｃｈａｎｃｓ＋、
　Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、）　４
１　＋Ｆ　アイ・ヤマザキ　（Ｉ　Ｙａｍａｚａｋｉ　
）　、生物学に於けるフリーラジカル（”　Ｆｒｅｅ　
Ｒａｄｌｃａｌｓ　　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ’）■巻、
ダブりニー・エイ・プライオア編（Ｗ、　Ａ、ｐｒｙｏ
ｒ）　１アカデミツクプレス−二ｚ−ヨーク（Ａｃａｄ
ｅｍｉ　ｃ　Ｐｒｅ　ｉ３゜オフイズ・アクタ（Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈ７ｓ、　Ａｃｔａ）　７７゜４７
−６４　　（１９６３）。
Ｈｚス−ジエイ・タレパノｌツフ（Ｓ　Ｊ　Ｋｌｅｂａ
ｎｏｆｆ）　。
ジエイ・ビイオル・ケム（Ｊ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）
　　２３４　。
Ｊ　アイ・アビラム（Ｉ　Ａｖｌｒａｍ）、アーク・ビ
オケム・ビオフイズ（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏｐｂｙｓ）　２１２　＋Ｋ　エル・サソン等（Ｌ　
５ａｓｓｏｎ　ａｔ　ａｌ　、）　、アーク・ビオケム
・ビオフイズ　（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｔｏ
ｐｈｙｓ、）２１７．２５９−５３５　　（１９８２）
Ｌ　エル・アール・フォックス等　（Ｌ　ＲＦｏｘ浪、
ａｌ、）＋プラント・フイズイオロジイ（Ｐｌａｎｔ　
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇ）’）４３．４５４−４５６　　（
１９６８）Ｍ　エム°ハルマン等（Ｍ　Ｈａｌｍａｎｎ
　ｅｔ　ａｌ、）　、フォトケミストリー及びフォトバ
イオロジー（Ｐｈｏｔｏｃｈ師ｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｏ
ｔｏｂｉｏｌｏｇ’ｙ）　　３０．　１６５＝１６７　
（１９７９）Ｎ　ノー・アーンストロム＠　（Ｇ　Ａｈ
ｎ３ｔｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ、）＋アクタ・ケム・スカン
ド（Ａｃｔａ、Ｃｈｅｍ、　５ａａｎｄ）　１９゜ペル
オキシダーゼに触媒されるＤＰＤの化学発光酸化（ｃｈ
ｅｍｉｌ−１ｎｅｓｃｅｎｔ　ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）の
感度を増進するために、エンハンサ即ち６−ヒドロキシ
ベンゾチアゾール（欧州特許公開第８７９５９号。
１９８３年９月７日公開後にナショナル・リサーチ・デ
ベロップメント・コーポレーション（Ｎａｔｌｏｎａｌ
　ＲｅｓｅａｒｃｈＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ　：　ＮＲＤＣ）に譲渡）及び成る穆の
フェノール（欧州特許公開第１１６４５４号。
１９８４年８月２２日公開後にＮＲＤＣＫ譲渡）を反応
体に混合すればよいことは従来から知られている。
ペルオキシダーゼに触媒されるＤＰＤの酸化が所与の化
合物によって増進されるか否かを予見することはできな
い。例えばフェノール自体によって有意な増へは得られ
ず、従来技術ではフェノールが阻害剤であると指摘され
ている。これに関しテハ、アール・シー・エルグ−フィ
ールド（ＲＣＥｌｄｅｒｆｉｅｌｄ）編［複素環化合物
（Ｈｅｔａｒｏｃ）’ｃｌｉｃＣｏｍｐｏｕｎｄａ　）
Ｊ　＋ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ　
Ｗｌｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　、　Ｉｎｃ、）　、　６巻
、６９゜２２８〜２３０頁、２３０頁中段を参照された
い。
４−ハロフェノール類は強力なエンハンサであるが、４
−アミンフェノール、４−シアノフェノール及び４−メ
トキシフェノールはそうではない。
他にも同様の例が数多く存在する。
発明の要約 本発明は、成る種の芳香族アミンが２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン（ＤＰＤ）のペルオキシダー
ゼ触媒酸化の発光反応の感度を有意に増進させるという
知見に基く。
本明細書に於ける「増廊°、」なる用語は１発光反応（
ｌｕｍｔｎｅａｃｅｎｔ　ｒｅａｃｔｔｏｎ　）の全発
光量及び／又は発光反応信号（ｓｉｇｎａｌ）対パック
グラウンド（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　）比が、感度エン
ハンサを存在させない２．３−ジヒドロ−１，４−フタ
ラジンジオン／酸化剤／ペルオキシダーゼ系で得られる
値よりも大きいことを意味する。
本発明によれば、ペルオキシダーゼと酸化剤と化学発も
性２，３−ジヒドロ−１．４−フタ２ジンジオンとの間
で化学発光性反応を生起さ弦、反応によって発生した化
学発光を測定又は検出する方法に於いて、反応が一般式 で示される芳香族アミンの存在中で生起され、前記一般
式（１）に於いて記号Ｒ（即ちＲ，Ｒ’、Ｒ”。
ＲＪ　、　Ｒ４、ＢＳ及びＲ６）が以下の（ａ）〜（ｊ
）、即ち、Ｎ（ＣＨｓ：ｈ ＮＨ，ＮＨ。
シクロへ年、ンル、又は炭素原子１〜４のアルキルもし
くはアル；キシ （ｃ）　　Ｒ”　、　Ｒ”とＲ４とが一緒に縮合多環式
系（ｄ）　　Ｒ”とＲ４が一緒に縮合環又は縮合環系（
ｆ）　　Ｒ”＝　ＮＨｚでＲ′＝１ Ｏ ＮＨｚ （ｈ）　　Ｒ３＝　Ｃｘ１Ｊｓ （ｉ）　　Ｒ”　”　Ｒ””　ＣＨ３及びＵ）　　Ｒ’
　”　　Ｒ’　＝　ＣＨｓのいずれかを示しており、各
場合に残りの記号Ｒは全て水素を示しておシ、縮合環（
ｆｕｓｅｄ　ｒｔｎｇｓ）は式（１）と同じ配置の意味
を有することを特徴とするアッセイ方法が提供される。
本発明は更に、ＤＰＤとペルオキシダーゼと芳香族アミ
ンを含むアッセイ用キットを提供する。
好適具体例の説明 化学発光性２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオ
ン（ＤＰＤ）は遊離ＤＰＤ又は結合ＤＰＤのいずれでも
よく、化学発光反応で励起状態になり光を放出して非励
起状態に戻れるような形状であればよい。
好ましい２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン
は一般式（２）で示される〇 〔式中、ｚｌはアミノ若しくは置換アミノでｚ２゜ｚ３
及びｚ４の各々がＨ，置換もしくは未置換のｃｊ＋Ｃ６
アルキル、置換もしくは未置換のＣｊ−Ｃ６アルケニル
、ヒト０ロキシル、Ｃ１−０６アルコキシル、カルボキ
シル、アミノもしくは置換アミン、又は、２　がアく）
もしくは置換アミンで２１．ｚ３及びｚ４の各々がＨ１
置換もしくは未置換のＣ１−Ｃ６アルキル、置換もしく
は未置換のＣ，−Ｃ６アルケニル、ヒト９０キシル、Ｃ
１−Ｃ６アルコキシル、カルボキシル、アミンもしくは
置換アミノ、又はｚｌ　とｚ２との組合せがベンゾ基の
アミノ誘導体もしくは置換アミノ誘導体でｚＪとｚ４　
との各々がＨ，、置換もしくは未置換のＣｊ−Ｃ，５ア
ルキル、置換もしくは未置換のＣ４−Ｃ６アルケニル、
ヒト１０キシル、Ｃ４−Ｃ６アルコキシル、アミノもし
くは置換アミノを示す。（本明細書に於いて「置換アミ
ノ」なる用語は例えば、アルキルカルボニル置換アミノ
即ち、アミド°、並びにアミノアルキル及びアミド９ア
ルキル置換アミンを意味する。）本発明のアッセイでの
使用が特に好ましいＤＰＤはルミノール及びイソルミノ
ールである。
本発明の発光反応（Ｉｕｍｆｎｅｓｃｅｎｔ　　ｒｅａ
ｃ　−１１ｏｎ）に於いて化学発光性ＤＰＤを如何なる
形態で使用するかは考慮中のアッセイのタイプによって
左右される。例えば有機発光（ｏｒｇａｎ。
ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）又は有機発光測定（ｏｒｇａ
ｎ。
Ｉｕｍｉｎｏｍｃｔｒｉｃ）イムノアッセイの如きアッ
セイの場合にはフタラジンジオンがうばルとして使用さ
れ、化学発光性ＤＰＤは２．３−ジヒドロ−１，４−フ
タラジンジオンの置換アミノ誘導体であり、このアミノ
基がタンパク質、ホルモン、ノ１ブテン、ステロイド９
、核酸、代謝物質、抗原又は抗体の如きリガンドに結合
する。アミノ基はリガント°に直結してもよく又は架橋
アーム（ｂｒｉｄｇ−ｉｌｇ　　ａｒｍ）を介して結合
してもよい。適当な架橋アームは当業者によく知られて
おり、例えば英国特許公開第２００８２４７号及び米国
特許第４１０４０２９号の記載より明らかである。好ま
しい架橋アームは例えば、ヘミサクシネート、ヘミグル
タレート、ヘミマレエ・−ト、カルボキシルメチル、グ
ルクロン酸化合物、メルカプトアセテート、及びカルボ
キシルユ・チルの誘導体から誘導される。公知の任意の
適当な手順でアミノ基をリガント°に結合させ得る。こ
れら手順についても英国特許公開第２００８２４７号及
び米国ｌ特許第４１０４０２９号に記載されている。好
ましい結合手順では混合無水物、カルボジイミド及び／
又は活性エステルを使用する。
フタラジンジオンをうイルとして使用するアッセイでは
、リガント９に結合したアミ７基をもつ２゜３−ジヒド
ロ−１，４−フタラジンジオンの置換アミン誘導体が適
当な化学発光性ＤＰＤとしてこれらのアッセイで使用さ
れる。特に好ましい物質は５−アミノ−２，３−ジヒド
ロ−１，４−フタラジンジオン（ルミノール）と６−ア
ミ７−２゜３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン（
イソルミノール）とであり、いずれもアミン基がリガン
ト９特に抗体に結合している。
フタラジンジオンをラベルとしては使用しないアッセイ
の場合、化学発光性ＤＰＤは通常、溶液中ζこ遊離して
いるか又はマトリックスに固定されている。この場合に
も特に好ましいＤＰＤはルミノール及びイソルミノール
である。
本発明のアッセイでは上で定義した芳香族アミンのいず
れを使用することも可能である。
しかし乍ら発明者等の知見によれば、上記以外の多数の
芳香族アミンははルオキシダーゼ触媒ＤｐＤａ化を有意
に又は有用な程度に増進させない。このような非エンハ
ンサ又は微弱エンハンサとしては例えば、アニリン自体
、４−ハロアニリン（ハロゲン原子：（Ｊ、Ｂｒ、Ｉ）
、４−デシルアニリン、２，４−ジクロロアニリン、２
７クロロー４−メチルアニリン、３−ハロアニリン（ハ
ロゲン原子＝Ｃｊ、Ｄｒ、Ｉ）、３−メトキシアニリン
、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン及びＮ−二チルアニリン、
１−アミノアントラセン及びピリジンがある。４−アミ
ノアニリン（ｐ−）二二レンジアミン）は実際に阻害剤
である。（これらの物質に関する結果は以下の手順でテ
ストして得られた。
エンハンサのＤＭＳＯｍ液Ｃｘｒｖ／ゴ）を調製した。
種々の量の溶液（５，１０又は２０μ））を、過酸化水
素（３０重ｆｌ／容ｔ％）（３１μ））を含むトリスバ
ッファ（０，１ｍｏｌ／７．ｐＨ８，５Ｘ１００ｍ／）
中のナトリウムルミノール（２５ｍ９）と１０００倍希
釈の、西洋ワサビ／はルオキシダーゼに結合した抗体１
０μＩとの混合物９５０μＬに加えた。エンハンサの各
殴度毎に、ウルフ→ノ゛ン、リサーチ、ラボラトリーズ
Ｗｏｌｆｓｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ　−ｒａ
ｔｏｒｉｅｓ　　製のルミノメータで発光量を記録した
。同時に各エンハンサ毎に、はルオキシダーゼ結合体を
含有しないブランク（ブランク１）とイルオキダーゼ結
合体とエンハンサとの双方を含有しないブランク（ブラ
ンク２）との発光量を記録した。） 従って本発明の技術的背景が、予見できない重要な要素
を含んでいたことは明らかであろう。このような理由か
ら本発明に於けるエンハンサの定義は、実施例の表３で
示す実験結果に基くものである。
好ましい芳香族アミンエンハ゛／すは、Ｎ、Ｎ。
Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル（ンジジン、４−（ンジルオ
キシアニリン、４−メトキシアニリン、及び３−アミノ
−フルオラントレンである。
一般的に、２．３−ジヒト９０−１，４−フタラジンジ
オン特にルミノールの発光反応を触媒するいかなるにル
オキシダーゼ（ＦＪＣＡｌ、１１．１゜７）も本発明の
発光反応に使用し得る。例えば植物の゛はルオキシダー
ゼが挙げられる。好ましい酵素は西洋ワサビはルオキシ
ダーゼである。特別な使用ｔこ適している。例えば標準
アッセイ用ＨＲＰ即ちｇＬＩＳＡアッセイ用抗体を椋識
するために［１的に使用されるＨＲＰが適当である。し
かし乍ら発明者等の実験によれば、酸性ペルオキシダー
ゼイソ酵素、例えばシグマタイプ■及び市は有意な増感
を生じ得ないことが判明した。これらのエッチリック（
ｅｓｏｔｅｒｉｃ　）な物質は、本発明で有用な普通の
ＨＲＰの１種たるシグマタイプ’ｌ□Ｔの何倍もの価格
である。
本ＭＭＢｙ中の「はルオキシダーゼ」なる用語は、マイ
クロはルオキシダーゼ、ヘモグロビン、ヘマチン及びミ
オグロビンを包含しない。
本発明の発光反応でのはルオキシグーゼの形態は考慮中
のアッセイのタイプに従属する。ペルオキシダーゼをラ
ベルとして使用するアッセイ特にイムノアッセイの場合
、はルオキシダーゼはタンパク質、ホルモン、ハプテン
、ステロイド９、核酸、代謝物質、抗原又は抗体の如き
リガンドに結合（コンジュゲート）するであろう。一般
にはルオキシグーゼは架橋アームを介してリガンドに結
合するであろう。架橋アーム及び結合手順としては公知
の適当なものを使用するとよい。
ペルオキシダーゼをラベルとして使用するアッセイ以外
のアッセイの場合には、酵素は溶解状態又はマトリック
スｌζ固定された状態の遊離形でありリガント９に結合
しない。
本発明の発光反応では、ＤＰＤを励起してＤＰＤが発光
反応により光を放出するように、はルオキシダーゼ及び
ＤＰＤ特にルミノール又はイソルミノールと反応する酸
化剤を使用してもよい。特に好ましい酸化剤は過酸化水
素及び過ホウ酸塩のイオンである。
２．３−ジヒト９０−１．４−フタラジンジオン又はは
ルオキダーゼをリガン白こ対するラベルとして使用する
アッセイ特にイムノアッセイに於いては、概して特許薬
品ソースから得られる既知量の酸化剤が反応混合物に添
加されるであろう。しかし乍らそれ以外の成る種のアッ
セイでは、酸化剤、一般には過酸化水素の存在量は未知
であるつ殿後者のタイプのアッセイでは、基質から酸化
剤への転換に関与する物質、特にグルコースオキシダー
ゼの如き酵素がうばルとして使用されるであろう。従っ
てこの場合には、本発明の発光反応は発光反応混合物中
の酸化剤一度を測定して標識されたりガントを定量する
ために使用されるであろう。
本発明の発光反応による発光量は、主としてペルオキシ
ダーゼ、酸化剤、感度エンハンサ及び化学発光性ＤＰＤ
の選択に依存するが、同時に、温度、ｐｇ、　ｔに薬α
度、混合速度及び測光方法の如き副次的要因の影響を受
ける。本発明の系の感度を最大ｌこするためには、でき
るだけ高いシグナル対バックグラウンド比をもつ最大発
光量が得現的に且つ測定容易に得られるように上記の副
次的要因を調整する必要がある。
一般には、はルオキシダーゼの酵素活性即ち触媒活性と
、反応の速度論と、使用装置と、シグナル対バックグラ
ウンド比と所望のΔ＆度とを総合的ｌこ配慮して条件を
選択する。
発明者等の知見によれば、最適結果を得るためには、温
１現１０〜５０℃及びｐＨ６〜１０特に７〜９の範囲の
適度な条件下で本発明の発光反応を実施するとよい。本
発明方法で使用される適当なｇ（ＪＩＨ４物質は、リン
酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２−
アミノ−２−メチル−１゜３−プロパンジオール、酢酸
塩、炭酸塩及びホウ酸塩である。
一般には、被測定物質以外の発光反応混合物中の試薬の
濃度は一定に維持される。可変要因としては例えば、標
識リガント９、ラベル産物、酸化剤又は未結合はルオキ
シダーゼのσ度等がある。
本発明の発光反応での使用には以下の試薬味度が特に好
適である。
イルオキシダーゼ　　　　０１μｇ　−５０００η／！
液化剤　　　　　　　　ｉｏ７ｔｍｏノー３００ｍｍｏ
ｌ／７化学発光性Ｄ　Ｐ　Ｄ　　　　　Ｏ，５μｍｏ　
ｌ　−２００ｍｍｏ　ｌ／ｚ−ｉ１４Ｊｆｆ１７ミン１
７ハ７す０．１μｍ”−１００ｍｍｏｌ／ｚ本発明の発
光反応を実施するためには、４８吋の主要試薬のいくつ
かを（但し少くともｉ＋ｉｉｉを省く）サンプル試験管
に入れる。次に、省いておいた（１種以上の）主要試必
を試験管に加えて発光反応を開始させる。発光量を、元
増浩管（ｐｈｏｔｏ−ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）の如き標
準測定装置で定−１ｌ′Ｃシ、該装置の信号を、記録装
置、オシロスコープ又は計数装置に表示又は記録すると
よい。成る場合には光を肉眼で観測してもよく又は感光
板に記録してもよい。しかし乍ら好ましくは、英国特許
出願公開ｇｚｏｚｓＧｏｓ号に記載のタイプのルミノメ
ータを用いて光量を測定する。
本発明の発光反応は、主として３種類のイムノアッセイ
に使用され得る。各アッセイは、リガント９に結合され
るラベルの１類によって分類されている。即ちう（ルは
、 （ａｌ２．３−ジヒト９０−１，４−フタラジンジオン
のアミン誘導体又は置換アミン誘導体、（ｂｉ　　イル
オキシダーゼ、及び、 ｔｅｌ　　上記（ａｌ）及び（ｂＪに含まれない物質で
一般的には、基質を本発明の発光反応で測定できる物質
（通常は過酸化水素又ははルオキシダーゼ）に転換させ
る酵素特にグルツースオキシダーゼ、に分類できる。ラ
ベル（ａ）に於いてはアミノ基がリガント９に結合する
。
上記イムノアッセイｔこ於いては、被検定物質を標識（
１ａｂｅｌ　）すること又は該物質に対する抗ｌこも第
均質（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ　）にもなり得る。前者の
場合には血清の如き複合流体を分析し得るが、後者の場
合には予備的抽出又はａ製ステップが必要である。
不均質及び均質な発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　）又
は発光測定（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ　）イムノアッ
セイの代表的な種類を以下に挙げる。
１、不均質な発光又は発光測定イムノアッセイこの種の
イムノアッセイでは被検定物質をその抗体と反応させる
。次に遊離抗体と結合抗体とを分離する。抗体、被検定
物質又は分離後の遊離抗体もしくは結合抗体と反応し得
る別の分子を標識することによって反応を定量する。
２、競合的不均質発光イムノアッセイ この場合には未知量の被検定物質とラベルに結合した既
知量の被検定物質と限定された既知量の該物質に対する
抗体とを混合する。標識物質（ｌａｂｅｌｌｅｄ　５ｕ
ｂｓｔａｎｃｅ　）と非標識物質との間で抗体に対する
競合反応が生じる。標識物質及び非標識物質の各々と抗
体との複合体を遊離状態の標識物質及び非標識物質から
分離する。
抗体に結合した標識物質の量は検定溶液中の非標識物質
の量と相関関係がある。これらの量を測定するには、抗
体に結合したラベルの螢を測定するか又は残存する遊離
標識物質の量を測定するとよい。うＲルとしてペルオキ
シダーゼを使用し抗体が固相即ちガラス試験管の壁に結
合するこの種のアッセイのいくつかの例は英国特許公開
第２０４４９２７号に記載されている。
この菰のイムノアッセイでは被検物質を先ずその非ｅｌ
Ｊ６＋２抗体に結合し、次にこの抗体をプラスチックの
ｙＯさ固相担体に結合する。次に（抗体と物質との）複
合体を標識抗体で処理する。得られた固体複合体中の標
識抗体を分析するために、固体複合体を溶液から分離し
１次に、分離固体複合体中のラベルの存在量を測定する
か、又は、溶液中に溶解している残留標識抗体中のラベ
ルの存在量を６川定した。
４、均質発光又は発光測定イムノアッセイこれは、２，
３−ジヒト９０−１．４−フタラジンジオンのアミン誘
導体又は置換アミノ誘導体をラベルとして開用するイム
ノアッセイに使用される。この方法は、遊離状態の被検
Ｆ　ａ４物・イ（又はその抗体が放出する光は、結合状
態の被検標識物質（又はその抗体）が放出する光とは異
なる強度又は波長を有することを利用している。
１つの例に於いては、（プロプステロン−イソルミノー
ル誘導体）結合体とｍｉ触媒（ｈｏｅｍｃａｔａｌｙｓ
ｔ　）と過酸化水素との反応によって放出される光度は
、抗プロプステロンＩｇＧの存在中で生じる同じ反応に
よって放出される強度より低いことが知見された。
従ってこのアッセイに於いては、先ず未知のプロゲステ
ロンサンプルを既知量の抗プロゲステロンＩｇＧと共に
インキュ（−トした。平衡に到達した後に、既知量のプ
ロゲステロン−イソルミノール誘導体結合体を加え、続
いて既知量の血液触媒と過酸化水素とを加えた。放出さ
れた光の綺を測定し、これにより未知サンプル中のプロ
ゲステロンの存在量を標ｆｓ曲線から決定した。（未知
サンプル中のプロゲステロンの存在量が多い程、平衡後
に残る遊離ＩｇＧが少ないので、発光反応で放出される
光が少ない。〕 上記の如くすれば分離ステップを要せずにプロゲステロ
ンを定量し得る。
上記イムノアッセイのいずれに於いても、本発明の発光
反応を用いて定量、検出又は位置決定（ｌｏｃａｔｉｎ
ｇ　）　（厳密には位置決定は検出の１種である）ステ
ップを実施し得る。
上記イムノアッセイで使用される抗体は、市販製品を購
入してもよく又は公知の免疫学的方法で調製してもよい
。抗体は抗体の複合混合物の形状でもよく又は１種以上
のモノクローナル抗体モもよい。一般には抗体の必要量
は極めて少なく、この抗体を活性ζこ適したｐ　Ｈ、イ
オン濃度及び温度条件で維持する。
本発明の発光反応を利用するイムノアッセイに於いてそ
の抗体を使用し得る物質の例を非網羅的に以下に列挙す
る：インシュリン、アルファフェトプロティン及びフェ
リチンの７口き・タンパク質。
生長ホルモン、傍甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、
黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン。
副腎皮質刺激ホルモン、グルカゴン、プロラクチン及び
カルシトニンの如きホルモン、エストラジオール、プロ
ゲステロン及びコルチゾールの如きハプテン／ステロイ
ド°、′）コ９キシンの如き薬剤。
細胞表面抗原及び癌胎児性抗原の′ｇＤき抗原、おたふ
くかぜウィルス抗体、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）
、ウサギＩｇＧ、ヒツジＩｇＧ、テンジク不ズミエｇＧ
、ロバｒｇａ、ヒト免疫グロブリンＥ及びＭのクロき抗
体。
本発明の発光反応は上記のイムノアッセイ以外のアッセ
イζこ於いても使用でき、例えば以下の場合がある。
アッセイ このアッセイでは、固体エラスチン−（ルオキシダーゼ
結合体を種々の量の酵素エラスターゼと共にインキュ（
−卜する。所定期間の経過後、未反応結合体を遠心除去
し上清の未結合はルオキシグーゼを定量する。
上７ｆｔ中の未結合ペルオキシダーゼの存在量が被検サ
ンプル中のエラスターゼ活性の指針である。
このアッセイでは、固定した合成はプチト９基質Ａｆｆ
ｉｇｅｌ　　Ｉｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−
イソルミノールを種々の量のタンパク分解酵素で処理す
る。所定期間の経過後、未反応基質を遠心除去し、上清
ノイソルミノールを定量する。Ｊ：ｉ’ＪＷ中のインル
ミノールの存在量が被検サンプル中のタンパク分解酵素
活性の指針である。
オキシダーゼとを用いるグルコースアッセイこのアッセ
イでは、グルコースオキシダーゼと（ルオキシダーゼと
を担体、例えばセファロース５ｅｐｈａｒｏｓｅ　又は
プラスチックチューブに同時固定する。これに、ルミノ
ールと感度エンハンサとの溶液を加える。最後にグルコ
ース溶液を加えて、発光量を記録する。発光量は溶液中
のグルコースの量に直接関連する。
４、標識ＤＮＡのアッセイ ＤＮＡをビオチンで標識する公知方法に於いて１、アビ
ジン又はストレプトアビジンの如き適当な結合リガンド
をはルオキシダーゼで標識し、ペルオキシダーゼを本発
明方法で定量する。
また、別の方法を用いてペルオキシダーゼで標識された
ＤＮＡに本発明を使用することも可能である。これに関
してはＰＣＴ出ＡＩｊｔ第８４１０３５２０号（ニー寺
ディー・ビー・マルコーム（Ａ、Ｄ、Ｂ。
Ｍａｌｃｏｌｍ）等）を参照されたい。
本発明のアッセイは主として、臨床研究所及び／又は病
院で使用されるであろう。これらの研究所及び／又は病
院では所与のアッセイ手順で使用すべき材料がアッセイ
キットとして入手できるのが便利であろう。このような
キットは、ＤＰＤと芳香族アミンエンハンサ（！−堅シ
ルオキシダーゼを含む以外に、酸化剤を含んでいてもよ
い。し力）し乍ら多くの場合、この材料は別個ｌこ用意
されてもよく、又は被検定物質であってもよい。
好ましくは、はルオキシダーゼと酸化剤と感度エンハン
サと化学発光性ＤＰＤとの各々は、本発明のアッセイで
の使用が好ましい例として前記に挙げた物質のうちから
選択される。本発明のアッセイ用キットの特に好俊しい
１つの具体例では、ペルオキシダーゼ酵素と化学発光性
ＤＰＤとの少くとも一方が被検定物質に対する抗体に結
合している。
また任意に、アッセイキットが、既知量の被検定物質を
各々含有する１種以上の標準溶液を含むか、及び／又は
、１種以上の好ましい緩衝溶液を含んでいてもよい。更
にアッセイ用キットが、アッセイ実施中に放出される光
量を測定する装置での使用に適した反応容器を含むのが
有利である。
また、アッセイ用キットが試薬を確実に混和させるため
の攪拌デバイスを備えていてもよい。
（以下余白ン ′実施例 以下に本発明の実施例を示すつ 材料及び方法 試薬 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＡ　Ｆ　
Ｐは、ダコ・プロダクツ、マーシャ・ブロジー１１−リ
ミテッド（１）ａｌｃｏ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　、Ｍｅｒ
ｃｉａＢｒｏｃａｄｅｓ　　ｉ、ｔｄ　）　、プロケー
トハウス、ピルフォードロード、ウェストバイフリート
、ウェイブリッジ、サーり州（Ｂｒｏｃａｄｅｓ　Ｈｏ
ｕｓｅ、ｐｙｒｆｏｒｄＲｏｕｄ　、　Ｗｅｓｔ　　Ｂ
ｙｆｌｅｅｔ　、Ｗｅｙｂｒｉｄｇｅ　３ｕｒｒｅｙ　
）英国、の製品である。
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を検定するための酵素イムノ・
アッセイ用キットは、アボット研究所（Ａｂｂｏｔｔ　
１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｔｄ　）　、診断部（１
）ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　［）ｉｖｉｓｉｏｎ　）　、
ベーシンストーク（ＢａｓｉｎｇｓｔｏＫａ　）　、英
国、の製品である。
ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−
フタラジンジオン）ドイツルミノール（６−アミノ−２
，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）と１は、
シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ（：：ｂｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏ　、　）　、プール、ビーセント。
（ｐｏｏｌｅ、１）ｏｒｓｅｔ）　、英国の製品である
っまた、ルミノールのナトリウム塩の調整にｉＪ　／　
Ｎ　ｈＱ−１３Ｉｎ）等、アナル、レタ（ＡｎａｌＪ、
ｅｔＬ　）　、　］　９７９　。
ユ、（ｓ３ｓ）、の方法を用いた。
式中の２１と２２とか一緒に１つのジメチルアミノ置換
ベンゾ基を示しＺ３＝Ｚ’＝Ｈを示す式（２）の化合物
たる７−シメチルアミノナフタレンー１１２−ジカルボ
ン酸ヒドラジドはベーリンガー、マンハイム（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ　ｌｙｌａｎｎｅｉｍ　）夷である。
Ｎ　−（、６−アミノブチル）−Ｎ＝エチルイソルミノ
ールはエル・ジー・ビー−フィンランド（ＬＫＢ　Ｆｉ
ｎｌａｎｄ　）　Ｈである。
芳香族アミン類は全てアルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ　（：：ｈｃｍｉｃａｌ　　（ｏ、）、［であ
る。
分析装置 冥鬼例１〜２４では化学発光反応に、１０頭×ｌｏｗの
４ｄ容の１吏い捨てプラスチックキュベツト（ダブリュ
・サーステツドーリミテッド（Ｗ　　５ａｒｓｔｅｄｔ
　ｌｔｄ、）　、ライセスタ−（Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ　
）、ＬＥ３　、ＩＵＱ、英国）を用いた。
放出光量の測定には、前出のルミノメータ（カーテル（
Ｃａｒｔｅｒ　）等、英国特許出願公開第２０２５６０
９号）を改造して光増倍管のホトカソードの前方に複数
個のキュベツトを正確に且つ再現的に連続配置できるよ
うにしたものを用いた。
結果を、高速電位差曲線記録装置（タイプ２Ｍ８２０２
；フイリツプス（ｐｈｉｌｉｐｓ　）　、エインドホー
ベン、ネザーランド（Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ　。
Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ　）　；完全偏向時間０．２５
秒未満）に表示したつ 癌胎児性抗原アッセイの場合、エルアイビー（エキツブ
メント・アンド・サービス）リミテッド（Ｌ　Ｉ　Ｐ　
（ｇｇｕｉｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　）
　Ｌｔｄ　、）、シ′ンプリー、ウェスト・ヨークシャ
、　（５１ｘｉｐｌｃｙＷｅｓｔ　Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ
　）　［の５５ｍＸ］］ｓｕ＋＋の途明ポリスチレン丸
底管で化学発光反応を実１１角した。
発光反応の自動的開始と発光量の自動的測定とを行なう
ために、ラボラトリラム・プロフェッサー・ドクターｅ
バートホールド（ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍｐｒｏｆ　
Ｄｒ　Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　）　、ワイルドハ’７　ト（
”ｒＶｉ　Ｉｄｂａｄ　）　、　ｆｉドイツ、表のオー
ト−バイオルーマット（Ａｕｔｏ＝８＋ｏｌｕｍａｔ　
）　Ｌ　Ｂ　”Ｊ　５０ルミノメータを使用した。この
装置は光子カウント装置であり、４８にアップル■コン
ピュータ（Ａｐｐｌｅ　ＵＣＯｍｐｕｔｅｒ　）で制御
される。
メチルベンジジンとを使用するペルオキシダーゼの元元
アツセイ ナトリウムルミノール（５０・η）と過酸化水素（６２
μｌ　、　３０　ｇ（ｉ、（／容量％）とを２００−の
トリスバッファ（０，１Ｍ　、　ｐＨｓ、ｓ　）に加え
た０このｔａ液を使用以前に約０．５時間静置し、光か
ら完全にｌ′ｉシした。１０μｔのウサギ抗Ａ　Ｆ　Ｌ
）　−１４几ｐ（＋ｏ００＠希釈）をキュベツトに入れ
、０．９＋＋＋ｌのルミノール／　Ｈ２０２試某を加え
た。次に２０μｔのＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル
ベンジジン（ジメチルスルホキシド］を中に４．５４モ
ル）を反応混合物に添加するか、務加以前に得られた発
光前を先ず記録し、添加以後の増進された光出力を同様
に記録して１Ｊ号の強度＞９７加を測定した。
バックグラウンドの１直１こ対するＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’
−テトラメチルベンジジンの影響を測定するためにウサ
ギ抗ＡＦＰ−Ｈ几Ｐを入れないで上記手順を株返した。
シグナル及びシグナル対バックグラウンド比の増加を１
ｌｌ１１定し、その結果を表３に示すＯシグナルの増加
がより重要なパラメータであると考えられるつ 実施例２−２Ｏ Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルベンジジンを別の芳
香族アミンに代えて実施例１の手ｊｊＵを繰返した。シ
グナル対バックグラウンド比のｈ￥Ｊ　７ＪＤをＪｌｌ
ｌ　矩しその結果を表３に示すっ 比較実施例 発光反応混合物に感度エンハンサを全く添加しないで実
施例１の手順を繰返した。結果を表３に示す。左端の文
字は、前出の式（］）で示される化合物中の前記に定義
した記号几の意味を示す。
実施例２１ １００−のトリスバッファ（０，１Ｍ、　ｐＨ８，５）
に入れたイソルミノール（２４Ｗ９）の保存浴液と１０
０−のトリスバッファ（０，１Ｍ、ｐＨ８，５）に入れ
た過酸化水素（４５０μｔ、３０重１α／谷量％）の保
存浴液とを調製した。キュベツトに以下の試薬を入れた
；５０μｔの保存インルミノール試薬と５０μｔの保存
Ａｆｎ化水水とＪＯμｔのウサギ抗ＡＦＰ−）１几Ｐ（
１０００倍希釈）とジメチルスルホキシドに入れた１０
μｔのＮ、Ｎ。
Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルベンジジン（’ＴＭＪＪ）又
は４−ベンジルオキシアニリン（４，５４ｍｍｏｔ／ｌ
）試薬を混合し、０．９ｍ／のトリスバッファ（０，１
Ｍ。
ｐＨ８，５）を加えて反応を開始させた。以後の発光量
を測定した。コントロール実験では、アミンの代りに１
０μｔのＤ　Ｍ　Ｓ　Ｏを用いて上記手順をａｉしたＯ
ＴＭＢ−ヌは４−ベンジルオキシアニリンで増感させた
反応はコントロールに比較してかなりのシグナルを示し
た。
実施例２２ イソルミノールをＮ−（６−アミノブチル）−Ｎ−エチ
ルイソルミノールに代えて実施例２１の手順を繰返した
。
４濾？１１２３ イソルミノールを７−シメチルアミノナフタレンー」、
２−ジカルボン戚ヒドラジド（９−ツメチルアミン−２
，３−ジヒドロベンゾ（ｆ）フタラジン−】、４−ジオ
ン）に代えて’Ｍ　ＪＡＭ　１ｙ１４２１の手順を繰返
した。
央Ｍ例２４ 過酸化水素を過ホウ酸ナトリウムに代え、イソルミノー
ルをルミノールに代えて実ｔａｙす２１の手順を繰返し
た。
実ＩＡｉｆ１２２〜２４の各々に於いては、Ｔ　Ｍ　Ｂ
又は４−ベンジルオキシアニリンの添加により発光量の
増加が礪誤された。
実施例２５−癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のアッセイ製造者
の指示通りにアッセイを実部した。酢Ｉ疲ナトリウムバ
ッファ（０，２ｍｏｌ／４ｐＨ５，０。
レイのウェルに冷加した。モルモットで産生じた抗−Ｃ
ＥＡでコートされた１つのプラスチックビーズを蒸留水
で況って各ウェルに加えた。トレイを徳やかに叩いてビ
ーズ面に付着した気泡を完全に除去し、蓋をして４５℃
の水浴中で２時間インキュベートした。次にサンプルを
吸引し、各ビーズを蒸留水で洗った。ｐ（５Ｘ２ｍｊ）
。ヤギ抗ヒトＣＥＡ−１−Ｉ几Ｐ結合体（２００μｔ、
タンパク質安定剤と０．０１％のチメロサールとを金回
するトリスバッファ１−中で約０．０５μｔ／ａｔ）を
各ビーズｌζ加え、次にトレイを前記同様に処理して４
５℃で２４ｒｄｌインキユベートした。各浴液を吸引後
、ビーズを蒸留水で洗い（５ｘ２ゴ）、（５５μ５Ｘｌ
Ｉ園）のポリスチレン管に移し、再に洗ったＩ（２Ｘ４
ｍｊ）。次にＴＭＢをエンハンサとして用い本発明のア
ッセイで結合したＨ几Ｐ結合体を定量した。
容管に０．５−のトリスバッファ（０，０５ｍａｔ／Ｌ
＋）Ｈ８，Ｏ）を加えた。次に０．５ｍｔのルミノール
／過酸化水素／ＴＭＨ浴液を注入してオート−バイオル
ーマット（Ａｕｔｏ−Ｂｉｏｌｕｍａｔ　）ルミノメー
タで発光反応を自動的に開始させたつこの浴ｌ没は、ル
ミノール（２，ｓ　ｍｍｏｔ／ｌ　）と過酸化水素（５
゜４ｍｍｏｔ／ｌ）とを含む】００−のトリスバッファ
（０，０５ｍｏｂ／Ｌ　、　ｐ　Ｈ８，０）溶液に１　
ｍｔのＴＭＢ溶液（ＤＭＳＯ中で０．５キ／−）を加え
て予め調製しておく。
発光反応の開始以後、各ビーズ毎に（反応開始から０〜
１８０秒までの積算光端を自動的にｎ「：録したつその
結果を表４に示す。
実施例２６ ＴＭＢ溶液を濃度２．５ｔｑ／ｍｔにして実施例２５の
アッセイを繰返した。結果を表４に示す。
実施例２７ ＴＭＢ溶液を濃度５．０η／　ｍｚにして実施列２５の
アッセイを繰返した。結果を表４に示す。
実施例２８ ＴＭＢＩ液を加えないで＊流側２５のアツセイを、ｇ！
ｌ：返した。結果を表４に示すつ一ロｃｏ＋５の［Ｆ］
すωヘリロロ ！ｒ　　寸　　　　　　！　　ｑコ　　寸　　０コ　　
　　　　ｎ　　ロ　　ω　　・寸−の　　　−へ　　　
−へ Ｃト ヘヘ

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ペルオキシダーゼと酸化剤と化学発光性２，３−
    ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンとの間で化学発光
    反応を生じさせ、これにより発生した化学発光を測定又
    は検出して行なう発光又は発光測定アッセイに於いて、
    前記反応が一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（１） で示される芳香族アミンの存在中で行なわれ、前記一般
    式中の記号Ｒ（即ちＲ、Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾
    ４、Ｒ＾５及びＲ＾６）が以下の式（ａ）〜（ｊ）のい
    ずれかを示しておりそれ以外のＲ＾が全て水素であり、
    式（ａ）〜（ｊ）に於ける縮合環が式（１）と同じ配置
    の意味で示されており、及び式（ａ）〜（ｊ）は（ａ）
    ▲数式、化学式、表等があります▼、 （ｂ）Ｒ＾４＝▲数式、化学式、表等があります▼、▲
    数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表
    等があります▼ シクロヘキシル、又は炭素原子１〜４のアルキルもしく
    はアルコキシ、 （ｃ）Ｒ＾２とＲ＾３とＲ＾４が一緒に縮合多環式系▲
    数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式、
    表等があります▼を示す、 （ｄ）Ｒ＾３とＲ＾４とが一緒に縮合塩又は縮合環系▲
    数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式、
    表等があります▼を示す、 （ｅ）Ｒ＾３とＲ＾４とが一緒に縮合環系 ▲数式、化学式、表等があります▼を示し且つ Ｒ＾５とＲ＾６とが一緒に縮合環▲数式、化学式、表等
    があります▼を示す、（ｆ）Ｒ＾２＝ＮＨ＿２及びＲ＾
    ４＝▲数式、化学式、表等があります▼、（ｇ）Ｒ＾２
    ＝Ｒ＾６＝ＣＨ＿３及びＲ＾４＝▲数式、化学式、表等
    があります▼、（ｈ）Ｒ＾３＝Ｃ＿２Ｈ＿５、 （ｉ）Ｒ＾２＝Ｒ＾４＝ＣＨ＿３及び （ｊ）Ｒ＾３＝Ｒ＾４＝ＣＨ＿３、 で示されることを特徴とする発光又は発光測定アッセイ
    。
  2. （２）化学発光性２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジ
    ンジオンが一般式（２） ▲数式、化学式、表等があります▼（２） 〔式中、Ｚ＾１はアミノ又は置換アミノを示しＺ＾２、
    Ｚ＾３及びＺ＾４の各々がＨ、置換もしくは未置換のＣ
    ＿１−Ｃ＿６のアルキル、置換もしくは未置換のＣ＿１
    −Ｃ＿６のアルケニル、ヒドロキシル、Ｃ＿１−Ｃ＿６
    のアルコキシル、カルボキシル、アミノもしくは置換ア
    ミノを示すか、又は、Ｚ＾１とＺ＾２とが一緒にベンゾ
    基のアミノ又は置換アミノ誘導体を示し、Ｚ＾３及びＺ
    ＾４の各々がＨ、置換もしくは未置換のＣ＿１−Ｃ＿６
    のアルキル、置換もしくは未置換のＣ＿１−Ｃ＿６のア
    ルケニル、ヒドロキシル、Ｃ＿１−Ｃ＿６のアルコキシ
    ル、カルボキシル、アミノ又は置換アミノを示す〕で示
    されることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
    アッセイ。
  3. （３）化学発光性２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジ
    ンジオンがルミノール又はイソルミノールであることを
    特徴とする特許請求の範囲第２項に記載のアッセイ。
  4. （４）ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼ
    であることを特徴とする特許請求の範囲第１項から第３
    項のいずれかに記載のアッセイ。
  5. （５）ペルオキシダーゼが分析物中に遊離形又は結合形
    で存在しており、ペルオキシダーゼの有無又はその量は
    夫々、化学発光の検出又は測定によつて推定されること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項から第４項のいずれ
    かに記載のアッセイ。
  6. （６）芳香族アミンが、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメ
    チルベンジジン、４−ベンジルオキシアニリン、３−ア
    ミノフルオラントレン又は４−メトキシアニリンである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項から第５項のい
    ずれかに記載のアッセイ。
  7. （７） ―化学発光性２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジ
    オンと ―ペルオキシダーゼと ―特許請求の範囲第１項に記載の芳香族アミンとを含む
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のアッセ
    イ用キット。
  8. （８）特許請求の範囲第２項に記載の化学発光性２，３
    −ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンが使用されるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第７項に記載のキット。
  9. （９）特許請求の範囲第６項に記載の芳香族アミンが使
    用されることを特徴とする特許請求の範囲第７項又は第
    ８項に記載のキット。
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