JPH0394160A - 酵素免疫測定法における増感方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素免疫測定法を用いる臨床検査の分野にお
いて利用出来る。

［従来の技術］ 酵素免疫測定法は極めて特異的で、微量でも反応が進行
する抗原抗体反応に、酵素の持つ高い基質特異性を併せ
持たせたものであり、その測定感度および精度は、ラジ
オイムノアツセイと同等もしくは、それをしのぐレベル
にまで到達している。

特にラジオイムノアッセイにおいては、ラジオアイソト
ープを利用するためのいくつかの欠点がある。即ち、放
射能による人体障害、環境汚染の危険性、放射能の拡散
を防止するための特殊施設・設備の必要性、高価な測定
装置、高価な試薬、ラジオアイソトープを取り扱うため
の資格が必要なこと、また、ラジオアイソトープは一般
に不安定で取り扱い、輸送、保存に不便であることなど
である。

一方、酵素免疫測定法においては、非常に複雑な組成か
らなる生体試料の分析においても、その分析対象を分離
せずに，特別な設備、資格を必要とすることなく、だれ
でも簡便迅速に測定することが出来る。

反面、不安定で失活しやすい酵素を用いるため、その酵
素活性は、ｐＨ，温度、時間や反応系に存在する種々の
干渉因子により容易に変動し、その結果、測定値の感度
や精度に影響を与える。

［発明が解決しようとする課題］ 酵素免疫測定法における酵素活性の測定は、比色法がも
っとも多く用いられるが、高感度を必要とする場合には
、蛍光法や化学発光法が用いられる。

しかし、高感度になればなるほど、反応生成物の低濃度
での検出限界は、検量線の低濃度域での直線性によって
決まるため、酵素反応に使用する基質液の発光量（試薬
ブランク）が問題となってくる。

特に、才キシダーゼ系の酵素を標識酵素とし、本酵素と
反応し過酸化水素を発生ずる基質を用い、発生した過酸
化水素量を化学発光法などにより測定する場合に、試薬
ブランクである基質液の発光量が基質液の調製のたびに
変動ずることが知られている。例えば、晴天に調製した
場合には基質液の発光量は高い値を示し、雨の場合には
逆に低い値となる。この試薬ブランクの変動が、酵素免
疫測定法におけるふれの原因の一つと考えられている。

本発明者らは、酵素免疫測定法における低濃度域でのふ
れの原因を探るため、酵素免疫測定法に使用する試薬、
蒸留水、反応容器などにつきその種類、品質などを検討
、また、酸素の影響を除くために測定系を窒素ガス雰囲
気下においてみたが、満足のゆく結果は得られなかった
。

オキシダーゼを標識酵素とする測定系において、特に試
薬ブランクの変動が大きいことからスーパーオキサイド
・ラジカル等の存在が考えられたので、基質液中にスー
パー才キサイド・ラジカルに対ずる分解能を有するスー
パー才キザイド・ジスムターゼを添加したところ、試薬
ブランクのふれが少なくなり、検量線の低濃度域におけ
る直線性が良くなり、その結果、低濃度域での測定感度
を上げることができ発明を完成した。

また、スーパーオキザイド・ジスムターゼを添加した基
質液は、冷暗所に保存しておけば、約１２か月経過して
も試薬ブランク値は、安定しており使用可能である。

スーパー才キサイド・ラジカルは放射線、紫外線、可視
光線等によって生成される。特に、高感度を目的とする
酵素免疫測定法においては、基質液の調製の際に、基質
と酸素との接触によりスーパー才キザイド・ラジカル等
が発生し、このものが過酸化水素測定時に、発光試薬等
に対して同時に反応して試薬ブランクをおしあげ、低濃
度域における検出限界を悪くしていると推定される。

［発明の構成コ 本発明は、標識酵素を用いて、抗原抗体反応を定量的に
測定する酵素免疫測定法において、その基質液にスーパ
ーオキサイド・ジスムターゼを添加することを特徴とす
る測定系の安定化および増感方法を図るものであり、ま
た、スーパー才キザイド・ジスムターゼを含有したキッ
トに関する。

酵素免疫測定法自体は、既知の方法を適用できる。

例えば、測定対象物質（抗原）を才キシダーゼ系の酵素
で標識し、対応ずる抗体との反応を検体中の抗原と競合
させ、次にあらかじめ固相化された先の抗体に対応ずる
第二抗休と反応させて固相上の酵素を定量する方法（競
合法） 測定対象とする抗原を、あらかじめ固相化された対応ず
る抗体と反応させ、更に、抗原に対す抗体を該酵素で標
識した標識酵素と反応させ、同相上の酵素を定量する方
法（サンドイッチ法　一段階法）、測定対象とする抗原
をあらかじめ固相化された対応ずる抗体と反応させ、洗
浄し、次いで、抗原に対ずる抗体を該酵素で標識した標
識酵素と反応させて、固相上の酵素を定量する方法（サ
ンドイッチ法　二段階法）などがあげられるが、これら
以外の従来使用されている方法にも適用することができ
る。

測定の対象としては、抗原性を有するるものであればど
れでも良いが、特に生体液中の生理活性物質があげられ
る。生体液としては、例えば血清、血漿、尿、腹水など
であり、生理活性物質としては、例えばα−フェトプロ
テイン、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）などの胎児性蛋白質、
種々のべプタイドホルモン、ステロイドホルモン、免疫
グロブリン、抗ウィルス抗体、また、各種の医薬品など
があげられる。これらの抗原性を有する物質および抗原
性を有する物質に対ずる抗体への酵素標識は常法によっ
て行なわれる。（酵素免疫測定法／第三版　医学書院　
１９８７年発行）標識酵素としては、後述の基質と反応
して過酸化水素を生成する酵素であれば特に限定されな
いが、例えば、Ｉ，−アミノ酸オキシダーゼ、アルデヒ
ドオキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、ガラ
クトースオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グリ
コール酸オキシダーゼ、グリセロル才キシダーゼ、クリ
セロール−３−リン酸オキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、Ｄ−グルタミン酸オキシダーゼ、コレステロー
ルオキシダゼ、ジヒドロオロット酸オキシダーゼ、シュ
ウ酸オキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、Ｌ−２ヒド
ロキシ酸オキシダーゼ、ビリドキシリン酸オキシダーゼ
、ビルビン酸オキシダーゼ、ブトレスチンオキシダーゼ
、ヘキソースオキシダーゼ、ラトステロールオキシダー
ゼ、リジン　α一才キシダーゼのような才キシダーゼ類
をあげることができる。これらのうちグルコースオキシ
ダーゼ（ＣＯＤ）は、安定性に冨み、入手が容易であり
、かつ安価でもあり、標識酵素として好適である。

標識酵素の酵素活性は、基質と反応して生成する過酸化
水素濃度を測ることによってなしつる。

基質としては、前述の酵素に対応して反応し、過酸化水
素を生成するもの、例えば、 Ｌ一ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アラニン等のＬ−
アミノ酸類、アセトアルデヒド、プリン、ヒポキサンヂ
ン、エタノールアミン、Ｄ−ガラクトース、ラクトース
、キサンチン、グリコール酸、乳酸、グリセロール、ジ
ヒドロキシアセトン、クリセロール−３−リン酸、Ｄ−
グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルタミン酸、コレ
ステロール、オロット酸、シュウ酸、チラミン、ドーバ
ミン、Ｌ−２−ヒドロキシイソカプロン酸、ビリドキシ
ン−５−リン酸、ビルビン酸、プトレステン、ラクトー
ス、ラトステロール、Ｌ−リジン、Ｌ−才ルニチン、Ｌ
−フェニルアラニン等があげられる。（臨床酵素ハンド
ブック：講談社１９８２年発行） 過酸化水素濃度の測定は比色法、蛍光法、化学発光法の
いずれでも適用できるが（酵素免疫測定法／第三版、前
述）、比色法の場合には発色剤として、１．２−ジアミ
ノベンゼン、２．２′−アジノービス（３−エヂルベン
ゾチアゾリン−６スルホン酸）等、蛍光法の場合には蛍
光剤として、ｐ−ハイドロキシフエニルプロビオン酸、
チラミン、ホモバリン等、また化学発光法の場合には発
光剤としてルミノール、イソルミノールの様なルミノー
ル誘導体、ビス（２，４．６−トリクロロフエニル）オ
キザレート（ＴＣＰＯ）の様なオキザレート誘導体、ビ
ロガロール、８−アニリノナフタレン−１−スルフ才ン
酸等がよい。

なお、これらの物質と過酸化水素との反応には、酸化触
媒としてベルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼお
よびフェリシアン化カリウムなどの存在が必要である。

スーパーオキサイド・ジスムターゼは、前述のごとく酵
素免疫測定法におけるふれの原因と考えられているスー
パー才キサイド・ラジカル等を除去し、試薬ブランクを
低下させる目的で基質液に添加する。

スーパーオキサイド・ジスムターゼとしては、種々のも
のが市販されているが、例えばヒトあるいは牛赤血球由
来のものおよび、バイオテクノロジー技術を用いたヒト
の遺伝子組換え体由来のものがあるが、本発明を実施す
るうえでその由来は問わない。

スーパーオキサイド・ジスムターゼの添加濃度は基質液
に対して５Ｊｘｇ／ｍ１以上が好ましい。

なお、スーパーオキサイド・ジスムターゼの存在が過酸
化水素濃度および酵素反応に影響しないことは確認され
ている。

抗原抗体反応、酵素反応、発光反応の各々の反応時間お
よび温度等は、常法の範囲内でなしつる。（酵素免疫測
定法／第三版　前述）以下に実施例をあげて、本発明の
方法をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定
されるものではない。

なお、実施例においては、抗原物質の標準液を使用して
いるが、検体（たとえば抗原物質を含む血清あるいは血
漿等）を使用しても全く同様に実施出来る。

実験に使用した試薬および方法 （ａ）スーパーオキサイド・ジスムターゼ（ＳｏＤ）： ヒト遺伝子組換え体由来のもの（特開昭６１−１１１６
９０により調製） （ｂ）基質液： ０．１Ｍのグルコースおよび０，１％のアジ化ナトリウ
ムを含む０．ＯＩＭアセテート緩衝液（ｐＨ５．８） １ｌ （ｃ）発光試薬： ０．２ｍＭのルミノールおよび６０μＭのミクロペルオ
キシダーゼ（シグマ社製）を含む１００ｍＭのＣＨＥＳ
一緩衝液（同仁化学製ｐＨ９．５）（ｄ）測定装置： 化学発光検出装置（三共株式会社製のものを使用したが
、特に機種はとわない） 発光量は、光電子増倍管の出力電流を１０秒間積分した
ものを単位時間当たりに換算したもので、その単位はμ
ＡＸｓｅｃである。

Ａ：アンペア（電流値） （ｅ）試験方法： ＳＯＯとして０，０．０５，０．１，０．５，１．５，
　１０，および５０μｇ／ｍｌを含む１００μ１の基質
液に、発光試薬１００μ１を加え、各々の発光量を前述
の測定装置を用い測定した。

（ｆ）その結果を第一図に示す。

ＳＯＤの添加量に応じて発光量は著しく滅少ずるが、Ｓ
ＯＤ濃度５〜ｌＯμｇ　／ｍｌでその値１　２ は、ほぼ一定になる。

したがって、基質液にＳＯＤを添加することにより試薬
ブランクは著しく小さくなり低濃度での測定感度の上昇
が期待される。

ＳＯＤ濃度としては、基質液に５μｇ／ｍ１以上含んで
いればば十分である。

［え巖班ユ］ （ａ）測定条件 抗体固相化チューブ ：抗ＰＡＰ抗体同相化チューブ （分析化学　３４，　５４４−５４８　（１９８５）「
サイロキシンの蛍光酵素イ ムノアッセイ法」に準じて調 製） 試料　　：　ＰＡＰ　４　ｕ　ｇ／ｍｌをＡ緩衝液（＊
）にて希釈し、０．３９，１．５６，６．２５および２
５ｎｇ／ｍｌの各試料を作成 酵素標識抗体 １　３ 基質 ：グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ） 一標識抗ＰＡＰ抗体 ：の　０．　１Ｍグルコース液 ■　■にＳＯＤ　１０μｇ／ｍｌを添加したもの （＊）Ａ緩衝液組成 リン酸−ナトリウムｌｏｍＭ 牛血清アルブミン０．１％ 塩化ナトリウム０．１Ｍ 塩化マグネシウム１ｍＭ アジ化ナトリウム０．１％ よりなる。

（ｂ）反応方法 抗ＰＡＰ抗体固相化チューブ（　ＰＡＰチューブ）に３
０μ１の試料とＡ緩衝液２７０μ王を加え、３７℃で１
５分間インキュベートの後このＰＡＰチューブをＡ緩衝
液１．５ｏ＋１を用いて洗浄した。これを３回繰り返し
、Ｂ／Ｆ分離を行なった。次いで、このＰＡＰチューブ
にＣＯＤ一標識抗ＰＡＰ抗体３００　ｕ　ｌを加え、３
７ｌ　４ ℃で１５分間インキｊ−ベートの後、Ａ緩衝液１．５ｍ
ｌを用い洗浄、これを３回繰り返し、Ｂ／Ｆ分離を行な
った。次ぎにこのＰＡＰチューブに基質を３００μ１加
え、３７℃で１５分間インキユベートした。この反応液
１００μ１を測光用セルに分取し、発光試薬を１００μ
ｌ加え、発光量を測定した。

（ｃ）結果 第二図から明らかなようにＳＯＤを添加することにより
、低濃度域での発光量が減少し、測定感度が著しく上昇
した。

［（ミ兜目列ユ１コ （ａ）測定条件 抗体固相化チューブ ：抗ＡＦＰ抗体固相化チューブ （分析化学３４，５４４−５４８　（１９８５１前述　
に基づき調製） 試料　　：　ＡＦＰ　１０８０　ｎｇ／ｍｌをＡ緩衝液
にてｌ　５ 希釈し、０．５４，　１．０８，１０．８，　１０８．
０および１０８０．　０ｎｇ／ｍｌの各試料液を作成 酵素標識抗体 ：グルコース才キシダーゼ（ＧＯＤ） 標識抗ＡＦＰ抗体 基質　　：の　０．　１Ｍグルコース液■　■にＳＯＤ
　１０μｇ／ｍｌを添加したもの （ｂ）反応方法 抗ＡＦＰ抗体固相化チューブ（　ＡＦＰチューブ）に３
０μｌの試料液とＡ緩衝液２７０μｌを加え、３７℃で
１５分間インキュベートの後このＰＡＰチューブをＡ緩
衝液１．５＋ｎｌを用いて洗浄した。これを３回繰り返
し、Ｂ／Ｆ分離を行なった。次いで、このＡＦＰチュー
ブにＣＯＤ一標識抗ＡＦＰ抗体３００μ１を加え、３７
℃で１５分間インキュベートの後、Ａ緩衝液１．５ｍｌ
を用い洗浄し、これを３回繰り返し、Ｂ／Ｆ分離を行な
った。次ぎにこのｌ６ ＡＦＰチューブに、基質を３００μ１を加え、３７℃で
１５分間インキユベートした。この反応液１００μｌを
測光用セルに分取し、発光試薬を１００μ１加え、発光
量を測定した。

（ｃ）結果 第三図から明らかなようにＳＯＤを添加することにより
、低濃度域での発光量が減少し、測定感度が著しく上昇
した。

［衷思見ユ］ ＳＯＤを添　した基　　の経　　′″一ヒト遺伝子組換
え体由来のＳＯＤとヒト赤血球由来のＳＯＤを各々１０
μｇ／ｍｌ添加した基質液を褐色瓶に入れ、４℃で冷暗
所に保存しておいた。

この基質液の発光量を継時的に測定し、発光量の変化を
調べた。

その結果は第四図の通りである。

基質にＳＯＤを添加することにより、基質の発光量は約
１７３０に減少した。そして、その発光量の減少は、Ｓ
ＯＤの由来には無関係であった。

また、発光量の経時変化はＳＯＤ添加後１０日間ほどは
上昇傾向にあったが、それ以後は安定しており、■２カ
月経過しても基質液として使用可能であった。

［発明の効果］ 本発明により、酵素免疫測定法における、低濃度域での
測定感度が上昇すると共に基質の保存性が増し、長期間
に渉る使用が可能となった。

【図面の簡単な説明】

第一図は、基質液に対するスーパーオキサイド・ジスム
ターゼの添加効果をみたもので、縦軸は発光爪、横軸は
ノ＾質濃度を示す。 第二図および第三図は、スーパー才キサイド・ジスムタ
ーゼ存在下での前立腺由来酸性フォスファターゼ（ＰＡ
Ｐ）およびα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の検量線を
示す。 第四図は、スーパーオキサイド・ジスムターゼ（ＳＯＤ
−Ａ：ヒト赤血球由来、ＳＯＤ−Ｂ　：ヒト遺伝子組換
え体由来を表わし、十一はＳＯＤの添加の有無を表わす
） を添加した基質液の経時変 化をみたもので、 縦軸は発光量、 横軸は経時日数 を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）酵素免疫測定法において、その基質液にスーパーオ
   キサイド・ジスムターゼを添加することを特徴とする増
   感方法。 ２）標識酵素としてオキシダーゼ系の酵素を用いる特許
   請求の範囲第一項記載の方法。 ３）オキシダーゼ系の酵素がグルコースオキシダーゼで
   ある特許請求の範囲第二項記載の方法。 ４）スーパーオキサイド・ジスムターゼを含有すること
   を特徴とする酵素免疫測定用キット。