JPH0779715B2 - Ｎａｄｈ又はｎａｄｐｈのペルオキシダ−ゼによる定量法 - Google Patents
Ｎａｄｈ又はｎａｄｐｈのペルオキシダ−ゼによる定量法Info
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- JPH0779715B2 JPH0779715B2 JP9818187A JP9818187A JPH0779715B2 JP H0779715 B2 JPH0779715 B2 JP H0779715B2 JP 9818187 A JP9818187 A JP 9818187A JP 9818187 A JP9818187 A JP 9818187A JP H0779715 B2 JPH0779715 B2 JP H0779715B2
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- nadh
- peroxidase
- nadph
- hydrogen peroxide
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、NADHにジアホラーゼを使用させるか又はNADP
Hに旧黄色酵素を作用させることによって過酸化水素を
生成させ、この過酸化水素をペルオキシダーゼによって
酸化発色させてNADHやNADPHを定量する方法であって、
特にNADHやNADPHの過酸化水素への転換効率を向上させ
ると共に酸化発色収率を向上させた方法に関するもので
ある。
Hに旧黄色酵素を作用させることによって過酸化水素を
生成させ、この過酸化水素をペルオキシダーゼによって
酸化発色させてNADHやNADPHを定量する方法であって、
特にNADHやNADPHの過酸化水素への転換効率を向上させ
ると共に酸化発色収率を向上させた方法に関するもので
ある。
［従来の技術］ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）やニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸（NADP+）は、
デヒドロゲナーゼによって触媒される非常に多くの酸化
還元反応に関与することが知られている。従って、これ
らの補酵素が酵素反応に関与して生じる還元型（NADH,N
ADPH）を定量することは、酵素活性や基質量を測定する
という観点からも重要なことであり、従来からもNADHや
NADPHを定量する為の各種の方法が提案されている。特
に、近年はNADHをジアホラーゼやフェナジンメトサルフ
ェート（PMS）等によって過酸化水素を発生させ、この
過酸化水素によってペルオキシダーゼの酸化発色を行な
わせる方法が検討されている。この方法によれば、還元
性発色色素に導くホルマザン発色法と比べて、分析機器
を汚染するという問題が回避でき、又分子吸光係数の面
から高感度化が達成されると共に、現在普及しているペ
ルオキシダーゼによる酸化発色法の統一化を図るという
面からも有利である。
チンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸（NADP+）は、
デヒドロゲナーゼによって触媒される非常に多くの酸化
還元反応に関与することが知られている。従って、これ
らの補酵素が酵素反応に関与して生じる還元型（NADH,N
ADPH）を定量することは、酵素活性や基質量を測定する
という観点からも重要なことであり、従来からもNADHや
NADPHを定量する為の各種の方法が提案されている。特
に、近年はNADHをジアホラーゼやフェナジンメトサルフ
ェート（PMS）等によって過酸化水素を発生させ、この
過酸化水素によってペルオキシダーゼの酸化発色を行な
わせる方法が検討されている。この方法によれば、還元
性発色色素に導くホルマザン発色法と比べて、分析機器
を汚染するという問題が回避でき、又分子吸光係数の面
から高感度化が達成されると共に、現在普及しているペ
ルオキシダーゼによる酸化発色法の統一化を図るという
面からも有利である。
［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、この方法においても下記の様な若干の問
題が残されている。
題が残されている。
上記の方法ではNADHやNADPHから過酸化水素を発生させ
る過程において、その反応系内で部分的に電子還元が進
行してスーパーオキサイド（O2 -）が生じるのである
が、ペルオキシダーゼを反応系に共存させておくと、前
記O2 -がペルオキシダーゼと結合してコンプレックスIII
と呼ばれる複合体を形成する。この様な複合体形成反応
は、水素供与体である色原体の共存下において著しく促
進される傾向があり、ここに形成された複合体は、カタ
ラーゼ作用を発揮してO2 -を分解する性質を有してい
る。従って反応系にO2 -が生成する場合には、このO2 -が
ペルオキシダーゼのカタラーゼ作用の為に迅速に消費さ
れてしまい、その結果過酸化水素を生成させる為のO2 -
が不足するのでNADHやNADPHの全てが消費されて過酸化
水素を発生するとは限らず、理論上期待されるレベルの
酸化発色が得られないという問題があった。換言するな
らば上記方法ではペルオキシダーゼによるカタラーゼ作
用が、O2 -の過酸化水素への自然不均化反応よりも速く
進行してしまい、期待通りの効果が得られないことが多
い。この様な不都合を回避する手段として、例えばペル
オキシダーゼの添加時期を上記自然不均化反応が終了し
た後にするということも考えられるが、自然不均化反応
は必ずしもそれほど早く進行する訳ではなく、又作業を
２段階で行なう必要があるので繁雑である。
る過程において、その反応系内で部分的に電子還元が進
行してスーパーオキサイド（O2 -）が生じるのである
が、ペルオキシダーゼを反応系に共存させておくと、前
記O2 -がペルオキシダーゼと結合してコンプレックスIII
と呼ばれる複合体を形成する。この様な複合体形成反応
は、水素供与体である色原体の共存下において著しく促
進される傾向があり、ここに形成された複合体は、カタ
ラーゼ作用を発揮してO2 -を分解する性質を有してい
る。従って反応系にO2 -が生成する場合には、このO2 -が
ペルオキシダーゼのカタラーゼ作用の為に迅速に消費さ
れてしまい、その結果過酸化水素を生成させる為のO2 -
が不足するのでNADHやNADPHの全てが消費されて過酸化
水素を発生するとは限らず、理論上期待されるレベルの
酸化発色が得られないという問題があった。換言するな
らば上記方法ではペルオキシダーゼによるカタラーゼ作
用が、O2 -の過酸化水素への自然不均化反応よりも速く
進行してしまい、期待通りの効果が得られないことが多
い。この様な不都合を回避する手段として、例えばペル
オキシダーゼの添加時期を上記自然不均化反応が終了し
た後にするということも考えられるが、自然不均化反応
は必ずしもそれほど早く進行する訳ではなく、又作業を
２段階で行なう必要があるので繁雑である。
本発明はこうした従来技術のもつ問題点を解決する為に
なされたものであって、その目的とするところは、NADH
やNADPHから過酸化水素への発生効率を向上させると共
に酸化発色収率を向上させ、NADHやNADPHを迅速且つ高
感度に定量し得る様な方法を提供することにある。
なされたものであって、その目的とするところは、NADH
やNADPHから過酸化水素への発生効率を向上させると共
に酸化発色収率を向上させ、NADHやNADPHを迅速且つ高
感度に定量し得る様な方法を提供することにある。
［問題点を解決する為の手段］ 上記目的を達成し得た本発明とは、NADHにジアホラーゼ
を作用させるか又はNADPHに旧黄色酵素を作用させ、生
成する過酸化水素に色原体及びペルオキシダーゼを作用
させて酸化発色させ、この発色強度を測定することによ
りNADH又はNADPHを定量する方法において、前記ペオキ
シダーゼに不均化反応促進剤を共存させた点に要旨を有
するNADH又はNADPHのペルオキシダーゼによる定量法で
ある。
を作用させるか又はNADPHに旧黄色酵素を作用させ、生
成する過酸化水素に色原体及びペルオキシダーゼを作用
させて酸化発色させ、この発色強度を測定することによ
りNADH又はNADPHを定量する方法において、前記ペオキ
シダーゼに不均化反応促進剤を共存させた点に要旨を有
するNADH又はNADPHのペルオキシダーゼによる定量法で
ある。
［作用］ 本発明は上述の如く構成されるが、要は上記一連の反応
系においてペルオキシダーゼに不均化反応促進剤を共存
させることにより、ペルオキシダーゼによるカタラーゼ
作用の反応よりも、O2 -の過酸化水素への不均化反応の
進行を促進させたものである。このことによってNADHや
NADPHから迅速に過酸化水素を発生せしめると共に、酸
化発色収率を向上させることに成功したものである。
系においてペルオキシダーゼに不均化反応促進剤を共存
させることにより、ペルオキシダーゼによるカタラーゼ
作用の反応よりも、O2 -の過酸化水素への不均化反応の
進行を促進させたものである。このことによってNADHや
NADPHから迅速に過酸化水素を発生せしめると共に、酸
化発色収率を向上させることに成功したものである。
NADHから過酸化水素を発生するにはジアホラーゼの存在
が必要であるが、このジアホラーゼはその起源によって
NADHオキシダーゼ作用に違いが認められる。例えば豚心
臓由来のジアホラーゼは上記作用が強いことが知られて
いる。
が必要であるが、このジアホラーゼはその起源によって
NADHオキシダーゼ作用に違いが認められる。例えば豚心
臓由来のジアホラーゼは上記作用が強いことが知られて
いる。
そこで本発明者らは自然不均化反応を促進させるという
趣旨のもとで、NADHオキシダーゼ作用の強いジアホラー
ゼをNADHに作用させることをまず試みた。しかしながら
この場合においてもペルオキシダーゼと色原体を共存さ
せた状態では、得られる酸化発色量は依然としてNADHの
酸化量に対応しないものであった。この知見は、既知量
の過酸化水素を添加して分子吸光係数を調べたり、或は
ペルオキシダーゼを自然不均化反応終了後に加えて酸化
発色させること等によって確認できた。但し自然不均化
反応終了後にペルオキシダーゼを添加させる方法は、本
発明方法と比べて時間的にも能率的にも劣ることは既に
述べた通りである。
趣旨のもとで、NADHオキシダーゼ作用の強いジアホラー
ゼをNADHに作用させることをまず試みた。しかしながら
この場合においてもペルオキシダーゼと色原体を共存さ
せた状態では、得られる酸化発色量は依然としてNADHの
酸化量に対応しないものであった。この知見は、既知量
の過酸化水素を添加して分子吸光係数を調べたり、或は
ペルオキシダーゼを自然不均化反応終了後に加えて酸化
発色させること等によって確認できた。但し自然不均化
反応終了後にペルオキシダーゼを添加させる方法は、本
発明方法と比べて時間的にも能率的にも劣ることは既に
述べた通りである。
次に、本発明者らは不均化反応促進剤としてスーパーオ
キサイドジスムターゼ（SOD）を選び、この促進剤を含
む下記の組成の試薬を用い、NADHの過酸化水素変換によ
る酸化発色反応を行なった。即ち下記組成の試薬に0.1m
lのNADH（1mM）を添加し、波長553nmにおける吸光度の
増加によって酸化発色反応を検討した。
キサイドジスムターゼ（SOD）を選び、この促進剤を含
む下記の組成の試薬を用い、NADHの過酸化水素変換によ
る酸化発色反応を行なった。即ち下記組成の試薬に0.1m
lのNADH（1mM）を添加し、波長553nmにおける吸光度の
増加によって酸化発色反応を検討した。
（試薬） Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジンナトリウム（TOOS:0.2％）…0.6m
l ４−アミノアンチピリン（４−AA:0.2％） …0.3ml ペルオキシダーゼ（90U/ml） …0.1ml ジアホラーゼ（豚心臓由来:200U/ml） …0.1ml SOD（100U/ml） …0.1ml Tris−HCl緩衝液（0.1M,pH8.1） …1.7ml 尚比較の為に、自然不均化反応終了後に（NADH添加５分
後）にペルオキシダーゼを添加した場合、及び促進剤と
してのSODを添加しない場合についても同様に実験し
た。
ル）−ｍ−トルイジンナトリウム（TOOS:0.2％）…0.6m
l ４−アミノアンチピリン（４−AA:0.2％） …0.3ml ペルオキシダーゼ（90U/ml） …0.1ml ジアホラーゼ（豚心臓由来:200U/ml） …0.1ml SOD（100U/ml） …0.1ml Tris−HCl緩衝液（0.1M,pH8.1） …1.7ml 尚比較の為に、自然不均化反応終了後に（NADH添加５分
後）にペルオキシダーゼを添加した場合、及び促進剤と
してのSODを添加しない場合についても同様に実験し
た。
これらの結果を第１図に示すが、第１図中のトレースＣ
は本発明方法に従った場合であり、トレースＢはSODを
添加しない場合、トレースＡは自然不均化反応終了後に
ペルオキシダーゼを添加した場合の夫々の結果を示して
いる。
は本発明方法に従った場合であり、トレースＢはSODを
添加しない場合、トレースＡは自然不均化反応終了後に
ペルオキシダーゼを添加した場合の夫々の結果を示して
いる。
第１図の結果から下記の様な知見が得られる。トレース
Ａの結果は、酸化発色のレベルが自然不均化反応後の過
酸化水素量を反映したものであるが、このトレースＡの
結果に比べトレースＢの結果は明らかに酸化発色のレベ
ルが低いものであった。尚SODを添加しない場合につい
ては、色原体量、ジアホラーゼ量及びペルオキシダーゼ
量を変えて種々検討したが、トレースＢの結果とほぼ同
様の結果しか得られなかった。
Ａの結果は、酸化発色のレベルが自然不均化反応後の過
酸化水素量を反映したものであるが、このトレースＡの
結果に比べトレースＢの結果は明らかに酸化発色のレベ
ルが低いものであった。尚SODを添加しない場合につい
ては、色原体量、ジアホラーゼ量及びペルオキシダーゼ
量を変えて種々検討したが、トレースＢの結果とほぼ同
様の結果しか得られなかった。
これに対しトレースＣ（本発明方法による場合）の結果
は、酸化発色のレベルがトレースＡとほぼ同様のレベル
に達しており、過酸化水素はペルオキシダーゼの共存下
においても充分に生成していることが理解される。尚ト
レースＡの結果については、波長340nmにおける吸光度
によってNADH減少量と酸化発色量について調査したが、
両者に対応した値を示していることが確認された。
は、酸化発色のレベルがトレースＡとほぼ同様のレベル
に達しており、過酸化水素はペルオキシダーゼの共存下
においても充分に生成していることが理解される。尚ト
レースＡの結果については、波長340nmにおける吸光度
によってNADH減少量と酸化発色量について調査したが、
両者に対応した値を示していることが確認された。
この様に本発明方法では反応系に不均化反応促進剤を共
存させることによって従来の不都合を解消し得たもので
あるが、用いる不均化反応促進剤としては上記SOD以外
に、ガラクトースオキシダーゼ,Fe−EDTA,Mn−EDTA,銅
イオン及びペプタイド結合性銅イオン等が挙げられる。
但し本発明はこれらの種類に限定されるものではない。
これらの不均化反応促進剤はいずれか１種を選んで用い
ればよいが、場合によっては２種以上を組合わせて用い
る様にしてもよい。
存させることによって従来の不都合を解消し得たもので
あるが、用いる不均化反応促進剤としては上記SOD以外
に、ガラクトースオキシダーゼ,Fe−EDTA,Mn−EDTA,銅
イオン及びペプタイド結合性銅イオン等が挙げられる。
但し本発明はこれらの種類に限定されるものではない。
これらの不均化反応促進剤はいずれか１種を選んで用い
ればよいが、場合によっては２種以上を組合わせて用い
る様にしてもよい。
又緩衝液に関しても上記Tris−HCl緩衝液に限らず、従
来から用いられている適当な緩衝液を用いればよい。更
に上記実験では色原体としてTOOSや４−AA等を用いた場
合について示したが、本発明で用いる色原体に関しても
上記のものに限らず、他のものを選んで適宜反応系を設
定すればよい。
来から用いられている適当な緩衝液を用いればよい。更
に上記実験では色原体としてTOOSや４−AA等を用いた場
合について示したが、本発明で用いる色原体に関しても
上記のものに限らず、他のものを選んで適宜反応系を設
定すればよい。
上記実験例ではNADHについてのみ述べたが、本発明はNA
DPHを定量する場合についても適用できるものであり、
その場合にはジアホラーゼの代りに旧黄色酵素を上記実
験におけるジアホラーゼと同程度の単位数で添加すれば
よい。NADPHに作用させる旧黄色酵素としては、イース
ト菌由来のものが例示できる。
DPHを定量する場合についても適用できるものであり、
その場合にはジアホラーゼの代りに旧黄色酵素を上記実
験におけるジアホラーゼと同程度の単位数で添加すれば
よい。NADPHに作用させる旧黄色酵素としては、イース
ト菌由来のものが例示できる。
本発明は基本的にはNADHやNADPH等を定量する為の方法
であるが、これらの生成に関与する脱水素酵素を共存さ
せることも可能であり、このことによって脱水素酵素活
性や基質等を測定することができる。
であるが、これらの生成に関与する脱水素酵素を共存さ
せることも可能であり、このことによって脱水素酵素活
性や基質等を測定することができる。
一方本発明で用いる試薬の各組成の濃度範囲についても
何ら限定するものではなく、例えば脱水素酵素を共存さ
せる場合にはその酵素の至適反応条件によって適宜設定
すればよい。
何ら限定するものではなく、例えば脱水素酵素を共存さ
せる場合にはその酵素の至適反応条件によって適宜設定
すればよい。
次に、本発明者らが不均化反応促進剤としてのSODの効
果について検討した結果を第２図に示す。これはSOD以
外は上記試薬組成に従い、SODについてはその濃度を変
化させて添加（添加量は同じ）したものである。又NADH
添加量に関しても上記実験と同様である。
果について検討した結果を第２図に示す。これはSOD以
外は上記試薬組成に従い、SODについてはその濃度を変
化させて添加（添加量は同じ）したものである。又NADH
添加量に関しても上記実験と同様である。
第２図の結果から明らかな様に、50U/ml以上のSODの添
加で酸化発色は飽和状態を示した。しかもこの発色量
は、第１図のトレースＡに一致するものであった。
加で酸化発色は飽和状態を示した。しかもこの発色量
は、第１図のトレースＡに一致するものであった。
［実施例］ SOD（50U/ml最終濃度）を加えた場合と加えない場合と
について、下記の反応組成でNADHを定量した。
について、下記の反応組成でNADHを定量した。
（反応組成） （TOOS:0.2％） …0.6ml ４−AA:（0.2％） …0.3ml ペルオキシダーゼ（90U/ml） …0.1ml ジアホラーゼ（200U/ml） …0.1ml SOD（1500U/ml） …0.1ml Tris−HCl緩衝液（0.1M,pH8.1） …1.7ml 上記反応組成（SODを添加しない場合はSODを含まないも
の）に、0.1mlの各種濃度のNADHを添加した。
の）に、0.1mlの各種濃度のNADHを添加した。
その結果を第３図に示すが、第３図の結果から明らかな
様に、SODを添加した場合（○印）に比べてSODを添加し
ない場合（●印）ではその発色量が少ない。尚第３図に
おける縦軸は波長553nmにおける吸光度を示し、横軸は
添加量0.1ml中のNADH濃度を示している。この様にSODの
添加によって、NADHの酸化に対応する発色量が得られ
た。
様に、SODを添加した場合（○印）に比べてSODを添加し
ない場合（●印）ではその発色量が少ない。尚第３図に
おける縦軸は波長553nmにおける吸光度を示し、横軸は
添加量0.1ml中のNADH濃度を示している。この様にSODの
添加によって、NADHの酸化に対応する発色量が得られ
た。
［発明の効果］ 以上述べた様に本発明法によれば、反応系中にSOD等の
不均化反応促進剤を共存させることによって、NADHやNA
DPHからの過酸化水素形成効率を向上させると共に酸化
発色収率を向上させ、NADHやNADPHを迅速且つ高感度に
定量し得る様になった。
不均化反応促進剤を共存させることによって、NADHやNA
DPHからの過酸化水素形成効率を向上させると共に酸化
発色収率を向上させ、NADHやNADPHを迅速且つ高感度に
定量し得る様になった。
第１図は各種条件下におけるNADHの酸化発色の吸光度変
化を示すグラフ、第２図はSOD添加量と発色度との関係
を示すグラフ、第３図はSODを加えた場合と加えない場
合においてNADHを測定した結果を示すグラフである。
化を示すグラフ、第２図はSOD添加量と発色度との関係
を示すグラフ、第３図はSODを加えた場合と加えない場
合においてNADHを測定した結果を示すグラフである。
Claims (2)
- 【請求項１】NADHにジアホラーゼを作用させるか又はNA
DPHに旧黄色酵素を作用させ、生成する過酸化水素に色
原体及びペルオキシダーゼを作用させて酸化発色させ、
この発色強度を測定することによりNADH又はNADPHを定
量する方法において、前記ペルオキシダーゼに不均化反
応促進剤を共存させたことを特徴とするNADH又はNADPH
のペルオキシダーゼによる定量法。 - 【請求項２】前記不均化反応促進剤が、スーパーオキシ
ドジスムターゼ，ガラクトースオキシダーゼ,Fe−EDTA,
Mn−EDTA,銅イオン及びペプタイド結合性銅イオンから
選ばれる１種又は２種以上である特許請求の範囲第１項
に記載の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9818187A JPH0779715B2 (ja) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | Ｎａｄｈ又はｎａｄｐｈのペルオキシダ−ゼによる定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9818187A JPH0779715B2 (ja) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | Ｎａｄｈ又はｎａｄｐｈのペルオキシダ−ゼによる定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63263098A JPS63263098A (ja) | 1988-10-31 |
| JPH0779715B2 true JPH0779715B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=14212852
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9818187A Expired - Lifetime JPH0779715B2 (ja) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | Ｎａｄｈ又はｎａｄｐｈのペルオキシダ−ゼによる定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0779715B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2019711A1 (en) * | 1989-06-28 | 1990-12-28 | Takashi Ikegami | Sensitization of assays |
| CN104316692B (zh) * | 2014-10-24 | 2016-08-17 | 广州市丰华生物工程有限公司 | 一种新生儿总半乳糖检测试剂盒、其使用方法及制备方法 |
-
1987
- 1987-04-20 JP JP9818187A patent/JPH0779715B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63263098A (ja) | 1988-10-31 |
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