JP2719709B2 - 胆汁酸硫酸サルファターゼ、その製造法及び胆汁酸の定量法 - Google Patents
胆汁酸硫酸サルファターゼ、その製造法及び胆汁酸の定量法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、胆汁酸硫酸サルファターゼ、その製造法及
び胆汁酸の定量法に関する。
び胆汁酸の定量法に関する。
本発明の酵素は、臨床検査上有用な新規酵素であり、
硫酸抱合型胆汁酸、例えば３位のOH基が硫酸エステル化
された胆汁酸（以下胆汁酸３α−硫酸という）の定量及
び血中又は尿中の胆汁酸の定量に有用である。
硫酸抱合型胆汁酸、例えば３位のOH基が硫酸エステル化
された胆汁酸（以下胆汁酸３α−硫酸という）の定量及
び血中又は尿中の胆汁酸の定量に有用である。
従来の技術とその問題点 肝胆道系疾患によって、血液中又は尿中の胆汁酸が著
しく増加することは、よく知られている。従って、血液
中又は尿中の胆汁酸の定量は、臨床検査において肝機能
を調べる上で重要な項目となっている。従来胆汁酸の定
量には、３α−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナー
ゼを用いる酵素分析法が採用されている。すなわち、前
記デヒドロゲナーゼは、３位のOH基がα配置の胆汁酸
（３α−ヒドロキシ胆汁酸）を酸化して３−オキソ胆汁
酸を生成させるとともに、補酵素であるβ−NADをNADH
に還元する。このNADHを定量することにより、３α−ヒ
ドロキシ胆汁酸が定量される。従来の臨床検査において
は、３α−ヒドロキシ胆汁酸量を総胆汁酸量としてい
る。
しく増加することは、よく知られている。従って、血液
中又は尿中の胆汁酸の定量は、臨床検査において肝機能
を調べる上で重要な項目となっている。従来胆汁酸の定
量には、３α−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナー
ゼを用いる酵素分析法が採用されている。すなわち、前
記デヒドロゲナーゼは、３位のOH基がα配置の胆汁酸
（３α−ヒドロキシ胆汁酸）を酸化して３−オキソ胆汁
酸を生成させるとともに、補酵素であるβ−NADをNADH
に還元する。このNADHを定量することにより、３α−ヒ
ドロキシ胆汁酸が定量される。従来の臨床検査において
は、３α−ヒドロキシ胆汁酸量を総胆汁酸量としてい
る。
しかるに、血液中の胆汁酸はその一部が硫酸エステル
化された硫酸抱合型胆汁酸として存在するとともに、硫
酸エステル化により親水性が増して排泄が容易になるた
め、尿中の硫酸抱合型胆汁酸、主に胆汁酸３α−硫酸の
比率は著るしく高くなる。従来法における上記デヒドロ
ゲナーゼは、３α−ヒドロキシ胆汁酸にしか作用しない
ため、従来法では、３α−ヒドロキシル基が硫酸エステ
ル化した胆汁酸３α−硫酸を定量することはできない。
臨床検査上、尿又は血液中の総胆汁酸３α−硫酸又はそ
れをも含めた総胆汁酸を定量する必要があるが、胆汁酸
３α−硫酸の硫酸エステル部分を特異的に加水分解する
胆汁酸サルファターゼは、未だ知られていない。
化された硫酸抱合型胆汁酸として存在するとともに、硫
酸エステル化により親水性が増して排泄が容易になるた
め、尿中の硫酸抱合型胆汁酸、主に胆汁酸３α−硫酸の
比率は著るしく高くなる。従来法における上記デヒドロ
ゲナーゼは、３α−ヒドロキシ胆汁酸にしか作用しない
ため、従来法では、３α−ヒドロキシル基が硫酸エステ
ル化した胆汁酸３α−硫酸を定量することはできない。
臨床検査上、尿又は血液中の総胆汁酸３α−硫酸又はそ
れをも含めた総胆汁酸を定量する必要があるが、胆汁酸
３α−硫酸の硫酸エステル部分を特異的に加水分解する
胆汁酸サルファターゼは、未だ知られていない。
従って、現状では胆汁酸３α−硫酸を定量するには、
試料をカラム・クロマトグラフィー処理して胆汁酸３α
−硫酸を分離し、ソルボリシスにより胆汁酸３α−硫酸
の硫酸エステル部分を化学的に加水分解する工程が必要
である。しかしながら、このような工程は煩雑であり、
日常の臨床検査に容易に活用できる方法ではない。
試料をカラム・クロマトグラフィー処理して胆汁酸３α
−硫酸を分離し、ソルボリシスにより胆汁酸３α−硫酸
の硫酸エステル部分を化学的に加水分解する工程が必要
である。しかしながら、このような工程は煩雑であり、
日常の臨床検査に容易に活用できる方法ではない。
問題点を解決するための手段 本発明者は、上記従来技術の問題点に鑑みて鋭意研究
を重ねた結果、胆汁酸３α−硫酸の硫酸エステル部分を
特異的に加水分解する、文献未載の新規な胆汁酸硫酸サ
ルファターゼを見出し、本発明を完成した。
を重ねた結果、胆汁酸３α−硫酸の硫酸エステル部分を
特異的に加水分解する、文献未載の新規な胆汁酸硫酸サ
ルファターゼを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、次の性状を有する胆汁酸硫酸サル
ファターゼ、その製造法及び胆汁酸の定量法を提供する
ものである。
ファターゼ、その製造法及び胆汁酸の定量法を提供する
ものである。
（ａ）作用：胆汁酸の３α−硫酸エステルに作用して硫
酸エステル部分を加水分解し、その際OH基の結合位置を
α配置からβ配置に逆転させ、３β−ヒドロキシ胆汁酸
を生成する。
酸エステル部分を加水分解し、その際OH基の結合位置を
α配置からβ配置に逆転させ、３β−ヒドロキシ胆汁酸
を生成する。
（ｂ）基質特異性：遊離型胆汁酸の３α−硫酸エステ
ル、並びに、グリシン抱合型及びタウリン抱合型胆汁酸
の３α−硫酸エステルに作用する。
ル、並びに、グリシン抱合型及びタウリン抱合型胆汁酸
の３α−硫酸エステルに作用する。
（ｃ）至適pH域:pH8.5±0.5 （ｄ）安定pH:30℃、16時間処理で、pH5.6〜7.6 （ｅ）至適温度及び熱安定性：至適温度は35℃±５℃。
pH7.2、10分間処理で、32℃の温度下では活性は100％残
存するが、それ以上の温度では急速に活性は低下し、50
℃で０％となる。
pH7.2、10分間処理で、32℃の温度下では活性は100％残
存するが、それ以上の温度では急速に活性は低下し、50
℃で０％となる。
（ｆ）分子量：高速液体クロマトグラフィー法により測
定した結果、分子量約100,000である。
定した結果、分子量約100,000である。
本発明の胆汁酸硫酸サルファターゼ（以下本酵素とい
う）は、シュードモナス・テストステロニー（Pseudomo
nas testosteroni）に属する細菌が生産する菌体内酵素
である。
う）は、シュードモナス・テストステロニー（Pseudomo
nas testosteroni）に属する細菌が生産する菌体内酵素
である。
本酵素の理化学的性質をより詳細に記すと、以下の通
りである。なお、本酵素の活性測定は以下のようにして
行なわれる。すなわち、リトコール酸３α−硫酸（シグ
マ社製）の2.5mM水溶液0.1ml、β−NAD（オリエンタル
酵母工業製）の15mM水溶液0.2ml、0.1Mトリス塩酸緩衝
液（pH8.0）1.0ml及び蒸溜水1.55mlを石英セルにとり、
30℃で平衡化した後、β−ヒドロキシステロイド・デヒ
ドロゲナーゼ（シグマ社製）溶液（10U/ml）0.05ml及び
本酵素溶液0.1mlを順次添加し、30℃で反応させ、340nm
における反応初期吸光度の増加を測定する。該条件下、
１分間に１μmolのNADHを生成する酵素活性を１単位と
する。
りである。なお、本酵素の活性測定は以下のようにして
行なわれる。すなわち、リトコール酸３α−硫酸（シグ
マ社製）の2.5mM水溶液0.1ml、β−NAD（オリエンタル
酵母工業製）の15mM水溶液0.2ml、0.1Mトリス塩酸緩衝
液（pH8.0）1.0ml及び蒸溜水1.55mlを石英セルにとり、
30℃で平衡化した後、β−ヒドロキシステロイド・デヒ
ドロゲナーゼ（シグマ社製）溶液（10U/ml）0.05ml及び
本酵素溶液0.1mlを順次添加し、30℃で反応させ、340nm
における反応初期吸光度の増加を測定する。該条件下、
１分間に１μmolのNADHを生成する酵素活性を１単位と
する。
（ａ）作用：胆汁酸の３α−硫酸エステルに作用して硫
酸エステルを加水分解し、その際、OH基の結合配置をα
配置からβ配置に逆転させ、３β−ヒドロキシ胆汁酸を
生成する。
酸エステルを加水分解し、その際、OH基の結合配置をα
配置からβ配置に逆転させ、３β−ヒドロキシ胆汁酸を
生成する。
（ｂ）基質特異性：遊離型の胆汁酸の３α−硫酸エステ
ル、並びに、グリシン抱合型及びタウリン抱合型胆汁酸
の３α−硫酸エステルに作用する。詳細を、下記第１表
に示す。
ル、並びに、グリシン抱合型及びタウリン抱合型胆汁酸
の３α−硫酸エステルに作用する。詳細を、下記第１表
に示す。
（ｃ）至適pH:至適pH8.5±0.5である。結果を第１図に
示す。
示す。
（ｄ）安定pH:安定pH範囲は30℃、16時間処理で、pH5.6
〜7.6である。結果を第２図に示す。
〜7.6である。結果を第２図に示す。
（ｅ）至適温度及び熱安定性：至適温度は35℃±５℃。
pH7.2、10分間処理で、32℃の温度下では活性は100％残
存するが、それ以上の温度では急速に活性は低下し、50
℃で０％となる。結果を第３図及び第４図に示す。
pH7.2、10分間処理で、32℃の温度下では活性は100％残
存するが、それ以上の温度では急速に活性は低下し、50
℃で０％となる。結果を第３図及び第４図に示す。
（ｆ）分子量：ゲル過カラム・シム−パックジオール
−300（島津製作所製）を用いた高速液体クロマトグラ
フィー法により測定した結果、分子量約100,000であ
る。
−300（島津製作所製）を用いた高速液体クロマトグラ
フィー法により測定した結果、分子量約100,000であ
る。
（ｇ）Km値：リトコール酸３α−硫酸に対するKm値６×
10-6Ｍ （ｈ）阻害及び活性化：Mn+により活性化され、EDTA、
Ｏ−フェナンスロリン等の、金属イオンに作用する物質
により阻害される。また、ｐ−クロロマーキュリベンゾ
エート、モノヨード酢酸等のSH試薬によっては、殆んど
阻害されない。詳細を、下記第２表に示す。
10-6Ｍ （ｈ）阻害及び活性化：Mn+により活性化され、EDTA、
Ｏ−フェナンスロリン等の、金属イオンに作用する物質
により阻害される。また、ｐ−クロロマーキュリベンゾ
エート、モノヨード酢酸等のSH試薬によっては、殆んど
阻害されない。詳細を、下記第２表に示す。
本酵素は、シュードモナス・テストステロニーに属す
る細菌を培養することによって得られる。
る細菌を培養することによって得られる。
シュードモナス・テストステロニー（以下本菌種とい
う）としては特に制限されず、公知のものが使用でき
る。その中でも、例えば、シュードモナス・テストステ
ロニーATCC11996等が好ましい。
う）としては特に制限されず、公知のものが使用でき
る。その中でも、例えば、シュードモナス・テストステ
ロニーATCC11996等が好ましい。
また本菌種の培養に使用する培地は特に制限されず、
シュードモナス属細菌用の培地がいずれも使用できる
が、例えば、有機栄養源として酵母エキス、ペプトン、
肉エキス等、無機栄養源としてリン酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、
塩化マグネシウム、塩化マンガン等を含むものが用いら
れる。更に本酵素を生産させるためには、胆汁酸を培地
に添加することが必須である。胆汁酸としては、例え
ば、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール
酸、リトコール酸硫酸、これらの塩等を挙げることがで
き、１種又は２種以上を使用できる。胆汁酸の添加量は
特に制限されないが、通常0.05〜1.0重量％程度とすれ
ばよい。
シュードモナス属細菌用の培地がいずれも使用できる
が、例えば、有機栄養源として酵母エキス、ペプトン、
肉エキス等、無機栄養源としてリン酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、
塩化マグネシウム、塩化マンガン等を含むものが用いら
れる。更に本酵素を生産させるためには、胆汁酸を培地
に添加することが必須である。胆汁酸としては、例え
ば、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール
酸、リトコール酸硫酸、これらの塩等を挙げることがで
き、１種又は２種以上を使用できる。胆汁酸の添加量は
特に制限されないが、通常0.05〜1.0重量％程度とすれ
ばよい。
培養時間及び温度は特に制限されないが、通常好気的
条件下に、24〜34℃程度で12〜24時間程度培養するのが
好ましい。この程度の時間培養すると、酵素活性が最大
になる。
条件下に、24〜34℃程度で12〜24時間程度培養するのが
好ましい。この程度の時間培養すると、酵素活性が最大
になる。
培養によって得られる菌体から、本酵素が抽出され
る。抽出は、通常の菌体内酵素抽出法に従って行なうこ
とができる。例えば超音波処理、各種機械的処理、酵素
処理等の方法により菌体を破砕し、不溶物を遠心分離し
た上清に酵素を回収することができる。この粗酵素を、
除核酸処理、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル過等の一般的な
酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製することによ
り、本酵素を得ることができる。
る。抽出は、通常の菌体内酵素抽出法に従って行なうこ
とができる。例えば超音波処理、各種機械的処理、酵素
処理等の方法により菌体を破砕し、不溶物を遠心分離し
た上清に酵素を回収することができる。この粗酵素を、
除核酸処理、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル過等の一般的な
酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製することによ
り、本酵素を得ることができる。
このようにして得られる本酵素とβ−ヒドロキシステ
ロイド・デヒドロゲナーゼとを、β−NADの存在下、胆
汁酸３α−硫酸を含む試料に作用させることにより、胆
汁酸３α−硫酸の定量を行なうことができる。すなわ
ち、本酵素が、胆汁酸３α−硫酸を３β−ヒドロキシ胆
汁酸に変換する。次いでβ−ヒドロキシステロイド・デ
ヒドロゲナーゼが、３β−ヒドロキシ胆汁酸を３−オキ
ソ胆汁酸に変換するとともに、該デヒドロゲナーゼの補
酵素であるNADをNADHに還元する。従って、NADからNADH
への変換量を定量することにより、胆汁酸３α−硫酸を
定量することができる。従って、β−NADの存在下に血
液又は尿に本酵素とβ−ヒドロキシステロイド・デヒド
ロゲナーゼを作用させることにより、血液又は尿中の総
胆汁酸３α−硫酸が定量できる。
ロイド・デヒドロゲナーゼとを、β−NADの存在下、胆
汁酸３α−硫酸を含む試料に作用させることにより、胆
汁酸３α−硫酸の定量を行なうことができる。すなわ
ち、本酵素が、胆汁酸３α−硫酸を３β−ヒドロキシ胆
汁酸に変換する。次いでβ−ヒドロキシステロイド・デ
ヒドロゲナーゼが、３β−ヒドロキシ胆汁酸を３−オキ
ソ胆汁酸に変換するとともに、該デヒドロゲナーゼの補
酵素であるNADをNADHに還元する。従って、NADからNADH
への変換量を定量することにより、胆汁酸３α−硫酸を
定量することができる。従って、β−NADの存在下に血
液又は尿に本酵素とβ−ヒドロキシステロイド・デヒド
ロゲナーゼを作用させることにより、血液又は尿中の総
胆汁酸３α−硫酸が定量できる。
β−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼとして
は特に制限されず、公知のものがいずれも使用できる。
は特に制限されず、公知のものがいずれも使用できる。
酵素の使用量は特に制限されないが、通常本酵素を0.
1〜1.0単位程度及びβ−ヒドロキシステロイド・デヒド
ロゲナーゼを0.1〜1.0単位程度使用すればよい。β−NA
Dの使用量も特に制限されず適宜選択すればよいが、通
常反応系中のβ−NAD濃度が0.5から5mM程度の濃度とな
るように添加すればよい。酵素反応は、通常25〜40℃程
度の温度下に、５〜30分程度行なわれる。
1〜1.0単位程度及びβ−ヒドロキシステロイド・デヒド
ロゲナーゼを0.1〜1.0単位程度使用すればよい。β−NA
Dの使用量も特に制限されず適宜選択すればよいが、通
常反応系中のβ−NAD濃度が0.5から5mM程度の濃度とな
るように添加すればよい。酵素反応は、通常25〜40℃程
度の温度下に、５〜30分程度行なわれる。
またNADHの定量は、公知の方法に従って行なうことが
できる。その具体例としては、UV（340nm）吸収測定
法、蛍光強度測定法、還元発色比色法、NADHオキシダー
ゼを作用させてNADHから過酸化水素を定量的に生成さ
せ、該過酸化水素を酸化発色で比色定量する方法等が挙
げられる。
できる。その具体例としては、UV（340nm）吸収測定
法、蛍光強度測定法、還元発色比色法、NADHオキシダー
ゼを作用させてNADHから過酸化水素を定量的に生成さ
せ、該過酸化水素を酸化発色で比色定量する方法等が挙
げられる。
更に本発明では、β−NADの存在下、血液又は尿に、
本酵素とβ−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ
に加えて３α−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナー
ゼを作用させることにより、上記原理に従って、血液又
は尿中の胆汁酸３α−硫酸をも含めた総胆汁酸が定量で
きる。
本酵素とβ−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ
に加えて３α−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナー
ゼを作用させることにより、上記原理に従って、血液又
は尿中の胆汁酸３α−硫酸をも含めた総胆汁酸が定量で
きる。
３α−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼとし
ては特に制限されず、公知のものがいずれも使用でき
る。該デヒドロゲナーゼの使用量は特に制限されない
が、通常0.1〜1.0単位程度とすればよい。その他、酵素
（本酵素及びβ−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナ
ーゼ）及びβ−NADの使用量、反応条件、生成するNADH
の定量等は、上述の場合と同様にすればよい。
ては特に制限されず、公知のものがいずれも使用でき
る。該デヒドロゲナーゼの使用量は特に制限されない
が、通常0.1〜1.0単位程度とすればよい。その他、酵素
（本酵素及びβ−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナ
ーゼ）及びβ−NADの使用量、反応条件、生成するNADH
の定量等は、上述の場合と同様にすればよい。
発明の効果 本発明によれば、新規な胆汁酸硫酸サルファターゼを
提供できる。また、β−NAD存在下に、本酵素とβ−ヒ
ドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼを共役させる
と、従来酵素法では測定が不可能であった血液又は尿中
の総胆汁酸３α−硫酸を容易に定量できる。更に、β−
NAD存在下に本酵素とβ−ヒドロキシステロイド・デヒ
ドロゲナーゼに加えて３α−ヒドロキシステロイド・デ
ヒドロゲナーゼを共役させると、血液又は尿中の胆汁酸
３α−硫酸をも含めた総胆汁酸を容易に定量できる。
提供できる。また、β−NAD存在下に、本酵素とβ−ヒ
ドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼを共役させる
と、従来酵素法では測定が不可能であった血液又は尿中
の総胆汁酸３α−硫酸を容易に定量できる。更に、β−
NAD存在下に本酵素とβ−ヒドロキシステロイド・デヒ
ドロゲナーゼに加えて３α−ヒドロキシステロイド・デ
ヒドロゲナーゼを共役させると、血液又は尿中の胆汁酸
３α−硫酸をも含めた総胆汁酸を容易に定量できる。
実施例 以下に実施例を挙げるが、本発明はこれらに制限され
るものではない。以下、実施例において「％」とあるの
は、「重量％」を意味する。
るものではない。以下、実施例において「％」とあるの
は、「重量％」を意味する。
実施例１ リン酸一アンモニウム0.1％、リン酸二アンモニウム
0.1％、リン酸一カリウム0.2％、塩化マグネシウム0.01
％、塩化マンガン0.01％及び酵母エキス1.0％より成る
培地（pH6.9）300mlを、2l容三角フラスコに入れ、オー
トクレーブで滅菌した。これに、シュードモナス・テス
トステロニーATCC11996を植菌し、28℃で24時間振盪培
養した。この種培養液を、50l容ジャー・ファンメンタ
ー中にて、上記と同組成の滅菌済培地30lに植菌し、同
時に別途滅菌した10％コール酸ナトリウム水溶液1.2lを
無菌的に加え、28℃で通気撹拌しながら15時間培養し
た。
0.1％、リン酸一カリウム0.2％、塩化マグネシウム0.01
％、塩化マンガン0.01％及び酵母エキス1.0％より成る
培地（pH6.9）300mlを、2l容三角フラスコに入れ、オー
トクレーブで滅菌した。これに、シュードモナス・テス
トステロニーATCC11996を植菌し、28℃で24時間振盪培
養した。この種培養液を、50l容ジャー・ファンメンタ
ー中にて、上記と同組成の滅菌済培地30lに植菌し、同
時に別途滅菌した10％コール酸ナトリウム水溶液1.2lを
無菌的に加え、28℃で通気撹拌しながら15時間培養し
た。
培養液を遠心分離し、得られた菌体を30mMリン酸緩衝
液（pH7.2）に懸濁し、この懸濁液をダイノミル細胞破
壊装置（ウィリー・エ・バッコーフェン社製）にかけ
て、菌体を破砕した。これを遠心分離して沈殿物を除
き、粗酵素液を得た。この粗酵素液をプロタミン硫酸で
除核酸処理した後、硫酸アンモニウムにより塩析処理
し、硫酸アンモニウム35〜70％飽和沈澱画分を集め、10
mMリン酸緩衝液（pH7.2）に透析した。この透析液を、1
0mMリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化したDEAEセルロース
（ワットマン社製）カラムに通液した。得られた非吸着
画分を、10mMリン酸緩衝液（pH6.6）で平衡化したCMセ
ルロース（ワットマン社製）カラムに通液して、活性画
分を吸着させた。このカラムに、30mMリン酸緩衝液（pH
7.8）を展開し、溶出活性画分を溶出させた。これを、
硫酸アンモニウムによる塩析処理で濃縮し、オクチル・
セファロースCL−4B（ファルマシア社製）カラムに吸着
させた。このカラムに、50mMリン酸緩衝液を通液し、溶
出する活性画分を限外過で濃縮した後、0.15M食塩を
含む50mMリン酸緩衝液で平衡化したセファアクリルＳ−
200（ファルマシア社製）カラムを通してゲル過し
た。活性画分を限外過でにより脱塩及び濃縮し、胆汁
酸硫酸サルファターゼ480単位を得た。該精製標品は、
7.5％アクリルアミド（pH8.9）によるスラブゲル電気泳
動において単一バンドを示した。
液（pH7.2）に懸濁し、この懸濁液をダイノミル細胞破
壊装置（ウィリー・エ・バッコーフェン社製）にかけ
て、菌体を破砕した。これを遠心分離して沈殿物を除
き、粗酵素液を得た。この粗酵素液をプロタミン硫酸で
除核酸処理した後、硫酸アンモニウムにより塩析処理
し、硫酸アンモニウム35〜70％飽和沈澱画分を集め、10
mMリン酸緩衝液（pH7.2）に透析した。この透析液を、1
0mMリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化したDEAEセルロース
（ワットマン社製）カラムに通液した。得られた非吸着
画分を、10mMリン酸緩衝液（pH6.6）で平衡化したCMセ
ルロース（ワットマン社製）カラムに通液して、活性画
分を吸着させた。このカラムに、30mMリン酸緩衝液（pH
7.8）を展開し、溶出活性画分を溶出させた。これを、
硫酸アンモニウムによる塩析処理で濃縮し、オクチル・
セファロースCL−4B（ファルマシア社製）カラムに吸着
させた。このカラムに、50mMリン酸緩衝液を通液し、溶
出する活性画分を限外過で濃縮した後、0.15M食塩を
含む50mMリン酸緩衝液で平衡化したセファアクリルＳ−
200（ファルマシア社製）カラムを通してゲル過し
た。活性画分を限外過でにより脱塩及び濃縮し、胆汁
酸硫酸サルファターゼ480単位を得た。該精製標品は、
7.5％アクリルアミド（pH8.9）によるスラブゲル電気泳
動において単一バンドを示した。
実施例２ 実施例１で得られた胆汁酸硫酸サルファターゼを用
い、胆汁酸３α−硫酸の定量を行なった。
い、胆汁酸３α−硫酸の定量を行なった。
β−NAD（オリエンタル酵母工業製）３μmol、β−ヒ
ドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ（シグマ社製）
0.5単位及び胆汁酸硫酸サルファターゼ0.2単位を含む35
mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）2.9mlに、基質として、濃
度の異なるリトコール酸３α−硫酸ナトリウム（シグマ
社製）水溶液又はグリコリトコール酸３α−硫酸ナトリ
ウム（シグマ社製）水溶液を0.1ml加え、30℃で10分間
反応させた後、340nmにおける吸光度を測定した。結果
を第５図に示す。第５図から、基質濃度と吸光度が正の
相関関係にあり、従って胆汁酸３α−硫酸の定量が可能
であることが判る。
ドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ（シグマ社製）
0.5単位及び胆汁酸硫酸サルファターゼ0.2単位を含む35
mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）2.9mlに、基質として、濃
度の異なるリトコール酸３α−硫酸ナトリウム（シグマ
社製）水溶液又はグリコリトコール酸３α−硫酸ナトリ
ウム（シグマ社製）水溶液を0.1ml加え、30℃で10分間
反応させた後、340nmにおける吸光度を測定した。結果
を第５図に示す。第５図から、基質濃度と吸光度が正の
相関関係にあり、従って胆汁酸３α−硫酸の定量が可能
であることが判る。
実施例３ 試薬：β−NAD（オリエンタル酵母工業製）25.2mg、
ニトロブルーテトラゾリウム（同仁化学研究所製）7.6m
g、及びジアホラーゼ（シグマ社製）10単位を、0.3％ノ
イゲンET−189（非イオン性界面活性剤、第一工業薬品
製）を含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）25mlに溶解
した。
ニトロブルーテトラゾリウム（同仁化学研究所製）7.6m
g、及びジアホラーゼ（シグマ社製）10単位を、0.3％ノ
イゲンET−189（非イオン性界面活性剤、第一工業薬品
製）を含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）25mlに溶解
した。
試薬:0.4N塩酸 測定：各種濃度のリトコール酸３α−硫酸ナトリウム
（シグマ社製）水溶液0.35mlに試薬1.25mlを加え、37
℃で５分間保持した。これに、β−ヒドロキシステロイ
ド・デヒドロゲナーゼ（シグマ社製）溶液（10単位/m
l）0.05ml及び胆汁酸硫酸サルファターゼ（２単位/ml）
0.1mlを順次添加し、混合して37℃で10分間保持し、発
色させ、試薬1.25mlを加えて反応を停止後、560nmの
吸光度を測定した。第６図に示すような良好な結果が得
られた。
（シグマ社製）水溶液0.35mlに試薬1.25mlを加え、37
℃で５分間保持した。これに、β−ヒドロキシステロイ
ド・デヒドロゲナーゼ（シグマ社製）溶液（10単位/m
l）0.05ml及び胆汁酸硫酸サルファターゼ（２単位/ml）
0.1mlを順次添加し、混合して37℃で10分間保持し、発
色させ、試薬1.25mlを加えて反応を停止後、560nmの
吸光度を測定した。第６図に示すような良好な結果が得
られた。
実施例４ グリコリトコール酸３α−硫酸（GLCA−Ｓ）を添加し
た血清を、無添加血清で種々の濃度に希釈し、試験用血
清とした。
た血清を、無添加血清で種々の濃度に希釈し、試験用血
清とした。
試験用血清0.2mlに蒸留水0.15ml及び実施例３の試薬
1.25mlを加え、以後実施例３と同様にしてGLCA−Ｓを
定量した。結果を第３表に示す。
1.25mlを加え、以後実施例３と同様にしてGLCA−Ｓを
定量した。結果を第３表に示す。
実施例５ GLCA−Ｓ及びグリコリトコール酸（GLCA）を添加した
血清を、無添加血清で種々の濃度に希釈し、試験用血清
とした。
血清を、無添加血清で種々の濃度に希釈し、試験用血清
とした。
試験用血清0.2mlに蒸留水0.15ml及び実施例３の試薬
1.25mlを加え、以後β−ヒドロキシステロイド・デヒ
ドロゲナーゼ溶液に代えてβ−ヒドロキシステロイド・
デヒドロゲナーゼと３α−ヒドロキシステロイド・デヒ
ドロゲナーゼ（シグマ社製）の混合溶液（各10単位/m
l）を使用する以外は実施例３と同様にしてGLCA−Ｓ及
びGLCAを定量した。結果を第４表に示す。
1.25mlを加え、以後β−ヒドロキシステロイド・デヒ
ドロゲナーゼ溶液に代えてβ−ヒドロキシステロイド・
デヒドロゲナーゼと３α−ヒドロキシステロイド・デヒ
ドロゲナーゼ（シグマ社製）の混合溶液（各10単位/m
l）を使用する以外は実施例３と同様にしてGLCA−Ｓ及
びGLCAを定量した。結果を第４表に示す。
第１図は、本酵素の至適pHを示すグラフである。第２図
は、本酵素の安定pHを示すグラフである。第３図は、本
酵素の至適温度を示すグラフである。第４図は、本酵素
の熱安定性を示すグラフである。第５図及び第６図は、
本発明方法による、基質（胆汁酸３α−硫酸）濃度と吸
光度の関係を示すグラフである。
は、本酵素の安定pHを示すグラフである。第３図は、本
酵素の至適温度を示すグラフである。第４図は、本酵素
の熱安定性を示すグラフである。第５図及び第６図は、
本発明方法による、基質（胆汁酸３α−硫酸）濃度と吸
光度の関係を示すグラフである。
Claims (4)
- 【請求項１】次の性状を有する胆汁酸硫酸サルファター
ゼ。 （ａ）作用：胆汁酸の３α−硫酸エステルに作用して硫
酸エステル部分を加水分解し、その際OH基の結合位置を
α配置からβ配置に逆転させ、３β−ヒドロキシ胆汁酸
を生成する。 （ｂ）基質特異性：遊離型胆汁酸の３α−硫酸エステ
ル、並びに、グリシン抱合型及びタウリン抱合型胆汁酸
の３α−硫酸エステルに作用する。 （ｃ）至適pH域:pH8.5±0.5 （ｄ）安定pH:30℃、16時間処理で、pH5.6〜7.6 （ｅ）至適温度及び熱安定性：至適温度は35℃±５℃。
pH7.2、10分間処理で、32℃の温度下では活性は100％残
存するが、それ以上の温度では急速に活性は低下し、50
℃で０％となる。 （ｆ）分子量：高速液体クロマトグラフィー法により測
定した結果、分子量約100,000である。 - 【請求項２】シュードモナス・テストステロニーに属す
る細菌を、胆汁酸を含む培地にて培養し、その培養物か
ら請求項の胆汁酸硫酸サルファターゼを採取すること
を特徴とする胆汁酸硫酸サルファターゼの製造法。 - 【請求項３】β−NADの存在下、胆汁酸の３α−硫酸エ
ステルを含む試料に、請求項記載の胆汁酸硫酸サルフ
ァターゼ及びβ−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナ
ーゼを作用させ、その際生成するNADHを定量することを
特徴とする、胆汁酸の３α−硫酸エステルの定量法。 - 【請求項４】β−NADの存在下、血液又は尿に、請求項
記載の胆汁酸硫酸サルファターゼ、β−ヒドロキシス
テロイド・デヒドロゲナーゼ及び３α−ヒドロキシステ
ロイド・デヒドロゲナーゼを作用させ、その際生成する
NADHを定量することを特徴とする、血液又は尿中の総胆
汁酸の定量法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63301415A JP2719709B2 (ja) | 1988-11-28 | 1988-11-28 | 胆汁酸硫酸サルファターゼ、その製造法及び胆汁酸の定量法 |
| PCT/JP1989/001186 WO1990006360A1 (en) | 1988-11-28 | 1989-11-21 | Bile acid sulfate sulfatase, process for its preparation and method for assaying bile acid |
| US07/548,932 US5091305A (en) | 1988-11-28 | 1989-11-21 | Bile acid sulfate sulfatase, process for its preparation and method for assaying bile acid |
| DE19893991428 DE3991428T1 (de) | 1988-11-28 | 1989-11-21 | Gallensaeuresulfatsulfatase, verfahren zu ihrer herstellung und verfahren zur gehaltsbestimmung von gallensaeure |
| DE3991428A DE3991428C2 (de) | 1988-11-28 | 1989-11-21 | Gallensäuresulfatsulfatase, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zur Gehaltsbestimmung von Gallensäure |
| NO903342A NO301843B1 (no) | 1988-11-28 | 1990-07-27 | Renset gallesyresulfatsulfatase, fremgangsmåte for fremstilling derav og fremgangsmåte for å måle gallesyre |
| US07/684,799 US5100795A (en) | 1988-11-28 | 1991-04-15 | Bile acid sulfate sulfatase, process for its preparation and method for assaying bile acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63301415A JP2719709B2 (ja) | 1988-11-28 | 1988-11-28 | 胆汁酸硫酸サルファターゼ、その製造法及び胆汁酸の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02145183A JPH02145183A (ja) | 1990-06-04 |
| JP2719709B2 true JP2719709B2 (ja) | 1998-02-25 |
Family
ID=17896604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63301415A Expired - Fee Related JP2719709B2 (ja) | 1988-11-28 | 1988-11-28 | 胆汁酸硫酸サルファターゼ、その製造法及び胆汁酸の定量法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5091305A (ja) |
| JP (1) | JP2719709B2 (ja) |
| DE (1) | DE3991428C2 (ja) |
| NO (1) | NO301843B1 (ja) |
| WO (1) | WO1990006360A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JPH0564598A (ja) * | 1991-09-06 | 1993-03-19 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | Ｎａｄｈ及びｎａｄｐｈの測定法 |
| JP3113947B2 (ja) * | 1992-02-28 | 2000-12-04 | マルキン忠勇株式会社 | 胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び胆汁酸硫酸サルファターゼの製造法 |
| JP3864191B2 (ja) * | 1994-09-13 | 2006-12-27 | アークレイ株式会社 | 硫酸抱合型胆汁酸測定一体型多層分析用具 |
| JP3760250B2 (ja) * | 1995-12-21 | 2006-03-29 | マルキンバイオ株式会社 | 硫酸抱合型胆汁酸の定量法及びそのキット |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0687777B2 (ja) * | 1986-07-08 | 1994-11-09 | 第一化学薬品株式会社 | ３α―ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物及びこれを用いる３α―ヒドロキシステロイドの定量法 |
-
1988
- 1988-11-28 JP JP63301415A patent/JP2719709B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-11-21 WO PCT/JP1989/001186 patent/WO1990006360A1/ja active Application Filing
- 1989-11-21 US US07/548,932 patent/US5091305A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-21 DE DE3991428A patent/DE3991428C2/de not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-07-27 NO NO903342A patent/NO301843B1/no not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-04-15 US US07/684,799 patent/US5100795A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO903342D0 (no) | 1990-07-27 |
| JPH02145183A (ja) | 1990-06-04 |
| US5100795A (en) | 1992-03-31 |
| WO1990006360A1 (en) | 1990-06-14 |
| US5091305A (en) | 1992-02-25 |
| NO903342L (no) | 1990-09-21 |
| NO301843B1 (no) | 1997-12-15 |
| DE3991428C2 (de) | 1996-10-10 |
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