JP2000189188A - 酵素を用いる分析方法 - Google Patents
酵素を用いる分析方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 酵素サイクリング反応に１２αハイドロ
キシステロイド脱水素酵素を用いNADまたはNADH濃度を
高感度でかつ高精度に電極上で検出する。 【効果】 酵素サイクリング用酵素として１２αハイド
ロキシステロイド脱水素酵素を用いることで極めて高感
度で簡便に補酵素濃度を定量分析することができ、特に
高感度な定量分析が要求される臨床検査分野や迅速な分
析結果が要求される食品や環境中の細菌検査等に有用で
ある。
キシステロイド脱水素酵素を用いNADまたはNADH濃度を
高感度でかつ高精度に電極上で検出する。 【効果】 酵素サイクリング用酵素として１２αハイド
ロキシステロイド脱水素酵素を用いることで極めて高感
度で簡便に補酵素濃度を定量分析することができ、特に
高感度な定量分析が要求される臨床検査分野や迅速な分
析結果が要求される食品や環境中の細菌検査等に有用で
ある。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生体成分、食品成
分、細菌等の微生物検査等に有用な酵素的分析法に関す
るものである。
分、細菌等の微生物検査等に有用な酵素的分析法に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（以下ＮＡＤと略す。）またはその還元型（以下ＮＡＤ
Ｈと略す。）は生体成分中含量の多い補酵素であり、生
体中では多くの酸化還元反応に関与している。これらＮ
ＡＤ（あるいはＮＡＤＨ）を分析する方法としてはそれ
ぞれ２６０ｎｍあるいは３４０ｎｍ付近に吸収極大を示
すためこれらの吸収を分光学的に測定する方法が知られ
ているが、本方法は感度が低い。一方これらの補酵素を
高感度に分析するための手段として酵素的サイクリング
シグナル増幅法が知られている（Ｔ．Ｓｌａｔｅｒ他，
ＡｒｃｈＩｎｔＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｉｍ，７２
巻、４２７〜４４７頁、１９６４年；Ｃ．Ｂｅｒｎｏｆ
ｓｋｙ等、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、５３巻、４５２〜４５８頁、１９７３年；Ａ．Ｊ
ｏｈａｎｎｓｓｏｎ等、ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａ
Ａｃｔａ，１４８巻、１１９〜１２４頁、１９８５
年）。
（以下ＮＡＤと略す。）またはその還元型（以下ＮＡＤ
Ｈと略す。）は生体成分中含量の多い補酵素であり、生
体中では多くの酸化還元反応に関与している。これらＮ
ＡＤ（あるいはＮＡＤＨ）を分析する方法としてはそれ
ぞれ２６０ｎｍあるいは３４０ｎｍ付近に吸収極大を示
すためこれらの吸収を分光学的に測定する方法が知られ
ているが、本方法は感度が低い。一方これらの補酵素を
高感度に分析するための手段として酵素的サイクリング
シグナル増幅法が知られている（Ｔ．Ｓｌａｔｅｒ他，
ＡｒｃｈＩｎｔＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｉｍ，７２
巻、４２７〜４４７頁、１９６４年；Ｃ．Ｂｅｒｎｏｆ
ｓｋｙ等、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、５３巻、４５２〜４５８頁、１９７３年；Ａ．Ｊ
ｏｈａｎｎｓｓｏｎ等、ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａ
Ａｃｔａ，１４８巻、１１９〜１２４頁、１９８５
年）。
【０００３】この分析法は酵素的サイクリング反応によ
るＮＡＤまたはＮＡＤＨの酸化還元反応に伴って発色す
るシグナルを、その反応の繰り返しによって増幅させ、
ＮＡＤまたはＮＡＤＨを高感度に検出する方法である。
すなわち、以下にその反応を示したように、ＮＡＤは、
アルコール脱水素酵素とその基質であるエタノール存在
下でアルコール脱水素酵素によるエタノールからアセト
アルデヒドへの酸化反応に補酵素として働き、その際に
ＮＡＤＨに還元される。この還元型ＮＡＤは、テトラゾ
リウム系色原体とジアフォラーゼ存在下に再びＮＡＤに
酸化されるが、同時にテトラゾリウム系色原体が還元さ
れて呈色したホルマザン色素が生成される。ＮＡＤはこ
のような条件下で酸化還元反応を繰り返し受けてシグナ
ル強度は反応時間と共に大きくなる。ＮＡＤＨが被検液
中に存在する場合でも同様の原理によりサイクリング反
応が進行する。
るＮＡＤまたはＮＡＤＨの酸化還元反応に伴って発色す
るシグナルを、その反応の繰り返しによって増幅させ、
ＮＡＤまたはＮＡＤＨを高感度に検出する方法である。
すなわち、以下にその反応を示したように、ＮＡＤは、
アルコール脱水素酵素とその基質であるエタノール存在
下でアルコール脱水素酵素によるエタノールからアセト
アルデヒドへの酸化反応に補酵素として働き、その際に
ＮＡＤＨに還元される。この還元型ＮＡＤは、テトラゾ
リウム系色原体とジアフォラーゼ存在下に再びＮＡＤに
酸化されるが、同時にテトラゾリウム系色原体が還元さ
れて呈色したホルマザン色素が生成される。ＮＡＤはこ
のような条件下で酸化還元反応を繰り返し受けてシグナ
ル強度は反応時間と共に大きくなる。ＮＡＤＨが被検液
中に存在する場合でも同様の原理によりサイクリング反
応が進行する。
【０００４】この酵素サイクリング系によるＮＡＤ（Ｎ
ＡＤＨ）の高感度検出系は、直接生体成分中の検出に応
用できるが、この他にアルカリホスファターゼの酵素活
性分析（Ｆ．Ｊ．Ｄｈａｈｉｒ他、ＣｌｉｎｉｃａｌＣ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８巻（２）、２２７〜２３２頁、
１９９２年）、特にアルカリホスファターゼの酵素活性
測定を利用した免疫測定系においては非常に優れた分析
方法として位置付けられている（石川英二他編、免疫測
定法、３巻、５８〜６０頁、医学書院刊）。
ＡＤＨ）の高感度検出系は、直接生体成分中の検出に応
用できるが、この他にアルカリホスファターゼの酵素活
性分析（Ｆ．Ｊ．Ｄｈａｈｉｒ他、ＣｌｉｎｉｃａｌＣ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８巻（２）、２２７〜２３２頁、
１９９２年）、特にアルカリホスファターゼの酵素活性
測定を利用した免疫測定系においては非常に優れた分析
方法として位置付けられている（石川英二他編、免疫測
定法、３巻、５８〜６０頁、医学書院刊）。
【０００５】従来、酵素サイクリング酵素としては、パ
ン酵母由来のアルコール脱水素酵素（Ｔ．Ｓｌａｔｅｒ
他，ＡｒｃｈＩｎｔＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｉｍ，７
２巻、４２７〜４４７頁、１９６４年）、ザイモモナス
属由来のアルコール脱水素酵素（特願平４−６０７４３
号）、好熱性微生物由来のアミノ酸脱水素酵素が知られ
ていた（特願平４−２９８９２４）。
ン酵母由来のアルコール脱水素酵素（Ｔ．Ｓｌａｔｅｒ
他，ＡｒｃｈＩｎｔＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｉｍ，７
２巻、４２７〜４４７頁、１９６４年）、ザイモモナス
属由来のアルコール脱水素酵素（特願平４−６０７４３
号）、好熱性微生物由来のアミノ酸脱水素酵素が知られ
ていた（特願平４−２９８９２４）。
【０００６】しかしながら、ＮＡＤあるいはＮＡＤＨ分
析の目的で酵素サイクリング反応に酵母由来のアルコー
ルデヒドロゲナーゼ、耐熱性アルコール脱水素酵素や耐
熱性アミノ酸脱水素酵素等を使用した場合、サイクリン
グ反応により感度良く分析できるものの単位時間当たり
のサイクル数には限度があった。また、より微量のＮＡ
ＤあるいはＮＡＤＨを検出する場合には上記脱水素酵素
の利用では対応できていないのが現状である。更に高感
度を達成するためには、脱水素酵素の基質例えばアルコ
ールデヒドロゲナーゼの場合はエチルアルコールを高濃
度（１００〜３００ｍＭ）反応系に用いなければなら
ず、同時に使用する他の酵素の安定性へ悪影響を及ぼす
危険性があった。また、殆どの酵素サイクリング反応は
水溶液中で行われ、着色した生成物濃度を分光光度計で
比色分析する方法が一般的であり、高精度の分析機器の
使用が必須であった。
析の目的で酵素サイクリング反応に酵母由来のアルコー
ルデヒドロゲナーゼ、耐熱性アルコール脱水素酵素や耐
熱性アミノ酸脱水素酵素等を使用した場合、サイクリン
グ反応により感度良く分析できるものの単位時間当たり
のサイクル数には限度があった。また、より微量のＮＡ
ＤあるいはＮＡＤＨを検出する場合には上記脱水素酵素
の利用では対応できていないのが現状である。更に高感
度を達成するためには、脱水素酵素の基質例えばアルコ
ールデヒドロゲナーゼの場合はエチルアルコールを高濃
度（１００〜３００ｍＭ）反応系に用いなければなら
ず、同時に使用する他の酵素の安定性へ悪影響を及ぼす
危険性があった。また、殆どの酵素サイクリング反応は
水溶液中で行われ、着色した生成物濃度を分光光度計で
比色分析する方法が一般的であり、高精度の分析機器の
使用が必須であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、さらに高感
度で、かつ高精度で簡便かつ迅速にＮＡＤおよびまたは
ＮＡＤＨ濃度を複雑な分析機器を要することなく検出す
る酵素サイクリング試薬を提供することを目的とするも
のである。
度で、かつ高精度で簡便かつ迅速にＮＡＤおよびまたは
ＮＡＤＨ濃度を複雑な分析機器を要することなく検出す
る酵素サイクリング試薬を提供することを目的とするも
のである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記課題
を解決するためＮＡＤまたはＮＡＤＨ濃度を検出する酵
素サイクリングシグナル増幅反応系において、酵素サイ
クリング反応に１２αハイドロキシステロイド脱水素酵
素（以下１２αＨＳＤと省略する。）とジアフォラーゼ
（以下ＤＩと省略する。）および電子伝達体を用いＮＡ
ＤまたはＮＡＤＨ濃度を高感度で、かつ高精度に電極上
で検出できることを見出し、本発明に到達した。つま
り、１２αＨＳＤがその基質である胆汁酸塩を酸化する
際に、補酵素ＮＡＤはＮＡＤＨに還元される。そのＮＡ
ＤＨおよび初めから存在したＮＡＤＨがＤＩにより酸化
されてＮＡＤに戻る際に、電子伝達体が還元されて、そ
の電子伝達体が電極へ電子を移送する。そして、この酵
素サイクリング反応を繰り返すことにより、ＮＡＤまた
はＮＡＤＨを電極上で高感度検出することが可能とな
る。
を解決するためＮＡＤまたはＮＡＤＨ濃度を検出する酵
素サイクリングシグナル増幅反応系において、酵素サイ
クリング反応に１２αハイドロキシステロイド脱水素酵
素（以下１２αＨＳＤと省略する。）とジアフォラーゼ
（以下ＤＩと省略する。）および電子伝達体を用いＮＡ
ＤまたはＮＡＤＨ濃度を高感度で、かつ高精度に電極上
で検出できることを見出し、本発明に到達した。つま
り、１２αＨＳＤがその基質である胆汁酸塩を酸化する
際に、補酵素ＮＡＤはＮＡＤＨに還元される。そのＮＡ
ＤＨおよび初めから存在したＮＡＤＨがＤＩにより酸化
されてＮＡＤに戻る際に、電子伝達体が還元されて、そ
の電子伝達体が電極へ電子を移送する。そして、この酵
素サイクリング反応を繰り返すことにより、ＮＡＤまた
はＮＡＤＨを電極上で高感度検出することが可能とな
る。
【０００９】１２αＨＳＤとＤＩを使用して過剰量のＮ
ＡＤ存在下に胆汁酸を分析する方法は既に公知である
（Ｎ．Ｔａｍａｓａｋａ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ
ｌｏｇｉａ Jａｐｏｎｉｃａ，２３巻（６）、６４６
〜６５１頁、１９８８年）が、本酵素を用いてＮＡＤや
ＮＡＤＨを高感度に発色法により検出できることは全く
予測できるものではなく、また電極上で該酵素による酵
素サイクリングによるシグナル増幅反応も全く予測でき
るものではなかった。
ＡＤ存在下に胆汁酸を分析する方法は既に公知である
（Ｎ．Ｔａｍａｓａｋａ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ
ｌｏｇｉａ Jａｐｏｎｉｃａ，２３巻（６）、６４６
〜６５１頁、１９８８年）が、本酵素を用いてＮＡＤや
ＮＡＤＨを高感度に発色法により検出できることは全く
予測できるものではなく、また電極上で該酵素による酵
素サイクリングによるシグナル増幅反応も全く予測でき
るものではなかった。
【００１０】すなわち、本発明は、（１）ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドおよび／またはその還元型を
分析する方法において、胆汁酸塩、１２αハイドロキシ
ステロイド脱水素酵素、ジアフォラーゼ、電子伝達能を
有する化合物、および電極を用いて酵素サイクリングシ
グナル増幅反応を行うことを特徴とする方法、（２）胆
汁酸塩、１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素、ジ
アフォラーゼ、電子伝達能を有する化合物、および電極
を用いてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび
／またはその還元型を分析する酵素サイクリングシグナ
ル増幅反応系、（３）１２αハイドロキシステロイド脱
水素酵素および／またはジアフォラーゼを固定化したニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび/またはそ
の還元型分析用の電極、に関する。
ドアデニンジヌクレオチドおよび／またはその還元型を
分析する方法において、胆汁酸塩、１２αハイドロキシ
ステロイド脱水素酵素、ジアフォラーゼ、電子伝達能を
有する化合物、および電極を用いて酵素サイクリングシ
グナル増幅反応を行うことを特徴とする方法、（２）胆
汁酸塩、１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素、ジ
アフォラーゼ、電子伝達能を有する化合物、および電極
を用いてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび
／またはその還元型を分析する酵素サイクリングシグナ
ル増幅反応系、（３）１２αハイドロキシステロイド脱
水素酵素および／またはジアフォラーゼを固定化したニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび/またはそ
の還元型分析用の電極、に関する。
【００１１】さらには、（４）１２αハイドロキシステ
ロイド脱水素酵素がバチルス属由来である（１）に記載
の方法、（５）１２αハイドロキシステロイド脱水素酵
素がバチルス属由来である（２）に記載の酵素サイクリ
ングシグナル増幅反応系、（６）１２αハイドロキシス
テロイド脱水素酵素がバチルス属由来である（３）に記
載の電極、（７）１２αハイドロキシステロイド脱水素
酵素がバチルス・スフェリクス由来である（１）または
（４）に記載の方法、（８）１２αハイドロキシステロ
イド脱水素酵素がバチルス・スフェリクス由来である
（２）または（５）に記載の酵素サイクリングシグナル
増幅反応系、（９）１２αハイドロキシステロイド脱水
素酵素がバチルス・スフェリクス由来である（３）また
は（６）に記載の電極、（１０）電極がカーボン電極で
ある（１）、（４）または（７）に記載の方法、（１
１）電極がカーボン電極である（２）、（５）または
（８）に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系、
（１２）電極がカーボン電極である（３）、（６）また
は（９）に記載の電極、（１３）胆汁酸塩がコール酸
塩、デオキシコール酸塩、タウロコール酸塩、タウロデ
オキシコール酸塩、グリココール酸塩、グリコデオキシ
コール酸塩からなる群から選ばれる胆汁酸塩である
（１）、（４）、（７）または（１０）に記載の方法、
（１４）胆汁酸塩がコール酸塩、デオキシコール酸塩、
タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、グリコ
コール酸塩、グリコデオキシコール酸塩からなる群から
選ばれる胆汁酸塩である（２）、（５）、（８）または
（１１）に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応
系、（１５）電子伝達能を有する化合物がアミノフェノ
ール類、フェロセン類、ベンゾキノン類からなる群から
選ばれる化合物である（１）、（４）、（７）、（１
０）または（１３）に記載の方法、（１６）電子伝達能
を有する化合物がアミノフェノール類、フェロセン類、
ベンゾキノン類からなる群から選ばれる化合物である
（２）、（５）、（８）、（１１）または（１４）に記
載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系、に関する。
ロイド脱水素酵素がバチルス属由来である（１）に記載
の方法、（５）１２αハイドロキシステロイド脱水素酵
素がバチルス属由来である（２）に記載の酵素サイクリ
ングシグナル増幅反応系、（６）１２αハイドロキシス
テロイド脱水素酵素がバチルス属由来である（３）に記
載の電極、（７）１２αハイドロキシステロイド脱水素
酵素がバチルス・スフェリクス由来である（１）または
（４）に記載の方法、（８）１２αハイドロキシステロ
イド脱水素酵素がバチルス・スフェリクス由来である
（２）または（５）に記載の酵素サイクリングシグナル
増幅反応系、（９）１２αハイドロキシステロイド脱水
素酵素がバチルス・スフェリクス由来である（３）また
は（６）に記載の電極、（１０）電極がカーボン電極で
ある（１）、（４）または（７）に記載の方法、（１
１）電極がカーボン電極である（２）、（５）または
（８）に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系、
（１２）電極がカーボン電極である（３）、（６）また
は（９）に記載の電極、（１３）胆汁酸塩がコール酸
塩、デオキシコール酸塩、タウロコール酸塩、タウロデ
オキシコール酸塩、グリココール酸塩、グリコデオキシ
コール酸塩からなる群から選ばれる胆汁酸塩である
（１）、（４）、（７）または（１０）に記載の方法、
（１４）胆汁酸塩がコール酸塩、デオキシコール酸塩、
タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、グリコ
コール酸塩、グリコデオキシコール酸塩からなる群から
選ばれる胆汁酸塩である（２）、（５）、（８）または
（１１）に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応
系、（１５）電子伝達能を有する化合物がアミノフェノ
ール類、フェロセン類、ベンゾキノン類からなる群から
選ばれる化合物である（１）、（４）、（７）、（１
０）または（１３）に記載の方法、（１６）電子伝達能
を有する化合物がアミノフェノール類、フェロセン類、
ベンゾキノン類からなる群から選ばれる化合物である
（２）、（５）、（８）、（１１）または（１４）に記
載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系、に関する。
【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。この発明
の酵素的測定法におけるＮＡＤおよびＮＡＤＨの検出
は、これらの両方あるいはいずれか一方を含有する検体
と、緩衝液、１２αＨＳＤ、水可溶性の胆汁酸塩、Ｄ
Ｉ、アミノフェノール類，フェロセン類またはベンゾキ
ノン類等の電子伝達体、界面活性剤等で構成されるカー
ボン電極に作用させ生じる電流を測定すればいい。
の酵素的測定法におけるＮＡＤおよびＮＡＤＨの検出
は、これらの両方あるいはいずれか一方を含有する検体
と、緩衝液、１２αＨＳＤ、水可溶性の胆汁酸塩、Ｄ
Ｉ、アミノフェノール類，フェロセン類またはベンゾキ
ノン類等の電子伝達体、界面活性剤等で構成されるカー
ボン電極に作用させ生じる電流を測定すればいい。
【００１３】本発明で使用される１２αＨＳＤとして
は、微生物由来の酵素が用いられる。市販の酵素（旭化
成工業社製、カタログ番号；Ｔ−２９）を使用してもい
いし、バチルス・スフェリクスＢ０８６５（日本国通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年
１１月１８日に受託番号：ＦＥＲＭＰ−１７０５７とし
て寄託されている）を液体培養し得られる菌体より抽出
精製したものを用いることができる。菌の培養及び精製
は下記のように行った。０．０５％コール酸ナトリウ
ム、２％ペプトン、１％酵母エキス、０．３％塩化ナト
リウム、０．１％リン酸２ナトリウム、０．０５％塩化
マグネシウム、０．０２％塩化カルシウム、０．０１％
消泡剤（シリコンＫＭ７２）の組成の滅菌培地２０リッ
トルに同一培地で前培養（３０℃、２０時間）したバチ
ルス・スフェリクスＢ０８６５の培養液１００ｍｌを移
植し、２５０回転、２０リットル／分の通気条件で１８
時間培養した。得られた培養液を５０００回転、１５分
間遠心分離して菌体を得た。
は、微生物由来の酵素が用いられる。市販の酵素（旭化
成工業社製、カタログ番号；Ｔ−２９）を使用してもい
いし、バチルス・スフェリクスＢ０８６５（日本国通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年
１１月１８日に受託番号：ＦＥＲＭＰ−１７０５７とし
て寄託されている）を液体培養し得られる菌体より抽出
精製したものを用いることができる。菌の培養及び精製
は下記のように行った。０．０５％コール酸ナトリウ
ム、２％ペプトン、１％酵母エキス、０．３％塩化ナト
リウム、０．１％リン酸２ナトリウム、０．０５％塩化
マグネシウム、０．０２％塩化カルシウム、０．０１％
消泡剤（シリコンＫＭ７２）の組成の滅菌培地２０リッ
トルに同一培地で前培養（３０℃、２０時間）したバチ
ルス・スフェリクスＢ０８６５の培養液１００ｍｌを移
植し、２５０回転、２０リットル／分の通気条件で１８
時間培養した。得られた培養液を５０００回転、１５分
間遠心分離して菌体を得た。
【００１４】菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５
１リットルに分散し、氷冷下で１５分間超音波処理して
酵素を抽出後、１５０００回転、２０分間遠心分離して
酵素粗抽出液９６５ｍｌを得た。次いでこれに等量の飽
和硫安液を加え４℃で１昼夜放置し遠心分離（１５００
０回転、２０分間）して得られた沈殿を１５０ｍｌの１
０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解した後、セファデ
ックスＧ２５カラムで脱塩した。この酵素液を１０ｍＭ
リン酸緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＤＥＡＥセファロ
ースカラム（内径５ｘ高さ１３ｃｍ）に通し酵素を吸着
させた後、５００ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．
５でカラムを洗浄し、次いで３００ｍｌの０．１Ｍ塩化
カリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、０．
２Ｍ塩化カリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．
５、３００ｍｌの０．３Ｍ塩化カリウムを含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液ｐＨ７．５、０．４Ｍ塩化カリウムを含む
１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５を順次通液した。活性
画分２８０ｍｌを集め３リットルの１０ｍＭリン酸緩衝
液ｐＨ７．５で透析した後、凍結乾燥して１９２ｍｇ
（１２５単位／ｍｇ重量）の１２αＨＳＤを得た。
１リットルに分散し、氷冷下で１５分間超音波処理して
酵素を抽出後、１５０００回転、２０分間遠心分離して
酵素粗抽出液９６５ｍｌを得た。次いでこれに等量の飽
和硫安液を加え４℃で１昼夜放置し遠心分離（１５００
０回転、２０分間）して得られた沈殿を１５０ｍｌの１
０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解した後、セファデ
ックスＧ２５カラムで脱塩した。この酵素液を１０ｍＭ
リン酸緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＤＥＡＥセファロ
ースカラム（内径５ｘ高さ１３ｃｍ）に通し酵素を吸着
させた後、５００ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．
５でカラムを洗浄し、次いで３００ｍｌの０．１Ｍ塩化
カリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、０．
２Ｍ塩化カリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．
５、３００ｍｌの０．３Ｍ塩化カリウムを含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液ｐＨ７．５、０．４Ｍ塩化カリウムを含む
１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５を順次通液した。活性
画分２８０ｍｌを集め３リットルの１０ｍＭリン酸緩衝
液ｐＨ７．５で透析した後、凍結乾燥して１９２ｍｇ
（１２５単位／ｍｇ重量）の１２αＨＳＤを得た。
【００１５】この酵素の測定試薬中の使用量は、４〜２
４単位、より好ましくは６〜１０単位である。なお、酵
素活性１単位はｐＨ８．０、３７℃で１分間にＮＡＤ存
在下デオキシコール酸を１マイクロモル脱水素する酵素
量として定義される。本酵素の活性測定は下記のように
行った。すなわち０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８．００．
１ｍｌ、１０ｍＭ ＮＡＤ ０．０５ｍｌ、０．２５％
ニトロテトラゾリウムブルー０．０５ｍｌ、２００Ｕ／
ｍｌ ＤＩ ０．０２５ｍｌ、２％トリトンＸ１００
０．０５ｍｌ、精製水０．２２５ｍｌからなる反応液
０．５ｍｌを３７℃で予備加温して１０ｍＭリン酸緩衝
液ｐＨ８で希釈した酵素液２０マイクロリットルを添加
して正確に５分間酵素反応を行った。しかる後０．５％
ＳＤＳ２．５ｍｌ添加して反応を止め５５０ｎｍの吸光
度を測定した。
４単位、より好ましくは６〜１０単位である。なお、酵
素活性１単位はｐＨ８．０、３７℃で１分間にＮＡＤ存
在下デオキシコール酸を１マイクロモル脱水素する酵素
量として定義される。本酵素の活性測定は下記のように
行った。すなわち０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８．００．
１ｍｌ、１０ｍＭ ＮＡＤ ０．０５ｍｌ、０．２５％
ニトロテトラゾリウムブルー０．０５ｍｌ、２００Ｕ／
ｍｌ ＤＩ ０．０２５ｍｌ、２％トリトンＸ１００
０．０５ｍｌ、精製水０．２２５ｍｌからなる反応液
０．５ｍｌを３７℃で予備加温して１０ｍＭリン酸緩衝
液ｐＨ８で希釈した酵素液２０マイクロリットルを添加
して正確に５分間酵素反応を行った。しかる後０．５％
ＳＤＳ２．５ｍｌ添加して反応を止め５５０ｎｍの吸光
度を測定した。
【００１６】また、この酵素の基質としてはデオキシコ
ール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシ
コール酸塩、コール酸塩、グリココール酸塩、タウロコ
ール酸塩等のいずれをも使用でき、その使用量は０．０
２〜２マイクロモル、好ましくは０．１〜０．４マイク
ロモルである。ＤＩについては、特にその由来に制限は
ないが、細菌由来の酵素が好ましく、市販の酵素を使用
できる（バチルス・メガテリウム由来酵素：旭化成工業
株式会社；カタログ番号Ｔ−０６、クロステリジウム・
エスピー由来酵素：東洋紡績株式会社；コードＤＡＤ−
３０１、バチルス・ステアロサーモフィルス由来酵素：
生化学工業株式会社；カタログ番号１００４３６）。そ
の測定試薬中の使用量は２〜１２単位、好ましくは４〜
８単位／ｍｌである。なお、酵素活性１単位はｐＨ８．
０、３７℃で１分間にニトロテトラゾリウムブルー存在
下ＮＡＤＨを１マイクロモル脱水素する酵素量として定
義した。ＤＩの酵素活性測定は下記に示す方法で行っ
た。すなわち、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）０．５
ｍｌ、０．２５％ニトロテトラゾリウムブルー０．１ｍ
ｌ、１％ウシ血清アルブミン０．１ｍｌ、１０ｍＭ Ｎ
ＡＤＨ ０．１ｍｌ、精製水０．２ｍｌからなる反応液
１ｍｌを３７℃で予備加温しこれに０．１％ウシ血清ア
ルブミンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８で希釈した
酵素液１００マイクロリットルを添加し正確に１０分後
に０．１Ｍ塩酸２ｍｌを加えて酵素反応を止め、生成し
たホルマザン色素を５５０ｎｍで比色定量した。
ール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロデオキシ
コール酸塩、コール酸塩、グリココール酸塩、タウロコ
ール酸塩等のいずれをも使用でき、その使用量は０．０
２〜２マイクロモル、好ましくは０．１〜０．４マイク
ロモルである。ＤＩについては、特にその由来に制限は
ないが、細菌由来の酵素が好ましく、市販の酵素を使用
できる（バチルス・メガテリウム由来酵素：旭化成工業
株式会社；カタログ番号Ｔ−０６、クロステリジウム・
エスピー由来酵素：東洋紡績株式会社；コードＤＡＤ−
３０１、バチルス・ステアロサーモフィルス由来酵素：
生化学工業株式会社；カタログ番号１００４３６）。そ
の測定試薬中の使用量は２〜１２単位、好ましくは４〜
８単位／ｍｌである。なお、酵素活性１単位はｐＨ８．
０、３７℃で１分間にニトロテトラゾリウムブルー存在
下ＮＡＤＨを１マイクロモル脱水素する酵素量として定
義した。ＤＩの酵素活性測定は下記に示す方法で行っ
た。すなわち、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）０．５
ｍｌ、０．２５％ニトロテトラゾリウムブルー０．１ｍ
ｌ、１％ウシ血清アルブミン０．１ｍｌ、１０ｍＭ Ｎ
ＡＤＨ ０．１ｍｌ、精製水０．２ｍｌからなる反応液
１ｍｌを３７℃で予備加温しこれに０．１％ウシ血清ア
ルブミンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８で希釈した
酵素液１００マイクロリットルを添加し正確に１０分後
に０．１Ｍ塩酸２ｍｌを加えて酵素反応を止め、生成し
たホルマザン色素を５５０ｎｍで比色定量した。
【００１７】測定試薬に用いる緩衝液としては、トリス
−塩酸緩衝液、燐酸緩衝液、各種グッド緩衝液、エタノ
ールアミン緩衝液等の中性からアルカリ性のものを使用
できる。ｐＨ範囲としては６．０〜１０．０、好ましく
は７．０〜９．０程度であり、特に好ましくは８から
８．５である。その濃度は１０〜１０００ｍＭ、好まし
くは２５〜４００ｍＭ程度である。界面活性剤として
は、非イオン性界面活性剤またはイオン性界面活性剤を
用いることができ、中でもトリトンＸ−１００等のポリ
オキシエチレン・フェニルアルキルエーテル系の界面活
性剤が好ましく、その測定試薬中の濃度は０．０１〜５
％、より好ましくは０．０５〜２％程度である。
−塩酸緩衝液、燐酸緩衝液、各種グッド緩衝液、エタノ
ールアミン緩衝液等の中性からアルカリ性のものを使用
できる。ｐＨ範囲としては６．０〜１０．０、好ましく
は７．０〜９．０程度であり、特に好ましくは８から
８．５である。その濃度は１０〜１０００ｍＭ、好まし
くは２５〜４００ｍＭ程度である。界面活性剤として
は、非イオン性界面活性剤またはイオン性界面活性剤を
用いることができ、中でもトリトンＸ−１００等のポリ
オキシエチレン・フェニルアルキルエーテル系の界面活
性剤が好ましく、その測定試薬中の濃度は０．０１〜５
％、より好ましくは０．０５〜２％程度である。
【００１８】本発明の具体的なＮＡＤまたはＮＡＤＨの
分析方法は以下のように行うことができる。すなわち、
緩衝液、界面活性剤、上記酵素１２αＨＳＤ、ＤＩ、水
可溶性胆汁酸塩から構成されるカーボン電極を作製す
る。用いる酵素類は緩衝液中に溶解させてもいいし電極
表面に固定化してもいいが、固定化した方が効率よく分
析できる。固定化はグルタルアルデヒドのような架橋性
試薬を用いて直接行ってもいいし、アミノ基を有する合
成ポリマーやアルブミンのような蛋白質を介してもい
い。酵素活性を最大限に発現する条件を適宜選ぶことが
できる。使用する電極の材料としては金、白金、カーボ
ンペースト、グラッシーカーボン等から適宜選ぶことが
できるがカーボン電極が好ましい。酵素以外の反応に必
要な成分（緩衝液、水可溶性胆汁酸塩類、電子伝達体、
界面活性剤等）は電極に酵素類を固定化する際に同時に
含浸させることもできる。このようにして得られた電極
をＮＡＤあるいはＮＡＤＨを含む試料液に浸し、一定電
圧を印加して電極間に生じる電流を測定することにより
濃度を容易に決定することができる。
分析方法は以下のように行うことができる。すなわち、
緩衝液、界面活性剤、上記酵素１２αＨＳＤ、ＤＩ、水
可溶性胆汁酸塩から構成されるカーボン電極を作製す
る。用いる酵素類は緩衝液中に溶解させてもいいし電極
表面に固定化してもいいが、固定化した方が効率よく分
析できる。固定化はグルタルアルデヒドのような架橋性
試薬を用いて直接行ってもいいし、アミノ基を有する合
成ポリマーやアルブミンのような蛋白質を介してもい
い。酵素活性を最大限に発現する条件を適宜選ぶことが
できる。使用する電極の材料としては金、白金、カーボ
ンペースト、グラッシーカーボン等から適宜選ぶことが
できるがカーボン電極が好ましい。酵素以外の反応に必
要な成分（緩衝液、水可溶性胆汁酸塩類、電子伝達体、
界面活性剤等）は電極に酵素類を固定化する際に同時に
含浸させることもできる。このようにして得られた電極
をＮＡＤあるいはＮＡＤＨを含む試料液に浸し、一定電
圧を印加して電極間に生じる電流を測定することにより
濃度を容易に決定することができる。
【００１９】使用する電子伝達体としては、１，４−ベ
ンゾキノン、トルキノン、１，４−ナフトキノン、ビタ
ミンＫ３、パラメチルアミノフェノール、２，５−ジク
ロロベンゾキノン、デュロキノン、２，５−ジメチルベ
ンゾキノン、２，６−ジメチルベンゾキノン等のキノン
類、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビ
ンアデニンジヌクレオチド等のフラビン類、４−アミノ
フェノール、４−メチルアミノフェノール、２，６−ジ
クロロフェノールインドフェノール等のフェノール類、
ヒドロキシメチルフェロセン、１ーヒドロキシエチルフ
ェロセン等のフェロセン類、フェロシアン化カリウムの
シアン化鉄類、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェ
ニレンジアミンのフェニレンジアミン類が使用できる
が、中でもアミノフェノール類、フェロセン類、ベンゾ
キノン類が好ましい。
ンゾキノン、トルキノン、１，４−ナフトキノン、ビタ
ミンＫ３、パラメチルアミノフェノール、２，５−ジク
ロロベンゾキノン、デュロキノン、２，５−ジメチルベ
ンゾキノン、２，６−ジメチルベンゾキノン等のキノン
類、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビ
ンアデニンジヌクレオチド等のフラビン類、４−アミノ
フェノール、４−メチルアミノフェノール、２，６−ジ
クロロフェノールインドフェノール等のフェノール類、
ヒドロキシメチルフェロセン、１ーヒドロキシエチルフ
ェロセン等のフェロセン類、フェロシアン化カリウムの
シアン化鉄類、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェ
ニレンジアミンのフェニレンジアミン類が使用できる
が、中でもアミノフェノール類、フェロセン類、ベンゾ
キノン類が好ましい。
【００２０】
【発明の実施の形態】次に実施例、比較例、参考例によ
って本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの
例によってなんら制限されるものではない。
って本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの
例によってなんら制限されるものではない。
【００２１】
【実施例１】鏡面仕上げした直径３ｍｍのグラッシーカ
ーボン電極（ＢＡＳ製：１１−２０１２）上に４０００
単位／ｍｌＤＩ（旭化成工業社製：カタログ番号Ｔ−０
６）と１２０００単位／ｍｌバチルス・スフェリクス由
来１２αＨＳＤの混合溶液１マイクロリットルと２％
（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液０．５マイクロリッ
トルを塗布し、室温（２５℃）で２時間静置してＤＩ、
１２αＨＳＤ同時固定電極を作製した。この酵素電極を
作用電極、飽和カロメル電極（ＢＡＳ製：１１−２０５
５）を参照電極、白金電極（ＢＡＳ製：１１−２２３
０）を対向電極としてポテンシオスタット（ＢＡＳ製：
ＢＡＳ−１００Ｂ）に接続し、３０℃での測定を行っ
た。予めサンプルホルダーに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）、１ｍＭコール酸ナトリウム、０．１ｍＭヒ
ドロキシメチルフェロセンを含む２００マイクロリット
ルを上記の固定化酵素電極を浸漬した後０．２ボルトを
３０分間印加した。しかる後終濃度で１００ｎＭになる
ようにＮＡＤＨを加え、３０℃で５分後の電流値を測定
した結果、５６ｎＡの電流（水を検体にして同様の操作
によって生じる電流値との差）が得られた。
ーボン電極（ＢＡＳ製：１１−２０１２）上に４０００
単位／ｍｌＤＩ（旭化成工業社製：カタログ番号Ｔ−０
６）と１２０００単位／ｍｌバチルス・スフェリクス由
来１２αＨＳＤの混合溶液１マイクロリットルと２％
（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液０．５マイクロリッ
トルを塗布し、室温（２５℃）で２時間静置してＤＩ、
１２αＨＳＤ同時固定電極を作製した。この酵素電極を
作用電極、飽和カロメル電極（ＢＡＳ製：１１−２０５
５）を参照電極、白金電極（ＢＡＳ製：１１−２２３
０）を対向電極としてポテンシオスタット（ＢＡＳ製：
ＢＡＳ−１００Ｂ）に接続し、３０℃での測定を行っ
た。予めサンプルホルダーに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）、１ｍＭコール酸ナトリウム、０．１ｍＭヒ
ドロキシメチルフェロセンを含む２００マイクロリット
ルを上記の固定化酵素電極を浸漬した後０．２ボルトを
３０分間印加した。しかる後終濃度で１００ｎＭになる
ようにＮＡＤＨを加え、３０℃で５分後の電流値を測定
した結果、５６ｎＡの電流（水を検体にして同様の操作
によって生じる電流値との差）が得られた。
【００２２】
【実施例２】実施例１に示した酵素固定化電極を用いて
実施例１と同様の操作により、２０、４０、６０、８
０、１００ｎＭ濃度のＮＡＤを被検液として用い分析し
た。図１に示したように高感度でＮＡＤを精度良く定量
分析することができた。
実施例１と同様の操作により、２０、４０、６０、８
０、１００ｎＭ濃度のＮＡＤを被検液として用い分析し
た。図１に示したように高感度でＮＡＤを精度良く定量
分析することができた。
【００２３】
【実施例３】実施例１に示した組成の中でコール酸ナト
リウムの代わりに、基質をタウロコール酸ナトリウム、
グリココール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウ
ム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、またはグリコ
デオキシコール酸ナトリウムを用いて得られた電流値は
表１の通りであった。
リウムの代わりに、基質をタウロコール酸ナトリウム、
グリココール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウ
ム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、またはグリコ
デオキシコール酸ナトリウムを用いて得られた電流値は
表１の通りであった。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【比較例１】実施例１の１２αＨＳＤの代わりにアルコ
ール脱水素酵素（シグマ社製）１００単位を使用、コー
ル酸の代わりにエタノールを使用し同様の操作によりＮ
ＡＤの酵素サイクリングによる定量を行った。但しエタ
ノール濃度は３００ｍＭ使用した。実施例１と同じ１０
０ｎＭ ＮＡＤＨでは全く電流値増加は観察されなかっ
た。０．１ｍＭ ＮＡＤＨを用いたとき１１０ｎＡの電
流値が得られた。
ール脱水素酵素（シグマ社製）１００単位を使用、コー
ル酸の代わりにエタノールを使用し同様の操作によりＮ
ＡＤの酵素サイクリングによる定量を行った。但しエタ
ノール濃度は３００ｍＭ使用した。実施例１と同じ１０
０ｎＭ ＮＡＤＨでは全く電流値増加は観察されなかっ
た。０．１ｍＭ ＮＡＤＨを用いたとき１１０ｎＡの電
流値が得られた。
【００２６】
【参考例１】１２５マイクロリットルの０．２Ｍリン酸
緩衝液ｐＨ８、１００マイクロリットルの０．５％ニト
ロテトラゾリウムブルー、５０マイクロリットルの５％
トリトンＸ−１００、５０マイクロリットルの８ｍＭコ
ール酸ナトリウム、４０マイクロリットルのＤＩ（７９
０単位／ｍｌ）、３０マイクロリットルの１２αＨＳＤ
（４８０単位／ｍｌ）、１０５マイクロリットルの精製
水からなる５００マイクロリットルの分析試薬を３７℃
で予備加温し、２０マイクロリットルの１００ｎＭ Ｎ
ＡＤを添加し１０分後に５００マイクロリットルの１％
ＳＤＳで反応を止めた。しかる後５５０ｎｍの吸光度を
測定した。その結果ＮＡＤＨ無添加試薬のみの吸光度は
０．０７３、ＮＡＤＨを添加した時の吸光度は０．２４
２であった。１０分間の酵素サイクリング回数は５２８
０であった。
緩衝液ｐＨ８、１００マイクロリットルの０．５％ニト
ロテトラゾリウムブルー、５０マイクロリットルの５％
トリトンＸ−１００、５０マイクロリットルの８ｍＭコ
ール酸ナトリウム、４０マイクロリットルのＤＩ（７９
０単位／ｍｌ）、３０マイクロリットルの１２αＨＳＤ
（４８０単位／ｍｌ）、１０５マイクロリットルの精製
水からなる５００マイクロリットルの分析試薬を３７℃
で予備加温し、２０マイクロリットルの１００ｎＭ Ｎ
ＡＤを添加し１０分後に５００マイクロリットルの１％
ＳＤＳで反応を止めた。しかる後５５０ｎｍの吸光度を
測定した。その結果ＮＡＤＨ無添加試薬のみの吸光度は
０．０７３、ＮＡＤＨを添加した時の吸光度は０．２４
２であった。１０分間の酵素サイクリング回数は５２８
０であった。
【００２７】
【参考例２】参考例１の１２αＨＳＤの代わりにアルコ
ール脱水素酵素（シグマ社製）２５単位を使用、コール
酸の代わりにエタノールを使用し参考例１と同様の操作
によりＮＡＤの酵素サイクリングによる定量分析を行っ
た。その結果１ｍＭエチルアルコール使用時で１０分間
のサイクリング回数は２５０、３００ｍＭエチルアルコ
ール使用時で回転数は８５０であった。
ール脱水素酵素（シグマ社製）２５単位を使用、コール
酸の代わりにエタノールを使用し参考例１と同様の操作
によりＮＡＤの酵素サイクリングによる定量分析を行っ
た。その結果１ｍＭエチルアルコール使用時で１０分間
のサイクリング回数は２５０、３００ｍＭエチルアルコ
ール使用時で回転数は８５０であった。
【００２８】
【発明の効果】本発明は、酵素サイクリング用酵素とし
て１２αＨＳＤを用いることにより極めて高感度にＮＡ
ＤあるいはＮＡＤＨを定量分析することができ、高感度
分析が要求される臨床検査分野や食品分野において有用
である。
て１２αＨＳＤを用いることにより極めて高感度にＮＡ
ＤあるいはＮＡＤＨを定量分析することができ、高感度
分析が要求される臨床検査分野や食品分野において有用
である。
【図１】酵素サイクリング法によるＮＡＤの検量線を示
すグラフ。
すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (16)
- 【請求項１】 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
および／またはその還元型を分析する方法において、胆
汁酸塩、１２αハイドロキシステロイド脱水素酵素、ジ
アフォラーゼ、電子伝達能を有する化合物、および電極
を用いて酵素サイクリングシグナル増幅反応を行うこと
を特徴とする方法。 - 【請求項２】 胆汁酸塩、１２αハイドロキシステロイ
ド脱水素酵素、ジアフォラーゼ、電子伝達能を有する化
合物、および電極を用いてニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドおよび／またはその還元型を分析する酵素サ
イクリングシグナル増幅反応系。 - 【請求項３】 １２αハイドロキシステロイド脱水素酵
素および／またはジアフォラーゼを固定化した、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／またはその還
元型分析用の電極。 - 【請求項４】 １２αハイドロキシステロイド脱水素酵
素がバチルス属由来である請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 １２αハイドロキシステロイド脱水素酵
素がバチルス属由来である請求項２に記載の酵素サイク
リングシグナル増幅反応系。 - 【請求項６】 １２αハイドロキシステロイド脱水素酵
素がバチルス属由来である請求項３に記載の電極。 - 【請求項７】 １２αハイドロキシステロイド脱水素酵
素がバチルス・スフェリクス由来である請求項１または
４に記載の方法。 - 【請求項８】 １２αハイドロキシステロイド脱水素酵
素がバチルス・スフェリクス由来である請求項２または
５に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系。 - 【請求項９】 １２αハイドロキシステロイド脱水素酵
素がバチルス・スフェリクス由来である請求項３または
６に記載の電極。 - 【請求項１０】 電極がカーボン電極である請求項１、
４または７に記載の方法。 - 【請求項１１】 電極がカーボン電極である請求項２、
５または８に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応
系。 - 【請求項１２】 電極がカーボン電極である請求項３、
６または９に記載の電極。 - 【請求項１３】 胆汁酸塩がコール酸塩、デオキシコー
ル酸塩、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸
塩、グリココール酸塩、グリコデオキシコール酸塩から
なる群から選ばれる胆汁酸塩である請求項１、４、７ま
たは１０に記載の方法。 - 【請求項１４】 胆汁酸塩がコール酸塩、デオキシコー
ル酸塩、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸
塩、グリココール酸塩、グリコデオキシコール酸塩から
なる群から選ばれる胆汁酸塩である請求項２、５、８ま
たは１１に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応
系。 - 【請求項１５】 電子伝達能を有する化合物がアミノフ
ェノール類、フェロセン類、ベンゾキノン類からなる群
から選ばれる化合物である請求項１、４、７、１０また
は１３に記載の方法。 - 【請求項１６】 電子伝達能を有する化合物がアミノフ
ェノール類、フェロセン類、ベンゾキノン類からなる群
から選ばれる化合物である請求項２、５、８、１１また
は１４に記載の酵素サイクリングシグナル増幅反応系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36638798A JP4364331B2 (ja) | 1998-12-24 | 1998-12-24 | 酵素を用いる分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36638798A JP4364331B2 (ja) | 1998-12-24 | 1998-12-24 | 酵素を用いる分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000189188A true JP2000189188A (ja) | 2000-07-11 |
| JP4364331B2 JP4364331B2 (ja) | 2009-11-18 |
Family
ID=18486661
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP36638798A Expired - Fee Related JP4364331B2 (ja) | 1998-12-24 | 1998-12-24 | 酵素を用いる分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4364331B2 (ja) |
Cited By (6)
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|---|---|---|---|---|
| WO2002025262A1 (fr) * | 2000-09-25 | 2002-03-28 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Electrode a enzyme |
| JP2005304483A (ja) * | 2004-03-24 | 2005-11-04 | Asahi Kasei Pharma Kk | アルカリフォスファターゼ測定法 |
| US7267986B2 (en) | 2002-03-19 | 2007-09-11 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Method of detecting inorganic phosphoric acid, pyrophosphate and nucleic acid, and method of typing SNP sequence of DNA |
| JPWO2006104077A1 (ja) * | 2005-03-29 | 2008-09-04 | シーシーアイ株式会社 | バイオセンサ |
| JP2015072288A (ja) * | 2009-08-31 | 2015-04-16 | パナソニックヘルスケアホールディングス株式会社 | センサ及び濃度測定方法 |
| JP2020076765A (ja) * | 2018-11-02 | 2020-05-21 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | ステロイドの測定方法、ステロイドの測定キット及びストレス度の測定方法 |
-
1998
- 1998-12-24 JP JP36638798A patent/JP4364331B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| US7169273B2 (en) | 2000-09-25 | 2007-01-30 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Enzyme electrode |
| JP4721618B2 (ja) * | 2000-09-25 | 2011-07-13 | 旭化成株式会社 | 酵素電極 |
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