JPS61128899A - 基質又は酵素の測定法 - Google Patents
基質又は酵素の測定法Info
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- JPS61128899A JPS61128899A JP24938984A JP24938984A JPS61128899A JP S61128899 A JPS61128899 A JP S61128899A JP 24938984 A JP24938984 A JP 24938984A JP 24938984 A JP24938984 A JP 24938984A JP S61128899 A JPS61128899 A JP S61128899A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
皮業上夏肌朋分界
本発明は、チューブやセルを汚すことな（正確かつ迅速
に基質又は酵素を測定することを可能とした方法に関す
る。
に基質又は酵素を測定することを可能とした方法に関す
る。
従来夏肢屯
臨床検査室で生体物質を可視部にて測定する方法を発色
方法の点から見ると、過酸化水素を発生させてペルオキ
シダーゼを用い又は非酵素的に赤〜緑色に発色させる方
法、脱水素酵嵜を利用してＮＡＤ にコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド）／ＮＡＤＨにコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド還元型）又はＮＡＤＰ にコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドホスフェート）／ＮＡＤＰＨ
にコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート還
元型）の変化を紫外部で測定する方法及びＮＡ、ＤＨ，
Ｎ、ＡＤＰＨをホルマザン発色に導く方法に大別される
。
方法の点から見ると、過酸化水素を発生させてペルオキ
シダーゼを用い又は非酵素的に赤〜緑色に発色させる方
法、脱水素酵嵜を利用してＮＡＤ にコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド）／ＮＡＤＨにコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド還元型）又はＮＡＤＰ にコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドホスフェート）／ＮＡＤＰＨ
にコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート還
元型）の変化を紫外部で測定する方法及びＮＡ、ＤＨ，
Ｎ、ＡＤＰＨをホルマザン発色に導く方法に大別される
。
一方、近年、自動分析の進歩とあいまって、グルコース
オキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダー
ゼ、ピルビン酸オキシダーゼ等の過酸化水素を生成させ
ることのできる酵素が数多く開発され、生体物質を容易
に且つ迅速に測定することが可能となってきた。
オキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダー
ゼ、ピルビン酸オキシダーゼ等の過酸化水素を生成させ
ることのできる酵素が数多く開発され、生体物質を容易
に且つ迅速に測定することが可能となってきた。
自動分析装置による測定では上記した発色法のうち、過
酸化水素発色法及びＮＡＤ／ＮＡＤＨ（又はＮＡＤ’Ｐ
／ＮＡＤＰＨ）を検出系に用いる紫外部吸収法のいずれ
も適用可能である。
酸化水素発色法及びＮＡＤ／ＮＡＤＨ（又はＮＡＤ’Ｐ
／ＮＡＤＰＨ）を検出系に用いる紫外部吸収法のいずれ
も適用可能である。
また、上記したホルマザン発色法は、過酸化水素発色に
導くことの出来ない脱水素酵素を利用する反応に対して
適用されるもので、例えばＬＤＨ−（乳酸脱水素酵素）
゛を可視部で測定する場合に下記の反応式に示されるよ
うにＬＩ）Ｈによって生じたＮ Ａ Ｄ ＨをＰＭＳ
（フェナジンメトスルフェート）、１−メトキシＰＭＳ
（１−メトキシフェナジンメトスルフェート）等の電
子伝達体を介して紫色のホルマザン発色に導くものであ
る。
導くことの出来ない脱水素酵素を利用する反応に対して
適用されるもので、例えばＬＤＨ−（乳酸脱水素酵素）
゛を可視部で測定する場合に下記の反応式に示されるよ
うにＬＩ）Ｈによって生じたＮ Ａ Ｄ ＨをＰＭＳ
（フェナジンメトスルフェート）、１−メトキシＰＭＳ
（１−メトキシフェナジンメトスルフェート）等の電
子伝達体を介して紫色のホルマザン発色に導くものであ
る。
ＬＤＨ
Ｃ式中、ＮＴＢはニトロテトラゾリウムブルー、Ｎ Ｔ
、 ］’３ Ｈはニトロテトラゾリウムブルー還元型で
ある。） 発側ｆ賀状山Ｊご目ご［ぞ皿測立 しかし、ホルマザン発色法では、ホルマザン発色物質に
よるチューブやセルに対する沈着が強くそれらの汚れの
問題を惹起するため自動分析には殆ど用いられず、用手
法をもちいざるを得ないという欠点があった。
、 ］’３ Ｈはニトロテトラゾリウムブルー還元型で
ある。） 発側ｆ賀状山Ｊご目ご［ぞ皿測立 しかし、ホルマザン発色法では、ホルマザン発色物質に
よるチューブやセルに対する沈着が強くそれらの汚れの
問題を惹起するため自動分析には殆ど用いられず、用手
法をもちいざるを得ないという欠点があった。
■題奎鮎火ｔゑ火汝勿王役
本発明は、上述したホルマザン発色法の欠点を解消すべ
〈発明されたもので、脱水素酵素反応で生成したＮＡＤ
Ｈ（又はＮＡ、ＤＰＨ）を電子伝達体を介して過酸化水
素の生成に導きかつスーパオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）によってその過酸化水素生成反応を促進させるよう
にすることを可能としたものである。本発明方法の反応
機序とし 、では次のようなものが考えられる。
〈発明されたもので、脱水素酵素反応で生成したＮＡＤ
Ｈ（又はＮＡ、ＤＰＨ）を電子伝達体を介して過酸化水
素の生成に導きかつスーパオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）によってその過酸化水素生成反応を促進させるよう
にすることを可能としたものである。本発明方法の反応
機序とし 、では次のようなものが考えられる。
以下余白
脱水素酵素
ＮＡＤ （Ｐ） ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ（上式中、ＮＡ
Ｄ（Ｐ’）はＮＡＤ又はＮＡＤＰを意味し、”ＮＡ’Ｄ
（Ｐ）ＨはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを意味するもので
ある。） 上記Ｈ潜住成反応をＳＯＤによって促進させるとともに
生成したＨ２％を色原体を用いて酵素的又は非酵素的に
発色させる点に特徴を有するものである。要するに、゛
還元型電子伝達体が反応液中の溶存酸素によって元の酸
化型に復帰する際、Ｈ２雫を生じかつこの馬ｑ生成反応
がＳＯＤによって促進される点に着目することによって
本発明の完成に至ったものである。
Ｄ（Ｐ’）はＮＡＤ又はＮＡＤＰを意味し、”ＮＡ’Ｄ
（Ｐ）ＨはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを意味するもので
ある。） 上記Ｈ潜住成反応をＳＯＤによって促進させるとともに
生成したＨ２％を色原体を用いて酵素的又は非酵素的に
発色させる点に特徴を有するものである。要するに、゛
還元型電子伝達体が反応液中の溶存酸素によって元の酸
化型に復帰する際、Ｈ２雫を生じかつこの馬ｑ生成反応
がＳＯＤによって促進される点に着目することによって
本発明の完成に至ったものである。
本発明は、従来のホルマザン法の欠点を解消し、チュー
ブやセルを汚すことがなくなり、自動分析にものりやす
くした基質又は酵素の演ｊ定法を提供することを目的と
する。
ブやセルを汚すことがなくなり、自動分析にものりやす
くした基質又は酵素の演ｊ定法を提供することを目的と
する。
本発明方法の要旨は、Ｎ Ａ Ｄ Ｈ又はＮＡＤＰＨ又
はこれらの誘導体を経由して基質又は酵素を測定する方
法において、電子伝達体を介して過酸化水素を生成せし
める反応でスーパオキシドジスムターゼを加えて反応を
促進させ、その生成した過酸化水素を酵素的又は非酵素
的に発色せしめて定量することを特徴とする基質又は酵
素の測定法に存する。
はこれらの誘導体を経由して基質又は酵素を測定する方
法において、電子伝達体を介して過酸化水素を生成せし
める反応でスーパオキシドジスムターゼを加えて反応を
促進させ、その生成した過酸化水素を酵素的又は非酵素
的に発色せしめて定量することを特徴とする基質又は酵
素の測定法に存する。
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの誘導体とは、３−アセチルピ
リジンアデニンジヌクレオチド還元型の他、例えばＢＲ
ＵＣＥ Ｍ、八ＮＤＥＲ３ＯＮ。
リジンアデニンジヌクレオチド還元型の他、例えばＢＲ
ＵＣＥ Ｍ、八ＮＤＥＲ３ＯＮ。
ｅｔ ａｌ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、＋２３４．
１２１９ （１９５９） 、ＢＲＵＣＥ Ｍ、ＡＮ
ＤＥＲ３ＯＮ、ｅｔ ａｌ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、、２３４，１２２６ｉ （１，９５９）等に記載さ
れている還元型のものをいう。
１２１９ （１９５９） 、ＢＲＵＣＥ Ｍ、ＡＮ
ＤＥＲ３ＯＮ、ｅｔ ａｌ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、、２３４，１２２６ｉ （１，９５９）等に記載さ
れている還元型のものをいう。
本発明で用いられる電子伝達体としては、フェナジンメ
トスルフェー） （ＰＭＳ） 、１−メトキシフェナ
ジンメトスルフェート （１−メトキシＰＭＳ）、フェ
ナジンエトスルフェ−１１ＰＥＳ）等をあげることがで
き、又ジアホラーゼのごとき酵素も包含される。
トスルフェー） （ＰＭＳ） 、１−メトキシフェナ
ジンメトスルフェート （１−メトキシＰＭＳ）、フェ
ナジンエトスルフェ−１１ＰＥＳ）等をあげることがで
き、又ジアホラーゼのごとき酵素も包含される。
本発明方法における非酵素的発色方法としては、公知の
方法が採用出来るが、例えばＴｉ −ＰＡＲ法（松原チ
ヨ等、分析化学、Ｖｏｌ、、２９．１９８０年、７５９
〜７６４頁）並びにＴｔ−ＸＯ法、Ｔｉ−ＣＡＳ法、Ｔ
ｉ−ＥＤＴＡ法及びＣ。
方法が採用出来るが、例えばＴｉ −ＰＡＲ法（松原チ
ヨ等、分析化学、Ｖｏｌ、、２９．１９８０年、７５９
〜７６４頁）並びにＴｔ−ＸＯ法、Ｔｉ−ＣＡＳ法、Ｔ
ｉ−ＥＤＴＡ法及びＣ。
−Ｅ、ＤＴＡ法（松原チヨ等、薬学雑誌、■０１゜９７
．１９７７年、４１〜４５頁）等を用いればよい。
．１９７７年、４１〜４５頁）等を用いればよい。
本発明方法が適用される反応の例としては次の如きもの
をあげることができる。
をあげることができる。
■グルコースの定量
（ａ） ムタロターゼ
α−グルコース β−グルコースグルコース
デヒドロゲナーゼ （ｂｌ へキソキナーゼ グルコース−６−リン酸脱水素酵素 ■コレステロールの測定 （ａｌ総コレステロールの測定 コレステロールエステラーゼ エステル型 −＞ 遊ｍ型コレステロールコレステロ
ール コレステロールデヒドロゲナーゼ ＮＡＤ （Ｐ） ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ以下余白 （ｂｌ＆離型コレステロールの測定 コレステロールデードロゲナーゼ ＮＡＤ （Ｐ） 、 、、ＮＡＤ 、（Ｐ）７
（■胆汁酸の測定 ３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＮＡＤ
（Ｐ） 、 ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ■乳酸の測定 乳酸脱水素酵素 − ＮＡＤ （Ｐ＞ 、 ＮＡＤ （Ｐ
） Ｈ以下余白 ■乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の測定 ＬＤＨ ＮＡＤ （Ｐ） ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ■ＧＯＴ−
ＧＰＴの測定 Ｌ−アスパラギン酸＋α−ケトゲルタール酸ＯＴ −一一一÷オキザロ酢酸＋Ｌ−グルタミン酸し一アラニ
ン＋α−ケトゲルタール酸 ＰＴ −十ピルピン酸＋Ｌ−１”ルタミン酸 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ＮＡＤ （Ｐ） ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ以下余白 ■タレアチンキナーゼ（ＣＫ）の測定 Ｋ クレアチンリン酸−シフレアチン＋ＡＴＰ＋ＡＤＰ ヘキソキナーゼ ＡＴＰ＋グルコースー−＋ Ａ ［） ｐ ＋グルコー
スー ６−リン酸 グルコース−６−リン酸脱水素酵素 （上式中、ＡＴＰはアデノシントリホスフェート、ＡＤ
Ｐはアデノシンジホスフェートである。）上記の反応の
如く生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子伝達体を介
して過酸化水素発色に導くものである。すなわち、過酸
化水素をペルオキシダーゼの存在下で４−アミノアンチ
ピリン及び水素供与体を反応させて有色の発色物質を生
成させる。この水素供与体としては、フェノール、２゜
４−ジクロロフェノール、ｐ−クロルフェノール、Ｎ、
Ｎ−ジメチルメタトルイジン、Ｎ、Ｎ−ジエチルメタト
ルイジン、ＴＯＯ３（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム
）等が用いられる。また、過酸化水素を発色させるため
のＭＢＴＨ（塩酸３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン
ヒドラゾン）やジメチルアニリン、ジエチルアニリン等
の組合せも可能である。更に、ペルオキシダーゼ存在下
で第３因子（４−アミノアンチピリン等）なしに過酸化
水素を発色させることのできる発色剤（フェニレンジア
ミン及びその誘導体、ＭＣＤＰ、ＢＣＭＡ等）を用いる
ことも出来る。
デヒドロゲナーゼ （ｂｌ へキソキナーゼ グルコース−６−リン酸脱水素酵素 ■コレステロールの測定 （ａｌ総コレステロールの測定 コレステロールエステラーゼ エステル型 −＞ 遊ｍ型コレステロールコレステロ
ール コレステロールデヒドロゲナーゼ ＮＡＤ （Ｐ） ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ以下余白 （ｂｌ＆離型コレステロールの測定 コレステロールデードロゲナーゼ ＮＡＤ （Ｐ） 、 、、ＮＡＤ 、（Ｐ）７
（■胆汁酸の測定 ３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＮＡＤ
（Ｐ） 、 ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ■乳酸の測定 乳酸脱水素酵素 − ＮＡＤ （Ｐ＞ 、 ＮＡＤ （Ｐ
） Ｈ以下余白 ■乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の測定 ＬＤＨ ＮＡＤ （Ｐ） ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ■ＧＯＴ−
ＧＰＴの測定 Ｌ−アスパラギン酸＋α−ケトゲルタール酸ＯＴ −一一一÷オキザロ酢酸＋Ｌ−グルタミン酸し一アラニ
ン＋α−ケトゲルタール酸 ＰＴ −十ピルピン酸＋Ｌ−１”ルタミン酸 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ＮＡＤ （Ｐ） ＮＡＤ （Ｐ）Ｈ以下余白 ■タレアチンキナーゼ（ＣＫ）の測定 Ｋ クレアチンリン酸−シフレアチン＋ＡＴＰ＋ＡＤＰ ヘキソキナーゼ ＡＴＰ＋グルコースー−＋ Ａ ［） ｐ ＋グルコー
スー ６−リン酸 グルコース−６−リン酸脱水素酵素 （上式中、ＡＴＰはアデノシントリホスフェート、ＡＤ
Ｐはアデノシンジホスフェートである。）上記の反応の
如く生成したＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子伝達体を介
して過酸化水素発色に導くものである。すなわち、過酸
化水素をペルオキシダーゼの存在下で４−アミノアンチ
ピリン及び水素供与体を反応させて有色の発色物質を生
成させる。この水素供与体としては、フェノール、２゜
４−ジクロロフェノール、ｐ−クロルフェノール、Ｎ、
Ｎ−ジメチルメタトルイジン、Ｎ、Ｎ−ジエチルメタト
ルイジン、ＴＯＯ３（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム
）等が用いられる。また、過酸化水素を発色させるため
のＭＢＴＨ（塩酸３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン
ヒドラゾン）やジメチルアニリン、ジエチルアニリン等
の組合せも可能である。更に、ペルオキシダーゼ存在下
で第３因子（４−アミノアンチピリン等）なしに過酸化
水素を発色させることのできる発色剤（フェニレンジア
ミン及びその誘導体、ＭＣＤＰ、ＢＣＭＡ等）を用いる
ことも出来る。
以上の如き構成により、本発明方法によれば、従来のホ
ルマザン発色法の欠点が解消され、チューブやセルが発
色物質によって汚されることがなくなり、基質又は酵素
の測定が自動分析にのりやすくなるという効果を奏する
ものである。
ルマザン発色法の欠点が解消され、チューブやセルが発
色物質によって汚されることがなくなり、基質又は酵素
の測定が自動分析にのりやすくなるという効果を奏する
ものである。
災施桝
以下に実施例を挙げて本発明方法をさらに説明する。
実施例Ｉ
ＮＡＤＨの定量
試薬組成
Ｒ・１液
リン酸緩衝液−−−−−−−−−−−−−−−−−−５
０ｍ Ｍ、 ｐ Ｈ７、０１−メトキシＰ Ｍ Ｓ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０、０７ｍ
ＭＳＯＤ ’−’−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−５０Ｕ
７ ｍ Ａ’Ｒ・２液 リン酸緩衝液−−−−−−−−−−−−５００ｍＭ、
ｐ Ｈ６、０４−アミノアンチピリンー−−−−−−−
−−−−−１、０８ｍ ＭＴ ＯＯＳ −−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−１、８ｍ Ｍベルオキシダーゼー−−−一
−−−・−−−−−−−−−−−−−−−−１２Ｕ ／
ｍ ｊ！約５ｍＭのＮＡＤＨを含む試料を炭酸水素ナ
トリウムの溶液で１１５〜５１５に５段階希釈し直線性
を検討した。
０ｍ Ｍ、 ｐ Ｈ７、０１−メトキシＰ Ｍ Ｓ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０、０７ｍ
ＭＳＯＤ ’−’−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−５０Ｕ
７ ｍ Ａ’Ｒ・２液 リン酸緩衝液−−−−−−−−−−−−５００ｍＭ、
ｐ Ｈ６、０４−アミノアンチピリンー−−−−−−−
−−−−−１、０８ｍ ＭＴ ＯＯＳ −−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−１、８ｍ Ｍベルオキシダーゼー−−−一
−−−・−−−−−−−−−−−−−−−−１２Ｕ ／
ｍ ｊ！約５ｍＭのＮＡＤＨを含む試料を炭酸水素ナ
トリウムの溶液で１１５〜５１５に５段階希釈し直線性
を検討した。
試料５０μｌをＲ−１液２ ｍ ｌに加え、室温に１０
分間放置後、Ｒ・２液１ｍ７！を加えた。次いで、５分
間放置して５５５ｎｍで吸光度を測定した。
分間放置後、Ｒ・２液１ｍ７！を加えた。次いで、５分
間放置して５５５ｎｍで吸光度を測定した。
測定結果を添付図面に示したが、吸光度が１゜５を示す
迄、良好な直線性を示した。
迄、良好な直線性を示した。
実施例２
グルコースの定量
試薬組成
Ｒ・１液
リン酸緩衝液−−−−−−−−−−−−−−−５０ｍ
Ｍ、 ｐ Ｈ７、０Ａ Ｔ Ｐ −−−−−−−−−
−−−−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−２ｍ Ｍβ−
Ｎ Ａ Ｄ −・−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−２ｍ Ｍへキソキナーゼーーーー−−−・−一−
−−−−−−−−−・０．４４Ｕ／ｍβグルコースー６
−リン酸− デヒドロゲナーゼー−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−４、５Ｕ ／ ｍ ７！塩化マグネシウムー−
−−−−−−一−−−−−−−・−−−−−・−−−−
−−一−−−−−−・２ｍＭ１−メトキシＰ Ｍ Ｓ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０、０７ｍ
ＭＳ ＯＤ 〜−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−一−−−−−−−−−−
５０Ｕ ／ ｍ ＡＲ・２液 リン酸緩衝液−−−−−−−−−−−−５００ｍＭ、
ｐ Ｈ６、０４−アミノアンチピリン・−−−−−−
−−−−−１、０８ｍ ＭＴ ＯＯＳ −−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−１、８ｍＭペルオキシダーゼ−・
−−−−−−一一一−−・−−−−−−−−１２Ｕ ／
ｍ Ｉ！６００■／ｄＩのグルコース水溶液を水で１
１５〜５１５に５段階希釈し、直線性を検討した。
Ｍ、 ｐ Ｈ７、０Ａ Ｔ Ｐ −−−−−−−−−
−−−−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−２ｍ Ｍβ−
Ｎ Ａ Ｄ −・−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−２ｍ Ｍへキソキナーゼーーーー−−−・−一−
−−−−−−−−−・０．４４Ｕ／ｍβグルコースー６
−リン酸− デヒドロゲナーゼー−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−４、５Ｕ ／ ｍ ７！塩化マグネシウムー−
−−−−−−一−−−−−−−・−−−−−・−−−−
−−一−−−−−−・２ｍＭ１−メトキシＰ Ｍ Ｓ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０、０７ｍ
ＭＳ ＯＤ 〜−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−一−−−−−−−−−−
５０Ｕ ／ ｍ ＡＲ・２液 リン酸緩衝液−−−−−−−−−−−−５００ｍＭ、
ｐ Ｈ６、０４−アミノアンチピリン・−−−−−−
−−−−−１、０８ｍ ＭＴ ＯＯＳ −−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−１、８ｍＭペルオキシダーゼ−・
−−−−−−一一一−−・−−−−−−−−１２Ｕ ／
ｍ Ｉ！６００■／ｄＩのグルコース水溶液を水で１
１５〜５１５に５段階希釈し、直線性を検討した。
試料１０ｐｌをＲ・１液２ｍ７！に加え、３７℃で１０
分間反応後、Ｒ・２液１ｍ７Ｉを加えた。次いで、５分
間室温に放置後、５５５ｎｍで吸光度を測定した。グル
コース６００■／ｄ１まで良好な直線性を示した。 本
実施例での従来法（グルコースオキシターゼ・過酸化水
素発色法）との相関は）’＝１．０６ｘ＋２０． ｒ
＝０．９’９９ （ｎ＝２５）であった。
分間反応後、Ｒ・２液１ｍ７Ｉを加えた。次いで、５分
間室温に放置後、５５５ｎｍで吸光度を測定した。グル
コース６００■／ｄ１まで良好な直線性を示した。 本
実施例での従来法（グルコースオキシターゼ・過酸化水
素発色法）との相関は）’＝１．０６ｘ＋２０． ｒ
＝０．９’９９ （ｎ＝２５）であった。
実施例３
遊離型コレステロールの測定
試薬組成
Ｒ・１液
トリス−リン酸緩衝液
一−−−−−−−−−−−−−−−Ｉ Ｑ Ｏｍ Ｍ、
ｐ Ｈ８、６ＮＡ Ｄ −−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−一−−−−−−−−−−−−−２０ｍＭコレステロー
ルデヒドロゲナーゼ（３β−ヒドロキシステロイドＮＡ
Ｄ （Ｐ）オキシドレダクターゼ） −−一−−・−−
−−−−−−・−・−・−−−−−−−−一〜−−−−
−−−０、８Ｕ ／ ｍρ１−メトキシＰ Ｍ Ｓ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−０、０７ｍ Ｍ
Ｓ ＯＤ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
５０Ｕ ／ ｍ Ａ！トリトンＸ−１００−・−一−−
−−・−−一−−−・・−・−−−−−−−−−−０、
４％Ｒ・２液 リン酸緩衝液−−−−−−−−−−−５００ｍＭ、
ｐ Ｈ６、０４−アミノアンチビリンー−−−−−−−
−−−−１、０８ｍ ＭＴ ＯＯＳ −−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−１、８ｍ Ｍペルオキシダーゼ−・−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−１２Ｕ
／ ｍ １８００■／ｄ１コレステロール溶液を水で
１１５〜５１５に５段階希釈して直線性を検討した。
ｐ Ｈ８、６ＮＡ Ｄ −−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−一−−−−−−−−−−−−−２０ｍＭコレステロー
ルデヒドロゲナーゼ（３β−ヒドロキシステロイドＮＡ
Ｄ （Ｐ）オキシドレダクターゼ） −−一−−・−−
−−−−−−・−・−・−−−−−−−−一〜−−−−
−−−０、８Ｕ ／ ｍρ１−メトキシＰ Ｍ Ｓ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−０、０７ｍ Ｍ
Ｓ ＯＤ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
５０Ｕ ／ ｍ Ａ！トリトンＸ−１００−・−一−−
−−・−−一−−−・・−・−−−−−−−−−−０、
４％Ｒ・２液 リン酸緩衝液−−−−−−−−−−−５００ｍＭ、
ｐ Ｈ６、０４−アミノアンチビリンー−−−−−−−
−−−−１、０８ｍ ＭＴ ＯＯＳ −−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−１、８ｍ Ｍペルオキシダーゼ−・−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−１２Ｕ
／ ｍ １８００■／ｄ１コレステロール溶液を水で
１１５〜５１５に５段階希釈して直線性を検討した。
試料１０ｕｌｌをＲ・１液１ｍＡに加え、３７℃で１５
分間反応後、Ｒ・２液２ｍ １２を加えた。次いで、５
分間室温に放置後、５５５ｎｍで吸光度を測定した。コ
レステロール６００■／ｄｉまで良好な直線性を示した
。
分間反応後、Ｒ・２液２ｍ １２を加えた。次いで、５
分間室温に放置後、５５５ｎｍで吸光度を測定した。コ
レステロール６００■／ｄｉまで良好な直線性を示した
。
実施例４
総コレステロールの測定
試薬組成
Ｒ・１液
トリス−リン酸緩衝液
−−−−−−−−−−−４００ｍＭ、 Ｉ） Ｈ８、
６Ｎ Ａ Ｄ −−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−２０ｍ Ｍコレステロールエステラーゼ−
・−−−−−・−２Ｕ ／ ｍ Ａコレステロールデヒ
ドロゲナーゼ（３β−ヒドロキシステロイドＮＡＤ （
Ｐ）オキシドレダクターゼ＞ −−−−−−・−−−−
−−一−−−−−−−−・−−−−一−−〜−−−−−
−−−０、’８ Ｕ ／ ｍ ｊ！１−メトキシＰ Ｍ
Ｓ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０
、０７ｍ ＭＳ ＯＤ −−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−５０Ｕ ／ ｍ ＲトリトンＸ −１００−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０、
４％コール酸ナトリウム−−−−−−−−−−−・−−
−−一・−３７０■／ｐＲ・２液 リン酸緩衝液−−−−−−−−−−−−−５００ｍＭ、
ｐ Ｈ６、０４−アミノアンチピリンー−−−−−
−−−−１、０８ｍ ＭＴ ＯＯＳ −−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−１、８ｍ Ｍペルオキシダーゼ−・
・−−−−−・−一−−−−−−−−−・−・１２Ｕ／
ｍｊ！５００■／ｄ１のコレステロールをもつヒト血清
を水で１７５〜５１５に５段階希釈し、実施例３と同様
の操作で直線性を検討した。総コレステロール５００．
ｍｇ／ｒＵ以下で良好な直線性を示した。
６Ｎ Ａ Ｄ −−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−２０ｍ Ｍコレステロールエステラーゼ−
・−−−−−・−２Ｕ ／ ｍ Ａコレステロールデヒ
ドロゲナーゼ（３β−ヒドロキシステロイドＮＡＤ （
Ｐ）オキシドレダクターゼ＞ −−−−−−・−−−−
−−一−−−−−−−−・−−−−一−−〜−−−−−
−−−０、’８ Ｕ ／ ｍ ｊ！１−メトキシＰ Ｍ
Ｓ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０
、０７ｍ ＭＳ ＯＤ −−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−５０Ｕ ／ ｍ ＲトリトンＸ −１００−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０、
４％コール酸ナトリウム−−−−−−−−−−−・−−
−−一・−３７０■／ｐＲ・２液 リン酸緩衝液−−−−−−−−−−−−−５００ｍＭ、
ｐ Ｈ６、０４−アミノアンチピリンー−−−−−
−−−−１、０８ｍ ＭＴ ＯＯＳ −−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−１、８ｍ Ｍペルオキシダーゼ−・
・−−−−−・−一−−−−−−−−−・−・１２Ｕ／
ｍｊ！５００■／ｄ１のコレステロールをもつヒト血清
を水で１７５〜５１５に５段階希釈し、実施例３と同様
の操作で直線性を検討した。総コレステロール５００．
ｍｇ／ｒＵ以下で良好な直線性を示した。
実施例５
ＬＤＨの測定
試薬組成
Ｒ・１液
Ｔｒｉｓ緩衝液−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−５０ｍ ＭＬ−乳
酸−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−２６ｍ ＭＮ Ａ Ｄ −−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−０、８ｍ Ｍｌ−メトキシＰＭＳ −−−−−−
−−−−−−−−−−−−−０、０’７ ｍ ＭＳ Ｏ
Ｄ −−−−−−−−＝−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−５０Ｕ ／ ｍ
ＥｐＨ８，４ Ｒ・２液 リン酸緩衝液−−−−−一−−＝−−−−−−−−・−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−５０ｍ
ＭＴ ＯＯＳ −−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０、９ｍ
Ｍベルオキシダーゼー−一−−−−−−・−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−６Ｕ ｌ ｍ ’ Ｒ蓚
酸ナトリウム−・−−−−−−−−−−−〜−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−一・−１９ｍＭ４−アミ
ノアンチピリンー−−−−−−−−’−−−−−０ 、
５４ ｍＭｐＨ６，０ 約１０００Ｕ相当のｔ Ｄ Ｈ標準血清を水で１１５〜
５１５に５段階希釈して直線性を検討した。
−−−−−−−−−−−−−−−−−５０ｍ ＭＬ−乳
酸−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−２６ｍ ＭＮ Ａ Ｄ −−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−０、８ｍ Ｍｌ−メトキシＰＭＳ −−−−−−
−−−−−−−−−−−−−０、０’７ ｍ ＭＳ Ｏ
Ｄ −−−−−−−−＝−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−５０Ｕ ／ ｍ
ＥｐＨ８，４ Ｒ・２液 リン酸緩衝液−−−−−一−−＝−−−−−−−−・−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−５０ｍ
ＭＴ ＯＯＳ −−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−０、９ｍ
Ｍベルオキシダーゼー−一−−−−−−・−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−６Ｕ ｌ ｍ ’ Ｒ蓚
酸ナトリウム−・−−−−−−−−−−−〜−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−一・−１９ｍＭ４−アミ
ノアンチピリンー−−−−−−−−’−−−−−０ 、
５４ ｍＭｐＨ６，０ 約１０００Ｕ相当のｔ Ｄ Ｈ標準血清を水で１１５〜
５１５に５段階希釈して直線性を検討した。
試料５０μｊ＋をＲ・１液１ ｍ １２に加え、３７℃
で正確に１０分間加温後、Ｒ・２液２ｍｌを加えた。次
いで、５分間室温に放置後、５５−５５ｎで吸光度を測
定した。はぼ８００Ｕまで良好な直線性を示した。
で正確に１０分間加温後、Ｒ・２液２ｍｌを加えた。次
いで、５分間室温に放置後、５５−５５ｎで吸光度を測
定した。はぼ８００Ｕまで良好な直線性を示した。
図面はＮ Ａ Ｄ Ｈ量に対する直線性を示すグラフで
ある。
ある。
Claims (1)
- （１）ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ又はこれらの誘導体を経
由して基質又は酵素を測定する方法において、電子伝達
体を介して過酸化水素を生成せしめる反応でスーパオキ
シドジスムターゼを加えて反応を促進させ、その生成し
た過酸化水素を酵素的又は非酵素的に発色せしめて定量
することを特徴とする基質又は酵素の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24938984A JPS61128899A (ja) | 1984-11-26 | 1984-11-26 | 基質又は酵素の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24938984A JPS61128899A (ja) | 1984-11-26 | 1984-11-26 | 基質又は酵素の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61128899A true JPS61128899A (ja) | 1986-06-16 |
Family
ID=17192269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24938984A Pending JPS61128899A (ja) | 1984-11-26 | 1984-11-26 | 基質又は酵素の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61128899A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0405988A2 (en) * | 1989-06-28 | 1991-01-02 | Sankyo Company Limited | Use of superoxide dismutase in assays involving an oxidase |
-
1984
- 1984-11-26 JP JP24938984A patent/JPS61128899A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0405988A2 (en) * | 1989-06-28 | 1991-01-02 | Sankyo Company Limited | Use of superoxide dismutase in assays involving an oxidase |
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