JP3159273B2 - ソルビトール測定方法およびその組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体試料中のソルビト
ールの測定方法、その測定用組成物および糖尿病の患者
の診断に関わる糖尿病の診断用組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、ソルビトールの測定はソルビトー
ル脱水素酵素（ＥＣ番号１．１．１．１４）の反応を利
用し、生成物であるＮＡＤＨの増加を測定することによ
り実施されていた。しかしこの方法は、使用するソルビ
トール脱水素酵素の基質特異性が低く、ソルビトール以
外の基質にも広く作用するため、測定値の正確性が低
く、体外診断用医薬品としての利用は困難であった。ま
た、上記測定法は生成するＮＡＤＨを測定する系である
ことより、従来より測定感度が低く測定の精密性の悪さ
も問題点として指摘されていた。また糖尿病の成因とし
ては、近年ポリオール代謝系異常による推論が広く認め
られるところとなり、糖尿病患者の体液中、例えば血清
中、赤血球中、神経鞘中、細胞中のソルビトール含量の
測定が注目されつつあるが、特異性の高い測定方法が完
成されていないため、糖尿病の診断方法として公に認め
られてはいない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
現状を鑑み、定量性、正確性、精密性に優れたソルビト
ール測定方法、測定用組成物を提供し、これを使用する
ことによって、従来困難であった体液中のソルビトール
含量を測定し、その結果を糖尿病の診断に利用する体外
診断用医薬品の提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために、鋭意検討を実施したところ、特開昭
５６−２９９９４号公報に開示されるソルビトール脱水
素酵素を用いた新規なソルビトール測定方法を検討した
結果、基質特異性に優れ、しかも高感度のソルビトール
測定方法及び測定用組成物を見出し、これを用いて患者
体液を測定したところ、正常者と糖尿病患者では、糖尿
病患者で体液中のソルビトール含量が高いことが確認で
き、有用な新規な体外診断用医薬品として広く糖尿病の
診断に寄与できるものを完成した。

【０００５】すなわち本発明は生体試料中のソルビトー
ルに、（ａ）ソルビトール脱水素酵素および（ｂ）１−
メトキシ−５−フェナゾニウムメチルサルフェイトを反
応させ、次いで（ｃ）ドデシル硫酸塩またはドデシルベ
ンゼンスルホン酸塩を添加し、生成した過酸化水素を測
定することを特徴とするソルビトール測定方法である。

【０００６】また本発明は（ａ）ソルビトール脱水素酵
素、（ｂ）１−メトキシ−５−フェナゾニウムメチルサ
ルフェイト、（ｃ）ドデシル硫酸塩またはドデシルベン
ゼンスルホン酸塩、（ｄ）ペルオキシダーゼおよび
（ｅ）過酸化水素発色剤を含有することを特徴とするソ
ルビトール測定用組成物である。

【０００７】さらに本発明は（ａ）ソルビトール脱水素
酵素、（ｂ）１−メトキシ−５−フェナゾニウムメチル
サルフェイト、（ｃ）ドデシル硫酸塩またはドデシルベ
ンゼンスルホン酸塩、（ｄ）ペルオキシダーゼおよび
（ｅ）過酸化水素発色剤を含有することを特徴とする糖
尿病診断用組成物である。

【０００８】本発明のソルビトール測定方法は、下記の
反応に基づくものである。

【０００９】

【化１】

【００１０】本発明に用いられるソルビトール脱水素酵
素とは、Ｄ−ソルビトールを脱水素して、Ｌ−ソルボー
スに変換する酵素であって、その起源を問わない。本発
明に使用するソルビトール脱水素酵素の一例を示す。 （ａ）作用：Ｄ−ソルビトールを脱水素して、Ｌ−ソル
ボースに変換する。 （ｂ）基質特異性：主としてＤ−ソルビトールを脱水素
する。Ｄ−フラクトースには、作用しない。 （ｃ）至適ｐＨ域：ｐＨ４．５±０． （ｄ）至適温度：２５℃±５℃ （ｅ）安定性 ：ｐＨ５．０、５℃、２４時間放置して
も失活しない。 （ｆ）失活条件：酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の中で４５
℃以上に１０分間加熱すると失活する。 （ｇ）阻害：ｐ−クロロマーキュリベンゾエートによっ
て活性は阻害される。 （ｈ）安定化：Ｄ−ソルビトールの存在によって安定化
される。 （ｉ）分子構造：分子量が約５６，０００のユニット、
約４３，０００のユニットおよび約１６，０００のユニ
ット（それぞれＳＤＳ−ゲル電気泳動法による）の３ユ
ニットから構成される。分子中にフラビン分子およびチ
トクロム分子を補欠分子として有する。 （ｊ）電子受容体：ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）には作用し
ない。

【００１１】本発明に用いられるソルビトール脱水素酵
素は、例えば特開昭５６−２９９９４号公報に記載され
る方法により入手することができる。

【００１２】本発明において、使用する酵素の量は、反
応時間、反応液量によって変化するが、通常、一検体の
反応液量３ｍｌ、反応時間１０分とすると、０．０５単
位／測定から５０単位／測定が必要である。

【００１３】本発明に用いられる１−メトキシ−５−フ
ェナゾニウムメチルサルフェイトの使用量は、反応液中
濃度として、０．００１ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌで
あれば好適に測定が可能である。電子伝達体としては、
このほかにフェナジンメタサルフェイト、メルドラブル
ー等が一般に知られているが、フェナジンメタサルフェ
イトは、溶解後の安定性に難点がある、また、メルドラ
ブルーは、溶解後沈澱物の発生等があることが知られて
おり、正確にしかも簡便にソルビトールを測定するため
には、１−メトキシ−５−フェナゾニウムメチルサルフ
ェイトが好適に利用できる。

【００１４】本発明に用いられるドデシル硫酸塩は、リ
チウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどの塩
を挙げることができる。好ましくは一般的に、ＳＤＳと
いう略称で知られている界面活性剤や、ドデシル硫酸リ
チウム等が知られている。ドデシル硫酸塩は、ソルビト
ール脱水素酵素の反応を測定時間に合わせて停止させる
ために用いる。また、ドデシルベンゼンスルホン酸塩も
同様の効果をもたらす。

【００１５】本発明に用いられるドデシルベンゼンスル
ホン酸塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネ
シウムなどの塩を挙げることができる。好適にはドデシ
ルベンゼンスルホン酸ナトリウムが用いられる。ドデシ
ル硫酸ナトリウムは低温下で保存すると、沈澱を形成す
るため、低温下での保存を行う必要がある場合は、ドデ
シルベンゼンスルホン酸ナトリウムや、ドデシル硫酸リ
チウムが好適に利用できる。これらの使用量は、ソルビ
トール脱水素酵素の反応を停止させることができればい
かほどでもよいが、好適に通常、使用する場合では、反
応液中濃度として、０．０５％（Ｗ／Ｖ）から５％（Ｗ
／Ｖ）である。

【００１６】本発明に用いられるペルオキシダーゼは、
特に限定されるものではないが、西洋わさびより調製さ
れたペルオキシダーゼが好適に使用できる。通常使用量
は、反応液濃度として、１単位／ｍｌから５０単位／ｍ
ｌである。

【００１７】本発明に用いられる生体試料は、血液、血
清、血しょう、赤血球抽出物、血液抽出物である。

【００１８】本発明で実施される糖尿病の診断は、上記
生体試料中のソルビトール含量を測定することにより実
施されるものであり、糖尿病患者の体液を試料とした場
合は、多くの場合、正常者（非糖尿病患者）より高値と
なることを利用して、糖尿病の診断を行うものである。

【００１９】本発明のソルビトール測定組成物は、通
常、試薬１、試薬２の二試薬もしくは試薬３を含む三試
薬からなり、ソルビトール脱水素酵素を含有する試薬の
ｐＨは、本発明に使用するソルビトール脱水素酵素が作
用するｐＨ、好ましくはｐＨ４．５±１．５の範囲にす
ることが望ましい。さらに好ましくは、ソルビトール脱
水素酵素を含有する試薬のｐＨは、４．５±０．５に設
定される。ソルビトール脱水素酵素を含有しない他の試
薬のｐＨは、ｐＨ５．０からｐＨ９．０の範囲にあれ
ば、本発明を実施することができるが、好適にはｐＨ
６．０から８．５に調整されて本発明を実施する。

【００２０】本発明で使用される過酸化水素発色剤は、
ペルオキシダーゼの存在下過酸化水素により酸化発色す
る化合物が用いられる。この様な化合物としては次に様
な組み合わせがある。４−アミノアンチピリン／アニリ
ン誘導体系、４−アミノアンチピリン／フェノール誘導
体系、ベンゾチアゾリンヒドラゾン誘導体／アニリン誘
導体系など。

【００２１】本発明で用いられるアニリン誘導体の具体
例としては、Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシメチル−３−
メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−
３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチ
ル−３−エチルアニリン、Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシ
エチル−３−メチルアニリン、Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロ
キシプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
ヒドロキシプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−メチル
−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−エチルアニリン、Ｎ−プ
ロピル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−メチルアニリン、
Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−プロピルアニ
リン、Ｎ，Ｎ−ビス（β−ヒドロキシエチル）−３−メ
チルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス（β−ヒドロキシプロピ
ル）−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メ
チルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−エチルアニリ
ン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−プロピルアニリン、Ｎ，Ｎ
−ジエチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−
３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−エチルア
ニリン、Ｎ，Ｎ−ジプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ
−エチル−Ｎ−（β−メタンスルホンアミドエチル）−
ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−アセトアミド
エチル）−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニ
リン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロ
ピルアニリン、Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニ
リン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアイリン、Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリ
ン、３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、３，５−ジメ
チル−Ｎ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピ
ル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スル
ホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン等が挙げられ
る。

【００２２】また、フェノール誘導体の具体例として
は、ｐ−クロロフェノール、ｐ−ブロムフェノール、
３，５−ジクロロフェノールスルホン酸、３−ヒドロキ
シ−２，４，６−トリヨード安息香酸等が挙げられる。

【００２３】さらに、ベンゾチアゾリノンヒドラジン誘
導体の具体例としては、３−メチル−２−ベンゾチアゾ
リノンヒドラゾンが挙げられる。

【００２４】アニリン誘導体およびフェノール誘導体の
使用濃度に関しては特に制限はないが、０．１ｍＭから
２０ｍＭ程度が最適である。

【００２５】４−アミノアンチピリンの使用量は０．５
ｍＭから２０ｍＭが好ましい。また、ベンゾチアゾリノ
ンヒドラゾン誘導体の使用濃度は、０．１ｍＭから２．
０ｍＭ程度が好ましい。

【００２６】

【実施例】以下に本発明を実施例により詳細に説明す
る。

【００２７】実施例１ （ソルビトールの測定）下記試薬１および試薬２を使用
し、下記操作方法によりソルビトールの量を測定した。 試薬２ ドデシル硫酸ナトリウム ０．５％ ペルオキシダーゼ １０単位／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ０．２ｍｇ／ｍｌ ＴＯＯＳ ０．２ｍｇ／ｍｌ グッド緩衝液 ｐＨ７．５ サンプル ： ソルビトール水溶液 ０ｍｇ／ｄｌから
２０ｍｇ／ｄｌ

【００２８】操作方法 １．試薬１を試験管に１．５ｍｌ取り、そこにソルビト
ール水溶液を０．２００ｍｌ添加し、３７℃に調整され
たウオターバス中で５分間予備加温した。 ２．次に、試薬２を１．５ｍｌ添加し、３７℃、５分間
インキュベーション後、５４６ｎｍの吸光度を測定した
（試料吸光度）。対照として、ソルビトール水溶液０ｍ
ｇ／ｄｌを用いて、下記式よりソルビトール濃度を算出
した（試薬ブランク）。標準液としては、２０ｍｇ／ｄ
ｌのソルビトール水溶液を用いた（ＳＴＤ吸光度）。

【００２９】

【数１】 ２０：標準液濃度（ｍｇ／ｄｌ）

【００３０】ドデシル硫酸ナトリウムを使用した場合の
ソルビトールの測定結果を図１に示す。縦軸は、本発明
の方法によって測定されたソルビトール濃度（ｍｇ／ｄ
ｌ）、横軸は、サンプルとして使用したソルビトール水
溶液の理論濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。図１から明らか
なように、原点を通る良好な直線となり、ソルビトール
が精度良く測定された。

【００３１】比較例１ （1-メトキシ-5- フェナゾニウムメチルサルフェイトを
使用しない場合の測定例）下記試薬１および試薬２を使
用し、下記操作方法によりソルビトールの量を測定し
た。 試薬１ ソルビトール脱水素酵素 ２．５単位／ｍｌ グッド緩衝液 ｐＨ５．０ 試薬２ ドデシル硫酸ナトリウム ０．５％ ペルオキシダーゼ １０単位／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ０．２ｍｇ／ｍｌ ＴＯＯＳ ０．２ｍｇ／ｍｌ グッド緩衝液 ｐＨ７．５ サンプル ： ソルビトール水溶液 ０ｍｇ／ｄｌから
２０ｍｇ／ｄｌ

【００３２】操作法は実施例１と同様にして、ソルビト
ール水溶液の測定を実施した。１−メトキシ−５−フェ
ゾニウムメチルサルフェイトを使用しない場合の測定結
果を図２に示す。 縦軸は、測定されたソルビトール濃
度（ｍｇ／ｄｌ）、横軸は、サンプルとして使用したソ
ルビトール水溶液の理論濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。ソ
ルビトール濃度が変化しても、色素の発色による５４６
ｎｍの吸光度の上昇が認められなかった。

【００３３】実施例２ （ソルビトールの測定）ドデシル硫酸ナトリウムをドデ
シルベンゼンスルホン酸ナトリウムに変更して、実施例
１と同様のソルビトール水溶液の測定を下記試薬１およ
び下記試薬２を使用して実施した。 試薬２ ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム ０．５％ ペルオキシダーゼ １０単位／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ０．２ｍｇ／ｍｌ ＴＯＯＳ ０．２ｍｇ／ｍｌ グッド緩衝液ｐＨ７．５ サンプル ： ソルビトール水溶液 ０ｍｇ／ｄｌから２０ｍｇ／ｄ ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを使用した場合
のソルビトールの測定結果を図３に示す。縦軸は、本発
明の方法によって測定されたソルビトール濃度（ｍｇ／
ｄｌ）、横軸は、サンプルとして使用したソルビトール
水溶液の理論濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。図３から明ら
かなように、原点を通る良好な直線となり、ソルビトー
ルが精度良く測定された。

【００３４】実施例３ （添加回収試験）赤血球抽出物に、ソルビトール水溶液
を、１：１になるように添加し、その測定値よりソルビ
トールが精度良く測定されるか検討した。ソルビトール
含量を検定した試料１、試料２、試料３の赤血球抽出物
にそれぞれ２．５ｍｇ／ｄｌ、１０．０ｍｇ／ｄｌソル
ビトール含量となるようにソルビトールを添加し、実施
例１の方法に基づき、ソルビトール測定を実施した。そ
の結果を表１にまとめた。

【００３５】

【表１】

【００３６】表１から精度良くソルビトール含量が回収
されていることが明らかである。なお、三種の血清試料
（原濃度として、３．２ｍｇ／ｄｌ，５．３ｍｇ／ｄ
ｌ，１３．０ｍｇ／ｄｌ）に、ソルビトール水溶液（添
加濃度として、５．０ｍｇ／ｄｌ，２０．０ｍｇ／ｄ
ｌ）を１：１に混合し作製した試料を実施例１の示す方
法で測定した。（原濃度＋添加濃度）／２で求められる
計算値（ｍｇ／ｄｌ）と測定値（ｍｇ／ｄｌ）を比較す
ると、正確にソルビトール濃度が測定されていることが
わかった。

【００３７】実施例４ （糖尿病患者と正常者の赤血球抽出物の測定）血清中の
ブドウ糖含量が１６０ｍｇ／ｄｌ以上の患者を糖尿病患
者とした。実施例１と同様にして、赤血球抽出物を試料
とし、ソルビトール含量を測定した。その結果を図４に
示した。正常者の平均が４．９ｍｇ／ｄｌ±０．９７ｍ
ｇ／ｄｌに対して、糖尿病患者群では平均値７．３７ｍ
ｇ／ｄｌ±３．９５ｍｇ／ｄｌ、１０．５７ｍｇ／ｄｌ
±３．４５ｍｇ／ｄｌとなり、糖尿病患者試料ではソル
ビトール濃度が高いことがわかった。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１のドデシル硫酸ナトリウムを使用した
場合のソルビトールの測定結果である。

【図２】比較例１の１−メトキシ−５−フェゾニウムメ
チルサルフェイトを使用しない場合の測定結果である。

【図３】実施例２のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリ
ウムを使用した場合のソルビトールの測定結果である。

【図４】実施例４の糖尿病患者試料と正常者（非糖尿
病）とのソルビトール測定結果をまとめたものである。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生体試料中のソルビトールに、（ａ）ソ
   ルビトール脱水素酵素および（ｂ）１−メトキシ−５−
   フェナゾニウムメチルサルフェイトを反応させ、次いで
   （ｃ）ドデシル硫酸塩またはドデシルベンゼンスルホン
   酸塩を添加し、生成した過酸化水素を測定することを特
   徴とするソルビトール測定方法。
2. 【請求項２】 （ａ）ソルビトール脱水素酵素、（ｂ）
   １−メトキシ−５−フェナゾニウムメチルサルフェイ
   ト、（ｃ）ドデシル硫酸塩またはドデシルベンゼンスル
   ホン酸塩、（ｄ）ペルオキシダーゼおよび（ｅ）過酸化
   水素発色剤を含有することを特徴とするソルビトール測
   定用組成物。
3. 【請求項３】 （ａ）ソルビトール脱水素酵素、（ｂ）
   １−メトキシ−５−フェナゾニウムメチルサルフェイ
   ト、（ｃ）ドデシル硫酸塩またはドデシルベンゼンスル
   ホン酸塩、（ｄ）ペルオキシダーゼおよび（ｅ）過酸化
   水素発色剤を含有することを特徴とする糖尿病診断用組
   成物。