JPS62124446A - 光学発光法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は，化学ルミネッセンス法に関する．本発明は，
さらに詳しくは，化学ルミネッセンスを使用する核酸雑
種，抗体、抗原および酵素の検出に関する．なおさらに
、本発明は化学ルミネッセンス装置に関する。 未発り１は、また、ｋＬ長増強された化学ルミネッセン
スに関する．さらに詳しくは、本発明は窒素含有化合物
の使用により増強された化学ルミネッセンス反応におけ
る酵素の安定化に関する。 未発ＩＩは，さらに、化学ルミネッセンス反応による核
酸雑種の検出に関する。 ルミネッセンスは熱によらない光の発生として定義され
る。ルミネッセンスにおいて、エネルギーはある分子に
特別に流れるので、その分子の温度を大きく上昇させな
いで、特別の光発生状態が生成される０色は含まれる光
発生の状態の特徴により決定され、そしてエネルギーま
たはその生成υ：が変化したとき、変化しない。 化学ルミネッセンスは、化学反応が同一形質および同一
スペクトルの範囲内で黒体（熱輻射）のそれを越える光
（紫外、Ｉｊｒ視または赤外）の放射の原因となるエネ
ルギーを供給するルミネッセンスとして定義される。こ
うして、化学ルミネッセンスは化学エネルギーの光エネ
ルギーへの直接の変換を含む、５００℃以下では、化学
反応の間の光の放射は化学ルミネッセンスを含む、ブン
ゼンバーナーの青色の内側の円錐またはコールマン（Ｃ
ｏ　ｌ　ｅｍａ　ｎ）ガズランブはその例である。 多くの化学反応はエネルギーを発生する０通常、この発
熱性は熱として、すなわち、生成物の分子の並進１回転
および振動のエネルギーとして現われる。これに対して
、可視の化学ルミネッセンスが起こるためには、反応生
成物の１つが励起した電子状ｊ５１（ドに星印で示す）
で発生しなくてはならず、これは光子の放射により失活
されうる。それゆえ、下の反応（ａ）および（ｂ）に示
すように、化学ルミネッセンス反応は光化学反応の逆と
見なすことができる。 Ａ＋Ｂ−＋Ｃ本＋Ｄ　　　　（ａ） Ｃ本→ｃ＋ｈν　　　　（ｂ） 光Ｔ−ｈν（ここでｈはブランクの定数であり、そして
νが光の振動数である）のエネルギーはＣの基底状態（
ｇｒｏｕｎｄ）と最初の励起した電子状！ムとの間の分
離に依存し：そして化学ルミネッセンスのスペクトルは
通常放射体の蛍光のスペクトルと一致する。場合によっ
て、この反応は追加の段階、Ｃ零から他の分子への電子
エネルギーの移動、そうでなければ必ずしもこの反応に
含まれない、を包含する０時には、明確な励起状ｆＥ、
は特定されず、この場合において、化学ルミネッセンス
のスペクトルは、いわゆる空気の残光におけるように、
分子の形成に関連する構造をもたない連続体である：　
ＮＯ＋０→Ｎｏ２＋ｈν（緑の光）。 化学ルミネッセンスの効・＃ｌは、その量子収量φ、す
なわち、反応した分子につき放射される光−ｒの数とし
て表わされる。多くの反応はｌの最大より非常に小サイ
：ｌ”＝、　−ｒ　収：、ｉ　（ｌ　Ｏ−”　ｈ　）’
　／　分子）を右し、ｉｊ７視光のフイシュタイン数（
１アイシュタイン＝Ｎｈν、ここでＮはアボカド口数で
ある）は４００〜７００ｎｍの波長で、約７０〜４０ｋ
ｃａ１１モル（３００〜１７０キロジユ一ル１モル）に
相当する。こうして、非常に発熱性、または「発エルゴ
ンの」化学方法は化学ルミネー、センスであることを期
待できる。部分的にこの理由のため、化学ルミネー、セ
ンスの最もよく知られた例は酸素および酸化のプロセス
を含む；これらの最も効率より例は酵素が仲介する生物
発光である。空気中のリンの発光（ｇｌｏｗ）は歴史的
に重要な場合であるが、この複雑な反応の機構はまだ完
全にわ理解されていない、加熱されたエーテル恭気と空
気との反応は、例えば、青味がかった「冷たい」炎を生
ずる。溶液中のある化学ルミネッセンス、例えば、ルミ
ノール（Ｉ）（下の式を参照）の酸化および、ことに、
あるシュウ酸エステル（Ｈ）（下の式を参照）と過酸化
水素との反応の効率は非常にｔ′６い（φ＝３０％）。 ｔｌｌ　　’　　　　　　　　ｔｌ１１化学ルミネッセ
ンスのための黄件は充分な発熱性および適当な放射体の
存在下であるばかりでなりく、かつまたその化学的プロ
セスは非常に速く、かつわずかの幾何学的変化を含み、
振動によるエネルギーの消散を最小とする。例えば、強
力なオキシダントから一元剤への１個の電子の移動（し
ばしば反対電荷の２つのラジカルイオンが電気化学的に
発生する）は、ある場合において、電子の励起の非常に
有効な発生を生じうる型のプロセスである。例えば、９
．ｌＯ−ジフェニルアントラセン（ＤＰＡ）を使用する
例を反応（ｃ）に示す。 ＤＰＡ−＋ＤＰＡ＋→ ＤＰＡ末＋ＤＰＡ　　　（ｃ） 回−・のことが４構Ｉｋ、員の環状過酸化物あ（［）の
カルボニル生成物への分解について当てはまり、この分
解は反応（ｄ）に示されており、これは多くの化学ルミ
ネッセンスの典型である。 （ＩＩＩ　１ 化学ルミネッセンスの特別の型は生物発光である。 生物発光は、エネルギー生成化学反応のために、生きて
いる右機体による光の放射として定義され、ここでルシ
フェリンと呼ばれる特別の生化学的物質は、リシフェラ
ーゼと呼ばれる特別の酵素により触媒される。酸化を行
う。 多くの特別のりシフニリン類およびルシフェラーゼ類が
存在し、これらは化学的に異なり、各々はある異なる生
きているルミネッセンス発生性有機体中に含まれている
。ホタルの発光、大洋の！′Ｆ明な「リン光」または「
輝き」、あるいは夜における森林の奥まったところのキ
ノコ類の不気味な発光は、これらの異なる生物発光性有
機体のほんのわずかの例である。 生物発光は化学ルミネッセンスの１つの型であるので、
光の放射を１１？るために生さている右機体を準備する
ことは不必要である。含まれる化学物質の簡単な保存は
十分である。これはある場合において有機体を穏和な条
件下に急速に乾燥することによって実施することができ
る。 乾燥したホタルの尾［ランタン（Ｉａｎｔｅｒｎ）］は
、水ですりつぶすとさ、光を放射する。 この光の放射は数分以内に消滅するが、細胞のエネルギ
ー機構における主深な補酵素であるアデノシン三リン酸
（Ａ　Ｔ　Ｐ）の添加によって回復させることができる
。この場合において、ＡＴＰはホタルのルシフェリンと
反応して、ルシフェニルアデニレート中間体とピロリン
酸１１！（ＰＰ）を生ずる。 数十万匹のホタルからランタン抽出物を使用して、化学
者らはジヨツブ・ホブキンス大学（Ｊ。 ｈｎｓ　　Ｈｏｐｋｉｎｓ　　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）
においてホタルのルシフェリンの化学！ＷｎはＣＩ　３
８１２　Ｎ２０３　ｓ２であることを決定した。それは
現在合成することができる。リシフェリンアデニレート
と酸素との反応は、４構Ｉ＆ｆｉの環のアルファーペル
オキシラクトン中間体を与え、そしてアデノシン−燐酸
（ＡＭＰ）を放出すると仮定される。これはエネルギー
生成段階で分解して二酸化炭素と発光する励起した分子
とを与える。これは光子（ｈν）としてそのエネルギー
を失い、このエネルギーはこの場合スペクトルの黄色領
域である。 保存した光器官からのホタルのルシフェリンとルシフェ
ラーゼを、非常に感受性の試験において使用してＡＩＰ
を検出する。 ホタルのルシフェリンのための仮定される通路は次の通
りである： ↓（０２ ↓ ↓ ホタルのルミネッセンスは短時間の発光（ｆｌａｓｈ）
として起こり、神経系の制御のもとに。 ランタン中の光発生性細胞の内部から来る。１１本の海
５’＋−から沖の海水中に存在する小さい海産甲殻網の
ウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）において、非常の異
なる場合が起こる。それは別々の腺にｔヶいて台のルシ
フェリンとルシフェラーゼを合成する０発光するために
、それはルシフェリンとルシフェラーゼをＷ＋ｊ水中に
巾に吹き出すだけであり、動物から離れた場所で反応が
起こる。この光は捕食動物の注意をそらしかかつそれを
だます機能をすることができる。 ウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）のルシフェリンの化
学は、　　Ｉ−１本における化学者のグループのより決
定された−　Ｃ２２Ｈ７７０Ｎ７は矢印（ド）で示す位
置において酸粛と直接反応して、ホタルの分子と同様に
１つの型のアルファーペルオキシラクトンを生成すると
仮定される。最後の段階において、二酸化炭素が、また
、励起された分子と一緒に放出され、励起された分子は
この場合、！、′色を放射する。 ウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ｃ７）ルシフェリン
のための仮定される通路は、次の通りである： ↓　）　　ｃノ。 ↓ ↓ ０、　　（ノ ホタルと同様に、乾燥したウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉ
ｎａ）は冷水ですりつぶすとき発光する；ウミホタル（
Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）をすりつぶすとき、保存されたル
シフェリンおよびルシフェラーゼは腺から開放される。 光はルシフェリンが酸化されるにつれて徐々に弱くなる
が、さらにルシフェリンを添加すると消耗された抽出液
中で光を回復する。ルシフェリンは合成的に得ることが
でき、あるいは乾燥したウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎ
ａ）を熱水中ですりつぶすことによって天然の形５島で
１１多ることができる。熱は蛋白質であるルシフェラー
ゼを１吠Ｊ−るが、ルシフェリンは活性のままに残る。 冷却しそして消耗した抽出液と混合すると、ルミネッセ
ンスが観察される。これは古典的ルシフェリン−ルシフ
ェラーゼ試験の基礎である。 ルミネッセンスを発生するバクテリアは、連続の２．′
緑の光を放射する。このようなバクテリアは海氷または
死んだ魚の表面から直接単離することができ、そして３
％の１１１（海水に等しい）およびある魚類または肉の
抽出物を含有する媒質−トで急速に生長するであろう。 バクテリアのルシフェリンのための仮定される゛通路は
、次の通りである： １゛・１゛ｊ元さｔＬ／ζす、１−ノラビンリ／酸す１
−フラピンリン酸　１Ａｒ（緑） 化学ルミネッセンスの検出は、分析物を検出する最も感
度の高い方法の１つである。この方法は、感受性である
が、いくつかの欠点に悩まされる。大抵の場合において
、光の放射を仲介する化学ルミネッセンス反応は寿命が
非常に短いので、すなわち、発光は非常に急速であるの
で、発光の程度を監視しかつまた分析物の存在の程度を
決定するために、複雑な装鐙を開発しなければならない
、また、相互作用する相手の性質を破壊または変化させ
ないで、相互作用する系を分析物に結合することは困難
である。 最近、ある物質、例えば、ヨードフェノールまたはベン
ゾチアゾール誘導体がワサビのペルオキシダーゼにより
仲介される化学ルミネッセンスの放射の間に存在する場
合、反応速度は遅延すると当時に発光の量子収量は増大
することが立証された［欧州特許出願第０　１１６　４
５４号；欧州特許出願第０　１０３　７８４号；英国特
許出願第８２０　６２　６３号；ガリイ（Ｇ　ａ　ｒ　
ｙ）Ｈ，Ｇ、トーペ（Ｔｈｏｒｐｅ）、　　ロバートー
ハー／ガート（Ｒｏｂｅｒｔ　　Ｈａｇｇａｒｔ）、ラ
リ−（Ｌａｒｒｙ）Ｊ、クリフカ（Ｋ　ｒ　ｉ　ｃ　ｋ
ａ）およびトウマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｐ、ホワイトヘッ
ド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）、［風疹の抗体、免疫グロブ
リンおよびジゴキシンについての増強されたルミネッセ
ンス発生性酵素の免疫アッセイ　（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　
　Ｌｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｔ　　Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｉｍｍ
ｎｕｎｏａｓｓａｙｓＦｏｒ　　Ｒｕｂｂｅｌｌａ　　
Ａｎｔ　ｉ　ｂａｄｙ、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
　　Ａｎｄ　　Ｄ２．４８１−４８７ページ、１９８４
年３Ｊ］１５１］；トウマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｐ、ホワ
イトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）、カリイ（Ｇａｒｙ
）Ｈ，Ｇ、　トーペ（Ｔｈｏｒｐｅ）、チモシー（Ｔｈ
ｉｍｏｔｙ）Ｊ、Ｎ、ガーター（Ｇａｒｔｅｒ）、カロ
ルφグロウカツッ（Ｃａｒｏｌ　　Ｇｒｏｕｃｕｔｔ）
およびラリ−（Ｌａ　ｒ　ｒｙ）　Ｊ　。 クリフカ（Ｋｒｉｃｋａ）、［免疫アッセイにおけるペ
ルオキシダーゼ標識複合体の感受性の決定のための１曽
強されたルミネッセンス丁１１ｆｆｆ　（Ｅ　ｎ　ｈａ
ｎｃｅｄ　　Ｌｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｃｅ　　Ｐｒ。 ｃｅｄｕｒｅ　　Ｆｏｒ　　５ｅｎｓｉｔｉｖｅ　　Ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　　Ｏｆ　　Ｐｅｒｏｘｉｄ
ａｓｅ−１ａｂｅｌｌｅｄ　　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　
　Ｉｎ　　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）Ｊ、ネイｆ−ｐ−
（Ｎａｔ　ｕ　ｒｅ）、Ｖｏ　ｌ　、３０５．１５８−
１５９ベージ、１９８３年９　ＪＪ　８　ｒｌ　；ガリ
イ（Ｇａｒｙ）Ｈ，Ｇ、　　トーペ　（Ｔｈｏｒｐｅ）
　　、ラリ−（Ｌａｒｒｙ）Ｊ、クリフカ（Ｋｒｉｃｋ
ａ）、エイリーン・ギレスピー（ＥｉｌｅｅｎＧｉｌｌ
ｅｓｐｉｅ）、　　スーザン・モウスリー（Ｓｕｓａｎ
　　Ｍｏ５ｅ　ｌｙ）、　　ロパートΦアメス（Ｒｏｂ
ｅｒｔ　　Ａｍｅｓｓ）、ネイル・バラゲット　（Ｎｅ
ｉｌ　　Ｂａｇｇｅｔｔ）およびウマス（Ｔｈｏｍａｓ
）Ｐ、ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）、「６−
ヒドロキシベンゾチアゾール類による環状ジアシルヒド
ラジド類のワサビのペルオキシダーゼ触媒化学ルミネッ
センス発生酸化の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　　Ｏ
ｆ　　Ｔｈｅ　　Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　　Ｐｅｒｏ
ｘｉｄａｓｅ　　Ｃａｔａｌｙｓｅｄ　　Ｃｈｅｍｉｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　　０ｘｉｄａｔｉｏｎ　　０ｆ
Ｃｙｃｌｉｃ’Ｄｉａｃｙｌ　　Ｈｙｄｒａｚｉｄｅｓ
　　Ｂｙ　　６−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｈｉａｚ
ｏｌｅＳ）」、アナリティ力ル・バイオケミストリー（
Ａｎａｌ、Ｂｊｏｃｈｅｍ、）］。 この方法は慣用の免疫アッセイ法による分析物の検出に
有用であることが示されたが、この方法を核酸雑種の検
出に利用できるかどうかは決して立証されなかった。 アーウィン・フリドビッチ（Ｉｒｗｉｎ　　Ｆｒ１ｄｏ
ｖｉｃｈ）、［窒素の配位子によるワサビのペルオキシ
ダーゼの刺′ｆｌＩ（Ｔｈｅ　　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏ
ｎ　　Ｏｆ　　ＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄ
ａｓｅ　　Ｂｙ　　Ｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓ　　Ｌｉｇ
ａｎｄｓ）　」、ザ争ジャーナル◆１２．１９６３年１
２月、３９２１−３９２７ページは、溶液中のペルオキ
シダーゼの窒素の配位ｆ−による安定化を記・成してい
る。 従来、発光がプレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）の
鉄開始活性化による場合、化学ルミネッセンス反応が起
こることが嶽１Ｆされた。自己不活性化反応はＤＮＡに
より影響される。 １ｏｇｙ）、Ｖｏｌ、４０，８２３−８３０ページ（１
９８４）に、発光が標的分子、例えば、ＤＮＡによりク
エンチングされること、およびＤＮＡの存在は、化学ル
ミネッセンスに関連するいわゆる「１己不活性化反応に
より、プレオマイシンの鉄開始活性化を妨害しないこと
が記載された。この文献がさらに述べているところによ
ると、これらの発見はプレオマイシンの電子的に励起さ
れた中間体は生物分子を変更できることを示唆している
が、その場合において、励起した状態の性質は正確では
なかった。 スウェーデン特許出願８２００４７９号は、核酸雑種の
化学ルミネッセンスの検出を記載している。 欧州特許出願０　０７０　６８７すは、発光性ポリヌク
レオチドの交雑の診断法に関する。 従来、化学ルミネッセンス反応は急速に進行し過ぎ、こ
うして光をほんの短い期間発生させるだけである。増強
剤の使用は化学ルミネッセンス反応からの光を多少延長
しかつ増強するが、放射された光の期間および強さはな
お多くの場合において不適当である。 免疫アッセイは臨床実験室において最も広く使用された
いる分析技術である。現在、免疫アッセイの大部分は放
射性アイソトープ、ことにヨウ素−１２５を標識として
使用する。しかしながら、放射性アイソトープはある数
の）：、要な欠点を右する。第１に、標識付は法は高度
に放射性であり、それゆえ潜在的に危険な試薬の使用を
包含する。 第２に、放射能で標識＋Ｊけしだ物質の貯蔵寿命は比較
的短い、なぜなら、まさにその性質により、放射性アイ
ソトープはｉ！Ｉ！続的に崩壊するばかりでなく、かつ
また放射能で標識付けした蛋白質はしばしば不安定であ
るからである。第３に、蛋白質を１−分にピｆ：Ｉ＆付
けして感度でかつ急速に検出ｉ−ｉ丁能な試薬をつくる
ことはしばしば困難である。第４に、放射能で標識した
物質の廃棄は不便である。 これらの欠点は、放射線標識に代わる生存しうる代（＋
物についての研究を刺激した。標識として適当であるた
めには、ある物質は少なくとも次の３つの要件を満足し
なくてはならない：ａ、それは配位子、例えば、抗原ま
たは抗体に結合したとき、急速にかつ非常に少１．腎で
検出可能であるべきである。 ｂ、それは、その決定に影響を及ぼごないで、配位子、
例えば、抗原または抗体に結合することが可能であるべ
きである。そして。 Ｃ１いったん結合すると、それは配位子の性質を有意に
変更してはならない。 １礒も有望な代行の標識のあるものは、反応にそれら自
体が参加してルミネッセンス光を発生することのできる
物質であるか、あるいは適当に処理すると、ルミネッセ
ンス反応に参加できる化合物を生成する物質である。従
来、免疫アッセイにおけるルミネッセンスの使用は困難
であった。なぜなら、ルミネッセンスの測定は急速なプ
ロセスであり、そして、放射能の測定に一般に要する数
分よりはむしろ、数秒で完結しうるからである。 ルミネッセンスは、３つの主星なルミネッセンスまたは
ルミネッセンス測定のシステムにおいて使用されてきた
。 ａ、有機ルミネッセンスまたは有機ルミネッセンス測定
の免疫アー２セイ、ここでルミネッセンス反応に直接参
加する（すなわち、励起状態に転化され、次いで光子を
放射して非励起状ｙＥにもどる）化学ルミネッセンスま
たは生物発光を発生する化合物は、配位子、例えば、蛋
白質、ホルモン、ハブテン、ステロイド、核酸、代謝物
、抗原および／または抗体をビご識するために使用され
てきた。適当な化合物の例は、ルミノールおよびイソル
ミノールを包含する： ｂ、ルミネッセンス発生性触媒またはコファクターの免
疫アッセイ、ここでルミネッセンス発生反応の触媒また
はコファクターは標識として使用されてきた。適当な触
媒の１例は、酵素のペルオキシダーゼである：および Ｃ１酵素結合免疫ア７セイ、ここでルミネッセンス発生
反応は適当なノ、（質への酵素標識の作用により形成５
れた生成物を定量するために使用されてきた。この型の
免疫アッセイの１例は、酵素／抗体試薬をグルコースと
反応させて過酸化水素を形成し、次いで制御された条件
下にルミノールを添加してルミネッセンス発生反応を開
始することによって生成した過酸化水素の量を測定する
ことによって、抗体結合タルコースオキシダーゼヲ定ら
：することである。 −１−のアッセイの感度は、一部分、標識または標識の
生成物の検出のド限により決定される。ルミネッセンス
またはルミネッセンス測定のアッセイの場合において、
この系の感度は部分的に標識された物質の？ｔｉ（＋”
＋りのルミネッセンス発生反応のにおいて放射される光
に依存するであろう。 化学ルミネッセンスの検出は分析物を検出する最も感度
のある方法の１つである。この方法は、感度があるが、
いくつかの欠点に悩まされる。大抵の場合において、化
学ルミネッセンス反応が仲介する光の放射は寿命が非常
に短いので、すなわち、発光は非常に急速であるので、
発光の程度を監視しかつまた分析物の存在の程度を決定
するために、複雑な装置を開発しなくてはならない、ま
た、相ｌｌ：作用する相ｆの性質を破壊または変更させ
ないで、相！ｌ：作用する系を分析物に結合させること
は困難である。 未発明の１つの目的は、長い期間にわたりかつ大きい強
度で光を放射する化学ルミネッセンス反応を提供するこ
とである。 また、本発明の他の目的は、発光の期間を延長できる化
学ルミネッセンス装置を提供することである。 未発明の他の目的は、核酸雑種を検出することである。 本発明のなを他の１−１的は、化学ルミネッセンスを使
用して抗体および抗原を検出することである。 未発明の他の目的は、試料中の酵素の検出であス− また、本発明の目的は、化学ルミネッセンス反応に参加
することのできる核酸を提供することである。 未発Ｉｌｌの他の１−１的は、未知の試料中の核酸を検
出する方法を提供することである。 本発明の他のＩＩ的は、核酸ＩＮを検出することである
。 これらの［１的および他の目的は、本発明により実現さ
れる。 本発明は、化学ルミネッセンス前駆体、例えば、２．３
−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、オキシダント
、例えば、過酸化水素、酵素。 例えば、ペルオキシダーゼ酵素、およびアンモニアおよ
び水溶性有機アミンから成る群より選択される窒素化合
物を接触させることからなる化学ルミネッセンス法に関
する。 本発明は、また、容器と、化学ルミネッセンス前駆体、
オキシダント、・酵素、およびアンモニアおよび水溶性
有機アミンから成る群より選択される′窒素化合物を接
触がせる「一段とからなる化学ルミネ・・７センス装置
に関する。 未発１９１は、また、化学ルミネッセンス前駆体、例え
ば、２，３−ジヒドロ−１，４〜フタラジンジオン、オ
キシダント、例えば、過酸化水素、酵素、例えば、ペル
オキシダーゼ酵素、およびアンモニアおよび水溶性有機
アミンから成る群より選択される窒素化合物、および化
学ルミネッセンス増強剤、例えば、４−ヨードフェノー
ルまたは６−ヒトロキシベンソチアゾールを接触させる
ことからなる化学ルミネッセンス法に関する。 本発明は、さらに。 ａ、定義した核酸配列、および ｂ、核酸配列に光化学的に結合した化学ルミネッセンス
前駆体、 からなり、化学ルミネ・・ｔ！ンス反応に参加できる核
酸プローブに関する。 本発明に従う他の核酸プローブは。 ａ、定義した核酸配列、および す、核酸配列に、例えば、共有結合した、化学ルミネッ
センス増強剤、 からなる。このようなプローブは、増強された化学ルミ
ネッセンス反応における参加体として、およびまたルシ
フェラーゼ型酵素のための基質として使用することがで
きる。 未発１ｇＩは、また、増強された化学ルミネッセンス反
応に参加することができ、定義した核酸配列からなる他
の核酸プローブに関し、前記配列は、ａ、化学ルミネッ
センス前駆体、 ｂ、化学ルミネッセンス増強剤、およびＣ，酵素、 のいずれか１つに結合されおり、（ａ）、（ｂ）および
（Ｃ）の残りの２つは結合された配列ととの混合物であ
る。核酸プローブは、均質混合物、例えば、溶液、不均
質相として、あるいは交雑した形７Ｅ−，で存在するこ
とができる。交雑した形た１は、均￥ｉ混合物１例えば
、溶液とした、あるいは不均質相として存在することが
できる。 本ｆｆ１ｌＪ＋は、また、試験媒質中の特定の一本鎖ポ
リヌクレオチド配列を、例えば、交雑により、決定する
方法に関し、この方法は、 （ａ）試験媒質を、決定すべき配列に対

【７て実質的に
相補的な塩基配列を右するポリヌクレオチドのプローブ
と、前記プローブと決定すべき配列との間の交雑に好適
な条件丁に、結合し、（ｂ）生ずる雑種または決定すべ
き配タクと交雑しなかったプローブを、増強された化学
ルミネッセンス反応における化学ルミネー７センス前駆
体、酵２番い　オキシダントおよび化学ルミネッセンス
１曽強剤を包含する参加体の１つで標識付けし、（Ｃ）
標識付けられた雑種またはプローブを使用してこのよう
な化学ルミネッセンス反応を開始し、および （ｄ）生ずる光の放射を検出する、 １−程からなる。 本発明は、試験媒質中の特定の一木鎖ボリヌクレオナド
配タリを決定する他の方法に関し、この方法は。 （ａ）試験媒質中の一木鎖核酩を固定化し、（ｂ）固定
化された核酸を、決定すべき配列に対して実質的に相補
的な塩基配列を有するポリヌクレオチドのプローブと、
前記プローブと決定すべき配列との間の交雑に好適な条
件下に、接触させ、 ここで、プローブは、 （１）２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化
学ルミネッセンス前駆体、ペルオキシダーゼ酵素および
化学ルミネッセンス増強剤を包含する増強された化学ル
ミネッセンス反応における参加体から選択されたルミネ
ッセンス標識で標識付けられているか、あるいは （２）特異的結合相手のための結合部位を含み、 （ｃ）生ずる固定化された雑種を、決定すべき配列と交
雑しなかったプローブから分離し、そしてここでプロー
ブは結合部位を含み、化学ルミネッセンス標識で標識伺
けられた結合相手を添加し。 （ｄ）化学ルミネッセンス反応を分離され標識伺けられ
た固定化雑種を使用して開始し、そして （ｅ）生ずる光の放射を検出する、 に程からなる。 未発ＩＪＪは、また、試験媒質中の特定の一木釦ボリヌ
クレオチド配列を決定する他の方法に関し、この方法は
、 （ａ）試験媒質を、決定すべき配列に対して実質的に相
補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドのプローブと
結合して、−末鎖核酸とそれら自体を区別する抗原決定
因子を有する雑種を形成し、 ここでプローブは固定化された形態であるか、あるいは
結合部位を含み、これによりプローブはこのような結合
部位のための固定化された形態の結合相手との接触によ
り固定化されることがで（ｂ）プローブが固定化された
形態であるとき、生ずる雑種を固定化された結合相手と
接触させ、 （Ｃ）生ずる固定化された雑種を１区別的な抗原決定因
子に結合できる抗体試薬と接触させ、ここで抗体試薬は
２．３−ジヒドロ−１，４−−フタラジンジオン化学ル
ミネッセンス前駆体、ペルオキシダーゼ酵素および化学
ルミネー２センス増強剤を包含する増強５れた化学ルミ
ネッセンス標識における参加体から選択されたルミネッ
センス標識で標識付けられており、 （ｄ）固定化された雑種に結合するようになる標識（−
ｊけられた抗体を結合しなかったものから分画に分離し
、 （ｅ）分離された分画０１つにおいて化学ルミネッセン
ス反応を開始し、そして （ｆ）生ずる光の放射を検出する、 上程からなる。 本発明は、免疫学的反応により、あるいは核酸交雑法に
より監視することのできるある種の病気の状！島の臨床
的診断にとくに有用な、増強されかつ延長された化学ル
ミネッセンスアッセイに関する０本発明は、また、アッ
セイのための反応成分の１つが試験試料中に未知のＩｉ
ｌですでに存在する。直接の試料分析において利用する
ことができる。免疫アッセイを使用することに−よるお
よびまた核酸交雑アッセイによる病気の状態の診断は、
高度の感受性の系を心安とする。存在する分析物のＨ，
４は通常Ｊ１常にわずかであるので、アッセイの条件は
！・分に増幅された検出を提供すべきである。例えば、
血液試料中の感染因ｆ１例えば、微生物を検１１１する
とき、微生物によりすでに感染された血液試料中からＤ
ＮＡを抽出し、そしてその微生物について特異的の核酸
プローブを使用することが可能である。この検出は、試
験血液試料から抽出されたＤＮＡおよび、血液試料を感
染したと思われる微生物について特異的な核酸プロープ
を使用する交雑によって実施することができる。 核酸の交雑技術は、また、感染因子により現われない遺
伝病の検出に使用することもでき、例えば、ベーターヘ
モグロビンへの１点突然変異（ａｐｏｉｔ　　ｍｕｔａ
ｔｉｏｎ）は鎌型赤血球貧血として知られている欠陥を
生ずる。ある突然変異で影響を受けている人およびまた
このような欠陥をもつ人は、交雑技術により検出するこ
とのできるそれらのゲノム中に核酸の特異的配列を有す
る。単一の逍仏子点の突然変異の検出のためには、検出
する遺伝子が低いＣ度であるので、高度に感受性の技術
を利用することが必須である９通常、放射源標識アイソ
トープがこの検出に使用されている０本発明は高１バに
感受性の化学ルミネッセンスアッセイを包含し、これは
ペルオキシダーゼ様酵素および発光の光基質のためのジ
アシルヒドラジド様基質によって過酸化物の存在下に仲
介される。本発明が有用である他のアッセイの例は、エ
ラスチンのアッセイまたはグルコースオキシダーゼペル
オキシダーゼ系を使用するグルコースのアッセイである
。これらのアッセイの原理および利用は、この分デナに
おいて知られており、そして−にに関連して説明されて
おり、ここで化学ルミネッセンス型アッセイをエラスチ
ンまたはグルコースの検出に使用できること、および化
学ルミネッセンス型７ツセイを免疫アッセイの［１的で
使用できることが立証された０本発明は、ある種の窒素
を含む物質が単独であるいは増強剤と一緒に化学ルミネ
ッセンス反応において光の放射速度を遅延しかつ酵素の
化性を長時間延長するという驚くべき観察に基ずく、こ
れらの２つの作用の組み合わせから、窒素を含む物質は
ペルオキシダーゼおよび過酸化水素が仲介するジアシル
ヒドラジン類からの化学ルミネッセンスの放射を増強し
かつ遅延すると結論することができる。 核酸雑種を検出する本発明による１つの方法において、
未知のＤＮＡ含有試料を、４混合物１例えば、ｔ８液の
中で、化学ルミネッセンス前駆体に結合された１例えば
、フルオロクマリンの使用により、光化学的に結合ぎれ
た核酸配列からなるプローブと接触させ、前記混合物は
オキシダント。 酵素、およびアンモニアおよび水溶性有機アミンから成
る群より選択される窒素化合物を含有し、次いで発光の
／、ｊ度を決定する。 核酸雑種を検出する未発ＩＩＩによる他の方法において
、未知のＤＮＡ含有試料を、混合物、例えば、溶液の中
で、定義した核酸配列および前記核酸配列に結合された
酵素からなるグローブと接触させ、前記混合物は化学ル
ミネッセンス前駆体、オキシダント、およびアンモニア
および水溶性有機アミンから成る群より選択される窒素
化合物を含イ」し、次いで発光の程度を決定する。 核酸雑種を検出する木発す１による１つの方υ：におい
て、未知のＤＮＡ含有試料を、混合物、例えば、溶液の
中で、化学ルミネッセンス前駆体に結合された、例えば
、フルオロクマリンの使用により、光化学的に結合され
た核酩配夕１１からなるプローブと接触させ、前記混合
物はオキシダント、酵素、増強剤、およびアンモニアお
よび水溶性有機アミンから成る群より選択される窒素化
合物を含有し、次いで発光の程度を決定する。 核酸雑種を検出する本発明による他の方法において、未
知のＤＮＡ含有試料を、混合物９例えば、溶液のＩｌｌ
で、定義した核酸配列およびｔｉｊ記核酸配列に結合さ
れた酵素からなるプローブと接触させ、前記混合物は化
゛フルミネッセンス増強剤、およびアンモニアおよび水
溶性有機アミンから成る群より選択される窒４．化合物
を含有し、次いで発光の程度を決定する。 核酸１種を検出する本発明による１つの方法において、
未知のＤＮＡ含有試料を、混合物、例えば、溶液の中で
、定義した核酸配列および前記核酸配列に結合された化
学ルミネッセンス前駆体からなるプローブと接触させ、
その後化学ルミネッセンス増強剤およびオキシダントを
添加し、次いで発光の程度を決定する。 核酸雑種を検出する本発明による他の方法において、未
知のＤＮＡ含有試料を、混合物１例えば、溶液の中で、
定−んした核酸配りｑおよび前記核酸配列に結合された
化学ルミネッセンス増強剤からなるプローブと接触させ
、その後化学ルミネッセンス前駆体およびオキシダン］
・を添加し１次いで発光の程度を決定する。 本発明による核酸雑種を検出する他の方法は、混合物、
例えば、溶液の中で、未知の核酸含有試ネ＝１をプロー
ブと接触させ、このようなプローブはａ、定義した核酸
配列、 ｂ、前記核酸配列に結合ごれた光化学的リンカ−（ｌ　
ｉ　ｎｋｅ　ｒ）、 Ｃ１前記リンカ−に結合された光、 ｄ、配位子へ結合された結合性蛋白質、およびｅ、前記
結合性蛋白質へ結合された酵素、からなり、その後化学
ルミネッセンス物質、化学ルミネッセンス増強剤および
オキシダントを添加し、次いで発光の程度を決定するこ
とを含む。 未発明は、また、化学ルミネッセンスアッセイに関する
。 本発明に従い未知の試料中の抗原を検出する化学ルミネ
ッセンス免疫アッセイは、前記試ネ１を化学ルミネッセ
ンス前駆体または酵素に結合された抗原と接触させ、前
記試料およびｉｉｒ＋記抗原全抗原シダント２．および
アンモニアおよび水溶性有機アミンから成る群より選択
される窒素化合物および、前記抗ｂ；〔が化学ルミネッ
センス前駆体の結合されている場合酵素と、あるいは前
記抗原が酵素に結合されている場合化学ルミネッセンス
前駆体と、接触させ、そして発光の程度を決定すること
からなる。 未発１ｊｉＪに従い未知の試料中の抗体を検出する化学
ルミネッセンス免疫アッセイは、前記試料を＋ｉｉｒ記
抗原に対する抗体と接触させ、前記抗体は化学ルミネッ
センス前駆体または酵素に結合されており、前記試料お
よび前記抗体り・１−１シダント、およびアンモニアお
よび水溶性有機アミンから成る群より選択される窒素化
合物および、前記抗原が化学ルミネッセンス前駆体の結
合されている場合酵素と、あるいは１１η記抗原が酵素
に結合されている場合化学ルミネッセンス前駆体と、接
触させ、そして発光の程度を決定することからなる。 本発明に従い未知の試料中の抗体を検出する他の化学ル
ミネッセンス免疫アッセイは、前記試料を前記抗Ｂ；（
に対する抗体と接触させ、前記抗体は化学ルミネッセン
ス１ｉ７１駆体または酵素に結合されており、前記試料
および前記抗体をオキシタント、化学ルミネッセンス増
強剤、およびアンモニアおよび水溶性４１機アミンから
成る群より選択される窒素化合物および、前記抗原が化
学ルミネッセンス１″ｒＩｉ駆体の結合されている場合
酵素と、あるいは１ｉｒｒ記抗原が酵素に結合されてい
る場合化学ルミネッセンス前駆体と、接触させ、そして
発光の程度を決定することからなる。 本発明に従い未知の試料中の抗体を検出する他の化学ル
ミネッセンス免疫アッセイは、前記試料を前記抗に（に
対する抗体と接触させ、前記抗体は化学ルミネッセンス
前駆体または酵素に結合されており、＋ｉｒｆ記試ネ４
および前記抗体をオキシダント、化学ルミネッセンス増
強剤、およびアンモニアおよび水溶性有機アミンから成
る群より選択される窒素化合物および、前記抗原が化学
ルミネフセンス＋ｉｉｊ駆体の結合されている場合酵素
と、あるいは前記抗原が酵素に結合されている場合化学
ルミネッセンス前駆体と、接触させ、そして発光の程度
を決定することからなる。 本発明は、さらに、未知の試料を化学ルミネッセンス前
駆体、オキシダント、およびアンモニアおよび水溶性有
機アミンから成る群より選択される窒素化合物と接触さ
せ、そして発光の程度を決定することからなる。ペルオ
キシダーゼ酵素を検出するための化学ルミネッセンスア
ッセイに関する。 本発明は、さらに、未知の試料を化学ルミネッセンス前
躯体、オキシダント、化学ルミネッセンス増強剤、およ
びアンモニアおよび水溶性有機アミンから成る群より選
択される窒素化合物と接触させ、そして発光の程度を決
定することからなる、ペルオキシダーゼ酵素を検出する
ための化学ルミネッセンスアッセイに関する。 なおさらに、化学ルミネッセンス前駆体、酵素、オキシ
ダンｉ・、およびアンモニアおよび水溶性有機アミンか
ら成る群より選択される窒素化合物からなる、化学ルミ
ネッセンスアッセイを実施するだめの試験キットに関す
る。 なおさらに、化学ルミネッセンス１ｉ７１駆休、酵素、
オキシダント、化学ルミネッセンス増強剤、およびアン
モニアおよび水溶性有機アミンから成るＪＴより選択さ
れる窒素化合物からなる、化学ルミネッセンスアッセイ
を実施するための試験キットに関する。 本発明は、また、アンモニアおよび水溶性有機アミンか
ら成るＩＴより選択される窒素化合物および化学ルミネ
ー、センス反応成分、すなわち、化学ルミネッセンス前
駆体、オキシダントおよび酵素を含イ１する容に（から
構成された化学ルミネッセンス装置に関する。このよう
な装置の１つの実施態様において、容器は少なくとも２
つの隔室、これらの隔室の各々は少なくとも１種である
が、すべてではない化学ルミネッセンス反応成分を含有
する。および窒２に化合物および反応成分を一方の隔室
から他方の隔室へ流すための手段を含有する。 未発明は、また、アンモニアおよび水溶性有機アミンか
ら成る群より選択される窒Ｊ化合物および化学ルミネッ
センス反応成分、すなわち、化学ルミネッセンス前駆体
、オキシダント、化学ルミネッセンス増強剤およびｆｆ
ｌ素を含有する容器から構成された他の化学ルミネッセ
ンス装置に関する。このような装置の１つの実施態様に
おいて、容器は少なくとも２つの隔室、これらの隔室の
各々は少なくとも１種であるが、すべてではない化学ル
ミネンセンス反応成分を含有する、および窒素化合物お
よび反応成分を一方の隔室から他方の隔室へ流すための
Ｌ段を含有する。 本発明は、ある種の窒素化合物および増強剤、例えば、
ヒトロキシヘンゾチアゾールまたはルシフェリンの相乗
的な組み合わせによって、増強さされた化学ルミネッセ
ンス法の寿命および強さを増加させるという渭〈へき観
察を記・敗する。それらを−緒に使用すると、それらは
それらが別々に存イＩＥすると５よりも強い光および延
長された光を生成する。光の放射の合計：１：は、未発
ＩＪ１のおかげにより、個々の光の放射の合計、例えば
、アンモニア含イ１緩抄１剤およびルシフェリン含有緩
衝剤からの合計よりも大きい。 ピコグラム以ドのＨ，Ｈ″の核酸雑種を本ｆｆ１ｌＪに
より検出することができ、これに対して化学ルミネッセ
ンス技術を用いる免疫アッセイでは、わずかにナノグラ
ムの１１′、の分析物、例えば、抗体または抗原を容易
に検出することができるに過ぎない。 本発明は、ある条件ドで、核酸はこの方法に認められ得
る作用をもたず、こうして化学ルミネッセンス反応を利
用して非常に少！１鼾のＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸
を、核酸が対応する未知の試験試料にまたは相補的な核
酸配列に対して交雑された後、検出することができると
いう、驚くべき観察に）、（づく。 本発明において使用するための窒素化合物の非制限的例
は、アンモニアおよびその１１５類、複素環式刀香族お
よび水溶性アミン、例えば、有機アミンを包含する０本
発明において使用するためのアンモニアの塩類の例は、
例えば、耐耐塩、塩化物、（わ酸塩、硫酸４１、リン酸
１１４およびホウ酸１１Ｂ、第一、第一、第一および第
四アンモニウＬ、）！！（ここでプロトンはアルキルま
たはアリール残基で交換されている）である。木９．明
において使用するための複素環式窒素化合物の非制限的
例は、イミダゾール類およびそれらのアルキル１誘導体
およびピリジンおよびそのアルキル誘導体を包含する。 本発明において使用するためのアミンは、アルキルアミ
ン、ポリアミン、アリールアミンおよびべンジルアミン
を包含する。本発明において使用するためのポリアミン
の非制限的例は、プトレシン（ブチレン−ジアミン）、
スペルミン、スペルミジン、およびそれらのフルキル塩
類を包含する。 イアジン類を本発明において窒素化合物として使用でき
る。チアジン類の例は、チオニンおよびメナレンプルー
である。 本発明において使用するアルキルアミンは、式式中、ｘ
、、Ｘ２．ｘ３は同一・もしくは相異り、そして脂肪族
飽和炭化水素基である、により例示される。本発明にお
いて使用するための脂肪族飽和炭化水素基の非制限的例
は、１〜８個の）に素原子、好ましくは１〜８個の炭素
原子を有する非置換および置換のアルカンである。この
ような置換アルカンのための置換ノ、（の非制限的例は
、ヒドロキシ、ニトロ、ハロ（例えば、フルオロ、クロ
ロ、ブロモ、ヨード）、カルボキシ、アミドなどを包含
する。 本発明において使用するための化学ルミネッセンス前駆
体は、２，３−ジヒドロ−１，４−７タラジンジオン（
ｒＤＰＤＪ）を包含する。好ましくは、２．３−ジヒド
ロ−１，４−フタラジンジオンは、式 式中、Ｒ１はアミ／であり、そしてＲ２、Ｒ３およびＲ
４の各々は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６−アルキル
もしくはアルケニル、ヒドロキシル、ｃ、−Ｃ６−アル
コキシ、カルボキシル、またはアミンであり、あるいは
Ｒ２はアミ／であり、そしてＲ，、Ｒ３およびＲ４の各
々はＨ１非置換もしくは置換のＣ，−Ｃ６−アルキルも
しくはアルケニル、ヒドロキシル、Ｃ＋−Ｃ６−アルコ
キシ、カルボキシルまたはアミノであり、あるいはＲ１
およびＲ２は、−緒に、ベンジノ、（のアミノまたは置
換アミノの誘導体であり、そしてＲ３およびＲ４の各々
はＨ１非置換もしくは置換のＣ＋−Ｃ６−アルキルもし
くはアルケニル、ヒドロキシル、ｃ、−Ｃ６−アルコキ
シ、カルボキシル、またはアミノである、 をもつ。とくに好ましい化学ルミネッセンス前駆体は、
５−アミノ−２，３−ジヒ１ζローｌ、４−フタラジン
ジオン（ルミノール）および６−アミン−２，３−ジヒ
ドロ−１，４−フタラジンジオン（イソルミノール）で
ある。 本発明において使用するための置換されたアルキル、ア
ルケニルおよびアミンは、この分野においてよく知られ
ている。このような置換された基の置換ノ、（の非制限
的例は、ハロゲン、例えば、クロロ、フルオロ、ブロモ
およびヨード、ヒドロキシ、カルボキシ、ニトロ、シア
ノおよびチオールである。さらに、本発明において使用
するためのアミンノ、（は、アルギル、好ましくは１−
１０個の炭素原子を有するアルキル、およびアルケニル
、好ましくは２〜１０個の炭素原子を有するアルケニル
で置換されることができる。本発明において使用するた
めのヒドロキシルノ１（は、ハロゲン、アルギル、好ま
しくは１〜１０個の炭素原子を有するアルキル、または
アルケニル、好ましくは２〜１０個の炭素原子を右する
アルケニルで置換されることができる。 一般に、ペルオキシダーゼ酵素を未発明において使用で
きる。本発明において使用するための酵素の、Ｊ＋制限
的例は、ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ミクロ
ペルオキシターゼおよびラクトペルオキシダーゼを包含
する。 化学ルミネッセンス前駆体と反応して化学ルミネッセン
ス前駆体を励起させ、こうしてそれがルミネッセンス反
応において光を放射するようにさせる、いかなるオキシ
ダントを未発ＩＩにおいて使川することもできる。とく
に好ましいオキシダントは、過酸化水素、過ホウ酸のイ
オンおよびナトリウムパーオキデート（ｓｏｄｉｕｍ　
　ｐｅｒ。 ｘｉｄａｔｅ）である。 本発明において使用するための緩衝化アミンの例は、ア
ンモニアである。 化学ルミネー２センス増強剤の非制限的例は、４−クロ
ロフェノール、４−’ロモフェノール、４−ヨードフェ
ノール、４−ブロモー２−クロロフェノール、２．４−
ジクロロフェノール、３゜４−ジクロロフェノール、４
−メチルフェノール、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール
、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸エチル
、４−ペンジルフェノール、４−（３’−メチルクロチ
ル）フェノール、４−スチリルフェノール、４−（２°
　、４°−ジニトロスチリル）フェノール、４−ヒドロ
キシ桂皮酸、アルファーシアノ−４−ヒドロキシ４１ｍ
。４−フェニルフェノール、４−　（４°−ヒドロキシ
フェニル）フェノール、２−クロロ−４−フェニルフェ
ノール、４−（４′−ヒドロキシフェニル）ベンゾフェ
ノン。 ４−（フェニルアゾ）フェノール、４−（２’−カルボ
キシフェニルアゾ）フェノール、４−フェノキシフェノ
ール、４−　（４°−ヒドロキシフェノキシ）フェノー
ル、４−ヒドロシキフェニルサルファイド、４−ヒドロ
キシフェニルジサルファイド、ナフト−２−オール、ｌ
−ブロモナフト−２−オール、６−プロモナフトー２−
オールおよび１．６−ジプロモナフトー１−オールであ
る。 とくに好ましい増強剤は４−ヨードフェノールである。 本発明において使用するための他の化学ルミネッセンス
増強剤の非１１ＪＩ限的例は、６−ヒドロキシベンゾチ
アゾール類、例えば、式 式中、ＲはＨ，ＣＮまたは非置換もしくは置換のチアゾ
ールであり、そしてｘ、、Ｘ２およびｘ３の各々はＨ１
置換されていてもよいＣ１−Ｃ６−アルキルもしくはア
ルケニル、ヒドロキシル、置換ヒドロキシル、ｃ、−Ｃ
６−アルコキシ、カルボキシル、アミノまたは置換アミ
ノである、 の６−ヒドロキシベンゾチアゾール類を包含する６とく
に好ましい化学ルミネッセンス増強剤は、ホタルのルシ
フェリン（４，５−ジヒドロ−２−（６−ヒドロキシ−
２−ヘンジチアゾリル）−チアゾール−４−カルボン酸
）お、よびデヒドロルシフェリンである。 本発明の化学ルミネッセンス反応からの発光は、酵素、
オキシダント、化学ルミネッセンス前駆体および緩衝化
アミンまたは増強剤に依存するが、また、二次因子、例
えば、形質、ｐＨ１試薬のｅ度、混合速度および光の測
定法によって決定されるであろう０本発明の系の感度を
最大にするためには、これらの二次因子を調節して、最
大の発光を、＋＋ｆ現性かつ容易に測定１１ｆ能な方法
で、信号一対バックグラウンドの比をできるだけ大きく
して、（１シるべきである。 選択する条件は、一般に、酵しもまたはオキシダンＩ・
の触媒活性１灰応の動力学、使用する装置、４−ｒ’；
一対バックグラウンドの比および費求する感度を含む妥
協を包含する。 Ｉｆｋ適な結果を得るためには、本発明の化学ルミネッ
センス反応は１０℃〜５０℃の範囲の温度および６〜１
０、々ｆましくは７〜９のｐＨの通電な条ヂ１ドで実施
すべきである０本発明はこれらの温度に限定されず、そ
して温度はそれ自体臨界的ではない。本発明において使
用できる適当な緩衝性物質は、リン酸塩、トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン、２−アミ／−２−メチル
−１，３−プロパンジオールである。 次の試薬のｃ度（溶液に添加するとき）は、本発明にお
ける使用にとくに適する： 酵素　　　　　　　　０．０１ｎｇ〜５００ｍｇ／ｌ オキシダント　　　　ｌＯルモル〜３００ミリモル／１ 化学ルミネフセンス　０．５にモルタ２００ミ物質　　
　　　　　　　リセル／１ ′ネ素化合物　　　　　５にモル〜５００ミリモル／Ｉ 化学ルミネフセンス　５ｐＬモル〜１００ミリモ増強剤
　　　　　　　ル／ｌ 未発１．！Ｉｔの１つの面は、核酸雑種の検出を含む。 本発明の方Ｖ、において使用する１つの核酸プローブは
、配（ＱＹ−に結合した核酸配列、例えば、結合性蛋白
質に結合した配位子であり、そしてこのような結合性蛋
白質は酵素に結合されている。 核酸は配位子へ、内位添加化合物、例えば、フロクマリ
ンまたはフエナントリジン化合物により、あるいは非内
位添加化合物、例えば、ネトロブシン、ジスタマイシン
およびビス−ベンズイミダゾールにより結合することが
できる。とくに好ましい内位添加化合物は、フロクマリ
ン類、例えば、アンゲリシン（インプソラレン）、ブソ
ラレンおよびそれらの誘導体、例えば、４−アミノメチ
ル−４，５°−ジメチルアンゲリシン、４°−７ミノメ
チルトリオキソラン、３−カルボキシ−５−または−８
−アミノ−または−ヒドロキシープソラレン、ならびに
七ノーまたはビスーアジドアミノアルキルメチジウｔ１
またはエチジウ１、化合物である。 本発明において使用するだめの内（〜“ｌ添加剤のＪ１
制限的例は、ド表に例示する通りである二人 内位添加化合物の 部類および代表的 化合物　　　　　　　　参考文献 Ａ、アクリジン２−Ｊ、ラー−２７（Ｌｅ　ｒｍａアク
リジンオし　上ユ）、且、１８　　（１９６ンジ、クイ
ナク　ｌ）；ブルー１、フィールドリン、アクリ７　　
（Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ）バリン　　　　　ら、核酸の
物理化学（ｐｈｙＡｃ　　ｉ　　ｄ　　ｓ）　　、　　
７＋’；？　、　　４２９−４７６ページ、ハーバ− （Ｈａｒｐｅｒ）およびロウ （Ｒｏｗｅ）、ニューヨーク （１９７４）　　、　　ミ　ラー　（Ｍｉｌｌｅｒ）ら
、バイオポリ ヱニｆ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅ −り互）、１且、２０９１　　（１ Ｂ、フェナントリ　ブルームフィールド（Ｂｌ。 ジン類　　　　　　　ｏｍｆｉｅｌｄ）も、ｓｕｐエナ
シウム　　　ｒａ；　　（Ｍｉ　ｌ　ｌ　ｅ　ｒ）ら。 コラリン　　　　５ｕｐｒａ；ウィルソン（Ｗｉｌｓｏ
ｎ）ら、ジャーナル 導体　　　　　　（１９７６）、ペスチ（Ｐｅｓｔｙ）
ら、ＦＥＢＳレター ズ（Ｌｅｔ　ｔ　ｅ　ｒｓ）　、　１ ヱ、３２１．（１９７１）； コーン（Ｋ　ｏ　ｈ　ｎ）ら、癌の （ｄＦ’Ｒｃｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅ 王ユ）、旦、７１（１９７ ６）ニレペック（Ｌｅｖｅｅ ｑ）ら、ＰＮＡＳ　（ＵＳ Ａ）、旦、５０７８（１９ ７４）：ペラプラト　（Ｐ　ｌ　ａ ｐｒａｔ）ら１、ジャーナル ｅｍ、）、２３、１３３０ Ｃ、フェナジン類　プルームフィールド（Ｂ　ｌ　。 ５−メチル７、　　ｏｍｆｉｅｌｄ）ら、ｓｕｐナジン
カチオン　」 Ｄ、フェッチアジ　同−ｌ− ン類 クロプロマシン Ｅ、キノリン類　　回１ニ クロロキン キニン Ｆ、アフラトギシ　同−Ｌ ン Ｇ、多環式炭化水　同上 、＋−類およびそれら のオキシラン誘導 体　　　　　　　　　ヤング（Ｙ　ａ　ｎ　ｇ）　　ら
、公ゴー３．４−ベンズ　オケミカル・アントΦバイオ
ピレン、ベンズ　フィジカル・リサーチΦコミピレンジ
オール　ユニケーションズ（Ｂｉｏｃエポキシド、ｌ　
　ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ−ピレニルオキ　ｅ　ｓ
　、Ｃｏｍｍ、）、８２、ラン　　　　　　９２９　（
１９７８）。 ベンズアントラ　アメア（Ａｍｅａ）ら、４ｊ−ｉセン
−５，６−五ｙｘ　（Ｓｃ　ｉ　ｅ　ｎｃｅ）、オキシ
ド　　　　１７６．４７　（１９７２）Ｈ、アクチノマ
イ　ブルームフィールド（Ｂ１．。 シン類　　　　　　　ｏｍｆｉｅｌｄ）ら、ｓｕｐアク
ナノマイシ　エ県 ンＤ ■、アントラサイ　同上 クリノン類 ベーターロドマイ シンＡ、ダウナマ イシン Ｊ、チアキサンテ　同１− メン類 ミ　マシンＤ Ｋ、アノトラマイ　同に ・シン し、ミドマイシン　オガワ（Ｏｇａｗａ）ら、桔オカワ
（Ｏｇａｗ　　酸（７）研究（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　
　Ｒｅｓ、）、５ｐｅ ｃ、Ｐｕｂｌ、３．７９（１ ９７７）；アクフタ−（Ａｋ ｈｔａｒ）ら、Ｃａｎ、Ｊ。 Ｍ、白金錯塩　　　リッパード（ＬｉｐｐａｒＮ、ポリ
内位添加　ワーリング（Ｗａ　ｒ　ｉ　ｎ　ｇ）化合物
、　　　　　　ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒエキノマイ
シン　旦）、Ａ旦ｌ、６５３（１９７４）；ワケリン（
Ｗａｋｅ ｌ　ｉ　ｎ）　、バイオケミカルφ （１９７６）。 キノマイシン　　リー（Ｌｅｅ）ら、バイオケトリオス
チン　　ミカル・ジャーナル（Ｂｉ。 ８８Ｍ９２８Ａ　　ｃｈｅｍ、Ｊ、）、↓７３、タンデ
ム　　　　１１５　（１９７８）、ファング（Ｈｕ　ａ
　ｎ　ｇ）ら、竺ヱ！ ケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ 見ユ）、よ溌、５５３７　（１ ９８０）；ビスワミトラ（Ｖ ｉ　ｓｗａｍｉ　ｔ　ｒａ）ら、ネ ジアクリジン類　レペック（ＬｅＰｅｃｑ）ら、ＰＮＡ
Ｓ　（ＵＳＡ）、７名 、２９１５　（１９７５）；カ レラキス（Ｃａｒｒｅｌｌａ ｋｉｓ）ら、バイオヒミカ会 ８．２７７　（１９７６）；ワ ケリ７　（Ｗｋｅ　Ｉ　ｉ　ｎ）ら、 ｃｈｅｍ、）、去ｌ、５０５ ７　（１９７８）、ワケリン （Ｗｋ　ｅ　ｌ　ｉ　ｎ）　ら、旦旦ｌＳレターズ（、
Ｌｅｔｔｅｒ 旦）、１立Ａ、２６１（１９ ７９）；カベレ（Ｃａｐｅｌ 旦、３３５４　（１９７９）。 ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、 ５　（１９８０）、パーニー７ （Ｂｅｒｎｉｅｒ）ら、バイ 旦、４７９　（１９８１）；キ ング（Ｋ　ｉ　ｎ　ｇ）ら、竺ニオ ｍ、）、２１．４９８２　　（１ ９８２）； エチジウＡ−！ｌｆ　　ガウガイン（Ｇａｕｇａｉ７．
５０７８　（１９７８）。 クルマン（Ｋｕｈｌｍａｎ） す、２６２９　（１９７８）。 マルコビツ（Ｍａｒｌｃｏｖ ｉｔｓ）ら、アナリティカル 旦Ａ、２５９　（１９７９）。 同上１旦」、３６６４（１９ エリプチセンニ　デへしくＤｅｂａｒｒｒｅ）ｈｌ一体
および類似　ら、Ｃｏｍｐｔ　、Ｒｅｎｄ。 体　　　　　　　　　　Ｓｅｒ、Ｄ、、　２８４、８１
（１９７７）、ペラプラト（ Ｐｅ　ｌ　ａｐ　ｒａｔ）、−、；；−ｐ−ヘテロシマ
ー　　力イン（Ｃａｉｎ）ら、／土５８　（１９７８）
；ガラガイ ン（Ｇａｕｇａ　ｉ　ｎ）らｔへ Ｅ　：、：、休　　　　　ハンセン（Ｈａ　ｎ　ｓ　ｅ
　ｎ）ら、ＪＣ５Ｃｈｍ、Ｃｏｍ ｍ８．１６２　（１９８３）； アトネ、ｎｚ（Ａｔｎｅｌｌ） Ｏ、ノルフィリン　ロラン（Ｌｏｕｎ）＋”＋、ＪＡＡ
　　　　　　　　４反、１旦Ａ、３２１３（１Ｐ、フル
オレン類　ブルームフィールド（Ｂ　Ｉ　。 およびフルオレノ　ｏｍｆｉｅｌｄ）ら、Σｕｐン類　
　　　　　　　　二重 フルオレノジアミ　ウィトコラスキー（Ｗｉｔｋン類　
　　　　　　　ｏｗｓｋｉ）ら、Ｗｉｓｓ。 Ｂｅ１ｔ　ｒ、−Ｍａｒｔ　１ｎ −Ｌｕｔｈｅｒ−Ｕｎｉｖ。 Ｈａｌｅｅ　　Ｗｉｔｔｅｎｂ ｅｒｇ、１１（１９８１） Ｑ、フロクマリン 類　　　　　　　　　ベネマ（Ｖｅｎｅｍａ）ら、アン
ゲリシ７　　　ＭＧＧ、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｒ＋ｔ　
、、１７９．１　（１９ ４．５′−ツメ　ベデルデ４（Ｖｅｄｅｌｄチルアンゲ
リシ　ｉ）ら、Ｃｈｍ、−Ｂｉ。 ン　　　　　　　　　　　　　１．Ｉｎｔｅｒａｃｔ、
　　３旦、２７５　（１９８１） プソラレン　　　マルシアニ（Ｍａｒｃｉａｎｉ）ら、
Ｚ、Ｎａｔｕｒｆ。 ｒｓｃｈ　　Ｂ、２７（２）、 ８−メトキシプ　ベログンゾブ（ＢｅｌｏｇｎソラＬ／
７　　　　　ＺＯＶ）ら、Ｍｕｔａｔ、Ｒｅｓ、、８４
．１１（１９８ １）；スコツト（Ｓ　ｃ　ｏ　ｔ ｔ）ら、フォトケミストリー ｂｉｏｌ、）、３４．６３（ ５−アミノメチ　ハンセｙ（Ｈａｎｓｅｎ）ルー８−メ
トキ　ら、Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔ、、２シプソラレン　　ヱ
、１８４７　（１９８１）４　、５、．８−ト　ベアー
バー　（Ｂ　ｅ　ｎ−Ｈｕリメチルブソラ　ｒ）ら、バ
イオヒミカψエト４゛−アミツメ　アイザンク（Ｉｓｓ
ａｃ）チル−４，５，ら、バイオケミストリー（、！！
８−トリメチル　ｉ　ｏｃｈｅｍ、）、↓互、ｌブソラ
レン　　　０５８（１９７７） キサントキシン　ハラデクマ（Ｈａｒａｄｅｃｍａ）、
Ａｃｔ　ａ　　Ｖｉ　ｒ。 上よ（Ｅｎｇｌ、Ｅｄ、）ヱ ６．３０５　（１９８２） ケリン　　　　　ペウモント（Ｂｅａｕｍｏｎｔ）ら、
パイオヒミ力・エト Ｒ，ヘンゾヂピロ　１、ルクス（Ｍｕｒｘ）ら、ン類　
　　　　　　　　Ｊ　、Ｈｅｔ　　、Ｃｈｅｍ、、　　
１２．４１７　（１９７５）；ホ ーター（Ｈｏｒｔｅｒ）ら、 土工）、互違、４０７（１９ Ｓ、モンストラル　ジュラランズ（Ｊｕｒａｒｒｅファ
スト・プル　ａｎｚ）ら、Ａｃｔａ　　Ｈ±ｓｔｏｃｈ
ｅｍ、、７０．１ ＼ン ７、Ｘ−Ｊ” ＼、 とくにイＪ用な内位添加化合物は、アジド内位添加化合
物である。それらの反応性二トレン類は長い波長の紫外
線または可視光線で容易に発生し。 そしてアリールアジド類のニトレン類はそれらの転位生
成物よりも挿入反応を好む［ホワイ１−（Ｗｈ　ｉ　Ｌ
　ｅ）ら、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、）、４ヱ、６４４（１９７７）］代表的な
アジド内位添加化合物は、３−アジドアクリジン、９−
アジドアクリジン、エチンウｌ、モノアジド、エチジウ
１、ジアジド、エチシウ１、−Ｈ，＋体アジド［ミッチ
ェル（ＭｉｔｃｈｅｌＩ）ら、Ｊ　ＡＣ３，１立Ａ、４
２６５　（１９８２）］、４−アジド−７−クロロキノ
リンおよび２−７シドフルオレンである。他の有用な内
位添加化合物はフロクマリン類であり、これらはピリジ
ン残基をもつ［２＋２］環式付加物を形成する。アルキ
ル化剤、例えば、ビスジクロロエチルアミン類およびエ
ポキシド類またはアジリジン類、例えば、アフラトキシ
類、多環式炭化水素エポキシド類、ミドマイシンおよび
ノルフィリンＡを使用することもできる。 本発明において使用するための適当なアンゲリンン誘導
体は１次の式を有する： ／１．＋ 式中、Ｒ，、Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は、次の通りである
： Ｒ，Ｒ２１？、、　　　　　Ｒ。 ＋Ｉ　　　　　）Ｉ　　　　１１　　　　　ＨＣＨ３１
（（Ｊ３Ｈ ＣＨ３Ｃ１，３０Ｈ３ＣＨ２０Ｈ ＣＨ３ＨＣＨ３ＣＨ２０ＣＨ３ Ｃｈ　　　　ＨＣＨ３Ｃ）１２ＮＨ２ ＣＨ３ＨＣ１（３ＣｔｈＣｌ ／う 異なるＲ基をもつ多の多の化合物を発表された「順に従
い合成できる。 本発明における使用に適当なプソラレン話導体は１次の
式をもつ： 式中、 Ｒ，Ｒ，およびＲ３は、各々独立に、水素または低級ア
ルキルであり、 Ｒ４は水素、低級アルキルまたはヒドロキシ置換低級ア
ルキル、低級アルコキシ、アミノ、ハロおよび／または Ｃノ であり、そして Ｒ２およびＲ５は、各々独０に、水素、ヒドロキシ、カ
ルボキシ、カルポー低級アルコキシまたは低級アルコキ
シである。 アンゲリシン誘導体はモノ付加物の形成についてブソラ
レン化合物よりも優れる。−・本領プローブがある余分
の一本鎖ＤＮＡへ共有結合する場合、フエナントリジウ
ムおよびプソラレン化合物は暗所中で一本鎖ＤＮＡに優
先的に相互作用するので望ましい。 本発明における使用のための核酸配列の非制限的な例は
、例えば、制限酵素により生産されるような、−末鎖ま
たは二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの断片で
あることができ、あるいは比較的短いオリゴマーである
ことさえできる。 本発明の実施ｆｆ、様において、プローブは固体の支持
体１例えば、ニトロセルロース紙上に固定化される。 本発明における使用のための配位子の非制限的な例は、
ハプテン類およびビオチン、例えば、ビオチン−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドおよびビオチン−Ｐ−ニトロフ
ェニルエステルを包含スる。 本発明における使用のための結合性蛋白質の非制限的な
例は、抗体、アビジンおよびストレプトアビジンを包含
する。 未発ＩＩを実施するための１つの実施ＩＥ様において、
ニトロセルロース紙」二の交雑により固定化された、す
なわち、透明容器内に閉じ込められた、標識プローブは
、高感度写真フィルム、例えば、［ポラロイド（ＰＯＬ
ＡＲＯＩＤ）Ｊフィルムのカートリッジ上の配置する。 固定化されたプローブおよびフィルムのカートリッジ、
および溶液の形態の適当な試薬（使用する試薬は利用す
るプローブに依存し、例えば、プローブが化学ルミネッ
センス物質を含有するとき、試薬の溶液は増強剤、オキ
シダントおよび酵素を含有するであろう）を、容器に注
入して固定化されたプローブと接触させる０次いで、試
薬とプローブとの間の反応により発生した光はフィルム
」−で検出されるであろう。放射された光の波長は使用
する試薬に依存することに注意すべきである。交雑が起
こるとき、光は放射されるであろう。交雑が起こらない
場合、光は放射されないであろう。 プローブおよび交雑のフォーマット 本発明の方法に従うことにより、交雑アッセイおよび検
出に使用できる多くの種類のプローブおよびフォーマッ
トが存在する。 本発明の目的に対して木質的にいかなる核酸交雑のフォ
ーマットに従うこともでき、ここでプローブと決定すべ
き配列との間で形成された雑種あるいは問題の配列と交
雑しなかったプローブのいずれかを選択した化学ルミネ
ッセンス標識で標識イ・１けする。この分野において知
られているように、このような雑種または交雑しなかっ
たプローブの標識付けは実際の交雑反応の前または後に
実現することができる０通常、プローブは特異的架橋反
応により標識されるかあるいは標識付けすることができ
、あるいは形成した雑種は、通常特異的架橋反応により
、引き続いて標識旧けされる。 本発明の中心の新規な面は、増強された化学ルミネッセ
ンスの現象を核酸の交雑の検出に右利に応用できること
である。 プローブは、検出すべき配列に対して相補的であるかあ
るいあはそれと相同のな少なくとも１種の一末鎖塩ノ、
（配列からなるであろう。しかしながら、このような塩
基配列はｔｎ−の連続のポリヌクレオチドセグメントで
ある必要はなく、非相同の配列により中断された２以−
Ｌの個々のセグメントから構成されることができる。こ
れらの非相同の配列は線状であることができ、あるいは
それらは自′己相補的であり、そしてヘヤビンループを
形成することができる、さらに、プローブの相同領域は
３’−５’−末端で非相同配列、例えば、増殖のため相
同配列が挿入されたベクターのＤＮＡまたはＲＮＡから
なるものによってフランキング（ｆ　ｌ　ａｎｋｉ　ｎ
ｇ）されることができる、いずれの場合においても、分
析用試薬として提供されるプローブは１または２以上の
点において問題の試料の核酸との交雑を示すであろう、
線状または円形の＝−末鎖ポリヌクレオチドをプローブ
の要素として使用することができ、主要部分または小部
分は相補的なポリヌクレオオチトの１またはそれ以」二
の鎖と二屯らせんを形成しており、ただし改要なｌまた
はそれ以上の相同セグメントは一本鎖の形７ｆｉであり
かつ試料のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑に利用されなくて
はならない、相同プローブ配列が本質的に一本鎖の形態
である線状または円形のプローブはとくに好ましい［と
くにツー（ＨＵ）およびメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）
、１ｎ（ａ２）参照］。 弔−のポリヌクレオチド配列をプローブとして使用する
フォーマットは、この分野において汀通である。プロー
ブは化学ルミネッセンス反応に参加できるような方法で
標識付けすることができる。これはプローブをある蛋白
質に特異的に結合する配位子、例えば、ビオチンで標識
付けすることによって達成することができ、そしてその
蛋白質は、例えば、ルミノールまたはワサビのペルオキ
シダーゼに共有結合した。化学ルミネッセンス反応の成
分のための担体であることができる。 プローブは、また、化学ルミネッセンス反応の相手に直
接結合させることができる。プローブはルミノールまた
はワサビのペルオキシダーゼに光化学的に結合させるこ
とができる。交雑後、雑種が反応成分の残部と免疫学的
に区別して挙動するような方式で、プローブを生成する
こともでき、例えば、ＤＮＡプローブをＲＮＡの検出に
使用するか、あるいはＲＮＡプローブをＤＮＡの検出に
使用する場合、ＤＮＡ／ＲＮＡ雑種はそれらの雑種を認
識する免疫学的に特異的な抗体を生成し。 そしてそれらの特異的認識を雑種の検出に利用すること
ができる。ＲＮＡプローブを固定化する場合、雑種は同
様に固定化され、モしてＲＮＡ／ＤＮＡ雑種に対してキ
４シ異的な抗体を雑種と反応せる。抗体が化学ルミネッ
センス反応に参加できる標識を有する場合、雑種は抗体
および化学ルミネッセンス法を経て検出することができ
る０例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ雑種特異的抗体をワサビの
ペルオキシダーゼに共有結合する場合、ペルオキシダー
ゼ結合抗体との交雑および相１１二作用後、前駆体およ
びオキシダントを添加することにより、化学ルミネッセ
ンス反応を開始することが可能であろう。 核酸を免疫に（性としかつ他の核酸と免疫学的に区別で
きるようにさせる、いくつかの多の方法が存在する。Ｒ
ＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡ雑種に対して選択的
である抗体も知られており、そして同様に使用すること
ができる。さらに、核酸が内位添加化合物と相互作用す
る場合、核酸の複合体は未反応の核酸から免疫学的に区
別されるようになる。雑種のフォーマットにおいて、プ
ローブが交雑後このような相！ｆ作用部位を提供するよ
うにプローブを調製する場合、抗体のアッセイは雑種の
検出のために実施することができる。 ２つの慣用のアッセイのフォーマットを下に詳述する： 本発明の分析法の実施は、いかなる特定の交雑フォーマ
ットにも限定されない、慣用の交雑技術を使用すること
ができる。改良がなされかつＪ！を公的に新規なフォー
マットが開発されるので、このようなものは本発明の方
法を実施するとき容易に適用することができる。とくに
有用な慣用の交雑フォーマットは、試料のヌクレオチド
酸またはポリヌクレオチドプローブを固体の支持体」−
に］−１１定化するもの（固相の交雑）およびポリヌク
レオチド種がすべて溶液中に存在するもの（溶液の交雑
）を包含する。 固相の交雑フォーマット 固相の交雑フォーマットにおいて、交雑に参加するポリ
ヌクレオチド種の１つを適当な方法でその一本鎖の形態
で固体の支持体へ固定する。有用な固体の支持体はこの
分野においてよく知られており、そして核酸を共有的に
または非共有的に結合するものを包含する。疎水的結合
を包含すると一般に理解されている非共有的支持体は、
天然に産出するポリマー材料および合成のポリマー材料
、例えば、ニドａセルコーヌ、？Ａ導化ナイロン、およ
びフッ素化ポリハイドロカーボンを種々な形ｙＥ、例え
ば、フィルターまたは固体のシートの形態で包含する。 ノ（右結合の支持体は、また、有用であり、そして化学
的に反応性の１または２以上の基を右する材料、例えば
、ジクロロトリアジン、ジアゾベンジルオキシメチルな
どを包含し、ポリヌクレオチドへの結合のために活性化
することができる。 典型的な固相交雑技術は、支持体へ試料の核酸を一本鎖
の形態で固定化するこで開始される。この初期の工程は
試料からの相補菌類の再アニーリングを木質的に防市し
、そして検出を増大するために支持体上に試料材料を集
中させる手段として使用することができる０次いで、こ
のポリヌクレオチドのプローブを支持体と接触させ、そ
して交雑をここに記載する方法により検出する。 未発ＩＪＩの目的に対して本質的にいかなる核酸交雑の
フォーマットに従うこともでき、ここでプローブと決定
すべき配列との１７１７で形成されたｆｆ種あるいは聞
届の配列と交雑しなかったプローブのいずれかを選択し
た化学ルミネッセンス標識で標識付けする。この分野に
おいて知られているように、このような雑種または交雑
しなかったプローブの標識付けは実際の交雑反応の前ま
たは後に実現することができる０通常、プローブは特異
的結合反応により標識されるかあるいは標識付けするこ
とができ、あるいは形成した雑種は、通常特異的結合反
応により、引き続いて標識付けされる。 本発明の中心の新規な面は、増強された化学ルミネッセ
ンスの現象を核酸の交雑の検出に有利に応用できること
である。 プローブは、検出すべき配列に対して相補的であるかあ
るいあはそれと相同のな少なくとも１種の一本鎖塩基配
列からなるであろう、しかしながら、このような塩基配
列は巾−の連続のポリヌクレオチドセグメントである必
要はなく、非相同の配列により中断された？以、にの個
々のセグメントから構成されることができる。これらの
非相同の配列は線状であることができ、あるいはそれら
は自己相補的であり、そしてヘヤピンループを形成する
ことができる。さらに、プローブの相同領域は３′−５
°−末端で非相同配列、例えば、増殖のため相同配列が
挿入されたベクターのＤＮＡまたはＲＮＡからなるもの
によってフランキングされることができる。いずれの場
合においても、分析用試薬として提供されるプローブは
１または２以−にの点において問題の試料の核酸との交
雑を示すであろう、線状または円形の一本領ポリヌクレ
オチドをプローブの要素として使用することができ、主
星部分または小部分は相補的なポリヌクレオチドの１ま
たはそれ以上の鎖と二組らせんを形成しており、ただし
重要なｌまたはそれ以上の相同セグメントは一本鎖の形
態でありかつ試料のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑に利用さ
れなくてはならない、相同プローブ配列が木質的に一本
鎖の形態である線状または円形のプローブはとくに好ま
しい［とくにツー（Ｈｕ）およびメッシング（Ｍｅ　ｓ
　ｓ　ｉ　ｎｇ）　１ｍ仏ユ（Ｇｅｎｅ）、↓ヱ、２７
１−２７７　（１９８２）参照］。 通常、プローブは選択した化学ルミネッセンス標識で直
接にあるいは１または２以上の特異的結合対を介して間
接に標識付けされる。ここで使用するとき、ｌまたは２
以上の特異的結合対を介する１１１１接の標識付け、固
定化または他の修飾は、１対の相互に結合する物質の一
方を標識付けすべき物質など、例えば、プローブへの結
合、および前記対の他方の構成員の標識付け、固定化な
どを意図する。有用な結合する対は、ビオチン／アビジ
ン（卵白のアビジンおよびストレトアビジンを包含する
）、ハプテンおよび抗原／抗体、炭水化物／レクチン、
酵素／阻害剤などのこの分野において知られているもの
を包含する。また、対、例えば、結合するビオチンまた
はハブテンを標識付けすべき物質などに、およびまた、
標識の固相などに架橋することができ、そしてそれぞれ
アビジンまたは抗ハプテンを使用して２つを架橋するこ
とができる。 標識付けしたプローブおよび固定化した試料の核酸を使
用するとき、生ずる雑種を交雑しないプローブから分離
し、そして化学ルミネッセンス反応を分離した分画の一
方または他方において開始する。雑種を交雑しない一本
鎖のプローブと区別する抗雑種抗体によって雑種を検出
する場合、雑種および交雑しないプローブを分離する必
要はない、このような抗体は混合されたＤＮＡ／ＲＮＡ
雑種のために選択的であるか、あるいはＲＮＡ／ＲＮＡ
またはＤＮＡ／ＤＮＡ雑種について選択的であるか、あ
るいは内位添加剤が雑種に導入されている場合内位添加
化合物の二重らせんのために選択的であることができる
。このような抗体試薬について、下に詳述する。 試料の核酸の固定化を含む方法に代任法は、固定化され
たプローブを用い、そして前述の化学ルミネッセンス標
識で直接または特異的結合対を介して標識付けされた抗
雑種抗体を使用する得られた固定化雑種の検出を用いる
。固定化された形１８で交雑反応に提供されるとき、プ
ローブはそのプローブ、および交雑によりおよび／また
は抗雑種試薬の結合によりそのプローブと関連するよう
になる反応混合物の成分を、引き続いて残りの混合物か
ら、例えば、遠心分離、症過、クロマトグラフィーまた
はデカンテーションによりｔｒｔｇ＆または分離するこ
とをＩｉｆ能とする任意の適当な形態であることができ
る０種々の組成および形状の固定化されたプローブは、
こうして明らかでありそしてこの分野の研究者らには入
手可能であろう０反応混合物中に不溶性の木質的に任意
の形態のプローブを使用することもできる０例えば、プ
ローブは凝集しあるいは他の方法で沈殿しており、不溶
性物質、ポリマー、支持体へ結合されており、あるいは
ゲル、例えば、アガロースまたはポリアクリルアミド中
に捕１足されていることができる［４ソツズ・イン・エ
ンジモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓｉ　ｎ　　Ｅｎｚｙｍｏ
　ｌ　ｏｇｙ）、１２Ｂ：６３５　（１９６８）ｔ３Ｊ
：びＰＮＡＳ、６７．８０７（１９７０）参照］、共有
結合または非共有結合によりプローブを取すイ・１けあ
るいは固定する固体の支持体を使用することはとくに好
ましく、後者は適当に安定なかつ強い取り付けを提供す
る吸着法を包含する。　１．＋１１体の支持体は種々の
形状および組成を取ることができ、例えば、微小粒子、
ビーズ、多項質および不透過性のストリップおよび膜、
反応容器１例えば、試験管およびマイクロタイター平板
（ｍｉｃｒｏｔ　１ｔｅｒ　　ｐ　　ｌ　　ａ　ｔｅ）
の内表面を包含する。所望の反応相手を選択した固体の
支持体に取り付ける手段は、この分野の研究者にとって
自Ｉｌｌであろう。 プローブをニトロセルロースの膜上に吸着させる１つの
方法は、プローブの溶液をヨウ化ナトリウ１、で飽和さ
せ、そしてアリコートを股上にスポツティングまたは濾
過することを包含する［ブＬ／７サー（Ｂ　ｒ　ｅ　ｓ
　ｓ　ｅ　ｒ）ら、旦ＮＡ、旦、２４３　（１９８３）
］。ヨウ化ナトリウ１、はプローブの変性を促進しかつ
ｌｌＩ２上への吸着を増進する。 あるいは、プローブをグリオキサールで、通常約１モル
（Ｍ）の濃度で、処理し、次いで膜上に吸、７′ｉさせ
ることができる。プローブは約ａｏ’ｃに真空丁に２〜
４時間ベーキングすることにより固定する。［Ｐ、Ｓ、
トウマス（Ｔｈｏｍａｓ）、）ソッズ・インーエンジモ
ロジ−（Ｍｅｔｈ、ｉｎＥｎｚｙｍ、）、１００．２５
５　（１９８３）］　。 ＲＮＡまたはＤＮＡの共有結合の固定化を、また、実施
することができる。広範な種類の支持物質および結合技
術を用いることができる。例えば、プローブはホスホセ
ルロースヘカーポジイミドまたはカルボニルジイミダゾ
ールにより活性化されたホスフェート基を介して結合す
ることができる［Ｅ　、　Ｋ　、　Ｆ　、バウツ（Ｂａ
ｕｔｚ）および４）、Ｔ、Ｙ、シー（Ｓ　ｈ　ｉ　ｈ）
およびＭ、Ａ。 マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）、バイオケミストリー（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、）、１３．３４１１−３４１８（１９７４
）コ、また１ｍ−ジアゾベンゾイルオキシメチルセルロ
−ス クレオチドのグアニンおよびチミジンの残基と反応する
ことができる［Ｂ　、　Ｅ　、ノイエス（Ｎｏｙｅｓ）
およびＧ．Ｒ．スターク（Ｓｔａｒｋ）。 ｍｌｌｌＥ　（Ｃ　ｅ　ｌ　ｌ　）　、　　５、３０１
−３１０　（１９７５）；Ｊ．レイザー（Ｒｅ　ｉ　ｓ
ｅ　ｒ）ら、／ヘイオ０４−１１１２　（１９７８）］
。多糖類の支持体は、また、水溶性カーポジイミドの活
性化により（Ｄ．リンチウッド（Ｒｉｃｈｗｏｏｄ）、
パイユ、４７−５０　（１９７２）；Ｆ’．Ｔ．キルハ
ム８）コ、あるいはポリヌクレオチド上の親核部位と臭
化シアン活性化支持体との結合により［Ｄ。 Ｊ．アーントージョビ７　（Ａｒｎｄｔ−Ｊ　ｏｖｉｎ
）ら、ユーロビアン・ジャーナルーオブ・バイオケミス
トリー（Ｅｕｒ．Ｊ．ＢｉｏｃｈｅＬ）、１４．４１１
−４１８　　（１９７５）；Ｕ．す７／＜−グ（Ｌｉｎ
ｂｅｒｇ）およびＳ．ｘリクンｙ（Ｅｒｉｃｋｓｓｏｎ
）　、、：Ｌ−ロビアン７９　（１９７１）］ポリヌク
レオチドの末端ホスフェートと支持体のヒドロキシルと
の間に形１＆，されたホスホジエステル結合を介する結
合で使用することができる。さらに、プローブの３゛−
ヒドロキシ末端を過ヨウ、に酸塩により酸化し、そして
シック塩基によりアミンまたはヒドラジトノ、（を右す
る支持体と結合させることができる［Ｐ。 Ｆ．ギルハム（Ｇｉｌｈａｍ）、　　メソッズ争イン−
　エフ　シモＯジー（Ｍｅｔ　ｈ．Ｅｎｚｙｍ．）、■
、１９１−１９７　（１９７１）、Ｈ．Ｄ．ハンスケ（
Ｈａｎｓｓｋｅ）ら、メソンズ・インｅｚンジモロジー
（Ｍｅｔｈ．　ｉｎ　　Ｅ　　ｎ　ｚ　ｙＬ）、且，１
７２−１８１　（１９７９）］。 親核部位を有する支持体を塩化シアヌル酸と反応させ，
次いでポリヌクレオチドと反応させることができる［Ｈ
．Ｄ．ハ７ガー（Ｈｕｎｇｅｒ）、ユ）、１旦ユ、３４
４−３４９　（１９８１）］。 ・般′に，任，・１の方法をプローブの固定化に使用す
ることができ、ただし相補的な一本鎖の配列が試料の核
酸への交雑に利用されなくてはならない。特定の方法ま
たは材料は本発明において臨界的ではない。 問題の多の方法はサンドインチ交雑技術であり、ここで
プローブの相同配列の２つの相１）−に排他的な断片の
一方を固定化し、そして他方を標識伺けする。問題のオ
リゴヌクレオオチドの存在は固定化されかつ標識＋ロナ
されたプローブのセグメントに対する二重の交雑を生じ
させ，再び同一の究極のＡＩｌｌ定は固定化されかつ標
識付けされたプローブのセグメント対する一重の交雑を
生じさせ、１すび支持体に関連した標識イ・１けされた
雑種の同−・の究極の測定を用いる。それ以上の詳細に
つ那　４６８　（１９８０）および直伝ｌ（免！ユ且）
、Ａ↓、７７−８５　（１９８３）を参照。 さらに良好に例示するため、内位添加された二重２らせ
んに対する抗体を使用する検出を包含する次の固相交雑
は本発明においてとくに有用である６ 第１の方法において、液状試験媒質からの一末鎖核耐を
まず固体の支持体上に固定化する０次いで、固定化され
た試料の核酸をプローブ（この場合、相補的−末鎖部分
に加えて、内位添加化合物と内位添加複合体の形態で化
学的に結合した物少なくとも１つの二木釦部分を含む）
と接触させることによって、交雑反応混合物を形成する
。プローブの特定の有用な形態は、上のツー（Ｈｕ）お
よびメッシング（Ｍｅ　ｓ　ｓ　ｉ　ｎｇ）文献に記載
されている円形の形ｙＥ；である。生ずる交雑凝集物は
プローブと交雑した固定化された問題のオリゴヌクレオ
オチドからなり、共有結合し、内位添加された二本鎖区
域を有する。次いで、固定化された二重らせんを有する
固体の支持体は反応混合物の残部から優先的に分離され
る。抗体を添加し。 好ましくは選択した化学ルミネッセンス標識で標識付け
された抗体を添加し、そして得られる凝集体中の内位添
加複合体に結合した固定化抗体を反応混合物の残部から
分離する６次いで、支持体へ結合した抗体を定Ｉ−ニジ
てアッセイを完結する。あるいは、分離した溶液中の抗
体を決定することができるが、これは大過剰の抗体を通
常必要とするので、一般に好ましさに劣る。 この方法の変法は上のようなプローブを使用することで
あるが、このプローブは二本鎖区域へ結合した共有結合
した内位添加化合物をもたない。 むしろ、内位添加化合物を固定化された凝集体に添加し
て、プローブの二木釦区域および交雑により形成された
二重らせん化区域の両者において内位添加化合物の複合
体を形成する。 第２の方Ｕ：はサンドイッチのフォーマットに基づき、
ここで反応混合物を問題の配列および第１および第２の
プローブを含有する試験媒質から形成し、各々はそれぞ
れ問題の配列の相互に排他的な部分°に対して相補的な
少なくとも１つからなる。第１プローブは固体の支持体
」二に固定化されており、そして第２プローブは前の方
法におけるように共有結合した内位添加複合体で修債さ
れている。得られる交雑凝集体は、固定化されたプロー
ブおよび内位添加複合体修飾プローブの両者に対して交
雑した問題の配列からなる。抗体、好ましくは標識付け
された形態の抗体を添加し、得られる凝集体中の内位添
加複合体に結合した固定化された抗体を反応混合物の残
部から分離する。 次いで、結合した抗体を定ｊＩＴｈする。 この第２の方法のいくつかの有用な変法が存在する。第
１に、第１の方法の変法に場合におけるように、共有結
合内位添加化合物を含まないがプローブを使用すること
ができるが、むしろ遊離の内位添加化合物を固定化され
た複合体に添加して、すべて有効な二本鎖区域をもつ内
位添加複合体を形成することができる。また、二木釦部
分をもつ第２プローブを使用する別法として、内位添加
化合物を化学的に結合して有する完全に一末鎖核酸のプ
ローブを使用し、こうして交雑のとき、内位添加複合体
が形成するか、あるいは内位添加化合物を添加し、こう
して２つのプローブと検出すべき配列との間に形成した
二重らせんの間に内位添加が起こるようにする。 この第３の方法において、試料の核酸を固定化ごれたプ
ローブと接触させ、そして好ましくは生ずる固定化され
た二重らせん体を反応混合物の残部から分離する。この
フォーマットにおいて、プローブは一本鎖の形態である
。生ずる交雑生成物は、問題の配列と交雑した固定化さ
れたプローブからなる。また、このフォーマットは試料
の核酸の相補的区域の間の有意の再アニーリングを０■
能とし、これは固定化された配列」二に起こることがで
きる。このような再アニーリングは、引き続く内位添加
のために追加の二本鎖核酸を提供するので、アッセイに
とって右利にはたらく。このアッセイにおける次の工程
は、内位添加および、再び好ましくは標識された形態の
、プローブを添加することである。このアッセイは、前
のフォーマットにおけるように分離および抗体の定量工
程によって完結される。 最後に、第４の方法が存在し、ここで−末鎖の試料の核
酸を固定化されたプローブと接触させ。 ここで、この場合において、このようなプローブは内位
添加化合物に化学的に、例えば共有的に結合し、こうし
て結合した内位添加化合物の区域における二重らせんの
形成は内位添加複合体を形成させる。これは高度に有利
なフォーマットであり、ここでプローブは固定化されか
つ修飾されており、固定化工程または修洟工程をアッセ
イの時実施することを必凹としない。得られる凝集体は
、試料とプローブの核酸との間の交雑区域および１１）
アニーリングされた試料の区域において、共有結合され
た内位添加複合体を含む０次いで、抗体を添加し、そし
てアッセイを前のフォーマットにおけるようにして完結
する。このフォーマットは、ある場合においては潜在的
に危険であることがある、遊離の内位添加化合物の溶液
の取扱いの必要性を排除するという利点を提供する。こ
の技術の簡単な変更は、標識付けされたプローブよりは
むしろ試料の核酸を固定化し、そして通常の方式で進行
させることである。これは多少好ましさに劣るが、実際
的なアッセイのアプローチである。 溶液相の交雑フォーマット 前述の固相のフォーマットに加えて１種々の溶液相の交
雑のフォーマットを、また、本発明に適用することがで
きる。このようなフォーマットは、交雑工程は試料の核
酸およびプローブの両者の溶液の形ｙＥ；を含むという
面によって特徴づけられる。これは右、・１に速い交雑
を生じうる。なぜなら、一方が固定化するときに比較し
て両方の鎖が溶液中に存在するとき、速度は非常に速い
からである０通常、交雑工程に引き続いて、生ずる雑種
を検出の目的で不動性とする。このような固定化は種々
の方法で実現することができる。従来、吸着剤、例えば
、ヒドロキシリン灰石およびニトロセルロース＋＋２へ
暴露することによって複合体を選択的に固定化すること
は知られている。 溶液相の交雑から形成した雑種を固定化するとくに有用
なアプローチは１反応相手と安定な共有結合または非共
有結合を形成しかつ固定化された形態のこのような反応
相手へ暴露することによって固定化を得ることのできる
反応部位を含むプローブを使用することを包含する。好
ましくは、プローブ中のこのような反応性部位は、ビオ
チンまたはハプテン部分のような結合部位であり、これ
らの部位は結合性物質、例えば、相手の役］］をするア
ビジンまたは抗体と特異的に非共有結合することができ
る０次いで、交雑を程後、固定化された形ｍの反応相「
、例えば、結合性物質を添加することができ、この物質
はプローブ上の反応性部位を介して雑種と選択的に結合
しかつそれを固定化するであろう。 木質的にいかなる対の物質も、反応性部位／反応性相手
の対からなることができ、これらは相互作用のために適
切な親和性を示して安定な結合を形成し、この結合は２
つの間の結合であり、引き続くアッセイの工程、とくに
分離および検出の工程に間実質的に無傷で残る。形成さ
れた結合は共有結合または非共有結合の相互作用である
ことができ、後者はことに選択性または特異性の程度に
より特徴づけられるとき好ましい、このような好ましい
結合の形成の場合において、プローブ上の反応性部位を
結合部位と呼び、そして反応相手はそれと非共有の杵通
特異的な結合を形成する結合物質と呼ぶ。このような結
合部位はプローブの一未鎖の交雑可能な部分中に存在す
ることができ、あるいはプローブの化学的修飾りム〜果
として存在することができる。ヌクレオチド配列中に存
在する結合部位の例は、プローブがプロモーター蛋白質
（例えば、バクテリオファージのプロモーター、ＲＮＡ
ポリメラーゼ）により結合可能なプロモーター配列（例
えば、１ａｃ−プロモーターまたはｔｒｐ−プロモータ
ー）からなるか、あるいはりセプター蛋白賀（例えば、
Ｉａｃ−リセプター）により結合可能なオペレーター配
列（例えば、Ｉａｃ−オペレーター）からなるか、ある
いは特異的抗体に結合可能な棲な抗体のヌクレオチドま
たは配列（例えば、５−ブロモまたは５−ヨートデオキ
シウリジン、Ｚ−ＤＮＡ）からなる場合である（英国特
許明細１Ｉｊ２　、　ｌ　２５　、９６４ｚＪ参照）。 プローブの化学的修飾により導入された結合部位は、と
くに有用であり、そして特異的結合対の一方の構成員を
プローブの核酸へ結合することを通常含む。選択に有用
な結合対は、ビオチン／アビジン、ハプテンおよび抗体
／抗体、炭水化物／レクチン、酵素／阻害剤などを包含
する、結合対が蛋白質の構成員および非蛋白質の構成ｆ
′１から核酸るとき、非蛋白質の構成員をプローブへ結
合することが好ましいであろう、なぜなら、蛋白質の構
成員はプローブの交雑の変性条件下に不安定であること
があるからでる。好ましい系はプローブをビオチンまた
はハブテンと結合させ、そしてそれぞれ［ｌＡ定化され
たアビジンまたは抗ブテン抗体を使用するこを包含する
。有用な配位子標識プローブの調製は文献から知られて
いる［ラニ）、ＬＡ、６６３３　（１９８１）；ブロー
９７８）、ソジャ（Ｓｏｄｊａ）ら、核酸の研究（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）　、互、３８
５　（１９７８）；チｘ　ン（Ｔ　ｃ　ｈ　ｅ　ｎ）（
１９８４）］。結合物賀の１／１１定化は従来の技術に
従うことができる。 固体の支持体上への蛋白質に固定化に種々の方法が知ら
れていおり、そしてこれらの方法は結合物質の固定化に
適用することができる［メンツズＥｎｚｙｍｏ　ｌｏｇ
ｙ）、Ｖｏ、４４　　（１９７６）８照］０例えば、抗
体は共有結合によりあるいは非共有的吸着により固定化
される。頻繁に使用される非共有的方法は、ポリスチレ
ンのビーズまたは微小粒子へ、あるいはポリ塩化ビニル
の表面へ吸着される。多くの共有結合の方法は蛋白質に
固定化に使用され、そしてわずかのものは臭化シアン活
性化アガロースおよびデキストラン：グルタルアルデヒ
ド活性化ナイロンおよびポリアクリルアミド；およびア
クリリルおよび他の支持体上のエポキシドを包含する。 プローブを固定化された形態で問題の配列との交雑に提
供するとき、プローブの性質により形成された二重らせ
んの固定化および抗雑種試薬の添加の引き続き工程は任
意の所望の順序で進行させることができる固定化および
抗雑種試薬の添加は、含まれる試薬および物質を同時に
添加することによって達成することができ、あるいは介
在する洗？’ｆｌまたは分離の工程を用いであるいは用
いないで、いずれかの順序で、一方を他方に対して先行
させることができる。順序をもった添加に従うとき、添
加する試薬のＣ度は形成する雑種を過度に変性しないよ
うにしかつそれと第２の添加物質との相互作用を禁止す
るように考慮しなければならないことはもちろんである
。 前述の特異的結合法により固体の支持体に結合するよう
になる固定化されたプローブまたは固定化可能なプロー
ブは好ましいが、固定化Ｔｉｆ能なプローブは比較的低
い特異性をもつプロセスによって支持体へ結合すること
ができる。この場合において、支持体は交雑したプロー
ブと結合するが、交雑しない形態と結合しない。次いで
、雑種の州を抗体試薬で測定する。この型の支持体の１
例はヒドロキシリン灰石であり、これはＤＮＡ／ＲＮＡ
およびＲＮＡ　’　ＲＮＡ二重らせんと結合するが、−
水加の種と結合しない［ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）
およびフォーコラ（Ｆａｌｋ。 ｗ）、Ａｃ１ｖ、ｉｎ　　Ｇｅｎｅｔ、、↓旦、（１９
７３）］。 また、化学的に活性な活性可能な基をプローブ中に導入
しし、そして交雑後固体の支持体と反応させることがで
きる。この系は共有結合で固定化されたプローブを１ｊ
−え、そして支持体に結合する雑種の量を抗体を使用し
て決定することができる。 −１−の方法に加えて、溶液相の交雑のフォーマットを
実施することができ、ここで雑種は固定化されたまたは
固定化ＩＩｆ能な抗雑種抗体試薬を結合することによっ
て固定化する。このような抗体試薬は内位添加二重らせ
ん体に対して、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮ
ＡまたはＤ　Ｎ　Ａ／Ｄ　ＮＡ￥＃種に対して前述のよ
うに特異的であることができる。探索する固定化された
二重らせんは、直接または間接の標識プローブ、生成物
結合第２抗雑種抗体、または標識第２プローブを使用す
ることによって検出される。 抗雑種抗体試薬および検出法 本発明の好ましい実施態様において使用する抗体試薬は
、プローブと相補的試料の核酸との間で形成された雑種
を一本鎖を有意に排除したポリメクレオチドに結合する
能力によって主として特徴づけられる。抗体試薬は全抗
体、抗体断片または多官能性抗体凝集体から成ることが
でき、あるいは抗雑種抗体からの１種または２種以−Ｌ
の特異的結合部位からなる任意の物質から成ることがで
きる。全抗体の形ｊムであるとき、それは既知の免疫グ
ロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭなとの群およびｉｎ
ｊ群のいかなるもに属することもできる。交雑したプロ
ーブに対する特異的結合の親和性を保持するこのような
結合のいずれの断片をも使用することができ、例えば、
Ｆａｂ、Ｆ　（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２として昔
０通に知られているＩｇＧの断片を使用することもでき
る。さらに、免疫グロブリン類またはそれらの断片の凝
集体、ポリマー、誘導体および複合体を適当ならば使用
することができる。 抗体試薬のための免疫グロブリン源は、任意の有効な方
法１例えば、抗血清およびモノクローナル技術により得
ることができる；抗血清はよく確台ニされた技術、例え
ば、動物１例えば、マウス、ウサギ、モルモット、ブタ
またはヤギの適当な免疫原の免疫化によって得ることが
できる。免疫グロブリンは、また、体細胞の交雑技術に
よって得ることができ、このような技術は、例えば、モ
ノクローナル抗体と普通に呼ばれるものを与え、また、
適″Ｌ７１な免疫原の使用を包含する。 イ１用な抗雑種抗体は、内位添加された核酸二重らせん
について選択的であるもの、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡ、
ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ雑種を特異的に結
合するものを包含する。 内位添加−屯らせんに対する抗体は、アニオン性蛋白質
または蛋白質誘導体（例えば、メチル化ウシ血清アルブ
ミンとア二オ性内位添加二重らせんとの間のイオン性複
合体から通常なる免疫原に対してレイズ（ｒａｉｓｅ）
される、好ましくは、内位添加は二重らせんに共有結合
される。あるいは、内位添加の二重らせん複合体は担体
の蛋白質に共有結合させることができる。 ＤＮＡ／ＤＮＡに対する抗体の調製は、欧州特許出願公
告第１３５，１３９号に記載されている。 ＤＮＡ　’　ＲＮＡ雑種に対して特異的の抗体を刺激す
る免疫原は、ホモポリマーまたはヘテロポリマーのポリ
ヌクレオチド二重らせんからなることができる。ＩＩ）
能なホモポリマーの二重らせんのうちで、ポリ（ｒＡ）
’およびポリ（ｄＴ）はとくに好ましい［キタガワ（Ｋ
ｉ　ｔ　ａｇａｗａ）およびストマー（ＳＬｏｌｌａｒ
）、Ｍｏ１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　上ユ、４１３　　（
１９８２）］　、Ｌかしながら、一般に、ヘテロポリマ
ーの二重らせんを使用することが好ましいであろう、そ
してこれらは種々の方法で１例えば、φＸｌ７４ピリオ
ン（ｖ　ｉ　ｒ　ｉ　ｏ　ｎ）　ＤＮＡｃ７）ＲＮＡポ
リメラーゼにより転写により調製することができる［ナ
カザト（Ｎａｋａｚａｔ　ｏ）、　　バイオケミストリ
ー（ＢＯ）０選択されたＲＮＡ　　ＤＮＡ二重らせんを
メチル化蛋白質に吸着させるか、あるいは他の方法でｆ
＆、−通の担体物質、例えば、ウシ血清アルブミンに結
合し、そして所望の宿主動物に注射することができる［
ストマー（Ｓｔ　ｏ　Ｉ　ｆａｒ）、ｊ’／−ｙＲＮＡ
’ＤＮＡ二手−らせんに対して抗体は、ウィルス、なか
でも、しオウイルス（ｒｅｏｖｉｒＵＳ）またはサトウ
キビに感染するフィシ−（Ｆｉｊｉ）病のウィルスから
の二本鎖ＲＮＡに対してレイズすることができる。また
、ホモポリマーの二重らせん、なかでも、例えば、ポリ
（ｒ　Ｉ）′ポリ（ｒＣ）またはポリ（ｒＡ）’ポリ（
ｒＵ）をにのように免疫化のために使用できる。 抗体試薬を使用して雑種を検出するとき、それは通常化
学ルミネッセンス標識で適当な合成手段により標識付け
されるであろう。 あるいは、抗体試薬を自然の性質、例えば、それ自身の
抗原性に基づいて検出することができる。化学ルミネッ
センス標識付けられた抗（抗体）抗体または蛋白質Ａは
第１抗体試薬に結合し、ここで第２抗体または蛋白質Ａ
のための標識は−１−のように汁通の標識である。さら
に、抗体は相補的固定または標識付けされた蛋白質Ａの
使用により、ならびに抗体の検出のためにこの分野で知
られた他の技術により検出することができる。 抗体試薬を標識伺けするとき、好ましいように、標識付
けする部分および抗体試薬を会合させるか、あるいは！
Ｌいに対して結合させることができ、これは直接の化学
的結合、例えば、共有結合を包含するこのような結合に
よって、あるいは標識をマイクロカプセルまたはリポソ
ームに組み込み１次いでこれらを抗体に結合Ｓせること
によるような間接的結合によって実施することができる
。標識付は技術はこの分野においてよく知られており、
そして任意に慣用の方法を本発明において使用すること
ができる。 放射される光は汁通の手段により、例えば、光増幅管に
より検出することができ、それからの信号を記録装置、
オツシレーターまたはスカラーに供給かつ表示または記
録することができる。光は、また、ルミノメータ−で定
；Ｉ」することができる。 使用する標識の種類に依存して、アッセイは不均質また
は均質であることができる。曲名の場合において、複雑
な流体、例えば、血清を分析することができるが、後者
の場合において、予備的な抽出または精製の上程を必要
とするであろう。 典型的な不均質または均質のルミネッセンスまたはルミ
ネッセンスＪｌｌｌ定の免疫アッセイは、次に概説する
通りである。 この型の免疫アッセイにおいて、アッセイすべき物質を
それに対する抗体と反応させる０次いで、Ｍ離の抗体を
結合した抗体から分離する。この反応は抗体、アッセイ
すべき物質またはＬ？のもしくは＆’ｒ合した部分と分
離後反応することのできる他の物質を標識付けすること
によって定量される。 ２、　拮抗的不均質ルミネッセンスの免疫アラ坦 この場合において、未知の清のアッセイすべき物質を、
既知ｊトの標識結合前記物質および既知であるが、限定
されたｌｉｊ二のそれに対する抗体と混合する。標識物
質および非標識物質との拮抗的反応（ｃｏｍｐｅｔｉｔ
ｉｖｅ　　ｒｅａｃｔｉｏｎ）が起こる。抗体と非標識
物質との間の複合体および抗体と標識物質との間の複合
体を、遊離の標識物質および非標識物質から分離する。 抗体に結合する標識物質の量を、アッセイする溶液中で
非標識物質に関係づける。これらの量は、抗体に結い、
シた標識の星を測定することにより、あるいは残るｔｌ
ｆＩの標識物質の量を測定することによって決定するこ
とができる。ペルオキシダーゼが標識であり、そして抗
体が固相に、例えば、ガラス管の壁を経て、結合するこ
の型のアッセイの例は、英国特許２，０４４，９２７Ａ
号に記載されている。 ３、　２部位の不均質ルミネッセンス測定免疫アッセイ この型の免疫アッセイにおいて、アッセイすべき物質を
まずそれに対する非標識抗体に結合し、ここでこの抗体
を固相の支持体、例えば、プラスチックに結合する０次
いで、複合体（抗体と物質との間の）を標識抗体で処理
する。 次いで、ず！Ｉられる固体の複合体中の標識抗体につい
ての分析は、固体の複合体を溶液から分離し、次いで分
離した固体の複合体中に存在する標識の量、あるいは溶
液中に溶解した残留する標識抗体中に存在する標識の量
を決定することによって実施することができる。 この型の免疫アッセイの別の実施態様において、アッセ
イすべき物質を連続的に標識抗体および非標識固体支持
抗体に結合するか、あるいは１つの結合工程において標
識抗体および非標識抗体の両者に結合することができる
。 これは標識が２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジ
オンのアミンまたは置換アミンの誘導体である免疫アッ
セイに適用することができる。それは問題の′Ｍ敲の標
識付けされた物質（またはそれに対する抗体）から放射
される光に依存し、この光は問題の結合され標識付けさ
れた物質（またはそれに対する抗体）から放射される光
と強度または波長が異なる。 １つの実施例において、（プロゲステロニインルミノー
ル誘導体）複合体を添加し、次いでヘムおよび過酸化水
素を添加した反応から、ある強度の光が放射することが
発見された。放射した光を測定し、そしてそして未知の
試料中に存在するプロゲステロンのをここで標準曲線か
ら決定した。 （未知の試料中に存在するプロゲステロンの債が多いほ
ど、ルミネッセンス反応の光の収率は低い）。 −Ｌの免疫アッセイのすべてにおいて、定量、検出また
は探索の工程は本発明のルミネッセンス反応であること
ができる。 使用の免疫アッセイにおいて使用する抗体は商業的に入
ｒ′−＋１丁能であるか、あるいは既知の免疫学的技術
により調製することができる。抗体は抗体の複雑な混合
物の形態であることができ、あるいは１種または２種以
上のモノクローナル抗体であることができる。はんのわ
ずかの容積の抗体を一般に必要とするだけであり、そし
てそれはその活性に適巴なｐＨ、イオン強度および温度
の条件に維持される。 次の非網羅的な物質の列挙に対する抗体は、木発明のル
ミネッセンス反応を利用する免疫アッセイにおいて通常
使用することができる：蛋白質、例えば、インスリン、
アルファフェトプロティン（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏ
ｔｅｉｎ）およびフェリチン、ホルモン、例えば、成長
ホルモン、上皮不休ホルモン、小胞刺激ホルモン、応対
遺伝子ホルモン、乾酪様刺激ホルモン、アドレノコルチ
コトロフィンホルモン、グルカゴン（ｇｌｕｃａｇｏｎ
）、　　プロラクチンおよびカルシトニン、ハプテン／
ステロイ１ζ、例えば、エストリオール、プロゲステロ
ンおよびコルチソール、薬物。 例えば、ジゴキシン、抗体、例えば、細胞表面抗体オヨ
びカルシ／エンブリオニック抗７４７（ｃａｒｃｉｎｏ
　　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　　ａｎｔ　　ｉｇｅｎ）およ
び抗体、例えば、おたふくかぜのウィルス抗体、ヒト免
疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ウサギＩｇＧ、ヒツジＩｇ
Ｇ、モルモット■ｇＧ、サルＩｇＧおよびヒト免疫グロ
ブリンＥおよびＭ。 第１１図は、本発明に従う化学ルミネッセンス装置を示
す、装置ｌＯは２つの隔室１２および１４を有し、これ
らは弁−ｒ一段または膜１６により分離されている。隔
室１２および１４の各々は、化学ルミネッセンス反応成
分、すなわち、化学ルミネッセンス前駆体、オキシダン
トおよび酵素の１つであるが、すべてではない成分を含
有する。緩衝化アミンは隔室１２および１４の一方また
は双方中に含有される。典型的な容器は、例えば、隔室
１２中に化学ルミネッセンス＋ｉｉｊ駆体を含イ１し、
そして隔室１４中にオキシダント、酵素および緩衝化ア
ミンを含有する。ブ「手段１６は、隔室１２から隔室１
４への化学ルミネッセンス前駆体の弔力流れを制御する
であろう。光は流れが開始したとき放射される。光の放
射を停＋Ｌさせるためには、弁手段１６を閉じて、化学
ルミネッセンス前駆体の流れを停止１ニさせる。 次の実施例を参照しながら１本発明を説明する。 丈池倒 実施例１：　配位子結合プローブＤＮＡの却Ｎドの方法
は特定の核酸を使用して例示するが、任・１のＤＮＡプ
ローブを使用することができる。 文献において知られている核酸プローブを標識刊けする
他の種々の方法（例えば、ニック翻訳）が存在する。核
酸、それゆえ試験試料を標識４−１けする一般的方υ：
を次に記載するニ ー１−において、次の用いた： ａ）　アデノウィルスＤＮＡすなわちｐＢ３２２プロー
ブ［ＥＮＺＯバイオケム（Ｂｉｏｃｈｅｍ）、ニューヨ
ークおよびＢＲＬ−ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−
（Ｂｅｔ　ｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｃｈＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）から商業的に人丁１−１ｆ能なりＮＡプロー
ブ］。 ｂ）　光反応性内位添加化合物はアミノメチルアンゲリ
シンであった。 Ｃ）　反応性配位子はＮ−ヒドロキシスクシンイミドビ
オチンであった。 プローブをまず光化学的に内位添加化合物と反応させた
０次いで、内位添加化合物をビオチンの反応性残基と反
応させたゆこの順序を変えて、ビオチン残基をまず光反
応性内位添加化合物と反応させ１次いでこの生成物を光
化学的にプローブと反１＜＞させることができる。 ５０ｘｇのＤＮＡを０．５００ｍ！のホウ酸塩緩衝液（
１０ｍｎ　　ｐ）（８，２）中に溶解し、そしてこの溶
液に５ｇｌ　（５ｇｇ）のアミノメチルアンゲリシン（
１ｍｇ／ｍ１．Ｈ２０中）を添加した。この溶液を３４
６ｎｍで３０分間照射した６反応した核酸をエタノール
で沈殿させて精製した。遺伝子したアンゲリシンの−Ｎ
Ｈ２残基は反応性であり、ビオチンのＮ−ヒドロキシス
クシンイミド誘導体（ＮＨＳビオチン）で修飾すること
ができた。これは次のようにして実施した。アミノメチ
ルーアンゲリシン結合核酸（１ｍｇ／ｍｌ）をホウ酸塩
緩衝液（１０ｍＭ（ミリモル）門Ｈ８，２）中に溶解し
、そして１０倍モル過剰のＮＨＳビオチア　（ＤＭＦ　
　Ｉ　Ｏｍｇ／ｍｌ中に溶解した）を添加した。この混
合物を室温で８時間浸透した。生ずるビオチニル化ＤＮ
Ａをリン酸塩緩衝液（１０ｍＭ　　ＮａＨ２ＰＯ４，１
０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　ｐ　Ｈ
７。 ５）に対して透析した。生ずるビオチニル化プローブは
交雑に使用できる状態であった。 実施例２：　　ＤＮＡについてのドットーブロッ１００
ｎｇ１００ｎの光化学的にビオチニル化したＤＮＡをバ
イオラド（ＢｉｏＲａｄ）［リッチモンド（Ｒｉｃｈｍ
ｏｎｄ）、米国カルフォルニア州］ニトロセルロース紙
上にスポツティングし、炉内で８０℃で２時間ベーキン
グし；この紙を３％のＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）
中に４２℃で２０分間浸漬することによりＢＳＡで飽和
させた０紙を容器から外に出しそしてそれを２枚の癌紙
間でブロッティングすることによって過剰のＢＳＡを除
去した０次いで、この紙をストレトアビジン（Ｓｔｒｅ
ｐｔａｖｉｄｉｎ）（０，２５ｍ　ｇ　／　ｍ　１．３
．０ｍｌの合計容積）を含有する溶液中で２０分間室温
でインキュベーションした０次いで、それをトリス（Ｔ
ｒｉｓ）０．１Ｍ（モル）、ｐＨ７，５，０，１Ｍ　　
Ｍａｉｌ、２ｍＭ　　ＭｇＣ１２および０．０５％のト
リトンｘを含有する緩衝液で３回洗沖した。それをビオ
チニル化ワサビペルオキシダーゼ（０，１ｍｇ／ｍｌ）
とともに室温で１５分間インキュベーションした。これ
をトリス（Ｔｒ　ｉ　ｓ）　　（０、１Ｍ、ｐＨ７，５
）、０．１Ｍ　　ＮａＣ１，２ｍＭＭｇＣ１２および０
．０５％のトリトンで３回洗浄した。スポットを打抜き
、そしてＤＮＡを含有するディスクを両側を黒く塗装し
たマイクロタイタート板のウェル（ｗｅ　１１）中に入
れた。打抜いた紙の円形体をマイクロタイタート板中に
配置した後、４０ｍＭのトリスおよび４０ｍＭの酢酸を
含有する０　、　８　ｍ　ｌの緩衝液（ｐＨ８，１）を
各ウェルに添加した１次いで、１０ｐｌのＤＭＦ中の３
９ｍＭのルミノールおよび水中の３０ｍＭのＨ２０２（
７）１　：　ｌ　（ｖ／　ｖ）混合物を添加し、放射光
の写真をとった。光が減衰した後、Ｈ２Ｏ。 ＋ルミノール混合物を添加した。この反応を３１１間続
け、酵素活性はほも５０％だけ損失した。 実施例３：　化学ルミネッセンス反応によるビオチニル
化プローブの交雑 溶液： Ａ、　　トリス−ＨＣＬ緩衝液（ＩＭ；　ｐＨ７。 Ｂ、　　０．５Ｍ　　ＮａＯＨ溶液 Ｃ５トリス−ＨＣＬ　（０，５Ｍ、ｐＨ７。 Ｄ、　　３モルのＮａＣＩ Ｅ、　　　ＳＳＣＸ　　　２０： １７５ｇのＮａｃＩ ８８ｇのＮａ−クエン酸塩 水を添加して１リツトルにする。 ＨＣｌｄｅｐＨを７．０に調節した。 これを水で希釈して異なる５ＳＣＣ度を生成した。 Ｆ、　予備交雑溶液： ４５％のホルムアミド ５０ｍｍのＮａ−リン酸塩緩衝液ｐＨ ６，５ ＸＳＳＣ ５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）溶液 ２００ｇｇ／ｍｌの水中の一本鎖ＤＮＡＧ、　交雑溶液
： ４５％のホルムアミド ２０ｍｍのＮａ−リン＃Ｊ１！緩衝液ＰＨ６，５ Ｘ５ＳＣ ５×デンハルト溶液 １１００ＩＬ／ｍｌの水中の一本鎖ＤＮＡ。 方法： １ｋｇ−ｔｐｇの試験試料のＤＮＡおよび対照のＤＮＡ
　（プローブと交雑すべきではない）をニトロセルロー
ス紙上にスポツティングした。この紙を３ＭＭ　　ワッ
トマフ　（Ｗｈ　ａ　ｔ　ｍａ　ｎ）セルロース紙（０
，５ＭのＮａＯＨ中でソーキングしかつそれで飽和した
）と７分間接触させることにより、ＤＮＡ試料を変性し
た０次いで、ニトロセルロース紙を他の湿潤３ＭＭ紙（
これは中和のため溶液Ａ中でソーキングした）と接触さ
せた０紙を２分後に乾燥させた。中和および真空下の乾
燥を３回反復した。 次いで、固定化した変性ＤＮＡを含有するニトロセルロ
ース紙を、溶液ＣおよびＤ中でソーキングしかつそれで
飽和した３ＭＭ紙と５分間接触させた８次いで、この紙
を８０℃で２時間真空下にベーキングした０次いで、−
紙を１０ｍ１の溶液Ｆを含有するプラスチ−２り袋に入
れた。この袋を水浴中で４２℃で２時間インキュベーシ
ョンした。予備交雑後、この紙を取り出し、そして１０
ｍ１の溶液Ｇおよび１蒋ｇの標識変性プローブ（実施例
１の生成物）を含有する他の袋に入れた。交雑を４２′
℃で１６時間実施した。 次いで、ニトロセルロース紙を次の順序で洗浄した： ａ、　２５０ｍ１（７）ＩＸＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ
：２回の洗浄、室温で３分間。 ｂ、　２５０ｍ１の０．２ｘＳＳＣ＋０．１％のＳＯＳ
　７２回の洗浄、室温で３分間。 ｃ、　　２５０ｍ１の０．１６ＸＳＳＣ＋０．１％のＳ
ＤＳ　：　２回の洗浄、５０℃で１５分間。 ｄ、　　５０ｍ１ｃ７）２ＸＳＳＣ＋０．１％（７）Ｓ
ＤＳ：２回の洗浄、室温で３分間。 次いで、雑種を次のようにして化学ルミネッセンス反応
により検出した：雑種を有する濾紙を３％のＢＳＡ　（
ウシ血清アルブミン）中に４２℃で２０分間侵漬するこ
とにより、症紙をＢＳＡで飽和させた０紙を容器から外
に出しそしてそれを２枚の濾紙間でブロッティングする
ことによって過剰のＢＳＡを除去した。この紙をストレ
トアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（０，２５ｍ
ｇ／　ｍ　ｌ、３．０ｍｌの合計容積）を含有する溶液
中で２０分間室温でインキュベーションした０次いで、
それをトリス（Ｔｒ　ｉ　ｓ）Ｏ、ＩＭ、ｐＨ７，５，
０，１ＭＮａＣ１，２ｍＭ　　Ｍ　　ｇ　　Ｃ１２およ
び０．０５％のトリトンＸを含有する緩衝液で３回洗浄
した０次に、その濾紙をビオチニル化ワサビペルオキシ
ダーゼ（０，１０ｍｇ／ｍｌ）とともに室温で１５分間
インキュベーションした。これをトリス（Ｔｒ　ｉ　５
）（０，１Ｍ、ｐＨ７，５）、０．１Ｍ　　ＮａＣ１，
２ｍＭ　　ＭｇＣｌ２および０．０５％のトリトンで３
回洗浄しおよびｌｏｍＭのトびス（ｐｉ−ｉａ　、０）
緩衝液で１回洗浄した。スポー２トを打抜き、そしてＤ
ＮＡを含有するディスクを両側を黒く塗装したマイクロ
タイター平板のウェル（ｗｅ　Ｉ　Ｉ）中に入れた。打
抜いた紙の円形体をマイクロタイター平板中に配置した
後、４０ｍＭのトリスおよび４０ｍＭの酢酸を含有する
０、８ｍｌの緩衝液（ｐＨ８，１）を各ウェルに添加し
た０次いで、１０ｐｌのＤＭＦ中の３９ｍＭのルミノー
ルおよび水中の３０　ｍＭ（７）Ｈ２ｏ２（７）ｌ　：
　１　（Ｖ／　Ｖ）混合物を添加した。それをフィルム
ホルダー内で直接露光することにより、光の放射を「ポ
ラロイド」インスタントフィルム上に記録した。 暗室内で、光を放射する紙を互いに接触させた。この湿
潤した紙を透明なプラスチック紙、例えば、「サランラ
ップ」で包み、開いたフィルム上に直接賃いた（フィル
ムホルダーを使用してカバーを引く）、それらろ露光し
た後、カバーを再配置し、そしてフィルムを引き出すこ
とによって現像および処理した。 Ｌ／７ズ（Ｒｅｎｚ）ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ
　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）、土ヱ、３４３５（１９
８４）に記載されているように、核酸プローブをワサビ
ペルオキシダーゼに化学的に結合し、そして固定化試験
試料（実施例３）に対して交雑させた。交雑の方法およ
び条件は凡人１．１冬、３４３５　（１９８４）に記載
されている手順と同一である。交雑後、紙を実施例３に
記載するようにトリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８）で洗
浄し、そして打抜きそして検出する。酵素標識プローブ
を使用するとき、交！ＩＩ後のＢＳＡのブロッキングは
不必要である。 ■ む ζ　　　　　　　　Ｎ １　　　　　　　　き） １００　ｍ　ｇの４′−アミノメチル−４，５’−ジメ
チルアンゲリシン（１）および０．４ｇのコハク酸無水
物を、無水ピリジン（５ｍｌ）中で２４時間−Ｘに振盪
する。ピリジンを蒸発させ。 残留物をメタノールで処理し、そして生成物を蒸発させ
るとゴム状塊が得られる。この固体を１０ｍ１のジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）中に入れ、０．２ｇのカーポ
ジイミドおよび０．４ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドビオチンを添Ｊ３１１する。この反応を２４時間実施
うる。この反応混合物を一２０℃に冷却してジシクロヘ
キシル尿素を沈殿させ、これを遠心のより取り出す、得
られる生成物をＤＭＦ中で３倍モル過剰のＡＨＥ　Ｉ（
６）と反応させる。この反応はこの混合物を１２時間室
温でインキュベーションすることによって実施する０次
いで、ＤＭＦｆｔ減圧蒸発させる。 得られる固体は精製しないで使用できる。この固体を１
０田ｌのＤＭＡ中に溶解し、この溶液の１．０．Ｉを標
識付けすべき１　ｍ　ｌのプローブ（５０ｐｇ）におよ
びし、そして実施例１におけるように光照射を実施し、
次いで実施例３におけるように交雑させる。 交雑後、スポットを別々にマイクロタイター平板のウェ
ル中に入れる。　　１　ｇ　Ｉ　　（０、１ｍｇ／ｍｌ
）のワサビペルオキシダーセ、１　ｍ　ｌのトリス−ア
ンモニウム１ａＷｊ液（４０ｍＭ　　ｌ−リス＋４０ｍ
Ｍ　　アンモニウム）および０　、５　ｍ　ｌの５ｍＭ
のＨ２Ｏ２を添加する。光の放射を「ポラロイド」フィ
ルムを露光することによって記録する。 実施例６：　交雑後のオリゴヌクレオチドの検出 この実施例は４つの部分に分；１，１される。 ６ａ、　　オリゴヌクレオチドを含有するアミンの合成
。 ６ｂ、　　６ａの生成物とＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドビオチンとの反応。 ６Ｃ５６ｂの精製。 ６ｄ、　交雑およびオリゴヌクレオチドの化学ルミネッ
センスによる検出。 ５′末端の１９Ａ′に付加 する１の合成の反応図 ■の合成は−Ｌの反応式で概略的に示される。 ５−クロロ水ｔＲ−２’−デオキシウリジン（５）［Ｄ
、Ｅ、バーストロム（Ｂｅｒｓｔｒ。 ｍ）およびＪ、Ｌ、ルス（Ｒｕ　ｔ　ｈ）　、　災ＪＲ
ＩＺ互）、迭、２５７　（１９７７）に記載される方法
に従い調製した］を、３−トリフルオロアセトアミド−
１−プロペン（７）［Ｍ、バイリーンド（Ｐａｉ　Ｉｅ
ａｎｄ）、Ｗ、Ｊ　、７ブシ、（Ｈｕ上±）、旦ヱ、９
９　（１９６６）］およびに２ＰｄＣ１４でメタノール
中で処理して、２回のクロマトグラフィーおよびメタノ
ールからの結晶化の後に、２２％の収率で５−トリフル
オロアセトアミドアリル−２′デオキシウリジン（８）
が得られた。８を塩化４，４°−ジメトキシトリチルと
反応させると、フラッシュクロマトグラフィーの後９が
８５％の収率で得られ［Ｗ、Ｃ，スチル（Ｓｔ　ｉ　Ｉ
　ｌ）　、　Ｍ、カーフ　（Ｋａｈｎ）、Ａ　。 見ユ）、旦、２９２３　（１９７８）］　、　これを引
き続いてＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシクロロ
ホスフィン［Ｌ、Ｊ、マクブライド（ＭｃＢｒｉｄｅ）
およびＭ、Ｈ，カルサーズ（ＣａｒｕＬｈｅｒｓ）、Ｔ
ｅｔ、Ｌｅｔｔｅｒｓ、２４．２４５　（１９８３）］
　　（１０）で処理すると、ペンタンから沈殿後に白色
固体としてｌが得られた。１９一単位のオリゴヌクレオ
チドＨＢＩ９Ａ′＝ ３　’　−ＧＡ−ＧＧＡ−ＣＸＣ−ＣＴＣ−ＴＴＣ−Ａ
ＧＡ−ＣＧ−５’ を、ＤＮＡ合成装置で調製した。各オリゴヌクレオチド
のこれらの別々の１ルモルのバッチをつくり、そして各
々を固体の支持体に結合しそしてジメトキシトリチル基
により完全に保護した。ジメトキシトリチル保護ノ、（
を５′−末端から除去し、モしてｌをＤＮＡ合成装置を
使用しないが、この機械（合成装置）が典型的には用い
るのと同一の試薬および条件を使用して、１９一単位の
鎖に結合した。 この方法の生成物は、支持体から除去した後、Ｃ−５′
末端に５°−（−アミノアリル−５′−（４，４°−ジ
メトキシトリチル）−２′−デオキシ−ウリジン単位、
すなわち、 をもつオリゴヌクレオチドである。この生成物のポリヌ
クレオチドを最後に３％のトリフルオロ酢酸に短時間暴
露して脱トリチル化し１次いでポリアクリルアミドゲル
の電気泳動により精製した。 このポリヌクレオチドＨＢ　１９Ａ　’は、ポリペプチ
ドのベータへモグリビンの遺伝情報を、ことにＤＮＡの
その区域において、指定するヒトＤＮＡの部分に相当す
る単位のポリヌクレオチドであり、ここには鎌型赤血球
ヘモグロビンの形成および組型赤血球貧血として知られ
ている遺伝疾患においてそれ自体を表わす突然変異が存
在する。 赤外（ＴＲ）スペルトルは、特記しないかぎり、ＣＨＣ
Ｉ３中の溶液として得た。ポリスチレンフィルムの１６
０２−１帯を外部の１１盛定め標ベロとして使用した。 プロトンの磁気共鳴（ＩＨＮＭＲ）スペクトルは、特記
しないかぎり、ＣＤＣＩ３溶液中でえた。化学シフトは
、特記しないかぎり、内部標準のテトラメチルシランか
らタウンフィールド（ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ）のｐｐｍで
報告する。 炭素−１３の磁気共Ｉ！ｒ、（１３０ＮＭＲ）スペクト
ルは、特記しないかぎり、ＣＤＣｌ３溶液中でえた。炭
素のシフトは、特記しないかぎり、内部標準のテトラメ
チルシランからダウンフィールドのｐｐｍで報告する。 リン−１３の磁気共ｌ０（３宜　Ｐ　　ＮＭＲ）スペク
トルは、特記しないかぎり、ＣＤＣＩ３溶液中でえた。 リンのシフトは、特記しないかぎり、外部標準の水性１
５％のＨ３ＰＯ，からダウンフィールドのｐｐｍで報告
する。 −し層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｅ、メルり（
Ｍｅｒｃｋ）からのシリカゲル６０Ｆ−２５４板を使用
して実施した。カラムクロマトグラフィーは、Ｅ、メル
り（Ｍｅｒｃｋ）のシリカゲル６０（７０〜２３０メツ
シユ）を使用して実施した。 ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）級のメタノ
ール（１２０ｍｌ）中の５−クロロ水銀−２°−デオキ
シウリジン（５）［八−グストロＡ　（Ｂｅ　ｒｇｓＬ
　ｒｏｍ）およびルス（Ｒｕｔｈ）、５ｕｐｒａｌ　　
（５，５６ｇ；　１２ナノモル）を、周囲温度において
不活性雰囲気のノ、（に維持し、そして３−トリフルオ
ロアセトアミド−１＝プロペン（７）［パイラー（Ｐａ
ｉｌｅｒ）およびツブシュ（Ｈｕｂｓｃｈ）、５ｕｐｒ
ａ］（７、３３ｇ　；　４’１Ｘｉｆ：）　オＪ：ヒに
２　ＰｄＣ１４（４，２８ｇ；１．１当１．；、　）で
処理した。この反応混合物は徐々に黒色になり、そして
２２時間攪拌した。この混合物をＨ２Ｓガスで数分間処
理し、次いでセライ１−（Ｃｅｌｉｔｅ）で症過し、メ
タノールで洗浄し、そして８０℃に浴から減圧蒸発乾固
すると、粗製の半固体の残留物（７，９ｇ）が得られた
。この残留物をシリカゲルのクロマトグラフ４−にかけ
、ＣＨ２Ｃ１２：ＭｅＯＨ（５：１）で展開した。変性
ｐ−アニスアルデヒド試薬［エゴン・スタール（Ｅｇｏ
ｎ　　５ｔａｈ１）、薄層クロマトグラフ　（Ｔｈ　ｉ
　ｎ　　Ｌａｙｅブリンガーーバーロング（Ｓ　ｐ　ｒ
　ｉ　ｎｇｅ　ｒ−Ｖｅ　ｒ　ｌ　ｏ　ｎｇ）、＝、　
−Ｂ−り８５７（１９６９）］でｉ’？色に着色しかつ
Ｒｆ＝０．５１　（ＣＨ３ＣＮ：ＭｅＯＨ３：　ｌ）を
有する帯を集め、そして真空ノ＾光乾固すると、無色の
物質が得られた。−この生成物を最少埴のメタノールか
ら結晶化し、−過し、そして冷Ｉｓ　　：　ＭｅＯＨ（
３：ｌ）で洗浄し、そして真シ；１乾燥した。母液を第
２収穫物のために処理した一合計の収縫１　、　Ｑ　ｌ
　ｇ（２２％）。Ｍ　ｅ　ＯＨから＋ｌｒ結晶化すると
、表題化合物が分析的に純粋な小さい白色剣状結晶が。 ６４°Ｃで一夜真空（＜０．１）ル）乾炊後　にず！ｌ
られた、融点＝　１８３−４℃、　　ｒＲ（ＫＢｒ）　
ｃｍ−’　　　３４２０．３２６０．１７１８．１６８
３（ｂｒ）、１５６０．１４７８．１２８３．１１９０
．１１０２．１０６１．９８０．７８８．７６３．７３
７．ＩＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（標準、ＤＭＳＯ−
ｄ６）２．１３、（ｄのｄ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、３．
５９　（ｂｒｓ、２Ｈ）、３．７０−３．９７　　（ｍ
、３Ｈ）　　、４．２５（ｂｒ　　　ｓ、ＬＨ）、５．
０６（ｂｒｍ、　ＩＨ）　　、５．２０　　（ｂｒ　　
ｍ、　　ＬＨ）、６０４−６．６５　　（ｍｓ、４Ｈ）
、８．０１　　（ｓ、　ＩＨ）、９．６０（ｂｒ　　　
ｓ、　ＩＨ）；’３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）　　（
標準、ＤＭＳＯ−ｃｌ）ｐｐｍ　　　１６２．０５、１
５５．２９．１４９゜５０、１３８　．０５、　！２４
．３３．１２４．１４、１０９．９６、８７．４７、７
０．２３、６１．１２、３９．９３；　　Ｃα）　　　
＝＋８．０１＠（ｃｍ０．８７、ＭｅＯＨ）。 分析：　Ｃ＋　４　Ｈ＋　６　Ｎ３０６　Ｆ２Ｏ３４４
，３３，Ｈｌ　４．２５；Ｎ、　　１１．０８Ｃ１４４
，１９；Ｈｌ　４．１０．Ｎ、　１０．９３デオキシウ
リジン（９） 無水ピリジン（８ｍｌ）中の８（０，６０ｇ。 １．５８ミリモル）の溶液を不活性雰囲気の下に維持し
、そして周囲温度で塩化４，４°−ジメトキシトリチル
（０，６７ｇ、１．２５ミリモル）で処理した。１８時
間攪拌後、この反応混合物を氷水（７０ｍｌ）中に激し
く攪拌しながら注入した。０°Ｃに２０分間放置すると
、コム状固体が分路し、はぼ透明な溶液が残り、これを
デカンテーションした。固体を８７０　（５ｍ　ｌ　）
で１回洗浄し、次いでＣＨ３Ｃ１２（１０ｍ　ｌ）中に
取り、ブライン（５ｍりで１回洗浄し、次いでＣＨ２Ｃ
ｌ２溶液をに２ＣＯ３で乾燥し、ｉｌ！過し、そして真
空蒸発乾固すると、褐色の泡が得られた。この粗生成物
をシリカゲル（メルク、対して級６０．２３０−４００
メツシユ、６０Ａ）（７５ｇ）のフラッシュクロマトグ
ラフィー［スチル（Ｓｔｉｌｌ）ら、５ｐｕｒａｌにか
け、４．０％のＣＨＣ１ａ中［７）４．０％（７）　Ｍ
　ｅ　ＯＨ溶奴（１，０リツトル）で力く開した。ピリ
ジン（１０ｐｌ）を含有する管中に６約２０ｍ１の分画
を集めて５′ヒドロキシルの脱保護を防１トした。腫瘍
生成物の帯を含有する分画（Ｒｆ＝０．２９；ＭｅＯＨ
：　ＣＨＣ１３７，９３）を合わせ、症過し、真空乾燥
すると、９（０，９１ｇ、８５％）がわずかに黄色の泡
としてｆ＋ｐられた。溶離の右心からの分画から溶成を
除去し、Ｉ”ｉｌ酸エチル（ＥｔｏＡｃ）中に取り、ｒ
ＮＯＲＩＴ　　２１１Ｊ　　［ゼネラル・ノリトーカン
パニー（ＧｅｎｅｒａｌＮｏｒｉｔ　　Ｃｏ、）から販
売されている］で処理し、　［セライト（ＣＥＬＩＴＥ
）Ｊ　　［ケム・アラート（Ｃｈｅｍ　　Ａｌｅｒｔ）
から販売されている分析用辿過助剤］で辿過し、そして
真空（１、Ｏトル）蒸発乾固すると、分析用試料が無色
の泡として得られた、融点＝１０５−１１０（分解）４
℃、　Ｉ　Ｒ（ＣＨＣ１３）　ｃｍ−’　　３３７０．
２９２０．１７１５．１６９５．１６１Ｂ、１５１５．
１４７０，１２６０．１１８２．１０４５．８４２；’
ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）２．３８（ｂｒ　　　ｍ、２Ｈ
）、３．２５−３．７５　　（ｍ、　５Ｈ）、３．７５
　　（ｓ、６Ｈ）、４．１０（ｂｒ　　ｍ、　　ＩＨ）
、４．．６０（ｂｒ　　　ｓ、　　ＩＨ）、５．３９　
　（ｄ、Ｊ＝１６　　Ｈｚ、　　ＩＨ）　、６、ｔｏ−
６，５５（ｍ、　２Ｈ）、６．７０−６　６９５（ｍ、
　５Ｈ）、　　７．１５−７．４５Ｃｍ、　　ｌ０Ｈ）
、７．８４（ｓ、　ＩＨ）；’３ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩ３
　）（標べＴ＋、　ＣＤＣＩ３　）　ｐｐｍ　　　１６
２．３１、１５８．７４、１５７．７０、　１５６．０
１　、１４９．７０、１４４．０４、１３７．８８、１
３５．６５、１３５．５２、　］、　　３　０　　、　
　ｌ　　２、１２８．１２、１２７．２６、１２５．０
５、１１３．４８、１１１．３３、８６．９４、８６６
８、８５　．２５、７２　。 １８．６３．．６０、５５．３４、４２　．６６、４１
．４２゜ 漣：　Ｃ３ｓ　Ｈ３４Ｎ３０ｓ　Ｆ２ Ｏ３６１，６７、Ｈｌ　５．０３．Ｎ、　５．０３Ｃ１
６１，４７，Ｈｌ　５．１９．Ｎ、　５．９５トリフル
オロアセトアミドアリル−５′〇−（４，４°−ジメト
キシトリチル）−２′デオキシウリジン−３’−０−（
Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミンメトキシホスフィン（１
）周囲温度においてアルゴン雰囲気下に維持された無水
ＣＨ２Ｃ１２（１，５ｍ１）中の９（０゜３４ｇ、０．
５ミリモル）の溶液を、まず、無水ジインプロピルアミ
ン（０，３５ｍ１；０．２５９ｇ；２ミリモル：４巴Ｉ
Ｉりで処理し、次いで、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ
メトキシ−クロロホスフィン［マクブライド（ＭｃＢｒ
ｉｄｅ）ら、５ｕｐｒａ参照］　　（１０）（０，１９
ｍ１；約２．２当州）で１分にわたり滴々処理した。生
ずる無色の溶液を２０分間纜押し、次いでＥｔＯＡｃ　
（２０ｍｌ）”Ｑ移した。（Ｅ　ｔ　ＯＡ　ｃ）は前も
って飽和水性ＮａＨＣＯ３で洗浄し、次いでブライン分
液漏斗に入れ、ブラインで４回洗浄しく各３５ｍ１）、
Ｎａ２　ＳＯ４で乾燥し、絽過し、そして真空蒸発乾固
すると、無色のガラス（０、５１ｇ）が得られた。この
粗生成物を無水ベンゼン（２ｍｌ）中に取り、そして急
速に攪拌した無水ペンタン（６０ｍｌ）中で一７８℃に
おいてアルゴン雰νＨ気下に沈殿させた。得られる懸濁
液を症過し、−７８℃のペンタンで洗浄し、そしてくｌ
トルにおいてＫＯＨで一夜真空乾燥すると、表題化合物
（１）が白色ノ１品質粉末として得られた（０．３８ｇ
、９３％）。ＩＲ（ＣＨＣ１３）ｃｍ−’　　２９６５
．１７２２．１６９８．１６１８．１５１８．１４７０
．１２Ｂ２゜１１８５．１０４５．９８８，８４２　：
　Ｉ　ＨＮＭＲ（ｃ［）２Ｃ１２）γ０．９５−１．３
０（ｍ、１２）１）　、　　２　、２０−２　、６０　
（ｍ、２Ｈ）、３．２４および３．３７（ｄのｄ、Ｊ＝
１３Ｈｚ、３Ｈ）（Ｐ−０−ＣＨ３）、３．２０＝３．
８０（ｍ、６Ｈ）、３．７５　（ｓ、６Ｈ）、４．１７
（ｂｒ　　ｍ、ＩＨ）、４．６８（ｖ　　ｂｒ　　ｍ、
ＩＨ）、５．４２　（ｄ、Ｊ＝１６Ｈｚ、ＩＨ）、８．
１５−６．５５　（ｍ、３）（）、６゜７５−６．９５
（ｍ、４Ｈ）、７．２０−７．５０　　（ｍ、ｌ０Ｈ）
、７．７９　　（ｓ、ＩＨ）：’　３ＣＮＭＲ（ＣＤ２
Ｃ１２）（標準、ＣＣｌ０２ｃ１２）ｐｐ　　　１６２
．４０．　１５９．２１．１５７　．７８、１４９．７
８、１４４．７１、　■３８．３４、１３６．００、１
３０．５３、１２＆、７１、１　２８　．４５、１２７
．５４．　１２５．６６、１２５．２７、１１３．８２
．１１１．４８、８７　．２３、８６．３１、８５．３
１、８５．６０．　５５．７５、４３　．７８、４３．
２０、４２．９４、２４．９９、２４．６０；３　’　
　Ｐ　　ＮＭＲ（ＣＤ２　　ＣＣ１２）ｐｐ　　１４９
．３０．１４８．８７．１４．１１（はぼ１２％の不純
物）、８．１８（はぼ４％の不純物）。 ｌのオリゴヌクレオチドへの取り付け １９一単位のオリゴヌクレオチドを、アプライド１１／
＜イオーシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｌｏ−５ｙ
ｓｔ　ｅｍｓ）３８０Ａ方ＤＮＡ合成装置を使用してコ
ントロール・ボア争グラス（ｃｏｎｔｒｏｌ　　ｐｏｒ
ｅ　　ｇｌａｓｓ）の固体の支持体ｌ二で合成した。１
をオリゴマーの５　’　末端へ取り伺ける直前に、５’
−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）保護基を機械
−ヒでＣＨ２Ｃｌ２中の３％のＣＣ１３ｃｏ２Ｈで切離
した。支持体結合５′脱保護オリゴマーをＣＨ３ＣＮで
洗浄し、そしてアルゴン流れ中で洗浄した。引き続＜　
ＩＡ：を機械（合成装置）を使用しないで実施したが、
同一の化学を用いた； ■、　　支持体結合オリゴマーを自動化合成に使用した
容器Ｃカラム）から取り出し、そしてアルゴン雰囲気下
に乾燥した隔壁−キャンプのバイアルに移した。 ２、　　結合したオリゴマーを無水ＣＨ３ＣＮ中の０．
５ＭのＩＨ−テトラゾールの２０〜３０倍の過剰星で処
理した。それをおだやかに攪拌しながら３０分間インキ
ュベーションした。 ３、　　　試薬をピペットで取り、そして結合したオリ
ゴマーを３つの部分のＣＨ３ＣＮで洗浄した。 ４、　　結合したオリゴマーを含有する固体の支持体を
過剰のｌ２Ｈ２０−ルチジン−ＴＨＦ（０，１Ｍ：１：
ｔｏ：４０）で処理し、そして１５分間纜押した。 ５、　　　試薬をピペットで取り、そして結合したオリ
ゴマーを４つの部分のＣＨ３ＣＮで洗？’ｆｌ　Ｌだ。 ６、　　結合したオリゴマーを含有する固体の支持体を
、過剰のチオフェノール−トリエチルアミン−ジオキサ
ンで６０分間洗ｎ１した。 ７、　　　試薬をピペットで取り、そして結合したオリ
ゴマーを４つの部分のＭ　ｅ　ＯＨで洗浄した。 ８、　　結合したオリゴマーを含有する固体の支持体を
、製水性ＮＨ４ＯＨで２時間周囲温度で処理した（これ
は保護されたオ リゴヌクレオチドを支持体から除去し た）。 ９、　　すべての保護基を除去するために、オリゴヌク
レオチドを遣水性ＮＨ４０Ｈで処理し、そして５０℃に
一夜加熱した（これは、ジメトキシトリチルを除外して
、すべての保護基を除去する）。 １０、　　支持体を症過し、そして昭液を蒸発乾固する
と、組成オリゴヌクレオチドがｆｌＰられた。 」二の工程を支持体結合オリゴヌクレオチドのすべての
バッチについて反復した。各々をシリカゲルのＴＬＣ板
上でＣＨ２Ｃｌ２中の３％のＣＣ１３ｃｏ２）（で処理
すると、ジメトキシトリチルカチオンのオレンジ−赤色
を生成し、これによりｌがオリゴヌクレオチド中に首尾
よく組み込まれたことが示された。 修飾されたＨＢ　１９Ａ　’オリゴヌクレオチドの１つ
の浴を、ＣＨ２Ｃ１２中の３％のＣＣ１３Ｃ０２Ｈで脱
トリチル化し、そしてポリアクリルアミドゲルの電気泳
動により精製した。 実施例６ｂ＝　特異的オリゴヌクレオチドとＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドビ オチン（ＮＨＳ−ビオチン）と の反応 実施例６ａからの２１４−ｇの１９Ａ’アミンまたは１
９ｓ’−アミンを２０弘ｌの１０ｍＭのホウ酸塩緩衝液
ｐＨ８，１６中に溶解した。これに、ピアース（Ｐｉｅ
ｒｃｅ）から購入したＮ−ヒドロキシスクシンイミドビ
オチン（１０ｍｇ／ｍｌ）の新しく調製したＤＭＦ溶液
の５ルｌを添加した。この反応を室温で１６時時間性さ
せた０反応後、溶媒を減圧蒸発させた。 実施例６Ｃ：　反応混合物からのＮＨＳビオチン１９Ａ
’の分離 シンクロパック（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｃｋ）ＲＦＰ４．
ｌＸ１０ｃｍ［ジンクロム（Ｓｙｃｈｒｏｍ）：インジ
アナ州すンデン］カラムに化合物したブラウンリー（Ｂ
ｒｏｅｗｎ　１ｅｅ）ＲＰ３３０ガード（ｇｕａｒｃｉ
）カラムを使用して１周囲温度で、０．１Ｍの酢酸トリ
エチルアンモニウムｐＨ７〜０．１Ｍの酢酸トリエチル
アンモニラ１、ｐ　ｆ（７の勾配で、ＨＰＬＣ分敲を分
離し、５０％のアセトニトリルを試料に依存して１０−
１２０分の期間にわたって流す。検出器を２５４ｎｍに
セットし、そして全１１盛は０．１５絶対単位である。 誘導化オリゴヌクレオチド生成物の位置を決定するため
に、ブランクの実験をオリゴヌクレオナトを含まない反
応混合物を使用して実施する。新しいピークはオリゴヌ
クレオチドの添加後に現われ、そして反応生成物に相当
する。生成物を分離しおよび分画コレクター中に集めた
後、生成物をゲル電気泳動により集め、そして次の実験
から、適切なピークの分析の決定は不必要であることが
わかった１次いで、オリゴヌクレオチドを減圧蒸発乾固
する。 実施例６ｄ：　交雑および交雑オリゴヌクレオチド検出 立証の目的で、精製した血液ＤＮＡをニトロセルロース
紙上に固定化し、実施例３におけるように予備交雑し、
実施例６のビオチニル化オリゴヌクレオチド生成物と、
コンナー（Ｃｏｎｎｅｒ）Ｌ　ｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃ　
ｉ　、）ＵＳＡ、且、２７８（１９８３）に記載される
条件下に交雑し、そして実施例２に記載する方法で検出
する。 実施例７： トリス＋アンモニウトの代わりに他のＨ＆ｉ剤を使用し
て、実施例２，３．５および６を反復した。このような
緩衝剤は次の通りであった：（ｉ）　　　　４０ｍＭの
トリス＋４０ｍＭのイミダゾール　ｐＨ８・１ （ｉｉ）　　　４０ｍＭのトリス＋１０ｍＭ（７）ピリ
ジン　ｐＨ８，１ （ｉ　ｉ　ｉ）　　４０ｍＭのトリス＋１０ｍＭのスペ
ルミン　ｐＨ８，１ アンモニウムを使用してより優れた結果が得られた。し
かしながら、緩衝剤（ｆ）、（ｉ　ｉ）および（ｉ　ｉ
　ｉ）におけるこれらのすべての窒素化合物は、化学ル
ミネッセンスの放射の遅延において有効であり、そして
酵素を長い時間活性に保持し、こうして放射を増強した
。 実施例８：　抗風疹ＩｇＧの検出 トーペ（Ｔｈｏｒｐｅ）ら、バイオケミカル１９８４）
に記・成されているように、ルバジム・キット（Ｒｕｂ
ａｚｙｍｅ　　Ｋｉｔ）［アボット番ヂアグノスチック
（Ａｂｂｏｔ　　Ｄｉａｇｎ。 ５ｔｉｃ）］をこのアアンモに使用する。ポリスチレン
ビーズを風疹（Ｒｕｂｅｌｌａ）ウィルスで被覆する０
次いで、この試験試料をウィルス被覆ビーズ（ｌｏｍＭ
）リス　ｐＨ７，５）ｌ樹液中でインキュベーションす
る。未反応の試験成分をビーズの分離により取り出し、
そしてそれらを洗浄する。 次いで、ビーズを抗と）ＩｇＧ（ヤギ）／ワサビのペル
オキシダーゼ（Ｉ　ｇＧ−ＨＲＰ）複合体と反応させる
。未反応のＩ　ｇＧ−ＨＲＰを除去した後、ビーズをマ
イクロタイターモ板のウェル中に入れる。Ｉ−分な緩衝
液（はぼ１ｍｌ）４０ｍＭのトリス＋４０ｍＭの酢酸ア
ンモニウム（ｐＨ＝８．１）を沈んだビーズに添加する
。３ｍｌのルミノール（ＤＭＦ中）と３０　ｍＭ（７）
Ｈ２０２（Ｈ２０’ｔ’）との４０弘１のｌ　：　１　
（ｖ／ｖ）混合物を添加した。実施例３におけるように
「ポラロイド」インスタントフィルムを露光することに
よって、光の放射を監視した。 実ｊ１Ｍ例９：　　ワサビペルオキシダーゼ仲介化学ル
ミネッセンス反応におけるアン モニウムおよびルシフェリ〉′の相 乗効果 光の放射をＳＬＭ４８００分光蛍光計で監視した。強度
を時間に対してプロットした。典型的なΔＩＩＩ定を第
１０図に示す。 Ａ　　：　緩衝液は４０ｍＭ（７）トリス＋４０ｍＭ（
ｐＨ８，１）酢酸アンモ ニウムであり、増強剤を含まな い。 Ｌ　　：　緩衝液はトリス（ｐＨ８，５）である。 増強剤はルシフェリン（４０ｕ ｍ）である。 Ａ＋Ｌ　　：　　緩衝液はＡと同一である。 増強剤はルシフェリン（４０ｕ ｍ）である。 ・・：　　）リスのみ・アンモニアおよび増強剤を含ま
ない。 ｌ　μＩ　　（ｉ　ｐ−ｇ／Ｈ２０ｍ　ｔ）　ノワサビ
ペルオキシターゼを添加し、次いで２ｍｌの（Ａ）、（
Ｌ）または（Ａ　＋　Ｌ）を添加し、次いでルミノール
３９ｍＭ　（ＤＭＦ中）とＨ２Ｏ２３０ｍＭ（Ｈ２Ｏ中
）と（７）１　：　ｌ　（ｖ／ｖ）混合物（７）４０ｇ
ｌを添加することによって、反応を開始した。 第１図は相乗効果を明瞭に示している。換言すると、別
々のＡおよびＬからの放射の強さの合計はＡ＋Ｌより小
さい。 実施例９ａ：　ペルオキシダーゼ仲介化学ルミネンセン
ス反応へのアンモニニ ランおよび増強ｈ＋＋の相乗効果 次の成分： ２ｍｌの緩衝液。 １００．１のｌｏｇ／ｍ１（）リス中）のビオチニル化
ワサビペルオキシダーゼ［シグマ−ケミカル・カンパ＝
−（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　　Ｃｈｅｍ。 Ｃｏ　、）　、米国ミゾリー州セントルイス］　、およ
び １〜４μ】の増強剤を含有する混合物を６０ルＭの最終
濃度を生成するようにしてＡ製し、フルオリメーターの
クベットに入れた。このクヘットを分光蛍光計ＳＬＭ４
８００のａｌｌｌｌｌｌ入室た。光源を除外して、すべ
ての装置にスイットを入れた。４０．１のＨ２Ｏ２−ル
シフェリン程合物（実施例）を添加した。放射を１２分
までａｌｌｌ定した。典型的な放射を第１図に示す。 光の放射の積分した（１１′ｉを下表に記載する。 ＼、 ゝ＼ 緩衝液は常にトリス（ｐＨ８，５）である。 １−の表から明らかなように、アンモニウムおよび増強
剤の同時の存在は、フルオロメーターにおいて決定して
、放射において相乗効果を生成する。 まず、Ｄ−ルシフェリン、すなわち− を実施例５におけるようにＮ−ヒドロキシスクシンイミ
１−で活性化し、次いで４′アミノメチル−４，５゛−
ジメチルアンゲリシンを実施例１におけるように反応さ
せる。交雑を実施例３と同一方法で実施する。検出はｌ
焦１　（０、１ｍｇ／ｍｌ）のワサビペルオキシダーゼ
、０．１ｍｌの０．５ｍＭのルシフェリン（ＤＭＦ中）
および５ｍＭのＨ２Ｏ２のＩ：ｌ混合物の添加を必要と
した。この方法はバックグラウンドの放射を減少する。 なぜなら、遅延された増強剤の化学ルミネッセンスは交
雑したプローブのみから生成されるからである。 実施例１１．１２および１３： 実施例１１．１２および１３は実施例２と同一方υ、で
実施したが、ルシフェリンを使用しなかった。ルシフェ
リンの代わりに、同一濃度の次の成分を使用した： ４−ヨードフェノール（実施例１１）、６−ヒドロキシ
ベンゾチアゾール（実施例１２）、および ４−フェニルフェノールＣ実に例１３）。 これらの増強剤のｈ：（溶液をエタノール中で１０倍の
ＣＩｚ　（２ｍ　Ｍ　）で調製し、そして１０！Ｉのみ
を１００ｇ１　（ルシフェリンについて使用した）の代
わりに使用する。 比較の結果は、ヨードフェノールは最大の増強を示すが
、光の放射の減衰はルシフェリンまたは６−ヒ］・ロキ
シベンンチアゾールよりも速いことヲ示ス。６−ヒドロ
キシベンゾチアゾールは光の放射の遅延および増強にお
いてルシフェリンよりモ優れる。フェニルフェノールは
ヨードフェノールに類似する挙動を示す。これらの結論
は露光したフィルムの視的分析から誘導された。 ｒ／ｍＭｔ４：　　ルシフェリンにより遅延された化学
ルミネッセンス反応へ（７）Ｄ ＮＡおよびＤＮＡ修飾剤の作用 第１図は、ＳＬＭ４８００分光蛍光計中でＷｌｌｌ定さ
れた光の放射へのＤＮＡの効果を示す。実験は２００ｇ
１の０．２ｍＭのルシフェリン＋５ｍＭの過酸化水素を
ｌ：１混合物で、１００延１の核酸を含有する溶液に添
加することによって実施した。混合物中に存在した核酸
の合計量は、それぞれＩＩＬｇ、５μｇおよび１０．ｇ
であった。ワサビペルオキシダーゼのｅ度は１１００ｎ
／ｍｌであった。非活性はシグマ・ケミカル壷カンパニ
ー（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍ、Ｃｏ　、）、米国ミゾリ
ー州セントルイスから購入した１ｍｇ当り２５０単位で
あった。核酸の交雑が研究するとき、同一の酵素を使用
するので、ワサビペルオキシダーゼをビオチニル化した
。反応混合物の合計の容積を、１０ミリモルのトリス緩
衝液（ｐＨ８，１）の添加により２．４ｍｌに調節した
。第１１ｍが１．１１瞭に示すように、核酸はこの方法
に事実上影響を及ぼさない。第２図および第３図が示す
ように、同一の条件ドに、ビオチニル化ＤＮＡは放射に
多少の照明作用を示すことがある。ＤＮＡをビオチンア
ンゲリシン付加物と反応させてビオチニル化しかつ３４
６ｎｍで照明した光化学的にビオチニル化した核酸は、
ニック翻訳した商業的に入手可能な生成物が示す種類の
作用を示さなかった。 ニック翻訳した核酸の作用は、明瞭に理解されないが、
この時点において、光化学的なビオチニル化法を実施す
る場合、化学ルミネッセンス反応への核酸の作用はアビ
ジンの使用によりさらに減少させることができる、第４
図、第５図および第６図は、それぞれ、アンゲリシン、
ビオチンおよびルシフェリンの作用の結果を示す。核酸
雑種の検出のためのワサビペルオキシダーゼ仲介法を利
用するために、４つの異なるフォーマットを使用して、
これにより究極的に同様な酵素アッセイのワサビのペル
オキシダーゼを使用して最終の反応の結果を監視できる
ようにした。 −にの実施例の化学ルミネッセンスは、「ポラロイド」
フィルムのホルダー１−でフォトラジオグラフィー（ｐ
ｈｏｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）ｆ：段により決定し
た。 光の放射プローブおよびフィルムが固体物質の薄い片、
例えば、「サランラップ」、透明繊維またはマイクロタ
イターモ板の＋７−担な側によってのみ分離されたカッ
ナト中に存在するときに、フィルムを露光した。 実施例１５〜３７： 実施例１５〜３７についての実験の原型は実施例ＬＡと
同一であった。相対的強度は、記録した曲線を裁断し、
そして分析用材で秤ｒ４することによって４１４定した
。１毛量は任意の中位で相対強度として表に記・１あし
た。実施例１５〜３７の結果を下に示す。 ム　　ム　　＋Ｌ＋　　＾　　１１　　　ふ　　＾　　
ふ　　＾　　ふ　　み　　み　　＾　　＾一 層 右 （）　　　（）　　　（）　　　（）　　　ｏｓ　　　
（）　　　（）　　　（）　　　（）　　　（）　　　
ｅ＞　　　（）　　　（）　　ｅ＋ ロ　　ロ　　■　　Ｃｏ　　　内Ｃｏ　　　ロ　　■　
　ロ　　■　　■　　ロ　　θ）　　ロ本　　　　　−
一　　　　　−−＾　　　　　　　　　　　　　　　　
−−ム　　　　　−一　　　　　ふｕ’）　　　　（）
　　　　（）　　　　の　　　　　　　　　　　−−。 　　　の℃　　　　の　　　　の　　　■　　　　　　
　　　　　　■　　　　■　　　　の　　　　■ｏ　　
　　０　　　０　　０　　　　　　　　　　　０　　　
０　　　　ｏ　　　　。 ｃｏ　　　　ｃｏ　　　　ｃｏ　　　　ロ　　　　　　
　　　　　Ｃｏ　　　　Ｃｏ　　　　ＣＯＣ０ニー＝）
　　　　　　り　　　　　：）：＋＋　　　　　　　　
　　コ　　　　　：）＝−や　　　　　　　　　　　　
　　　＼ り　　　り　　　：Ｎ　　　り　　　り　　　）；）　
　　　コ　　　り　　　コ　　　−１　　　コ　　　　
　　　コ　　　コ　　　）ふ　　　＾　　　＾　　　ム
　　　ふ　　　ふ　　　＾　　　ム　　　二　　　二本
明細書および特許請求の範囲は例示を目的とし、そして
限定するものではなく、そして種々の変更および変化を
本発明の精神および範囲を逸脱しないでななすことがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、子牛胸腺ＤＮＡの発光速度への影響を示す。 第２図は、ビオチニル化ＤＮＡの発光速度への影響を示
す。 第３図は、ニック翻訳ビオチニル化ＤＮＡの発光速度へ
の影響を示す。 第４図は、アンゲリシンの発光速度への影響を、Ｊ＜す
。 第５図は、ビオチンの発光速度への影響を示す。 第６Ａ図は、ルシフェリンおよびビオチニル化ＤＮＡの
発光速度への影響を示す。 第６Ｂ図は、ルシフェリンおよび非ビオチニル化ＤＮＡ
の発光速度への影響を示す。 第７図は、非ビオチニル化アデノウィルスＤＮＡ対ビオ
チニル化アデノウィルスＤＮＡの検出限界を示す。 第８図は、交雑ビオチニル化アデノウィルスＤＮＡの検
出を示す。 第９図は、交雑ビオチニル化ＰＢＲ３２２ＤＮＡの検出
を示す。 第１Ｏ図は、緩衝化アミンについて、ルシフェリンにつ
いて、アミンまたはルシフェリンの不存在について、お
よびＷＷｊ化アミン＋ルシフェリン（本発明による）に
ついての光の強さ対Ｈ１ｐ間のプロントである。 第１１図は、本発明に従う化学ルミネッセンス装置の側
面図である。 １０　化学ルミネッセンス １２　隔室 １４　隔室 １６５ｒ手段 図面の１７Ｉ’ｉ（内容に変更なし） 第７図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、化学ルミネッセンス前駆体、オキシダント、及び酵
   素を、アンモニアおよび水溶性有機アミンから成る群よ
   り選択される窒素化合物の存在に接触させることを特徴
   とする化学ルミネッセンス前駆体、オキシダント、およ
   び酵素を接触させることからなる化学ルミネッセンス法
   。 ２、前記窒素化合物がアルキルアミン、ポリアミン、ア
   リールアミンおよびベンジルアミンから成る群より選択
   される特許請求の範囲第１項記載の化学ルミネッセンス
   法。 ３、前記窒素化合物がスペルミン、スペルミジン、プト
   レシン、ブチレンージアミン、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｘ＿１、Ｘ＿２、Ｘ＿３は同一もしくは相異なり
   、そして１〜８個の炭素原子を有する非置換もしくは置
   換の脂肪族飽和炭化水素基である、アルキルアミン、Ｎ
   Ｈ＿３またはその塩、ピリジン、アゾール類およびチア
   ジン類から成る群より選択される特許請求の範囲第１ま
   たは２項記載の化学アルミネッセンス法。 ４、化学ルミネッセンス前駆体が、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｒ＿１はアミノであり、そしてＲ＿２、Ｒ＿３お
   よびＲ＿４の各々は非置換もしくは置換のＣ＿１−Ｃ＿
   ６−アルキルもしくはアルケニル、ヒドロキシル、Ｃ＿
   １−Ｃ＿６−アルコキシ、カルボキシル、またはアミノ
   であり、あるいはＲ＿２はアミノであり、そしてＲ＿１
   、Ｒ＿３およびＲ＿４の各々はＨ、非置換もしくは置換
   のＣ＿１−Ｃ＿６−アルキルもしくはアルケニル、ヒド
   ロキシル、Ｃ＿１−Ｃ＿６−アルコキシ、カルボキシル
   、またはアミノであり、あるいはＲ＿１およびＲ＿２は
   、一緒に、ベンゾ基のアミノまたは置換アミノの誘導体
   であり、そしてＲ＿３およびＲ＿４の各々はＨ、非置換
   もしくは置換のＣ＿１−Ｃ＿６−アルキルもしくはアル
   ケニル、ヒドロキシル、Ｃ＿１−Ｃ＿６−アルコキシ、
   カルボキシル、またはアミノである、 の２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンである
   特許請求の範囲第１または３項のいずれかに記載の化学
   ルミネッセンス法。 ５、増強剤をさらに含み．前記増強剤が４−クロロフェ
   ノール、４−ブロモフェノール、４−ヨードフェノール
   、４−ブロモ−２−クロロフェノール、２，４−ジクロ
   ロフェノール，３，４−ジクロロフェノール、４−メチ
   ルフェノール、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、３−
   （４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸エチル、４−
   ベンジルフェノール，４−（３’−メチルクロチル）フ
   ェノール、４−スチリルフェノール、４−（２’，４’
   −ジニトロスチリル）フェノール、４−ヒドロキシ桂皮
   酸、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸，４−フェニル
   フェノール、４−（４’−ヒドロキシフェニル）フェノ
   ール、２−クロロ−４−フェニルフェノール，４−（４
   ’−ヒドロキシフェニル）ベンゾフェノン、４−（フェ
   ニルアゾ）フェノール、４−（２’−カルボキシフェニ
   ルアゾ）フェノール、４−フェノキシフェノール、４−
   （４’−ヒドロキシフェノキシ）フェノール、４−ヒド
   ロシキフェニルサルファイド、４−ヒドロキシフェニル
   ジサルファイド、ナフト−２−オール、１−ブロモナフ
   ト−２−オール、６−ブロモナフト−２−オール、１，
   ６−ジブロモナフト−１−オールおよび式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、ＲはＨ、ＣＮまたは非置換もしくは置換のチアゾ
   ールであり、そしてＸ＿１、Ｘ＿２およびＸ＿３の各々
   はＨ、非置換もしくは置換のＣ＿１−Ｃ＿６−アルキル
   もしくはアルケニル、ヒドロキシル、置換ヒドロキシル
   、Ｃ＿１−Ｃ＿６−アルコキシ、カルボキシル、アミノ
   または置換アミノである、 の６−ヒドロキシベンゾチアゾール類から成る群より選
   択される特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の
   方法。 ６、特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の化学
   ルミネッセンス法を分析物の検出に使用することを特徴
   とする抗体、抗原、核酸、オリゴヌクレオチドおよび酵
   素から成る群より選択される分析物を検出するためのア
   ッセイ。 ７、分析物または分析物の結合相手を化学ルミネッセン
   ス前駆体、増強剤または酵素で標識する特許請求の範囲
   第６項記載のアッセイ。 ８、特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の方法
   からなることを特徴とする特定の核酸を検出するための
   アッセイ。 ９、核酸がリボ核酸、デオキシリボ核酸およびオリゴヌ
   クレオオチドの群から選択される特許請求の範囲第８項
   記載のアッセイ。 １０、特許請求の範囲第６〜９項のいずれかに記載のア
   ッセイを実施するための試験キット。