DE3688766T2 - Verlängerte Chemolumineszenz. - Google Patents

Verlängerte Chemolumineszenz.

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Description

  • Die Erfindung betrifft Chemolumineszenz-Assays, die zum Nachweis von Nucleinsäurehybriden, Antikörpern, Antigenen und Enzymen geeignet sind.
  • Die Erfindung betrifft eine verlängerte, verstärkte Chemolumineszenz. Genauer gesagt betrifft die Erfindung die Stabilisierung des Enzyms bei Reaktionen mit verstärkter Chemolumineszenz durch Verwendung von stickstoffhaltigen Verbindungen.
  • Die Erfindung betrifft ferner den Nachweis von Nucleinsäurehybriden durch Chemolumineszenz-Reaktionen.
  • Lumineszenz ist als die Emission von Licht ohne Wärme definiert. Bei der Lumineszenz wird Energie spezifisch zu einem Molekül geleitet, so daß ein spezieller, Lichtemittierender Zustand hergestellt wird, ohne daß die Temperatur des Moleküls wesentlich erhöht wird. Die Farbe wird durch den Charakter des beteiligten Licht-emittierenden Zustandes bestimmt, und sie ändert sich nicht, wenn die Energie oder die Methode zu seiner Bildung verändert werden.
  • Chemolumineszenz ist als Lumineszenz definiert, wobei eine chemische Reaktion die Energie bereitstellt, die für die über die Emission des schwarzen Körpers (thermische Strahlung) bei der gleichen Temperatur und innerhalb des gleichen spektralen Bereiches hinausgehende Emission von Licht (ultraviolett, sichtbar oder infrarot) verantwortlich ist. Chemolumineszenz beinhaltet also die direkte Umwandlung chemischer Energie in Lichtenergie. Unterhalb von 500ºC beinhaltet jede Emission von Licht während einer chemischen Reaktion Chemolumineszenz. Der blaue innere Kegel eines Bunsenbrenners oder die Coleman- Gaslampe sind Beispiele.
  • Viele chemische Reaktionen erzeugen Energie. Üblicherweise führt dieser exotherme Ablauf zu Wärme, d. h., zu Translations-, Rotations- und Vibrationsenergie der Produktmoleküle; damit eine sichtbare Chemolumineszenz auftritt, muß dagegen eines der Reaktionsprodukte in einem angeregten elektronischen Zustand (nachstehend durch einen Stern gekennzeichnet) erzeugt werden, von dem aus es einer Desaktivierung durch Emission eines Photons unterliegen kann. Dementsprechend kann eine Chemolumineszenzreaktion, wie sie in den nachstehenden Reaktionsgleichungen (a) und (b) gezeigt ist, als Umkehrung einer photochemischen Reaktion aufgefaßt werden.
  • A + B → C* + D (a)
  • C* → C + h ny (b).
  • Die Energie des Lichtquantums h ny (wobei die h die Plancksche Konstante und ny die Lichtfrequenz ist) hängt vom Abstand zwischen dem Grundzustand und dem ersten angeregten elektronischen Zustand von C ab. Das Spektrum der Chemolumineszenz stimmt üblicherweise mit dem Fluoreszenzspektrum des emittierenden Moleküls überein. Gelegentlich umfaßt die Reaktion eine zusätzliche Stufe, und zwar die Übertragung von elektronischer Energie von C* auf ein anderes Molekül, das nicht notwendigerweise anderweitig an der Reaktion beteiligt ist. Manchmal kann kein diskreter angeregter Zustand angegeben werden, und in diesem Fall ist das Chemolumineszenzspektrum ein strukturloses Kontinuum, das mit der Bildung eines Moleküls verknüpft ist, wie beim sogenannten Nachleuchten der Luft: NO + O → NO&sub2; + h ny (grünes Licht).
  • Die Effizienz einer Chemolumineszenz wird als Quantenausbeute Φ, d. h. als Zahl der pro umgesetztem Molekül emittierten Photonen, ausgedrückt. Viele Reaktionen weisen Quantenausbeuten auf, die wesentlich geringer (10&supmin;&sup8; h ny pro Molekül) als das Maximum von 1. 1 Einstein bei sichtbarem Licht (1 Einstein = Nh ny, wobei N die Avogadrosche Zahl ist) mit Wellenlängen von 400 bis 700 nm entspricht Energien von etwa 70 bis 40 kcal/Mol (300 bis 170 kJ/Mol). Man kann also nur von sehr stark exothermen oder exergonischen chemischen Prozessen erwarten, daß sie Chemolumineszenz zeigen. Zum Teil aus diesem Grund beinhalten die vertrautesten Beispiele von Chemolumineszenz Sauerstoff und Oxidationsprozesse. Die effizientesten Beispiele sind die enzymvermittelten Biolumineszenzen. Das Leuchten von Phosphor an der Luft ist ein historisch wichtiger Fall, obwohl der Mechanismus dieser komplexen Reaktion nicht vollständig aufgeklärt ist. Die Oxidation von vielen organischen Substanzen, wie von Aldehyden oder Alkoholen, durch Sauerstoff, Wasserstoffperoxid und Ozon ist chemolumineszierend. Die Reaktion von erwärmtem Etherdampf mit Luft führt z. B. zu einer bläulichen "kalten" Flamme. Die Effizienz einiger Chemolumineszenzen in Lösung, wie die Oxidation von Luminol (I) (siehe nachstehende Formel) und insbesondere die Reaktion einiger Oxalatester (II) (siehe nachstehende Formel) mit Wasserstoffperoxid kann sehr hoch sein (Φ = 30 -%).
  • Man nimmt an, daß die Erfordernisse für die Chemolumineszenz nicht nur in einem ausreichend exothermen Ablauf und dem Vorhandensein eines geeigneten emittierenden Moleküls bestehen, sondern auch darin, daß der chemische Prozeß sehr schnell ist und geringe geometrische Änderungen beinhaltet, so daß die Energiedissipation durch Schwingungen minimiert wird. Zum Beispiel ist die Übertragung eines Elektrons von einem starken Oxidationsmittel auf ein Reduktionsmittel (oftmals zwei Radikalionen mit entgegengesetzter Ladung, die elektrochemisch erzeugt wurden) ein Prozeßtyp, der in einigen Fällen zu einer sehr wirksamen Erzeugung einer elektronischen Anregung führen kann. Ein Beispiel mit 9,10-Diphenylanthracen (DPA) ist in Reaktionsgleichung (c) gezeigt.
  • DPA&supmin; + DPA&spplus; → DPA* + DPA (c).
  • Das gleiche gilt für die Zersetzung von viergliedrigen cyclischen Peroxiden (III) in Carbonylprodukte, wie in Reaktionsgleichung (d) gezeigt ist, die als Prototyp vieler Chemolumineszenzen aufgefaßt werden kann.
  • Ein spezieller Typ von Chemolumineszenz ist die Biolumineszenz.
  • Biolumineszenz ist als die Lichtemission durch lebende Organismen definiert, und zwar aufgrund einer Energie liefernden chemischen Reaktion, in der eine spezielle biochemische Substanz, die als Luciferin bezeichnet wird, einer Oxidation unterliegt, die durch ein spezifisches Enzym, das als Luciferase bezeichnet wird, katalysiert wird.
  • Es gibt viele spezifische Luciferine und Luciferasen, die chemisch verschieden sind und jeweils in verschiedenen lebenden lumineszierenden Organismen auftreten. Das Aufleuchten des Leuchtkäfers (firefly), die brillante "Phosphoreszenz" oder das "Brennen" des Ozeans oder das unheimliche Leuchten von Pilzen tief im Wald bei Nacht sind nur einige wenige Beispiele dieser verschiedenen biolumineszierenden Organismen.
  • Da Biolumineszenz eine Art von Chemolumineszenz ist, ist es nicht erforderlich, einen lebenden Organismus zu haben, um die Lichtemission zu erhalten. Die einfache Konservierung der beteiligten Chemikalien reicht aus. Dies kann in einigen Fällen durch rasches Trocknen des Organismus unter milden Bedingungen erreicht werden.
  • Getrocknete Leuchtkäferschwänze (Laternen) emittieren Licht, wenn sie mit Wasser verrieben werden. Diese Lichtemission klingt innerhalb weniger Minuten ab, aber sie kann durch die Zugabe von Adenosintriphosphat (ATP), einem Schlüssel-Coenzym des Energiestoffwechsels von Zellen, wiederhergestellt werden. In diesem Fall reagiert ATP mit dem Luciferin der Leuchtkäfer, wobei das Luciferyladenylat-Zwischenprodukt und Pyrophosphat (PP) gebildet werden.
  • Unter Verwendung von Laternenextrakten von Hunderttausenden von Leuchtkäfern haben Wissenschaftler an der John Hopkins University die chemische Struktur des Leuchtkäfer-Luciferins als C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub2;N&sub2;O&sub3;S&sub2; bestimmt. Es kann nun synthetisiert werden. Es wird postuliert, daß die Reaktion von Luciferyladenylat mit Sauerstoff zu einem α-Peroxylacton-Zwischenprodukt mit einem viergliedrigen Ring führt und Adenosinmonophosphat (AMP) freisetzt. Im Energie-liefernden Schritt erfolgt ein Zerfall unter Bildung von Kohlendioxid und eines Lichtemittierenden angeregten Moleküls. Dieses verliert seine Energie als Photon (h ny), und zwar in diesem Fall in der gelben Region des Spektrums.
  • Leuchtkäfer-Luciferin und -Luciferase aus konservierten Lichtorganen werden in sehr empfindlichen biochemischen Tests zum Nachweis von ATP verwendet.
  • Ein postulierter Reaktionsweg für Leuchtkäfer-Luciferin ist nachfolgend dargestellt:
  • Die Lumineszenz des Leuchtkäfers tritt als kurzer Blitz auf, der aus dem Inneren photogener Zellen in der Laterne kommt, und zwar unter der Steuerung des Nervensystems. Eine recht unterschiedliche Situation ist in dem kleinen Meereskrebs Cypridina gegeben, der in Gewässern an der Küste von Japan auftritt. Er synthetisiert sein Luciferin und seine Luciferase in getrennten Drüsen. Um Licht zu emittieren, spritzt er einfach Luciferin und Luciferase in das Wasser, wo die Reaktion getrennt von dem Tier auftritt. Das Licht kann dazu dienen, Angreifer zu verwirren oder zu täuschen.
  • Die Chemie des Cypridina-Luciferins wurde von einer Gruppe von Chemikern in Japan untersucht. Es wird postuliert, daß C&sub2;&sub2;H&sub2;&sub7;ON&sub7; direkt mit Sauerstoff an der durch den Pfeil (nachstehend) markierten Position reagiert, und zwar unter Bildung einer Art von α-Peroxylacton, das dem Leuchtkäfer- Molekül ähnlich ist. Im letzten Schritt wird ebenfalls Kohlendioxid freigesetzt, zusammen mit dem angeregten Molekül, das in diesem Fall im blauen Bereich emittiert.
  • Der postulierte Reaktionsweg für Cypridina-Luciferin ist nachfolgend dargestellt: (blau)
  • In den vorstehenden Formeln kann es sich bei R, R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; um beliebige geeignete Substituenten handeln.
  • Wie Leuchtkäfer, so emittieren auch getrocknete Cypridina Licht, wenn sie mit kaltem Wasser verrieben werden; das konservierte Luciferin und die konservierte Luciferase werden aus den Drüsen freigesetzt, wenn sie zerdrückt werden. Das Licht verblaßt allmählich mit der Oxidation des Luciferins, aber durch Zugabe von weiterem Luciferin zu dem erschöpften Extrakt kann die Lichtemission wiederhergestellt werden. Luciferin kann entweder synthetisch oder in natürlicher Form durch Zerreiben getrockneter Cypridina in heißem Wasser erhalten werden. Die Hitze zerstört die Luciferase, bei der es sich um ein Protein handelt, läßt aber das Luciferin aktiv. Nach Abkühlen und Mischen mit dem erschöpften Extrakt wird die Lumineszenz beobachtet. Dies ist die Grundlage des klassischen Luciferin-Luciferase-Tests.
  • Lumineszierende Bakterien emittieren ein kontinuierliches blau-grünes Licht. Derartige Bakterien können direkt aus Seewasser oder von der Oberfläche eines toten Fisches isoliert werden, und sie wachsen schnell in einem beliebigen Medium mit einem Gehalt an 3% Salz (äquivalent zu Seewasser) und etwas Fisch- oder Fleischextrakt.
  • Der postulierte Reaktionsweg für bakterielles Luciferin ist nachfolgend dargestellt: Reduziertes Riboflavinphosphat + O&sub2; + Aldehyd (RCHO) (Luciferase-Flavin-Komplex) Riboflavinphosphat + h ny (grün)
  • Der Chemolumineszenznachweis ist einer der empfindlichsten Wege zum Nachweis eines Analyten. Obwohl das Verfahren empfindlich ist, weist es eine Reihe von Nachteilen auf. In den meisten Fällen weist die durch die Chemolumineszenzreaktion vermittelte Lichtemission eine sehr kurze Lebensdauer auf, d. h. die Lichtemission ist sehr schnell, so daß aufwendige Vorrichtungen entwickelt werden müssen, um das Ausmaß der Lichtemission auf zuzeichnen und auch um die Menge des Analyten zu bestimmen. Es ist auch schwierig, die in Wechselwirkung tretenden Systeme an den Analyten zu koppeln, ohne die Eigenschaften der in Wechselwirkung tretenden Partner zu zerstören oder zu verändern.
  • Kürzlich ist gezeigt worden, daß, wenn eine Substanz, wie ein Iodphenol- oder ein Benzothiazolderivat während der durch Meerrettich- Peroxidase vermittelten Chemolumineszenz-Emission vorhanden ist, die Reaktionsgeschwindigkeit verlangsamt und gleichzeitig die Quantenausbeute der Lichtemission erhöht wird (EP-A-0 116 454; EP-A-0 103 784; GB-A-820 62 63; Gary H.G. Thorpe, Robert Haggart, Larry J. Kricka und Thomas P. Whitehead, "Enhanced Luminescent Enzyme Immunoassays for Rubella Antibody, Immunoglobulin and Digoxin", Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 119, Nr. 2, S. 481-487, 15. März 1984; Thomas P. Whitehead, Gary H.G. Thorpe, Timothy J.N. Carter, Carol Groucutt und Larry J. Kricka, "Enhanced Luminescence Procedure for Sensitive Determination of Peroxidase-labelled Conjugates in Immunoassay", Nature, Bd. 305, S. 158-159, 8. September 1983; Gary H.G. Thorpe, Larry J. Kricka, Eileen Gillespie, Susan Mosely, Robert Amess, Neil Baggett und Thomas P. Whitehead, "Enhancement of the Horseradish Peroxidase Catalysed Chemiluminescent Oxidation of Cyclic Diacyl Hydrazides By 6- Hydroxybenzothiazoles", Anal. Biochem.). Obwohl gezeigt werden konnte, daß diese Methode beim Nachweis eines Analyten durch herkömmliche Immunoassay-Methoden geeignet ist, ist nicht nachgewiesen worden, daß diese Methode zum Nachweis von Nucleinsäurehybriden angewandt werden kann.
  • Irwin Fridovich, "The Stimulation of Horseradish Peroxidase by Nitrogenous Ligands", The Journal of Biological Chemistry, Bd. 238, Nr. 12, Dezember 1963, S. 3921-3927 beschreibt die Stabilisierung von Peroxidase in Lösung mit stickstoffhaltigen Liganden.
  • Es wurde bereits nachgewiesen, daß eine Chemolumineszenzreaktion auftritt, bei der die Emission durch eine von Eisen initiierte Aktivierung von Bleomycin verursacht wird. Die Selbstinaktivierungsreaktion wird durch die Gegenwart von DNA beeinflußt.
  • In Photochemistry Photobiology, Bd. 40, S. 823-830, (1984) wird beschrieben, daß die Photoemission durch Zielmoleküle, wie DNA, gelöscht wird und daß die Gegenwart von DNA die durch Eisen initiierte Aktivierung von Bleomycin nicht durch die sogenannte Selbstinaktivierungsreaktion, die mit der Chemolumineszenz verknüpft ist, verhindert. In dem Artikel wurde weiter festgestellt, daß diese Befunde darauf hindeuten, daß ein elektronisch angeregtes Zwischenprodukt von Bleomycin Biomoleküle verändern kann, obwohl in diesem Fall die genaue Beschaffenheit des angeregten Zustandes nicht bekannt war.
  • Die schwedische Patentanmeldung 8200479 beschreibt einen Chemolumineszenznachweis von Nucleinsäurehybriden.
  • Die europäische Patentanmeldung 0 070 687 betrifft eine Licht emittierende diagnostische Methode mit Polynucleotidhybridisierung.
  • EP 87 959 und EP 116 454 beschreiben beide luminometrische Assays unter Verwendung eines Verstärkers, aber sie sagen nichts über die Zugabe einer Stickstoffverbindung aus.
  • Bisher liefen Chemolumineszenzreaktionen zu schnell ab und führten daher nur kurzzeitig zur Lichtentwicklung. Die Verwendung von Verstärkern hat die Lichtentwicklung von Chemolumineszenzreaktionen etwas verlängert und verstärkt, aber die Dauer und Intensität des emittierten Lichtes ist in vielen Fällen immer noch unzureichend.
  • Der Immunoassay ist eine der am weitesten verbreiteten analytischen Techniken in einem klinischen Labor. Gegenwärtig wird bei der Mehrzahl der Immunoassays ein radioaktives Isotop, insbesondere Iod-125, als Markierung eingesetzt. Radioaktive Isotope weisen jedoch eine Anzahl von schwerwiegenden Nachteilen auf. Erstens umfaßt die Methode der Markierung die Verwendung stark radioaktiver und damit möglicherweise gefährlicher Reagenzien. Zweitens ist die Haltbarkeit radioaktiv markierter Substanzen oft vergleichsweise kurz, und zwar nicht nur, weil radioaktive Isotope aufgrund ihrer Beschaffenheit kontinuierlich zerfallen, sondern auch, weil radioaktiv markierte Proteine oft instabil sind. Drittens ist es oft schwierig, Proteine ausreichend zu markieren, um ein empfindliches und rasch nachweisbares Reagenz bereitzustellen. Viertens ist die Beseitigung radioaktiv markierter Substanzen lästig.
  • Diese Nachteile haben die Suche nach ausführbaren Alternativen zur radioaktiven Markierung angeregt. Um als Markierung geeignet zu sein, sollte eine Substanz mindestens die folgenden drei Anforderungen erfüllen:
  • a. Sie sollte sowohl rasch als auch in sehr kleinen Mengen nachweisbar sein, wenn sie an einen Liganden, wie ein Antigen oder ein Antikörper, gebunden ist;
  • b. es sollte möglich sein, sie (ohne ihre Bestimmung zu beeinträchtigen) mit einem Liganden, wie einem Antigen oder einem Antikörper, zu verknüpfen; und
  • c. wenn sie mit einem Liganden verknüpft ist, sollte sie dessen Eigenschaften nicht wesentlich ändern.
  • Einige der vielversprechendsten alternativen Markierungen sind entweder Substanzen, die selbst an einer Reaktion teilnehmen können, die zur Emission von lumineszierenden Licht führt, oder Substanzen, die bei geeigneter Behandlung Verbindungen bilden, die in der Lage sind, an einer Lumineszenzreaktion teilzunehmen. Bisher hat die Anwendung von Lumineszenz bei Immunoassays darunter gelitten, daß die Messung der Lumineszenz ein rascher Prozeß ist und innerhalb von Sekunden anstelle von mehreren Minuten, die im allgemeinen zur Messung der Radioaktivität erforderlich sind, abgeschlossen sein kann.
  • Lumineszenz ist in drei hauptsächlichen lumineszierenden oder luminometrischen Immunoassaysystemen angewandt worden:
  • a. Organolumineszierende oder organoluminometrische Immunoassays, bei denen chemolumineszierende oder biolumineszierende Verbindungen, die direkt an Lumineszenzreaktionen teilnehmen (d. h., die in einen angeregten Zustand umgewandelt werden und anschließend unter Emission eines Photons in einen nicht-angeregten Zustand zurückkehren), verwendet worden sind, um Liganden, wie Proteine, Hormone, Haptene, Steroide, Nucleinsäuren, Metaboliten, Antigene und/oder Antikörper, zu markieren. Beispiele geeigneter Verbindungen umfassen Luminol und Isoluminol.
  • b. Immunoassays mit lumineszierenden Katalysatoren oder Cofaktoren, bei denen die Katalysatoren oder Cofaktoren von Lumineszenzreaktionen als Markierungen verwendet worden sind. Ein Beispiel eines geeigneten Katalysators ist das Enzym Peroxidase.
  • c. Enzymimmunoassays, bei denen Lumineszenzreaktionen verwendet werden, um Produkte zu bestimmen, die durch Einwirkung der Enzymmarkierungen auf geeignete Substrate gebildet worden sind. Ein Beispiel dieses Typs von Immunoassay ist die Bestimmung von mit Antikörpern verknüpfter Glucose-oxidase durch Umsetzung des Enzym/Antikörper-Reagenz mit Glucose unter Bildung von Wasserstoffperoxid und die anschließende Messung der Menge des gebildeten Wasserstoffperoxids durch Zugabe von Luminol unter kontrollierten Bedingungen, um eine Lumineszenzreaktion zu initiieren.
  • Die Empfindlichkeit der vorstehenden Assays wird zum Teil durch die untere Grenze für den Nachweis der Markierung oder des Produktes der Markierung bestimmt. Im Fall von lumineszierenden oder luminometrischen Assays hängt die Empfindlichkeit des Systems teilweise von dem bei der Lumineszenzreaktion pro Einheit an markiertem Material emittierten Licht ab.
  • Es ist bekannt, daß der Chemolumineszenznachweis einer der empfindlichsten Wege zum Nachweis eines Analyten ist. Obgleich das Verfahren empfindlich ist, weist es eine Reihe von Nachteilen auf. In den meisten Fällen hat die durch die Chemolumineszenzreaktion vermittelte Lichtemission eine sehr kurze Lebensdauer, d. h., die Lichtemission ist sehr schnell, so daß aufwendige Vorrichtungen entwickelt werden müssen, um das Ausmaß der Lichtemission aufzuzeichnen und auch um die Menge des Analyten zu bestimmen. Es ist auch schwierig, das in Wechselwirkung tretende System an den Analyten zu koppeln, ohne die Eigenschaften der in Wechselwirkung tretenden Partner zu zerstören oder zu verändern.
    • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Chemolumineszenzreaktionen bereitzustellen, die für eine lange Zeit und mit hoher Intensität Licht emittieren.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Chemolumineszenzvorrichtungen bereitzustellen, die zu einer verlängerten Lichtdauer fähig sind.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Nucleinsäurehybride nachzuweisen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Antikörper und Antigene unter Verwendung von Chemolumineszenz nachzuweisen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht im Nachweis von Enzymen in einer Probe.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Nucleinsäuren bereit zustellen, die zur Teilnahme an einer Chemolumineszenzreaktion fähig sind.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren in unbekannten Proben bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Nucleinsäurehybride nachzuweisen.
  • Diese und weitere Aufgaben werden durch die vorliegende Erfindung gelöst.
  • Die Erfindung betrifft einen Chemolumineszenzassay gemäß der Definition in Anspruch 1, der das Kontaktieren eines chemolumineszierenden 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindions, eines Oxidationsmittels, z. B. Wasserstoffperoxid, eines Peroxidase- Enzyms, eines Empfindlichkeitsverstärkers und einer wasserlöslichen Stickstoffverbindung, die unter Ammoniak und wasserlöslichen organischen Aminen ausgewählt ist, in einem Puffer mit einem pH-Wert von 6 bis 10 umfaßt.
  • Die Erfindung betrifft einen verstärkten und verzögerten Chemolumineszenzassay, der insbesondere zur klinischen Diagnose bestimmter Arten von Krankheitszuständen, die durch immunologische Reaktionen oder durch Nucleinsäurehybridisierungsmethoden überwacht werden können, geeignet ist. Die Erfindung kann auch zur direkten Probenanalyse verwendet werden, wenn eine der reagierenden Komponenten für den Assay bereits in der Probe in einer unbekannten Menge vorhanden ist. Die Diagnose von Krankheitszuständen unter Verwendung von Immunoassays und auch unter Verwendung von Nucleinsäurehybridisierungsassays erfordert hochgradig empfindliche Nachweissysteme. Da die Menge des vorhandenen Analyten üblicherweise sehr klein ist, sollte die Assaybedingung für einen ausreichend verstärkten Nachweis sorgen. Zum Beispiel ist es beim Nachweis eines infektiösen Agens, wie eines Mikroorganismus, in einer Blutprobe möglich, DNA aus der Blutprobe, die bereits durch die Mikroorganismen infiziert ist, zu extrahieren, und eine Nucleinsäuresonde zu verwenden, die spezifisch für diesen Mikroorganismus ist. Der Nachweis kann durch Hybridisierung mit der aus der Blutprobe extrahierten DNA und der Nucleinsäuresonde, die spezifisch für den Mikroorganismus ist, von der man annimmt, daß die Blutprobe damit infiziert ist, durchgeführt werden.
  • Die Nucleinsäurehybridisierungstechnik kann auch zum Nachweis von genetischen Erkrankungen, die sich nicht durch ein infektiöses Agens manifestieren, verwendet werden, z. B. für eine Punktmutation des β-Hämoglobin-Gens, die zu dem als Sichelzellenanämie bekannten Defekt führt. Menschen, die von einer Mutation betroffen sind, und auch solche, die Träger eines derartigen Defektes sind, haben eine spezifische Nucleinsäuresequenz in ihrem Genom, die durch die Hybridisierungstechnik nachgewiesen werden kann. Für den Nachweis einer einzelnen Punktmutation eines Gens ist es wichtig, daß eine hochgradig empfindliche Technik zur Verfügung steht, und zwar wegen der geringen Konzentration des defekten Gens. Üblicherweise werden radioaktiv markierte Isotope für das Nachweisverfahren eingesetzt. Mit der vorliegenden Erfindung wird ein hochgradig empfindlicher Chemolumineszenzassay bereitgestellt, der durch ein Peroxidase-ähnliches Enzym und ein Diacylhydrazid-ähnliches Substrat zur Lichtemission in Gegenwart von Peroxid vermittelt wird. Zu den weiteren Assays, bei denen die Erfindung nützlich ist, gehören ein Assay für Elastin oder ein Assay für Glucose unter Verwendung eines Glucoseoxidase- Peroxidase-Systems. Die Prinzipien und die Nützlichkeit dieser Assays sind bekannt und vorstehend diskutiert worden, wobei gezeigt wurde, daß Assays vom Chemolumineszenztyp zum Nachweis von Elastin oder Glucose verwendet werden können und daß Assays vom Chemolumineszenztyp für Zwecke von Immunoassays verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Beobachtung, daß bestimmte stickstoffhaltige Materialien zusammen mit Verstärkern die Geschwindigkeit der Lichtemission verringern und die Aktivität des Enzyms für eine lange Zeitspanne in einer Chemolumineszenzreaktion verlängern. Aus der Kombination dieser beiden Effekte kann geschlossen werden, daß die stickstoffhaltigen Materialien die durch Peroxidase und Wasserstoffperoxid vermittelte Chemolumineszenzemission von Diacylhydraziden verstärken und verlängern.
  • Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäurehybriden.
  • Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäurehybriden wird eine unbekannte DNA enthaltende Probe in einem Gemisch, z. B. in einer Lösung, mit einer Sonde kontaktiert, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer definierten Nucleinsäuresequenz, die mit einer Chemolumineszenzvorstufe verknüpft ist, und zwar z. B. photochemisch verknüpft ist, wie durch Verwendung von Furocumarin, wobei das Gemisch ein Oxidationsmittel, ein Enzym und eine unter Ammoniak und wasserlöslichen organischen Aminen ausgewählte Stickstoffverbindung enthält, und die anschließende Bestimmung des Ausmaßes der Lichtemission umfaßt.
  • Bei einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäurehybriden wird eine unbekannte DNA enthaltende Probe in einem Gemisch, z. B. einer Lösung, mit einer Sonde kontaktiert, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer definierten Nucleinsäuresequenz und eines mit der Nucleinsäuresequenz verknüpften Enzyms, wobei das Gemisch eine Chemolumineszenzvorstufe, ein Oxidationsmittel und eine unter Ammoniak und wasserlöslichen organischen Aminen ausgewählte Stickstoffverbindung enthält, und die anschließende Bestimmung des Ausmaßes der Lichtemission umfaßt.
  • Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäurehybriden, wird eine unbekannte DNA enthaltende Probe in einem Gemisch, z. B. in einer Lösung, mit einer Sonde kontaktiert, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer definierten Nucleinsäuresequenz, die mit einer Chemolumineszenzvorstufe verknüpft ist, und zwar z. B. photochemisch verknüpft ist, wie durch Verwendung von Furocumarin, wobei das Gemisch ein Oxidationsmittel, ein Enzym, einen Verstärker und eine unter Ammoniak und wasserlöslichen organischen Aminen ausgewählte Stickstoffverbindung enthält, und die anschließende Bestimmung des Ausmaßes der Lichtemission umfaßt.
  • Bei einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäurehybriden wird eine unbekannte DNA enthaltende Probe in einem Gemisch, z. B. in einer Lösung, mit einer Sonde kontaktiert, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer definierten Nucleinsäuresequenz und eines mit der Nucleinsäuresequenz verknüpften Enzyms, wobei das Gemisch einen Chemolumineszenzverstärker und eine unter Ammoniak und wasserlöslichen organischen Aminen ausgewählte Stickstoffverbindung enthält, und die anschließende Bestimmung des Ausmaßes der Lichtemission umfaßt.
  • Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäurehybriden wird eine unbekannte Nucleinsäure enthaltende Probe in einem Gemisch, z. B. in einer Lösung, mit einer Sonde, die eine definierte Nucleinsäuresequenz und eine mit der Nucleinsäuresequenz verknüpfte Chemolumineszenzvorstufe umfaßt, in Kontakt gebracht, und danach werden ein Chemolumineszenzverstärker und ein Oxidationsmittel zugegeben, und das Ausmaß der Lichtemission wird anschließend bestimmt.
  • Bei einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäurehybriden wird eine unbekannte Nucleinsäure enthaltende Probe in einem Gemisch, z. B. in einer Lösung, mit einer Sonde, die eine definierte Nucleinsäuresequenz und einen mit der Nucleinsäuresequenz verknüpften Chemolumineszenzverstärker umfaßt, in Kontakt gebracht, und danach werden eine Chemolumineszenzvorstufe und ein Oxidationsmittel zugegeben, und das Ausmaß der Lichtemission wird anschließend bestimmt.
  • Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäurehybriden beinhaltet das Kontaktieren in einem Gemisch, z. B. in einer Lösung, einer eine unbekannte Nucleinsäure enthaltenden Probe mit einer Sonde, die folgende Bestandteile umfaßt:
  • a. Eine definierte Nucleinsäuresequenz,
  • b. einen an die Nucleinsäuresequenz gebundenen photochemischen Linker,
  • c. einen an den Linker gebundenen Liganden,
  • d. ein an den Liganden gebundenes Bindungsprotein und
  • e. ein an das Bindungsprotein gebundenes Enzym. Danach erfolgt die Zugabe einer Chemolumineszenzsubstanz, eines Chemolumineszenzverstärkers und eines Oxidationsmittels, und anschließend wird das Ausmaß der Lichtemission bestimmt.
  • Die Erfindung betrifft auch Chemolumineszenzassays.
  • Ein erfindungsgemäßer Chemolumineszenzimmunoassay zum Nachweis eines Antigens in einer unbekannten Probe umfaßt das Kontaktieren der Probe mit einem an eine Chemolumineszenzvorstufe oder an ein Enzym gebundenen Antigen, das Kontaktieren der Probe und des Antigens mit einem Oxidationsmittel, einer unter Ammoniak und wasserlöslichen organischen Aminen ausgewählten Stickstoffverbindung und einem Enzym, wenn das Antigen an eine Chemolumineszenzvorstufe gebunden ist, oder einer Chemolumineszenzvorstufe, wenn das Antigen an ein Enzym gebunden ist, und die Bestimmung des Ausmaßes der Lichtemission.
  • Ein erfindungsgemäßer Chemolumineszenzimmunoassay zur Bestimmung eines Antikörpers in einer unbekannten Probe umfaßt das Kontaktieren der Probe mit einem Antikörper für das Antigen, wobei der Antikörper an eine Chemolumineszenzvorstufe oder an ein Enzym gebunden ist, das Kontaktieren der Probe und des Antikörpers mit einem Oxidationsmittel, einer unter Ammoniak und wasserlöslichen organischen Aminen ausgewählten Stickstoffverbindung und einem Enzym, wenn das Antigen an eine Chemolumineszenzvorstufe gebunden ist, oder einer Chemolumineszenzvorstufe, wenn das Antigen an ein Enzym gebunden ist, und die Bestimmung des Ausmaßes der Lichtemission.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Chemolumineszenzimmunoassay zum Nachweis eines Antikörpers in einer unbekannten Probe umfaßt das Kontaktieren der Probe mit einem Antikörper für das Antigen, wobei der Antikörper an eine Chemolumineszenzvorstufe oder an ein Enzym gebunden ist, das Kontaktieren der Probe und des Antikörpers mit einem Oxidationsmittel, einem Chemolumineszenzverstärker und einer unter Ammoniak und wasserlöslichen organischen Aminen ausgewählten Stickstoffverbindung und einem Enzym, wenn das Antigen an eine Chemolumineszenzvorstufe gebunden ist, oder einer Chemolumineszenzvorstufe, wenn das Antigen an ein Enzym gebunden ist, und die Bestimmung des Ausmaßes der Lichtemission.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Chemolumineszenzimmunoassay zum Nachweis eines Antikörpers in einer unbekannten Probe umfaßt das Kontaktieren der Probe mit einem Antikörper für das Antigen, wobei der Antikörper an eine Chemolumineszenzvorstufe oder ein Enzym gebunden ist, das Kontaktieren der Probe und des Antikörpers mit einem Oxidationsmittel, einem Chemolumineszenzverstärker und einer unter Ammoniak und wasserlöslichen organischen Aminen ausgewählten Stickstoffverbindung und einem Enzym, wenn das Antigen an eine Chemolumineszenzvorstufe gebunden ist, oder einer Chemolumineszenzvorstufe, wenn das Antigen an ein Enzym gebunden ist, und die Bestimmung des Ausmaßes der Lichtemission.
  • Die Erfindung betrifft ferner einen Chemolumineszenzassay zum Nachweis eines Peroxidase-Enzyms, der das Kontaktieren einer unbekannten Probe mit einer Chemolumineszenzvorstufe, einem Oxidationsmittel und einer unter Ammoniak und wasserlöslichen organischen Aminen ausgewählten Stickstoffverbindung und die Bestimmung des Ausmaßes der Lichtemission umfaßt.
  • Die Erfindung betrifft ferner einen weiteren Chemolumineszenzassay zum Nachweis eines Peroxidase-Enzyms, der das Kontaktieren einer unbekannten Probe mit einer Chemolumineszenzvorstufe, einem Oxidationsmittel, einem Chemolumineszenzverstärker und einer unter Ammoniak und wasserlöslichen organischen Aminen ausgewählten Stickstoffverbindung und die Bestimmung des Ausmaßes der Lichtemission umfaßt.
  • Die Erfindung beschreibt die überraschende Beobachtung, daß die Lebensdauer und die Intensität einer verstärkten Chemolumineszenzmethode durch eine synergistische Kombination bestimmter stickstoffhaltiger Verbindungen und Verstärker, wie Hydroxybenzothiazol oder Luciferin, erhöht werden. Wenn sie zusammen verwendet werden, dann bilden sie Licht intensiver und länger, als wenn sie getrennt vorhanden sind. Die Gesamtmenge der Lichtemission ist erfindungsgemäß größer als die Summe der einzelnen Lichtemissionen, z. B. von Ammonium enthaltenden Puffern und Luciferin enthaltenden Substanzen.
  • Subpicogramm-Mengen von Nucleinsäurehybriden können erfindungsgemäß nachgewiesen werden, während mit Immunoassays unter Verwendung von Chemolumineszenztechniken nur Nanogramm- Mengen des Analyten, d. h. des Antikörpers oder Antigens, zuverlässig nachgewiesen werden können.
  • Die Erfindung basiert weiterhin auf der überraschenden Beobachtung, daß unter bestimmten Bedingungen Nucleinsäuren keinen nennenswerten Effekt auf den Prozeß haben, so daß durch Enzyme, z. B. Meerrettich-Peroxidase, vermittelte Chemolumineszenzreaktionen eingesetzt werden können, um die Gegenwart sehr kleiner Mengen an DNA, RNA oder anderen Nucleinsäuren nachzuweisen, nachdem die Nucleinsäure mit der entsprechenden unbekannten Testprobe oder mit den komplementären Nucleinsäuresequenzen hybridisiert worden ist.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 zeigt den Einfluß von Kälberthymus-DNA auf die Rate der Lichtemission.
  • Fig. 2 zeigt den Einfluß von biotinylierter DNA auf die Rate der Lichtemission.
  • Fig. 3 zeigt den Einfluß von Nick-translatierter, biotinylierter DNA auf die Rate der Lichtemission.
  • Fig. 4 zeigt den Einfluß von Angelicin auf die Rate der Lichtemission.
  • Fig. 5 zeigt den Einfluß von Biotin auf die Rate der Lichtemission.
  • Fig. 6A zeigt den Einfluß von Luciferin mit biotinylierter DNA auf die Rate der Lichtemission.
  • Fig. 6B zeigt den Einfluß von Luciferin mit nichtbiotinylierter DNA auf die Rate der Lichtemission.
  • Fig. 7 zeigt die Nachweisgrenzen von nicht-biotinylierter Adenovirus-DNA, verglichen mit biotinylierter Adenovirus-DNA.
  • Fig. 8 zeigt den Nachweis von hybridisierter biotinylierter Adenovirus-DNA.
  • Fig. 9 zeigt den Nachweis von hybridisierter biotinylierter pBR322-DNA.
  • Fig. 10 ist eine graphische Darstellung der Lichtintensität gegen die Zeit für ein gepuffertes Amin, für Luciferin, für eine Lösung ohne Amin und ohne Luciferin sowie für gepuffertes Amin + Luciferin (erfindungsgemäß).
  • Fig. 11 ist eine Vorderansicht einer erfindungsgemäßen Chemolumineszenzvorrichtung.
  • Die wasserlösliche Stickstoffverbindung ist unter Ammoniak oder Arylaminen oder Benzylaminen oder Polyaminen unter Einschluß von Spermin, Spermidin, Putrescin, Butylendiamin oder einem Alkylamin der Formel
  • wobei X&sub1;, X&sub2; und X&sub3; gleich oder verschieden sind und unsubstituierte aliphatische gesättigte Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeuten, ausgewählt, oder sie ist ein Heterocyclus, der unter Pyridin, Azolen, insbesondere Imidazol und Tetrazol und Derivaten davon und Thiazinen ausgewählt ist.
  • Erfindungsgemäß zu verwendende Chemolumineszenzvorstufen sind 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindione der Formel
  • wobei R&sub1; Amino bedeutet und jede der Gruppen R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; die Bedeutung H, gegebenenfalls substituiertes C&sub1;-C&sub6;-Alkyl oder -Alkenyl, Hydroxyl, C&sub1;-C&sub6;-Alkoxy, Carboxyl oder Amino hat oder wobei R&sub2; Amino bedeutet und jede der Gruppen R&sub1;, R&sub3; und R&sub4; die Bedeutung H, unsubstituiertes oder substituiertes C&sub1;-C&sub6;-Alkyl oder -Alkenyl, Hydroxyl, C&sub1;-C&sub6;-Alkoxy, Carboxyl oder Amino hat oder wobei R&sub1; und R&sub2; zusammen sind und ein Amino- oder substituiertes Aminoderivat einer Benzogruppe bedeuten und jede der Gruppen R&sub3; und R&sub4; die Bedeutung H, gegebenenfalls substituiertes C&sub1;-C&sub6;-Alkyl oder -Alkenyl, Hydroxyl, C&sub1;-C&sub6;-Alkoxy, Carboxyl oder Amino hat. Besonders bevorzugte Chemolumineszenzvorstufen sind 5-Amino-2,3- dihydro-1,4-phthalazindion (Luminol) und 6-Amino-2,3-dihydro- 1,4-phthalazindion (Isoluminol).
  • Substituierte Alkyl-, Alkenyl- und Aminoreste zur erfindungsgemäßen Verwendung sind gut bekannt. Nicht Substituierte Alkyl-, Alkenyl- und Aminoreste zur erfindungsgemäßen Verwendung sind gut bekannt. Nicht beschränkende Beispiele für Substituenten für derartige substituierte Reste umfassen Halogen, z. B. Chlor, Fluor, Brom und Iod, Hydroxy, Carboxy, Nitro, Cyano und Thiol. Darüber hinaus können Aminreste zur erfindungsgemäßen Verwendung durch Alkyl, vorzugsweise mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, und Alkenyl, vorzugsweise mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, substituiert sein. Hydroxylgruppen zur erfindungsgemäßen Verwendung können durch Halogen, Alkyl, vorzugsweise mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Alkenyl, vorzugsweise mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, substituiert sein.
  • Im allgemeinen können erfindungsgemäß beliebige Peroxidase- Enzyme verwendet werden. Nicht beschränkende Beispiele für Enzyme zur erfindungsgemäßen Verwendung umfassen Meerrettich- Peroxidase (HRP), Mikroperoxidase und Lactoperoxidase.
  • Beliebige Oxidationsmittel, die mit der Chemolumineszenzvorstufe reagieren, um eine Anregung der Chemolumineszenzvorstufe zu bewirken, so daß sie in einer Lumineszenzreaktion Licht emittiert, können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Besonders bevorzugte Oxidationsmittel sind Wasserstoffperoxid, Perborationen und Natriumperoxidat.
  • Ein Beispiel für ein gepuffertes Amin zur erfindungsgemäßen Verwendung ist Ammoniak.
  • Beispiele für Chemolumineszenzverstärker sind 4-Chlorphenol, 4-Bromphenol, 4-Iodphenol, 4-Brom-2-chlorphenol, 2,4- Dichlorphenol, 3,4-Dichlorphenol, 4-Methylphenol, 4-tert. Butylphenol, Ethyl-3-(4-hydroxyphenyl)-propionat, 4- Benzylphenol, 4-(3'-Methylcrotyl)-phenol, 4-Styrylphenol, 4- (2',4'-Dinitrostyryl)-phenol, 4-Hydroxyzimtsäure, α-Cyano-4- hydroxyzimtsäure, 4-Phenylphenol, 4-(4'-Hydroxyphenyl)phenol, 2-Chlor-4-phenylphenol, 4-(4'-Hydroxyphenyl)benzophenon, 4-(Phenylazo)-phenol, 4-(2'-Carboxylphenylazo)phenol, 4-Phenoxyphenol, 4-(4'-Hydroxyphenoxy)-phenol, 4- Hydroxyphenylsulfid, 4 -Hydroxyphenyldisulfid, 2-Naphthol, 1- Bromnaphth-2-ol, 6-Bromnaphth-2-ol und 1, 6-Dibromnaphth-2-ol. Ein besonders bevorzugter Verstärker ist 4-Iodphenol.
  • Weitere Beispiele für Chemolumineszenzverstärker zur erfindungsgemäßen Verwendung sind 6-Hydroxybenzothiazole, wie 6-Hydroxybenzothiazol der Formel
  • wobei R die Bedeutung H, CN oder gegebenenfalls substituiertes Thiazol hat, und wobei jede der Gruppen X&sub1;, X&sub2; und X&sub3; die Bedeutung H, gegebenenfalls substituiertes C&sub1;-C&sub6;- Alkyl oder -Alkenyl, Hydroxyl, substituiertes Hydroxyl, C&sub1;-C&sub6;-Alkoxy, Carboxyl, Amino oder substituiertes Amino hat. Besonders bevorzugte Chemolumineszenzverstärker sind Leuchtkäfer-Luciferin (4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2- benzothiazolyl)-thiazol-4-carbonsäure) und Dehydroluciferin.
  • Die Lichtemission der erfindungsgemäßen Chemolumineszenzreaktion wird, obwohl sie vor allem von der Wahl des Enzyms, des Oxidationsmittels, der Chemolumineszenzvorstufe und des gepufferten Amins oder des Verstärkers abhängt, auch von sekundären Faktoren, wie Temperatur, pH-Wert, Reagenzkonzentration, Mischgeschwindigkeit und Methode der Lichtmessung bestimmt. Um die Empfindlichkeit des vorliegenden Systems zu maximieren, sollten diese sekundären Faktoren so eingestellt werden, daß eine maximale Lichtemission erhalten wird, und zwar in reproduzierbarer und einfach meßbarer Weise mit einem möglichst großen Verhältnis von Signal zu Hintergrund.
  • Die gewählten Bedingungen umfassen im allgemeinen einen Kompromiß, der das Enzym oder die katalytische Aktivität des Oxidationsmittels, die Kinetiken der Reaktion, die eingesetzte Vorrichtung, das Verhältnis von Signal zu Hintergrund und die erforderliche Empfindlichkeit beinhaltet.
  • Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten die Chemolumineszenzreaktionen der vorliegenden Anmeldung unter mäßigen Bedingungen für die Temperatur im Bereich von 10 bis 50ºC und den pH-Wert im Bereich von 6 bis 10 und vorzugsweise von 7 bis 9 durchgeführt werden. Die Lumineszenz des erfindungsgemäßen Verfahrens ist nicht auf diese Temperaturbereiche beschränkt, und die Temperatur als solche ist nicht kritisch. Geeignete Puffersubstanzen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind Phosphat, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 2-Amino-2-methyl-1,3- propandiol, Acetat, Carbonat und Borat.
  • Die folgenden Reagenzkonzentrationen (wenn sie zu einer Lösung gegeben werden) sind für die erfindungsgemäße Verwendung besonders geeignet:
  • Enzym : 0,01 ng bis 5000 mg/Liter
  • Oxidationsmittel : 10 uMol bis 300 mMol/Liter
  • chemolumineszierende Substanz : 0,05 uMol bis 200 mMol/Liter
  • Stickstoffverbindung : 5 uMol bis 500 mMol/Liter
  • Chemolumineszenzverstärker : 5 uMol bis 100 mMol/Liter.
  • Gemäß einem Aspekt beinhaltet die Erfindung den Nachweis von Nucleinsäurehybriden.
  • Eine Nucleinsäuresonde zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt eine Nucleinsäuresequenz, die an einen Liganden gebunden ist, wobei ein derartiger Ligand an ein Bindungsprotein gebunden ist und ein derartiges Bindungsprotein an ein Enzym gebunden ist. Die Nucleinsäuresequenz kann durch eine Interkalator-Verbindung, wie eine Furocumarin- oder eine Phenanthridin-Verbindung, oder durch eine Nicht-Interkalator-Verbindung, wie Netropsin, Distamycin und Bis-benzimidazol, gebunden werden. Besonders bevorzugte Interkalator-Verbindungen sind Furocumarine, z. B. Angelicin (Isopsoralen), Psoralen und Derivate davon, z. B. 4- Aminomethyl-4,5'-dimethylangelicin, 4'-Aminomethyltrioxsalen, 3-Carboxy-5- oder -8-amino- oder -hydroxy-psoralen, sowie Mono- oder Bis-azido-aminoalkylmethidium- oder -ethidium- Verbindungen.
  • Nicht beschränkende Beispiele der interkalierenden Mittel zur erfindungsgemäßen Verwendung sind in der folgenden Tabelle angegeben:
    • Tabelle
  • Interkalatorklassen und beispielhafte Verbindungen Literaturzitat
  • A. Acridinfarbstoffe J. Lerman, Mol. Biol., Bd. 3, S. 18 (1961); Bloomfield et al., Physical chemistry of Nucleic Acids, Kapitel 7, S. 429-476, Harper and Rowe, NY (1974);
  • Proflavin, Acridinorange, Chinacridin, Acriflavin Miller et al., Biopolymers, Bd. 19, S. 2091 (1980)
  • B. Phenanthridine Bloomfield et al., a.a.O. Miller et al., a.a.O.
  • Ethidium coralyn Wilson et al., J. Med. chem., Bd. 19, S. 1261 (1976)
  • Ellipticin, Ellipticinkation und Derivate Festy et al., FEBS Letters, Bd. 17, S. 321 (1971); Kohn et al., cancer Res., Bd. 35, S. 71 (1976); LePecq et al., PNAS (USA), Bd. 71, S. 5078 (1974); Pelaprat et al., J. Med. chem., Bd. 23, S. 1330 (1980)
  • B. Phenazine 5-Methylphenazinkation Bloomfield et al., a.a.O.
  • D. Phenothiazine Chlorpromazin ebenda
  • E. chinolin chloroguin chinin ebenda
  • F. Aflatoxin ebenda
  • G. Polycyclische Kohlenwasserstoffe und ihre Oxiranderivate ebenda
  • 3,4-Benzpyren Benzopyrendiolepoxid, 1-Pyrenyloxiran Yang et al., Biochem. Biophys. Res. comm., Bd. 82, S. 929 (1978)
  • Benzanthracen-5,6-oxid Amea et al., Science, Bd. 176, S. 47 (1972)
  • H. Actinomycine Actinomycin D Bloomfield et al, a.a.O.
  • I. Anthracyclinone β-Rhodomycin A Daunamycin ebenda
  • J. Thiaxanthenone Miracil D ebenda
  • K. Anthramycin ebenda
  • L. Mitomycin Ogawa et al., Nucl. Acids Res., Spec. Publ., Bd. 3, S. 79 (1977), Akhtar et al., Can. J. chem., Bd. 53, S. 2891 (1975)
  • M. Platinkomplexe Lippard, Accts. Chem. Res., Bd. 11, S. 211 (1978)
  • N. Polyinterkalatoren Echinomycin Waring et al., Nature, Bd. 252, S. 653 (1974); Wakelin, Biochem. J., Bd. 157, S. 721 (1976)
  • Quinomycin Triostin BBM928A Tandem Lee et al., Biochem. J., Bd. 173, S. 115 (1978); Huang et al., Biochem., Bd. 19, S. 5537 (1980); Viswamitra et al., Nature, Bd. 289, S. 817 (1981)
  • Diacridine LePecq et al., PNA5 (USA), Bd. 72, S. 2915 (1975); carrellakis et al., Biochem. Biophys. Acta, Bd. 418, S. 277 (1976); Wakelin et al., Biochem., Bd. 17, S. 5057 (1978); Wakelin et al., FEBS Lett., Bd. 104, S. 261 (1979); capelle et al., Biochem., Bd. 18, S. 3354 (1979); Wright et al., Biochem., Bd. 19, S. 5825 (1980); Bernier et al., Biochem. J., Bd. 199, S. 479 (1981); King et al., Biochem., Bd. 21, S. 4982 (1982)
  • Ethidium-Dimer Gaugain et al., Biochem., Bd. 17, S. 5078 (1978); Kuhlman et al., Nucl. Acids Res. Bd. 5, S. 2629 (1978); Marlcovits et al., Anal. Biochem., Bd. 94, S. 259 (1979); Dervan et al., JACS, Bd. 100, S. 1968 (1978); ebenda Bd. 101, S. 3664 (1979)
  • Ellipticen-Dimere und Analoga Debarre et al., Compt. Rend. Ser. D., Bd. 284, S. 81 (1977); Pelaprat et al., J. Med. Chem., Bd. 23, S. 1336 (1980)
  • Heterodimere cain et al., J. Med. Chem., Bd. 21, S. 658 (1978); Gaugain et al., Biochem., Bd. 17, S. 5078 (1978)
  • Trimere Hansen et al., JCS Chem. Comm., S. 162 (1983); Atnell et al., JACAS, Bd. 105, S. 2913 (1983)
  • O. Norphillin A Loun et al., JACS, Bd. 104, S. 3213 (1982)
  • P. Fluorene und Fluorenone Fluorenodiamine Bloomfield et al, a.a.O. Witkowski et al., Wiss. Beitr.-Martin-Luther-Univ. Halle-Wittenberg, Bd. 11 (1981)
  • Q. Furocumarine Angelicin Venema et al., MGG, Mol. Gen. Genet., Bd. 179, S. 1 (1980)
  • 4,5'-Dirnethylangelicin Vedaldi et al., Chem.-Biol. Interact, Bd. 36, S. 275 (1981)
  • Psoralen Marciani et al., Z. Naturforsch. B, Bd. 27(2), S. 196 (1972)
  • 8-Methoxypsoralen Belognzov et al., Mutat. Res., Bd. 84, S. 11 (1981); Scott et al., Photochem. Photobiol., Bd. 34, S. 63 (1981)
  • 5-Aminomethyl-8-methoxypsoralen Hansen et al., Tet. Lett., Bd. 22, S. 1847 (1981)
  • 4,5,8-Trimethylpsoralen Ben-Hur et al., Biochem. Biophys. Acta, Bd. 331, S. 181 (1973)
  • 4'-Arninomethyl-4,5,8-trimethylpsoralen Issacs et al., Biochem., Bd,. 16. S. 1058 (1977)
  • Xanthotoxin Hradecma et al., Acta Virol. (Engl. Ed.), Bd. 26, S. 305 (1982)
  • Khellin Beaumont et al., Biochem. Biophys. Acta, Bd. 608, S. 1829 (1980)
  • R. Benzodipyrone Murx et al., J. Het. Chem., Bd. 12, S. 417 (1975); Horter et al., Photochem. Photobiol., Bd. 20, S. 407 (1974)
  • S. Monstral-Echtblau Jurarranz et al., Acta Histochem., Bd. 70, S. 130 (1982).
  • Besonders nützliche interkalierende Mittel sind Azido- Interkalatoren. Ihre reaktiven Nitrene werden bei langwelligem ultraviolettem oder sichtbarem Licht leicht erzeugt, und die Nitrene von Arylaziden bevorzugen Insertionsreaktionen über ihre eigenen Umlagerungsprodukte (White et al., Methods in Enzymol., Bd. 47, S. 644 (1977)). Beispielhafte Azido-Interkalatoren sind 3-Azidoacridin, 9- Azidoacridin, Ethidiummonoazid, Ethidiumdiazid, Ethidiumdimerazid (Mitchell et al, JACS, Bd. 104, S. 4265 (1982), 4-Azido-7-chlorchinolin und 2-Azidofluoren. Weitere nützliche Interkalatoren sind Furocumarine, die [2+2]- Cycloaddukte mit Pyrimidinresten bilden. Alkylierungsmittel, wie Bischlorethylamine und Epoxide oder Aziridine, z. B. Aflatoxine, Epoxide polycyclischer Kohlenwasserstoffe, Mitomycin und Norphillin A, können ebenfalls verwendet werden.
  • Geeignete Angelicin-Derivate zur erfindungsgemäßen Verwendung weisen die folgende Formel auf:
  • wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; wie nachstehend definiert sind:
  • Viele weitere Verbindungen mit verschiedenen R-Resten können gemäß veröffentlichten Verfahren synthetisiert werden.
  • Geeignete Psoralen-Derivate zur erfindungsgemäßen Verwendung weisen die folgende Formel auf
  • in der
  • R, R&sub1; und R&sub3; unabhängig voneinander die Bedeutung Wasserstoff oder Niederalkyl haben,
  • R&sub4; die Bedeutung Wasserstoff, Niederalkyl oder durch Hydroxy substituiertes Niederalkyl, Niederalkoxy, Amino, Halogen und/oder
  • und R&sub2; und R&sub5; unabhängig voneinander die Bedeutung Wasserstoff, Hydroxy, Carboxy, Carbo-niederalkoxy oder Niederalkoxy haben.
  • Angelicinderivate sind Psoralenverbindungen bei der Bildung von Monoaddukten überlegen. Wenn eine einzelsträngige Sonde kovalent an zusätzliche doppelsträngige DNA gebunden ist, dann ist die Verwendung von Phenanthridin- und Psoralenverbindungen günstig, da diese Verbindungen vorzugsweise mit doppelsträngiger DNA im Dunkeln in Wechselwirkung treten.
  • Nicht-beschränkende Beispiele für Nucleinsäuresequenzen zur erfindungsgemäßen Verwendung sind einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA oder Fragmente davon, wie sie durch Restriktionsenzyme hergestellt werden, oder selbst vergleichsweise kurze Oligomere.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Sonde auf einem festen Träger, z. B. Nitrocellulose-Papier, immobilisiert.
  • Nicht-beschränkende Beispiele für Liganden zur erfindungsgemäßen Verwendung umfassen Haptene und Biotin,
  • z. B. Biotin-N-hydroxysuccinimid und Biotin-p- nitrophenylester.
  • Nicht beschränkende Beispiele für Bindungsproteine zur erfindungsgemäßen Verwendung umfassen Antikörper, Avidin und Streptavidin.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird die markierte, durch Hybridisierung auf Nitrocellulose-Papier immobilisierte, d. h. in einem transparenten Behälter eingeschlossene Sonde auf einem schnellen photographischen Film, wie einer POLAROID®-Filmpatrone, angeordnet. Die immobilisierte Sonde und die Filmpatrone und geeignete Reagenzien in Lösungsform (die eingesetzten Reagenzien hängen von der verwendeten Sonde ab; wenn die Sonde z. B. eine Chemolumineszenzsubstanz enthält, dann enthält die Reagenzlösung einen Verstärker, ein Oxidationsmittel und ein Enzym) werden in das Gefäß eingespritzt, um mit der immobilisierten Sonde in Kontakt zu treten. Aufgrund der Reaktion zwischen den Reagenzien und der Sonde emittiertes Licht wird dann auf dem Film nachgewiesen. Es ist darauf hinzuweisen, daß die Wellenlänge des emittierten Lichtes von den eingesetzten Reagenzien abhängt. Wenn eine Hybridisierung auftritt, dann wird Licht emittiert. Wenn keine Hybridisierung auftritt, dann wird kein Licht emittiert.
    • Sonden und Formate zur Hybridisierung
  • Es gibt verschiedene Arten von Sonden und Formaten, die für Hybridisierungsassays und zum Nachweis nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können.
  • Im wesentlichen kann jedes Nucleinsäurehybridisierungsformat für die erfindungsgemäßen Zwecke angewandt werden, bei dem entweder die zwischen der Sonde und der zu bestimmenden Sequenz gebildeten Hybride oder die Sonde, die nicht mit der Sequenz von Interesse hybridisiert ist, mit der ausgewählten Chemolumineszenzmarkierung markierbar sind. Es ist bekannt, daß die Markierung derartiger Hybride oder nichthybridisierter Sonden vor oder nach der tatsächlichen Hybridisierungsreaktion durchgeführt werden kann. Normalerweise ist die Sonde entweder markiert oder durch eine spezifische Brückenreaktion markierbar, oder die gebildeten Hybride sind nachfolgend markierbar, und zwar üblicherweise durch eine spezifische Brückenreaktion. Ein wesentliches neuartiges Merkmal der Erfindung ist die vorteilhafte Anwendung des Phänomens der verstärkten Chemolumineszenz zum Nachweis der Nucleinsäurehybridisierung.
  • Die Sonde umfaßt mindestens eine einzelsträngige Basensequenz, die zu der nachzuweisenden Sequenz im wesentlichen komplementär oder homolog ist. Bei einer derartigen Basensequenz muß es sich jedoch nicht um ein einzelnes kontinuierliches Polynucleotidsegment handeln, sondern sie kann aus zwei oder mehr einzelnen, von nichthomologen Sequenzen unterbrochenen Segmenten bestehen. Diese nicht-homologen Sequenzen können linear oder selbstkomplementär sein und Haarnadelschleifen bilden. Außerdem kann die homologe Region der Sonde an den 3'- und 5'-Enden von nicht homologen Sequenzen flankiert sein, wie etwa von Sequenzen, die DNA oder RNA eines Vektors umfassen, in den die homologe Sequenz zur Vermehrung inseriert worden war. In jedem Fall zeigt die als analytisches Reagenz vorliegende Sonde eine nachweisbare Hybridisierung an einem oder mehreren Punkten mit der Probennucleinsäure von Interesse. Lineare oder kreisförmige einzelsträngige Polynucleotide können als Sondenelemente verwendet werden, wobei hauptsächliche oder geringfügige Abschnitte mit einem komplementären Polynucleotidstrang oder komplementären Polynucleotidsträngen zusammengelagert sind, sofern das kritische homologe Segment oder die kritischen homologen Segmente in einzelsträngiger Form vorliegen und zur Hybridisierung mit der Proben-DNA oder Proben-RNA zur Verfügung stehen. Besonders bevorzugt sind lineare oder kreisförmige Sonden, bei denen die homologe Sondensequenz im wesentlichen nur in einzelsträngiger Form vorliegt (vgl. insbesondere Hu und Messing, Gene, Bd. 17, S. 271-277 (1982)).
  • Die Formate, bei denen eine einzelne Polynucleotidsequenz als Sonde verwendet wird, sind nach dem Stand der Technik üblich. Die Sonde kann so markiert werden, daß sie fähig ist, an einer Chemolumineszenzreaktion teilzunehmen. Dies kann durch Markieren der Sonde mit einem Liganden, z. B. Biotin, das spezifisch an ein Protein bindet, erzielt werden, und das Protein kann ein Träger für die Komponente der Chemolumineszenzreaktion sein, es kann also z. B. kovalent mit Luminol oder Meerrettich-Peroxidase verknüpft sein.
  • Die Sonde kann auch direkt mit den Partnern der Chemolumineszenzreaktion verknüpft sein. Die Sonde kann photochemisch mit Luminol oder Meerrettich-Peroxidase verknüpft sein. Die Sonde kann auch in einer solchen Weise hergestellt werden, daß nach der Hybridisierung das Hybrid sich im Vergleich zum Rest der Reaktionskomponenten immunologisch unterschiedlich verhält, z. B. wenn eine DNA- Sonde zum Nachweis von RNA oder eine RNA-Sonde zum Nachweis von DNA verwendet wird, dann bildet das DNA/RNA-Hybrid immunologisch spezifische Antikörper, die diese Hybride erkennen, und diese spezifische Erkennung kann zum Nachweis des Hybrids verwendet werden. Wenn die RNA-Sonde immobilisiert ist, dann ist das Hybrid auch immobilisiert, und ein für das RNA/DNA-Hybrid spezifischer Antikörper wird mit dem Hybrid umgesetzt. Wenn der Antikörper eine Markierung trägt, die an einer Chemolumineszenzreaktion teilnehmen kann, dann kann das Hybrid über den Antikörper und die Chemolumineszenzreaktion nachgewiesen werden. Wenn z. B. der für das RNA/DNA-Hybrid spezifische Antikörper nach der Hybridisierung und der Wechselwirkung mit dem mit Peroxidase verknüpften Antikörper kovalent mit Meerrettich-Peroxidase verknüpft ist, dann sollte es möglich sein, eine Chemolumineszenzreaktion durch Zugabe der Vorstufe und eines Oxidationsmittels zu initiieren.
  • Es gibt mehrere weitere Wege, eine Nucleinsäure immunogen und immunologisch verschieden von anderen Nucleinsäuren zu machen. Antikörper, die selektiv für RNA/RNA- oder DNA/DNA- Hybride sind, sind ebenfalls bekannt und können auf ähnliche Weise verwendet werden. Wenn außerdem eine Nucleinsäure mit einem Interkalator in Wechselwirkung tritt, dann wird der Nucleinsäurekomplex immunologisch verschieden von nicht umgesetzter Nucleinsäure. Wenn in einem Hybridisierungsformat eine Sonde so hergestellt wird, daß die Sonde derartige Wechselwirkungsstellen nach der Hybridisierung bereitstellt, dann kann ein Antikörperassay zum Nachweis des Hybrids durchgeführt werden. Zwei nicht-konventionelle Assayformate werden nachstehend ausführlich beschrieben.
  • Die Ausführung der erfindungsgemäßen analytischen Verfahren ist nicht aufirgendwelche besonderen Hybridisierungsformate beschränkt. Beliebige herkömmliche Hybridisierungstechniken können angewandt werden. Sowie Verbesserungen gemacht werden und konzeptionell neue Formate entwickelt werden, können sie leicht bei der Ausführung der Erfindung angewandt werden. Herkömmliche Hybridisierungsformate, die besonders geeignet sind, umfassen Hybridisierungsformate, bei denen die Nucleinsäuren der Probe oder die Polynucleotidsonde auf einem festen Träger immobilisiert sind (Festphasenhybridisierung) und Hybridisierungsformate, bei denen die Polynucleotidspezies alle in Lösung sind (Lösungshybridisierung).
    • Festphasenhybridisierungsformate
  • Bei Festphasenhybridisierungsformaten wird eine der Polynucleotidspezies, die an der Hybridisierung teilnehmen, in geeigneter Weise in ihrer einzelsträngigen Form an einem festen Träger fixiert. Geeignete feste Träger sind gut bekannt und umfassen solche, die Nucleinsäuren entweder kovalent oder nicht-kovalent binden. Nicht-kovalente Träger, worunter man im allgemeinen Träger versteht, die eine hydrophobe Bindung beinhalten, umfassen natürlich auftretende und synthetische polymere Materialien, wie Nitrocellulose, derivatisiertes Nylon und fluorierte Polykohlenwasserstoffe, und zwar in einer Reihe von Formen, wie Filtern oder festen Platten. Kovalent bindende Träger sind ebenfalls nützlich, und sie umfassen Materialien mit chemisch reaktiven Gruppen, wie Dichlortriazin, Diazobenzyloxymethyl und dergl., die zur Bindung von Polynucleotiden aktiviert werden können.
  • Eine typische Festphasen-Hybridisierungstechnik beginnt mit der Immobilisierung von Probennucleinsäuren auf einem Träger in einzelsträngiger Form. Diese Anfangsstufe verhindert im wesentlichen die erneute Zusammenlagerung komplementärer Stränge, und sie kann als Maßnahme zur Konzentrierung des Probenmaterials auf dem Träger für eine verbesserte Nachweisbarkeit dienen. Die Polynucleotidsonde wird mit dem Träger in Kontakt gebracht, und die Hybridisierung wird durch die hier beschriebenen Methoden nachgewiesen.
  • Im wesentlichen können beliebige Nucleinsäurehybridisierungsformate für die erfindungsgemäßen Zwecke angewandt werden, bei denen entweder Hybride zwischen der Sonde und der zu bestimmenden Sequenz oder die Sonde, die nicht mit der Sequenz von Interesse hybridisiert ist, mit der ausgewählten Chemolumineszenzmarkierung markierbar sind. Wie bekannt ist, kann die Markierung derartiger Hybride oder nicht-hybridisierter Sonden vor oder nach der tatsächlichen Hybridisierungsreaktion durchgeführt werden. Normalerweise ist die Sonde entweder markiert oder durch eine spezifische Bindungsreaktion markierbar, oder die gebildeten Hybride werden anschließend markiert, und zwar üblicherweise durch eine spezifische Bindungsreaktion. Ein wesentliches neuartiges Merkmal der Erfindung besteht in der vorteilhaften Anwendung des Phänomens der verstärkten Chemolumineszenz zum Nachweis der Nucleinsäurehybridisierung.
  • Die Sonde umfaßt mindestens eine einzelsträngige Basensequenz, die zu der nachzuweisenden Sequenz im wesentlichen komplementär oder homolog ist. Bei einer derartigen Basensequenz muß es sich jedoch nicht um ein einzelnes kontinuierliches Polynucleotidsegment handeln, sondern sie kann aus zwei oder mehr einzelnen, von nichthomologen Sequenzen unterbrochenen Segmenten bestehen. Diese nicht-homologen Sequenzen können linear oder selbstkomplementär sein und eine Haarnadelschleife bilden. Außerdem kann die homologe Region der Sonde an den 3'- und 5'-Enden von nicht homologen Sequenzen flankiert sein, wie etwa von Sequenzen, die DNA oder RNA eines Vektors umfassen, in den die homologe Sequenz zur Vermehrung inseriert worden war. In jedem Fall zeigt die als analytisches Reagenz vorliegende Sonde eine nachweisbare Hybridisierung an einem oder mehreren Punkten mit der Nucleinsäure der Probe von Interesse. Lineare oder kreisförmige einzelsträngige Polynucleotide können als Sondenelemente verwendet werden, wobei hauptsächliche oder geringfügige Abschnitte mit einem komplementären Polynucleotidstrang oder komplementären Polynucleotidsträngen zusammengelagert sind, sofern das kritische homologe Segment oder die kritischen homologen Segmente in einzelsträngiger Form vorliegen und zur Hybridisierung mit der Proben-DNA oder Proben-RNA zur Verfügung stehen. Besonders bevorzugt sind lineare oder kreisförmige Sonden, bei denen die homologe Sondensequenz im wesentlichen nur in einzelsträngiger Form vorliegt (vgl. insbesondere Hu und Messing, Gene, Bd. 17, S. 271-277 (1982)).
  • Normalerweise ist die Sonde direkt oder indirekt durch eines oder mehrere spezifische Bindungspaare mit der ausgewählten Chemolumineszenzmarkierung markiert. Indirekte Markierung, Immobilisierung oder andere Modifikationen durch eines oder mehrere spezifisch bindende Paare bedeuten hier die Kupplung eines Bindungspartners eines Paares sich gegenseitig bindender Substanzen an das zu markierende Material, z. B. an die Sonde, und die Markierung, Immobilisierung und dergl. des anderen Bindungspartners des Paares. Nützliche Bindungspaare umfassen Biotin/Avidin (einschließlich Eiweißavidin und Streptavidin), Haptene und Antigene/Antikörper, Kohlenhydrate/Lectine, Enzyme/Inhibitoren und dergl., wie sie bekannt sind. Man kann auch verbrückende Paare verwenden, wie die Kupplung von Biotin oder einem Hapten an das zu markierende Material und auch an die Markierung, die feste Phase und dergl., und man kann dann Avidin bzw. ein anti- Hapten verwenden, um die beiden zu überbrücken.
  • Wenn eine markierte Sonde und eine immobilisierte Nucleinsäureprobe verwendet werden, dann werden die resultierenden Hybride von der nicht-hybridisierten Sonde abgetrennt, und die Chemolumineszenzreaktion wird in der einen oder der anderen der getrennten Fraktionen initiiert. Alternativ dazu brauchen die Hybride und die nichthybridisierte Sonde nicht getrennt zu werden, wenn die Hybride durch anti-Hybrid-Antikörper, die die Hybride von der nicht-hybridisierten, einzelsträngigen Sonde unterscheiden, nachgewiesen werden. Derartige Antikörper können selektiv für gemischte DNA/RNA-Hybride oder selektiv für RNA/RNA- oder DNA/DNA-Hybride sein, oder sie können selektiv für Interkalatorduplexe sein, bei denen das interkalierende Mittel in die Hybride eingeführt worden ist. Derartige Antikörperreagenzien werden nachstehend ausführlich beschrieben.
  • Ein alternatives Verfahren zu den Verfahren, bei denen die Nucleinsäure der Probe immobilisiert wird, verwendet eine immobilisierte Sonde und den Nachweis der resultierenden immobilisierten Hybride mit einem anti-Hybrid-Antikörper, der direkt oder über ein spezifisches Bindungspaar mit der ausgewählten Chemolumineszenzmarkierung, wie es vorstehend beschrieben wurde, markiert ist. Wenn sie in immobilisierter Form bei der Hybridisierungsreaktion eingesetzt wird, dann kann die Sonde in einer beliebigen geeigneten Form vorliegen, bei der es möglich ist, die Sonde und etwaige Bestandteile des Reaktionsgemisches, die damit durch Hybridisierung und/oder Bindung des anti-Hybrid-Reagenz verknüpft worden sind, anschließend zu isolieren oder von dem verbleibenden Gemisch abzutrennen, wie durch Zentrifugation, Filtration, Chromatographie oder Dekantieren. Eine Reihe von Zusammensetzungen und Konfigurationen einer immobilisierten Sonde sind somit für den Fachmann offensichtlich und stehen ihm zur Verfügung. Es können im wesentlichen beliebige Formen der Sonde, die in dem Reaktionsgemisch unlöslich sind, verwendet werden. Zum Beispiel kann die Sonde aggregiert oder auf andere Weise gefällt, mit einem unlöslichen Material, einem Polymer oder einem Träger verbunden oder in einem Gel, wie Agarose oder Polyacrylamid, eingeschlossen sein (vgl. Meth. Enzymol., Bd. 12B, S. 635 (1968) und PNAS, Bd. 67, S. 807 (1970)). Es wird besonders bevorzugt, einen festen Träger einzusetzen, mit dem die Sonde verknüpft oder an den die Sonde durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen fixiert ist, wobei letzteres Adsorptionsmethoden einschließt, die für eine ausreichend stabile und feste Haftung sorgen. Der feste Träger kann eine Reihe von Formen und Zusammensetzungen annehmen, einschließlich Mikropartikeln, Kügelchen, porösen und impermeablen Streifen oder Membranen, die innere Oberfläche eines Reaktionsgefäßes, wie eines Teströhrchens oder einer Mikrotiterplatte, und dergl. Das Anheften eines gewünschten Reaktionspartners an einen ausgewählten festen Träger kann von einem Fachmann routinemäßig durchgeführt werden.
  • Ein Verfahren zum Adsorbieren der Sonde auf Nitrocellulose- Membranen umfaßt das Sättigen einer Lösung der Sonde mit Natriumiodid und das Betupfen der Membran mit Teilen der Lösung oder das Filtrieren von Teilen der Lösung durch die Membran (Bresser et al., DNA, Bd. 2, S. 243 (1983)). Das Natriumiodid erleichtert die Denaturierung der Sonde und verstärkt die Adsorption auf der Membran. Alternativ dazu kann die Sonde mit Glyoxal, üblicherweise bei Konzentrationen von etwa 1 molar, behandelt und anschließend auf der Membran adsorbiert werden. Die Sonde wird durch Erwärmen auf etwa 80ºC unter Vakuum für eine Zeitspanne im Bereich von 2 bis 4 Stunden fixiert. (P.S. Thomas, Meth. Enzymol., Bd. 100, S. 255 (1983)).
  • Eine kovalente Immobilisierung von RNA- oder DNA-Sonden kann ebenfalls durchgeführt werden. Eine Vielzahl von Trägermaterialien und Kupplungstechniken kann eingesetzt werden. Zum Beispiel kann die Sonde an Phosphocellulose über Phosphatgruppen gekuppelt werden, die mit Carbodiimid oder Carbonyldiimidazol aktiviert sind (E.K.F. Bautz und B.D. Hall, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 48, S. 400-408 (1962); T.Y. Shih und M.A. Martin, Biochem., Bd. 13, S. 3411-3418 (1974)). Es können auch Diazogruppen auf m- Diazobenzoyloxymethyl-Cellulose mit Guanin- und Thymidinresten des Polynucleotids reagieren (B.E. Noyes und G.R. Stark, Cell, Bd. 5, S. 301-310 (1975); J. Reiser et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. Bd. 85, S. 1104-1112 (1978)). Es können auch Polysaccharid-Träger verwendet werden, wobei die Kupplung über Phosphodiesterbindungen erfolgt, die zwischen dem endständigen Phosphat des Polynucleotids und Hydroxylgruppen des Trägers durch Aktivierung mit wasserlöslichem Carbodiimid gebildet werden (D. Richwood, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 269, S. 47-50 (1972); P.T. Gilham, Biochem., Bd. 7, S. 2809-2813 (1968)), oder durch Kupplung nucleophiler Stellen des Polynucleotids mit einem mit Bromcyan aktivierten Träger (D.J. Arndt-Jovin et al., Eur. J. Biochem., Bd. 54, S. 411-418 (1975); U. Linberg und S. Ericksson, Eur. J. Biochem., Bd. 18, S. 474-479 (1971)). Ferner kann das 3'-Hydroxylende der Sonde mit Periodat oxidiert und unter Bildung einer Schiffschen Base mit Trägern, die Amin- oder Hydrazidgruppen tragen, verknüpft werden (P.T. Gilham, Method. Enzymol., Bd. 21, S. 191-197 (1971); H.D. Hansske et al., Method. Enzymol., Bd. 59, S. 172-181 (1979)). Träger mit nucleophilen Stellen können mit Cyanurchlorid und anschließend mit dem Polynucleotid umgesetzt werden (H.D. Hunger et al., Biochim. Biophys. Acta, Bd. 653, S. 344-349 (1981)).
  • Im allgemeinen können beliebige Methoden zur Immobilisierung der Sonde eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß die komplementäre einzelsträngige Sequenz zur Hybridisierung mit den Nucleinsäuren der Probe verfügbar ist. Spezielle Methoden und Materialien sind erfindungsgemäß nicht kritisch.
  • Eine weitere Methode von Interesse ist die Sandwich- Hybridisierungstechnik, bei der eines von zwei sich gegenseitig ausschließenden Fragmenten der homologen Sequenz der Sonde immobilisiert und das andere markiert wird. Die Gegenwart des Polynucleotids von Interesse führt zu einer zweifachen Hybridisierung an das immobilisierte und das markierte Sondensegment, und zwar wiederum mit den gleichen endgültigen Meßergebnissen bei der zweifachen Hybridisierung an die immobilisierten und markierten Sondensegmente, und wiederum mit der gleichen endgültigen Messung der trägergebundenen markierten Hybride; bezüglich weiterer Einzelheiten vergl. Methods in Enzymology, Bd. 65, S. 468 (1980) und Gene, Bd. 21, S. 77-85 (1983).
  • Zum Zweck der besseren Verdeutlichung sind die folgenden Festphasen-Hybridisierungsmethoden, die den Nachweis mit einem Antikörper gegen interkalierte Duplexe umfassen, erfindungsgemäß besonders nützlich.
  • Bei einer ersten Methode werden einzelsträngige Nucleinsäuren aus dem flüssigen Testmedium zunächst auf einem festen Träger immobilisiert. Ein Hybridisierungsreaktionsgemisch wird dann durch Kontaktieren der immobilisierten Nucleinsäure in der Probe mit der Sonde, die in diesem Fall, zusätzlich zu dem komplementären, einzelsträngigen Abschnitt, mindestens einen doppelsträngigen Abschnitt umfaßt, der mit dem Interkalator chemisch in Form eines Interkalationskomplexes verknüpft ist, gebildet. Eine besonders geeignete Form der Sonde ist die kreisförmige Form, die von Hu und Messing, a.a.O., beschrieben wurde. Das resultierende Hybridisierungsaggregat umfaßt das immobilisierte Polynucleotid von Interesse, das mit der Sonde, die eine kovalent verknüpfte, interkalierte doppelsträngige Region aufweist, hybridisiert ist. Der feste Träger, der immobilisierte Duplexe trägt, wird dann vorzugsweise vom Rest des Reaktionsgemisches abgetrennt. Der Antikörper, der vorzugsweise mit der ausgewählten Chemolumineszenzmarkierung markiert ist, wird zugegeben, und der resultierende, immobilisierte, an die Interkalationskomplexe im Aggregat gebundene Antikörper wird vom Rest des Reaktionsgemisches abgetrennt. Der an den Träger gebundene Antikörper wird anschließend bestimmt, um den Assay abzuschließen. Alternativ dazu kann der Antikörper in der abgetrennten Lösung bestimmt werden, obwohl dies im allgemeinen weniger bevorzugt ist, da normalerweise ein großer Überschuß an Antikörper verwendet wird.
  • Eine Variation dieser Methode besteht darin, eine Sonde wie vorstehend zu verwenden, bei der jedoch kein Interkalator kovalent an die doppelsträngige Region gebunden ist. Vielmehr wird der Interkalator zum immobilisierten Aggregat gegeben, was zur Bildung von Interkalatorkomplexen sowohl im doppelsträngigen Abschnitt der Sonde als auch in der durch die Hybridisierung gebildeten Duplex-Region führt.
  • Eine zweite Methode basiert auf einen Sandwich-Format, bei dem ein Reaktionsgemisch aus dem Testmedium, das die Sequenz von Interesse enthält, und der ersten und zweiten Sonde, die jeweils mindestens eine zu sich gegenseitig ausschließenden Abschnitten der Sequenz von Interesse komplementäre Basensequenz umfassen. Die erste Sonde wird auf einem festen Träger immobilisiert, und die zweite Sonde wird mit kovalent verknüpften Interkalationskomplexen wie bei der vorhergehenden Methode modifiziert. Das resultierende Hybridisierungsaggregat umfaßt die Sequenz von Interesse, die sowohl mit der immobilisierten ersten Sonde als auch mit der durch den Interkalationskomplex modifizierten zweiten Sonde hybridisiert ist. Der Antikörper wird vorzugsweise in der markierten Form zugegeben, und der resultierende immobilisierte Antikörper, der an die Interkalationskomplexe in dem Aggregat gebunden ist, wird vom Rest des Reaktionsgemischs abgetrennt. Der gebundene Antikörper wird dann bestimmt, um den Assay abzuschließen.
  • Es gibt mehrere nützliche Variationen dieser zweiten Methode. Zunächst kann man, wie im Fall der Variation der ersten Methode, eine Sonde einsetzen, die keinen kovalent gebundenen Interkalator umfaßt, sondern man kann vielmehr den freien Interkalator zum immobilisierten Aggregat geben, was zur Bildung von Interkalationskomplexen mit allen verfügbaren doppelsträngigen Regionen führt. Auch kann man als Alternative zur Verwendung einer zweiten Sonde mit einem doppelsträngigen Abschnitt eine Sonde verwenden, die vollständig aus einzelsträngiger Nucleinsäure besteht, wobei der Interkalator chemisch daran gebunden ist, so daß bei Hybridisierung Interkalationskomplexe gebildet werden, oder wobei der Interkalator zugegeben wird, so daß die Interkalation zwischen den Duplexen, die zwischen den beiden Sonden und der zu bestimmenden Sequenz gebildet wurden, auftritt.
  • Bei einer dritten Methode werden die Nucleinsäuren der Probe mit immobilisierten Sonden in Kontakt gebracht, und vorzugsweise werden die resultierenden immobilisierten Duplexe vom Rest des Reaktionsgemischs abgetrennt. Bei diesem Format liegt die Sonde in einzelsträngiger Form vor. Das resultierende Hybridisierungsprodukt umfaßt die immobilisierte Sonde, die mit der Sequenz von Interesse hybridisiert ist. Dieses Format ermöglicht auch eine signifikante erneute Zusammenlagerung zwischen komplementären Regionen der Nucleinsäure der Probe, die im immobilisierten Aggregat auftreten kann. Eine derartige erneute Zusammenlagerung ist von Vorteil für den Assay, da sie zu zusätzlicher doppelsträngiger Nucleinsäure für die nachfolgende Interkalation führt. Die nächste Stufe des Assays besteht darin, Interkalator und Antikörper, wiederum vorzugsweise in einer markierten Form, zuzugeben. Der Assay wird durch Abtrennen und Bestimmung des Antikörpers wie in den vorstehenden Formaten abgeschlossen.
  • Schließlich gibt es eine vierte Methode, bei der einzelsträngige Nucleinsäuren der Probe mit immobilisierten Sonden in Kontakt gebracht werden, wobei in diesem Fall eine derartige Sonde chemisch, z. B. kovalent, an den Interkalator gebunden ist, so daß die Duplexbildung im Bereich des gebundenen Interkalators zur Bildung von Interkalationskomplexen führt. Dies ist ein sehr vorteilhaftes Format, und zwar weil die Sonde sowohl immobilisiert als auch modifiziert ist, so daß keine Immobilisierungs- oder Modifizierungsstufe zum Zeitpunkt des Assays durchgeführt werden muß. Das resultierende Aggregat umfaßt kovalent gebundene Interkalationskomplexe im Bereich der Hybridisierung zwischen den Proben- und Sondennucleinsäuren und in allen erneut zusammengelagerten Probenregionen. Antikörper werden dann zugegeben, und der Assay wird wie bei den vorstehenden Formaten abgeschlossen. Dieses Format weist den Vorteil auf, daß für den Analytiker die Notwendigkeit der Handhabung von Lösungen mit freiem Interkalator, der in einigen Fällen möglicherweise gefährlich ist, entfällt. Eine einfache Variation dieser Technik besteht darin, Nucleinsäuren der Probe anstelle der markierten Sonde zu immobilisieren und in der normalen Weise vorzugehen. Dies ist weniger vorteilhaft, es ist aber ein praktikabler Ansatz für einen Assay.
    • Lösungshybridisierungsformate
  • Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Festphasenformaten können eine Reihe von Lösungshybridisierungsformaten erfindungsgemäß ebenfalls angewandt werden. Derartige Formate sind durch das Merkmal charakterisiert, daß die Hybridisierungsstufe lösliche Formen sowohl der Nucleinsäure der Probe als auch der Sonde beinhaltet. Dies kann zu wesentlich schnelleren Hybridisierungen führen, da die Kinetiken viel schneller sind, wenn beide Stränge in Lösung vorliegen, verglichen mit der Immobilisierung eines Stranges. Normalerweise werden nach der Hybridisierungsstufe die resultierenden Hybride zum Zweck des Nachweises immobilisiert. Eine derartige Immobilisierung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Es ist bekannt, in herkömmlicher Weise selektiv Komplexe zu immobilisieren, und zwar indem sie Adsorptionsmitteln, wie Hydroxylapatit oder Nitrocellulose- Membranen, ausgesetzt werden.
  • Ein besonders nützlicher Ansatz zur Immobilisierung der in einer Lösungshybridisierung gebildeten Hybride beinhaltet die Verwendung einer Sonde, die eine reaktive Stelle aufweist, die zur Bildung einer stabilen kovalenten oder nichtkovalenten Bindung mit einem Reaktionspartner und zu einer Immobilisierung, indem sie einer immobilisierten Form eines derartigen Reaktionspartners ausgesetzt wird, fähig ist. Vorzugsweise handelt es sich bei einer derartigen reaktiven Stelle in der Sonde um eine Bindungsstelle, wie eine Biotin- oder Haptengruppe, die zur spezifischen, nicht-kovalenten Bindung mit einer Bindungssubstanz, wie Avidin oder einem Antikörper, die als Reaktionspartner dienen, fähig ist. Nach der Hybridisierungsstufe kann man dann eine immobilisierte Form des Reaktionspartners, z. B. einer Bindungssubstanz, zugeben, die wirksam die Hybride über die reaktive Stelle der Sonde bindet und immobilisiert.
  • Im wesentlichen kann jedes Paar von Substanzen das Paar aus reaktiver Stelle und reaktivem Partner darstellen, das eine geeignete Affinität zur Wechselwirkung unter Bildung einer stabilen Bindung aufweist, bei der es sich um eine Verknüpfung oder Kupplung zwischen den beiden handelt, die während der nachfolgenden Assay-Stufen, hauptsächlich der Abtrenn- und Nachweisstufen, weitgehend intakt bleibt. Bei der gebildeten Bindung kann es sich um eine kovalente Bindung oder eine nicht-kovalente Wechselwirkung handeln, wobei letztere bevorzugt ist, und zwar insbesondere, wenn sie durch einen gewissen Grad an Selektivität oder Spezifität charakterisiert ist. Im Falle einer derartigen bevorzugten Bindungsbildung wird die reaktive Stelle der Sonde als Bindungsstelle und der Reaktionspartner als Bindungssubstanz, mit der sie eine nicht-kovalente, im allgemeinen spezifische Bindung oder Verknüpfung bildet, bezeichnet. Eine derartige Bindungsstelle kann in einem einzelsträngigen hybridisierbaren Abschnitt der Sonde vorhanden sein, oder sie kann als Ergebnis einer chemischen Modifizierung der Sonde vorhanden sein. Beispiele für in der Nucleotidsequenz bestehende Bindungsstellen sind gegeben, wenn die Sonde eine Promotorsequenz (z. B. lac-Promotor, trp-Promotor) umfaßt, die gegenüber einem Promotorprotein bindungsfähig ist (z. B. Bacteriophagenpromotor, RNA-Polymerase) oder wenn sie eine Operatorsequenz (z. B. lac-Operator) umfaßt, die gegenüber einem Repressorprotein (z. B. lac-Repressor) bindungsfähig ist, oder wenn sie seltene, antigene Nucleotide oder Sequenzen (z. B. 5-Brom- oder 5-Ioddesoxyuridin, Z-DNA) umfaßt, die gegenüber spezifischen Antikörpern bindungsfähig sind (vgl. britisches Patent 2 125 964). Durch chemische Modifikation eingeführte Bindungsstellen der Sonde sind besonders nützlich, und sie umfassen normalerweise die Verknüpfung eines Bindungspartners eines spezifisch bindenden Paares an die Sondennucleinsäure. Geeignete bindende Paare, unter denen man auswählen kann, umfassen Biotin/Avidin, Haptene und Antigene/Antikörper, Kohlenhydrate/Lectine, Enzyme/Inhibitoren und dergl. Wenn das Bindungspaar aus einem proteinartigen Bindungspartner und einem nicht-proteinartigen Bindungspartner besteht, dann wird vorzugsweise der nichtproteinartige Bindungspartner mit der Sonde verknüpft, da der proteinartige Bindungspartner unter den denaturierenden Bedingungen der Hybridisierung der Sonde instabil sein kann. Bevorzugte Systeme beinhalten die Verknüpfung der Sonde mit Biotin oder einem Hapten und die Anwendung von immobilisiertem Avidin bzw. anti-Hapten-Antikörper. Die Herstellung geeigneter, mit Liganden markierter Sonden ist in der Literatur beschrieben (Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 78, S. 6633 (1981); Broker, Nucl. Acids Res., Bd. 5, S. 363 (1978); Sodja et al., Nucl. Acids Res., Bd. 5, S. 385 (1978); Tchen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 81, S. 3466 (1984)). Die Immobilisierung der Bindungssubstanz kann gemäß herkömmlichen Techniken erfolgen.
  • Eine große Vielzahl von Methoden sind zur Immobilisierung von Proteinen auf festen Trägern bekannt, und diese Methoden sind zur Immobilisierung der Bindungssubstanz anwendbar (vgl. Methods in Enzymology, Bd. 44 (1976)). Antikörper werden z. B. entweder durch kovalente Kupplung oder durch nicht-kovalente Adsorption immobilisiert. Häufige angewandte, nicht-kovalente Methoden sind die Adsorption auf Polystyrol-Kügelchen oder - Mikropartikeln oder auf Polyvinylchlorid-Oberflächen. Viele kovalente Methoden werden zur Immobilisierung von Proteinen angewandt, und einige umfassen mit Bromcyan aktivierte Agarose und mit Bromcyan aktiviertes Dextran; mit Glutaraldehyd aktiviertes Nylon und Polyacrylamid sowie Epoxide auf acrylischen oder anderen Trägern.
  • Wenn die Sonde zur Hybridisierung eingesetzt wird, wobei die Sequenz von Interesse in einer immobilisierten Form vorliegt, dann können die nachfolgenden Stufen der Immobilisierung der gebildeten Duplexe durch eine Eigenschaft der Sonde und der Zugabe des anti-Hybrid-Reagenzes in einer beliebigen Reihenfolge erfolgen. Die Immobilisierung und die Zugabe des anti-Hybrid-Reagenzes können durch gleichzeitige Zugabe der beteiligten Reagenzien und Materialien erfolgen, oder eines kann vor dem anderen zugegeben werden, und zwar mit oder ohne dazwischenliegende Wasch- oder Trennstufen und in jeder Reihenfolge. Wenn die Zugaben in einer bestimmten Reihenfolge erfolgen, dann berücksichtigt man natürlich die Konzentrationen der zugegebenen Reagenzien, um nicht die gebildeten Hybride zu übersättigen und ihre Wechselwirkung mit dem zweiten zugegebenen Material zu hemmen.
  • Obwohl immobilisierte Sonden oder immobilisierbare Sonden, die durch spezifische Bindungsprozesse, die vorstehend beschrieben sind, an feste Träger gebunden werden, bevorzugt sind, können immobilisierbare Sonden an Träger durch Prozesse mit vergleichsweise niedriger Spezifität gebunden werden. In diesem Fall bindet der Träger die hybridisierte Sonde, aber nicht die unhybridisierte Form. Die Menge des Hybrids wird dann mit einem Antikörper-Reagenz gemessen. Ein Beispiel für einen Träger dieser Art ist Hydroxylapatit, der DNA/RNA- und RNA/RNA-Duplexe, aber nicht die einzelsträngigen Spezies bindet (Brenner und Falkow, Adv. in Genet., Bd 16, S. 81 (1973)).
  • Man kann auch eine chemisch aktive oder aktivierbare Gruppe in die Sonde einführen, die man nach der Hybridisierung mit dem festen Träger reagieren läßt. Dieses System ergibt eine kovalent immobilisierte Sonde, und die Menge des an den Träger gekuppelten Hybrids kann mit dem Antikörper bestimmt werden.
  • Zusätzlich zu den vorstehenden Methoden können Lösungshybridisierungsformate durchgeführt werden, wobei die Hybride durch Bindung immobilisierter oder immobilisierbarer anti-Hybrid-Antikörperreagenzien immobilisiert werden. Derartige Antikörperreagenzien können spezifisch für interkalierte Duplexe oder für DNA/RNA, RNA/RNA- oder DNA/DNA-Hybride sein, wie vorstehend beschrieben wurde. Immobilisierte Duplexe werden unter Verwendung von direkt oder indirekt markierten Sonden, markierten zweiten anti- Hybrid-Antikörpern oder markierten zweiten Sonden nachgewiesen.
    • Anti-Hybrid-Azitikörperreagenzien und Nachweisschemata
  • Das in der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendete Antikörperreagenz ist vor allem durch seine Fähigkeit charakterisiert, die zwischen der Sonde und komplementären Nucleinsäuren der Probe gebildeten Hybride bei einem signifikanten Ausschluß von einzelsträngigen Polynucleotiden zu binden. Das Antikörperreagenz kann aus ganzen Antikörpern, Antikörperfragmenten, polyfunktionalen Antikörperaggregaten oder im allgemeinen beliebigen Substanzen, die eine oder mehrere spezifische Bindungsstellen von einem anti-Hybrid-Antikörper umfassen, bestehen. Wenn es in der Form von ganzen Antikörpern vorliegt, dann kann es zu einer beliebigen der Klassen oder Unterklassen bekannter Immunoglobuline, z. B. IgG, IgM und dergl., gehören. Beliebige Fragmente beliebiger derartiger Antikörper, die die spezifische Bindungsaffinität für die hybridisierte Sonde aufweisen, können ebenfalls eingesetzt werden, z. B. Fragmente von IgG, die üblicherweise als Fab, F(ab') und F(ab')&sub2; bekannt sind. Zusätzlich können gegebenenfalls Aggregate, Polymere, Derivate und Konjugate von Immunoglobulinen oder von ihren Fragmenten verwendet werden.
  • Die Immunoglobuline für das Antikörperreagenz können auf beliebige Weise erhalten werden, wie durch herkömmliche Antiserumtechniken oder durch monoklonale Techniken. Antiseren können durch etablierte Techniken, die die Immunisierung eines Tieres, wie einer Maus, eines Kaninchens, eines Meerschweinchens oder einer Ziege, mit einem geeigneten Immunogen umfassen, erhalten werden. Die Immunoglobuline können auch durch Hybridisierungstechniken für somatische Zellen erhalten werden, was zu normalerweise als monoklonal bezeichneten Antikörpern führt, und zwar ebenfalls unter Verwendung eines geeigneten Immunogens.
  • Geeignete anti-Hybrid-Antikörper umfassen solche, die selektiv für interkalierte Nucleinsäureduplexe sind, sowie diejenigen, die spezifisch an DNA/RNA-, RNA/RNA- oder DNA/DNA-Hybride binden.
  • Antikörper gegen interkalierte Duplexe werden gegen ein Immunogen gebildet, das üblicherweise einen ionischen Komplex zwischen einem anionischen Protein oder Proteinderivat (z. B. methyliertes Rinderserumalbumin) und dem anionischen interkalierten Duplex umfaßt. Vorzugsweise wird die Interkalationsverbindung kovalent mit dem Duplex verknüpft. Alternativ dazu kann der Interkalator-Duplex-Komplex kovalent an ein Trägerprotein gekuppelt werden.
  • Die Herstellung von Antikörpern gegen DNA/DNA ist in EP- 135 139 beschrieben.
  • Immunogene zur Stimulierung von Antikörpern, die spezifisch für DNA/RNA-Hybride sind, können homopolymere oder heteropolymere Polynucleotid-Duplexe umfassen. Unter den möglichen Homopolymer-Duplexen werden Poly-(rA) und Poly-(dT) besonders bevorzugt (Kitagawa und Stollar, Mol. Immunol., Bd. 19, S. 413 (1982)). Im allgemeinen werden jedoch vorzugsweise Heteropolymerduplexe verwendet, die auf einer Reihe von Wegen hergestellt werden können, einschließlich der Transkription viraler ΦX174-DNA mit RNA-Polymerase (Nakazato, Biochem., Bd. 19, S. 2835 (1980)). Die ausgewählten RNA-DNA-Duplexe werden an ein methyliertes Protein adsorbiert oder auf andere Weise an ein herkömmliches immunogenes Trägermaterial, wie Rinderserumalbumin, gebunden, und in das gewünschte Wirtstier injiziert (vgl. Stollar, Meth. Enzymol., Bd. 70, S. 70 (1980)).
  • Antikörper gegen RNA/DNA-Duplexe können gegen doppelsträngige RNA aus Viren, wie dem Reovirus oder dem Virus der Fiji- Krankheit, das Zuckerrohr infiziert, gebildet werden. Auch Homopolymer-Duplexe, wie Poly-(rI)/Poly-(rC) oder Poly- (rA)/Poly-(rU) können neben anderen zur Immunisierung, wie sie vorstehend beschrieben wurde, verwendet werden.
  • Wenn das Antikörperreagenz zum Nachweis von Hybriden verwendet wird, dann wird es üblicherweise mit der Chemolumineszenzmarkierung durch geeignete synthetische Maßnahmen markiert.
  • Alternativ dazu kann das Antikörperreagenz auf der Grundlage einer nativen Eigenschaft, wie seiner eigenen Antigenität, nachgewiesen werden. Ein chemolumineszierend markierter anti- (Antikörper)-Antikörper oder Protein A binden an das primäre Antikörperreagenz, wobei es sich bei der Markierung für den zweiten Antikörper oder Protein A um eine herkömmliche Markierung, wie sie vorstehend beschrieben wurde, handelt. Weiterhin kann der Antikörper durch Komplementfixierung oder durch Verwendung von markiertem Protein A nachgewiesen werden, sowie auch durch weitere Techniken, die zum Nachweis von Antikörpern bekannt sind.
  • Wenn das Antikörperreagenz markiert ist, was bevorzugt ist, dann sind die markierende Gruppe und das Antikörperreagenz miteinander verknüpft oder aneinander gebunden, und zwar durch direkte chemische Verknüpfung, etwa unter Beteiligung kovalenter Bindungen, oder durch indirekte Verknüpfung, etwa durch Einverleiben der Markierung in eine Mikrokapsel oder ein Liposom, das wiederum mit dem Antikörper verknüpft ist. Markierungstechniken sind gut bekannt, und jede geeignete Methode kann erfindungsgemäß verwendet werden.
  • Emittiertes Licht kann auf ähnliche Weise nachgewiesen werden, etwa durch eine Photomultiplier-Röhre, deren Signal einer Aufzeichnungsvorrichtung, einem Oszilloskop oder einer Skala zugeführt und dort dargestellt oder aufgezeichnet wird. Das Licht kann auch mit einem Lichtmeßgerät quantifiziert werden.
  • Je nach Art der eingesetzten Markierung kann der Assay entweder heterogen oder homogen sein. Im ersten Fall können komplexe Fluide, wie Serum, analysiert werden, im zweiten Fall kann jedoch eine vorhergehende Extraktions- oder Reinigungsstufe erforderlich sein.
  • Typische heterogene und homogene lumineszierende oder luminometrische Immunoassays werden nachstehend erläutert.
    • 1. Reterogener lumineszierender oder luminometrischer Immunoassay
  • Bei dieser Art von Immunoassays wird die zu untersuchende Substanz mit einem Antikörper dagegen umgesetzt. Der freie Antikörper wird dann vom gebundenen Antikörper getrennt. Die Reaktion wird durch Markierung entweder des Antikörpers, der zu bestimmenden Substanz oder eines anderen Moleküls, das mit den freien oder gebundenen Gruppen nach der Trennung reagieren kann, quantifiziert.
    • 2. Kompetitiver heterogener lumineszierender Immunoassay
  • In diesem Fall wird eine unbekannte Menge der zu bestimmenden Substanz mit einer bekannten Menge der Substanz, die mit einer Markierung gekuppelt ist, und mit einer bekannten, aber begrenzten Menge eines Antikörpers dagegen gemischt. Darauf folgt eine kompetitive Reaktion zwischen der markierten und der nicht-markierten Substanz um den Antikörper. Die Komplexe zwischen Antikörper und nicht-markierter Substanz und zwischen Antikörper und markiert er Substanz werden von der freien markierten oder nicht-markierten Substanz abgetrennt.
  • Die Menge an markierter, an den Antikörper gebundener Substanz steht in Beziehung zu der Menge an nicht markierter Substanz in der zu untersuchenden Lösung. Diese Mengen können entweder durch Messung der Menge der an den Antikörper gebundenen Markierung oder durch Messung der Menge der verbleibenden freien markierten Substanz bestimmt werden.
  • Beispiele dieser Art von Assay, wobei Peroxidase die Markierung ist und der Antikörper an einer festen Phase über die Wände eines Glasteströhrchens gebunden ist, sind in GB-A- 2 044 927A angegeben.
    • 3. Reterogener luminometrischer Immunoassay mit zwei Stellen
  • Bei dieser Art von Immunoassay wird die zu bestimmende Substanz zuerst an einen nicht-markierten Antikörper dagegen gebunden, der wiederum an einen festen Träger, wie Kunststoff, gebunden ist. Der Komplex (zwischen Antikörper und Substanz) wird anschließend mit einem markierten Antikörper behandelt.
  • Eine Analyse auf den markierten Antikörper in dem erhaltenen festen Komplex kann dann durch Abt rennen des festen Komplexes von der Lösung und anschließende Bestimmung entweder der Menge der in dem abgetrennten festen Komplex vorhandenen Markierung oder der Menge der in dem verbleibenden, in der Lösung gelösten markierten Antikörper vorhandenen Markierung, erfolgen.
  • Bei alternativen Ausführungsformen dieser Art von Immunoassay wird die zu bestimmende Substanz entweder nacheinander an den markierten Antikörper und den nicht markierten, auf dem festen Träger befindlichen Antikörper gebunden, oder, sie wird sowohl an den markierten als auch an den nichtmarkierten Antikörper in einer Bindungsstufe gebunden.
    • 4. Homogener lumineszierender oder luminometrischer Immunoassay
  • Dieser ist anwendbar auf Immunoassays, bei denen die Markierung ein Amino- oder substituiertes Aminoderivat von 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion ist. Er hängt von dem Licht ab, das von der freien, markierten Substanz von Interesse (oder dem Antikörper dagegen) emittiert wird, wobei dieses Licht eine andere Intensität oder Wellenlänge als das Licht, das von der gebundenen markierten Substanz von Interesse (oder dem Antikörper dagegen) emittiert wird, aufweist.
  • Bei einem Beispiel wurde festgestellt, daß die Intensität des emittierten Lichtes aus der Reaktion eines (Progesteron- Isoluminol-Derivat)-Konjugats zugegeben wurde, gefolgt von einer bekannten Menge Häm und Wasserstoffperoxid. Das emittierte Licht wurde gemessen, und die Menge des vorhandenen Progesterons in der unbekannten Probe wurde dabei mit Hilfe einer Eichkurve bestimmt (je mehr Progesteron in der unbekannten Probe vorhanden war, umso weniger freies IgG bleibt im Gleichgewicht zurück, und um so geringer ist die Lichtausbeute der Lumineszenzreaktion).
  • Auf diese Weise kann die Bestimmung von Progesteron erfolgen, ohne daß eine Abtrennung erforderlich ist.
  • Bei allen vorstehenden Immunoassays kann die Stufe der Quantifizierung, des Nachweises oder der Lokalisierung in der erfindungsgemäßen Lumineszenzreaktion bestehen.
  • Die in den vorstehenden Immunoassays eingesetzten Antikörper können im Handel erworben oder durch bekannte immunologische Techniken hergestellt werden. Die Antikörper können in Form eines komplexen Gemischs von Antikörpern vorliegen, oder sie können als einer oder mehrere monoklonale Antikörper vorliegen. Im allgemeinen ist nur ein kleines Volumen an Antikörper erforderlich, und es wird bei Bedingungen hinsichtlich pH-Wert, Ionenstärke und Temperatur gehalten, die für seine Aktivität geeignet sind.
  • Antikörper gegen die folgende nicht-erschöpfende Liste von Substanzen können sinnvoll in Immunoassays unter Verwendung der Lumineszenzreaktion der vorliegenden Anmeldung eingesetzt werden: Proteine, wie Insulin, α-Fetoprotein und Ferritin, Hormone, wie Wachstumshormon, Parathyroidhormon, Follikelstimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon, Tyroidstimulierendes Hormon, adrenocorticotrophes Hormon, Glucagon, Prolactin und Calcitonin, Haptene/Steroide, wie Estriol, Progesteron und Cortisol, Arzneistoffe, wie Digoxin, Antigene, wie Zelloberflächenantigene und carcino-embryonale Antigene und Antikörper, wie Mumpsvirus-Antikörper, menschliches Immunglobulin G (IgG), Kaninchen-IgG, Schaf-IgG, Meerschweinchen-IgG, Affen-IgG und menschliche Immunoglobuline E und M.
  • Fig. 11 zeigt eine erfindungsgemäße Chemolumineszenzvorrichtung. Die Vorrichtung 10 weist zwei Kammern 12 und 14 auf, die durch eine Ventileinrichtung oder eine Membran 16 voneinander getrennt sind. Die Kammern 12 und 14 enthalten jeweils einen, aber nicht alle der Chemolumineszenz-Reaktanten, d. h., Chemolumineszenzvorstufe, Oxidationsmittel und Enzym. Ein gepuffertes Amin ist in einer oder in beiden Kammern 12 und 14 enthalten. Ein typisches Gefäß enthält z. B. eine Chemolumineszenzvorstufe in Kammer 12 und ein Oxidationsmittel, Enzym und gepuffertes Amin in Kammer 14. Eine Ventileinrichtung 16 steuert den Fluß von Chemolumineszenzvorstufe aus Kammer 12 in Kammer 14 unter dem Einfluß der Schwerkraft. Licht wird emittiert, wenn der Fluß beginnt. Um die Emission von Licht zu beenden, wird die Ventileinrichtung 16 geschlossen, um den Fluß von Chemolumineszenzvorstufe zu unterbrechen.
  • Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben.
    • Beispiele Beispiel 1 Herstellung von Liganden-gebundener Sonden-DNA
  • Obwohl die nachstehende Methode anhand einer spezifischen Nucleinsäure verdeutlicht wird, kann sie für eine beliebige DNA-Sonde verwendet werden. In der Literatur sind verschiedene weitere Methoden zur Markierung (z. B. Nick- Translation) von Nucleinsäuresonden bekannt. Eine allgemeine Methode zur Markierung von Nucleinsäuren, also auch einer Probe, ist nachstehend beschrieben: Nucleinsäure + photoreaktiver Interkalator Licht kovalenter Komplex chemische Reaktion mit reaktivem Liganden mit Liganden markierte Nucleinsäure
  • Vorstehend wurden folgende Bestandteile eingesetzt:
  • a) eine Adenovirus-DNA- oder pBR322-Sonde (im Handel erhältliche Plasmid-DNA-Sonde der Firma ENZO Biochem, New York und BRL - Bethesda Research Laboratory, Maryland).
  • b) Bei dem photoreaktiven Interkalator handelte es sich um ein Aminomethylangelicin.
  • c) Bei dem reaktiven Liganden handelte es sich um N- Hydroxysuccinimido-Biotin.
  • Die Sonde wurde zuerst photochemisch mit dem Interkalator umgesetzt. Der Interkalator wurde dann mit einem reaktiven Rest des Biotins umgesetzt. Die Reihenfolge kann verändert werden, so daß zuerst die Biotinreste mit dem photoreaktiven Interkalator umgesetzt werden und anschließend das Produkt photochemisch mit der Sonde umgesetzt wird.
  • 50 ug DNA-Sonde wurden in 0,500 ml Boratpuffer (,10 millimolar, pH-Wert: 8,2) aufgelöst, und zu der Lösung wurden 5 ul (5 ug) Aminomethylangelicin (1 mg/ml in H&sub2;O) gegeben. Die Lösung wurde 30 Minuten bei 346 nm bestrahlt. Die umgesetzte Nucleinsäure wurde durch Ausfällen mit Ethanol gereinigt. Die -NH&sub2;-Gruppe des gebundenen Angelicins war reaktiv und konnte mit dem N-Hydroxysuccinimid-Derivat von Biotin (NHS-Biotin) modifiziert werden. Dies geschah durch Auflösen der mit Aminomethylangelicin gekuppelten Nucleinsäure (1 mg/ml) in einem Boratpuffer (10 millimolar, pH-Wert: 8,2) und Zugabe des 10-fachen molaren Überschusses an NHS-Biotin (gelöst in DMF, 10 mg/ml). Das Gemisch wurde 8 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die resultierende biotinylierte DNA wurde durch Dialyse gegen Phosphatpuffer (10 millimolar NaH&sub2;PO&sub4;, 10 millimolar Na&sub2;HPO&sub4;, 1 millimolar EDTA, pH-Wert: 7,5) gereinigt. Die resultierende biotinylierte Sonde war fertig für die Hybridisierung.
    • Beispiel 2: Dot-blot-Assay für DNA
  • 100 ng bis 1 pg photochemisch biotinylierte DNA wurden auf Nitrocellulose-Papier (BioRad, Richmond, Kalifornien, USA) aufgetragen, in einem Trockenschrank 2 Stunden bei 80ºC erwärmt und durch 20-minütiges Eintauchen des Papiers in 3 %ige BSA-Lösung (Rinderserumalbumin) bei 42ºC mit BSA gesättigt. Überschüssiges BSA wurde entfernt, indem das Papier dem Behälter entnommen und zwischen zwei Stücken Filterpapier abgetupft wurde. Das Papier wurde dann 20 Minuten mit einer Streptavidin enthaltenden Lösung (0,25 mg/ml, 3,0 ml Gesamtvolumen) bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde anschließend dreimal mit einem Puffer, der 0,1 m Tris, pH-Wert: 7,5, 0,1 m NaCl, 2 millimolar MgCl&sub2; und 0,05 % Triton X enthielt, gewaschen. Es wurde 15 Minuten mit biotinylierter Meerrettich-Peroxidase (0,10 mg/ml) bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde dreimal mit Tris (0,1 m, pH-Wert: 7,5), 0,1 m NaCl, 2 millimolar MgCl&sub2; und 0,05 % Triton X-100 gewaschen. Die Flecken wurden ausgestanzt, und die DNA enthaltenden Scheiben wurden in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, die an der Seite schwarz angestrichen worden waren, angeordnet. Nachdem die ausgestanzten Papierkreise in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte angeordnet worden waren, wurden 0,8 ml eines Puffers, der 40 millimolar Tris und 40 millimolar Ammoniumacetat (pH-Wert: 8,1) enthielt, in jede der Vertiefungen gegeben. Anschließend wurden 10 jl eines 1 : 1 (Vol./Vol.)-Gemischs von 39 millimolar Luminol in DMF und 30 millimolar H&sub2;O&sub2; in Wasser zugegeben, und es wurde eine photographische Aufnahme des emittierten Lichtes gemacht. Nachdem das Licht abgenommen hatte, wurde weiteres Gemisch aus H&sub2;O&sub2; und Luminol zugegeben. Die Reaktion dauerte 3 Tage mit einer ungefähren Abnahme der Enzymaktivität von 50%.
    • Beispiel 3: Hybridisierung der biotinylierten Sonde und Nachweis durch Chemolumineszenzreaktion
  • Lösungen:
  • A. Tris-HCl-Puffer (1 m; pH-Wert: 7,5)
  • B. 0,5 m NaOH-Lösung
  • C. Tris-HCl (0,5 m; pH-Wert: 7,5)
  • D. 3 m NaCl
  • E. SSCx20 : 175 g NaCl
  • 88 g Na-citrat
  • Wasser auf 1 Liter
  • pH-Wert mit HCl auf 7,0 eingestellt.
  • Diese Lösung wurde mit Wasser verdünnt, um verschiedene SSC-Konzentrationen zu erhalten.
  • F. Prähybridisierungslösung:
  • 45 % Formamid
  • 50 millimolar Na-Phosphat-Puffer, pH-Wert: 6,5 5xSSC
  • 5x Denhardt-Lösung
  • 200 ug/ml einzelsträngige DNA in Wasser
  • G. Hybridisierungslösung:
  • 45 % Formamid
  • 20 millimolar Na-Phosphat-Puffer, pH-Wert: 6,5 5xSSC
  • 5x Denhardt - Lösung
  • 100 ug/ml einzelsträngige DNA in Wasser.
  • Methode:
  • 1 ug bis 1 pg Proben-DNA und Kontroll-DNA (die mit der Sonde nicht hybridisieren sollte) wurden auf Nitrocellulose-Papier aufgetragen. Die DNA-Proben wurden denaturiert, indem das Papier 7 Minuten mit 3 MM Whatman-Cellulosepapier (das in 0,5 m NaOH-Lösung getränkt und damit gesättigt worden war) in Kontakt gebracht wurde. Anschließend wurde das Nitrocellulose-Papier mit einem weiteren nassen 3MM-Papier (das mit Lösung A zur Neutralisierung getränkt worden war, in Kontakt gebracht. Das Papier war nach 2 Minuten getrocknet. Die Neutralisierung und das Trocknen unter Vakuum wurden dreimal wiederholt.
  • Das die immobilisierte, denaturierte DNA enthaltende Nitrocellulose-Papier wurde anschließend 5 Minuten in Kontakt mit einem 3MM-Papier gebracht, das mit den Lösungen C und D getränkt und gesättigt worden war. Das Papier wurde dann 2 Stunden unter Vakuum auf 80ºC erwärmt. Das Filter wurde anschließend in einen Kunststoffbeutel, der 10 ml der Lösung F enthielt, gebracht. Der Beutel wurde 2 Stunden bei 42ºC in einem Wasserbad inkubiert. Nach der Prähybridisierung wurde das Papier entnommen und in einen anderen Beutel, der 10 ml der Lösung G und 1 ug markierte, denaturierte Sonde (Produkt aus Beispiel 1) enthielt, gebracht. Die Hybridisierung wurde 16 Stunden bei 42ºC durchgeführt.
  • Das Nitrocellulose-Papier wurde anschließend mit folgenden Lösungen in der angegebenen Reihenfolge gewaschen:
  • a. Mit 250 ml 1xSSC + 0,1 % SDS: 2mal Waschen, 3 Minuten bei Raumtemperatur.
  • b. Mit 250 ml 0,2xSSC und 0,1 % SDS, 2mal Waschen, 3 Minuten bei Raumtemperatur.
  • c. Mit 250 ml 0,16xSSC + 0,1 % SDS: 2mal Waschen, 15 Minuten bei 50ºC.
  • d. Mit 50 ml 2xSSC + 0,1 % SDS: 1mal Waschen, 1 Minute bei Raumtemperatur.
  • Die Hybride wurden dann durch eine Chemolumineszenzreaktion wie folgt nachgewiesen: Die Filter mit den Hybriden wurden durch 20-minütiges Eintauchen in eine 3%-ige BSA-Lösung (Rinderserumalbumin) von 42ºC mit BSA gesättigt. Überschüssiges BSA wurde entfernt, indem das Papier dem Behälter entnommen und zwischen zwei Stücken Filterpapier abgetupft wurde. Das Papier wurde in einer Streptavidin enthaltenden Lösung (0,25 mg/ml, 3,0 ml Gesamtvolumen) 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde anschließend 3mal mit einem Puffer gewaschen, der 0,1 m Tris, pH-Wert: 7,5, 0,1 m NaCl, 2 millimolar MgCl&sub2; und 0,05 % Triton X enthielt. Sodann wurde das Filter 15 Minuten mit biotinylierter Meerrettich-Peroxidase (0,10 mg/ml) bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde 3mal mit Tris (0,1 m, pH-Wert: 7,5), 0,1 m NaCl, 2 millimolar MgCl&sub2; und 0,05 % Triton X-100 und 1mal mit 10 millimolar Tris-Puffer (pH-Wert: 8,0) gewaschen. Die Flecken wurden ausgestanzt, und die DNA enthaltenden Scheiben wurden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, deren Seiten schwarz angestrichen worden waren, angeordnet. Nachdem die ausgestanzten Papierkreise in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte angeordnet worden waren, wurde 0,8 ml eines Puffers, der 40 millimolar Tris und 40 millimolar Ammoniumacetat (pH-Wert: 8,1) enthielt, in jede Vertiefung gegeben. Anschließend wurden 10 ul eines 1 : 1-Gemischs von 39 millimolar Luminol (in DMF) und 30 millimolar H&sub2;O&sub2; (in Wasser) zugegeben. Die Lichtemission wurde mit einem POLAROID-Sofortbildfilm aufgenommen, indem der Film direkt in der Filmhalterung belichtet wurde.
  • In einem dunklen Raum wurden die Licht-emittierenden Papiere miteinander in Kontakt gebracht. Das nasse Papier wurde in eine durchsichtige Kunststoffolie, z. B. "SARAN-WRAP" eingewickelt, und direkt auf den offenen Film (dessen Abdeckung unter Verwendung einer Filmhalterung abgezogen worden war) gelegt. Nachdem sie belichtet worden waren, wurde die Abdeckung ersetzt, und der Film wurde durch Herausziehen entwickelt und verarbeitet.
    • Beispiel 4: Herstellung einer Enzym-markierten Sonde und Chemolumineszenznachweis von Nucleinsäurehybriden
  • Wie von Renz et al. in Nucleic Acids Res., Bd. 12, S. 3435 (1984) beschrieben worden ist, wird eine Nucleinsäuresonde chemisch mit Meerrettich-Peroxidase verknüpft und mit einer immobilisierten Probe (Beispiel 3) hybridisiert. Das Verfahren und die Bedingungen der Hybridisierung sind mit dem veröffentlichten Verfahren in N.A.R., Bd. 12, S. 3435 (1984) identisch. Nach der Hybridisierung wird das Papier mit Tris- Puffer (10 millimolar, pH-Wert: 8,0) gewaschen. Die Flecken werden ausgestanzt und wie in Beispiel 3 beschrieben nachgewiesen. Eine BSA-Blockierung nach der Hybridisierung ist nicht erforderlich, wenn eine Enzym-markierte Sonde verwendet wird.
    • Beispiel 5: Herstellung eines photoreaktiven Isoluminol- Derivats und Hybridisierung
  • Schema:
  • 100 mg 4'-Aminomethyl-4,5'-dimethylangelicin (1) und 0,4 g Bernsteinsäureanhydrid werden in wasserfreiem Pyridin (5 ml) 24 Stunden geschüttelt. Das Pyridin wird abgedampft, der Rückstand mit Methanol behandelt und das Produkt wird zu einer gummiartigen Masse eingeengt. Der Festkörper wird in 10 ml Dimethylformamid (DMF) gegeben, und 0,2 g Dicyclohexylcarbodiimid und 0,4 g N-Hydroxysuccinimid werden zugegeben. Die Reaktion wird 24 Stunden lang durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird auf -20ºC abgekühlt, um Dicyclohexylharnstoff auszufällen, der durch Zentrifugation entfernt wird. Das resultierende Produkt wird dreimal mit einem molaren Überschuß an AHEI (6) in DMF umgesetzt. Die Reaktion wird durch 12-stündiges Inkubieren des Gemischs bei Raumtemperatur durchgeführt. Das DMF wird anschließend unter vermindertem Druck abgedampft. Der resultierende Feststoff kann ohne weitere Reinigung verwendet werden. Der Feststoff wird in 10 ml DMA gelöst, und 1,0 ul dieser Lösung werden zu 1 ml zu markierender Sonde (50 ug) gegeben. Die Bestrahlung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt. Anschließend wird wie in Beispiel 3 hybridisiert.
  • Nach der Hybridisierung werden die Flecken getrennt in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte angeordnet. 1 ul (0,1 mg/ml) Meerrettich-Peroxidase, 1 ml Tris-Ammonium-Puffer (40 millimolar Tris und 40 millimolar Ammonium) und 0,5 ml 5 millimolar H&sub2;O&sub2; werden zugegeben. Die Lichtemission wird durch Belichten eines POLAROID-Films aufgezeichnet.
    • Beispiel 6: Oligonucleotidnachweis nach Hybridisierung
  • Dieses Beispiel ist in vier Teile unterteilt:
  • 6a. Synthese eines ein Amin enthaltenden Oligonucleotids.
  • 6b. Umsetzung des Produkts aus 6a mit N- Hydroxysuccinimido-Biotin.
  • 6c. Reinigung des Produkts aus 6b.
  • 6d. Hybridisierung und Nachweis von Oligonucleotiden durch Chemolumineszenz. Beispiel 6a: Synthese eines reaktiven, ein Amin enthaltenden Oligonucleotids
  • Schema für die Synthese von 1, das an 19A' am 5'-Ende addiert werden soll.
  • Die Synthese von 1 ist im vorstehenden Schema dargestellt.
  • 5-Chlormercuri-2'-desoxyuridin (5), das gemäß der Methode von D.E. Berstrom und J.L. Ruth, J. Carbohydrates, Nucleosids, and Nucleotides, Bd. 4, S. 257 (1977) hergestellt worden war, wurden mit 3-Trifluoracetamido-1-propen (7) (M. Paileand, W.J. Hubsch, Monatshefte für Chemie, Bd. 97, S. 99 (1966)) und K&sub2;PdCl&sub4; in Methanol behandelt, wobei man 5- Trifluoracetamidoallyl-2'-desoxyuridin (8) in 22%-iger Ausbeute nach zweifacher chromatographischer Reinigung und Umkristallisation aus Methanol erhielt. Die Umsetzung von (8) mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid in Pyridin ergab (9) in 85 %iger Ausbeute nach Flash-Chromatographie (W.C. Still, M. Kahn, A. Mitra, J. Org. Chem., Bd. 43, S. 2923 (1978)), das anschließend mit N, N-Diisopropylaminomethoxychlorphosphin (L.J. McBride und M.H. Caruthers, Tet. Letters, Bd. 24, S. 245 (1983)) (10) behandelt wurde, wobei man (1) als weißen Feststoff nach Ausfällen aus Pentan erhielt. Das 19 Einheiten umfassende Oligonucleotid HB19A':
  • 3'-GA-GGA-CXC-CTC-TTC-AGA-CG-5'
  • wurde unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten hergestellt. Drei getrennte, 1 uMol jedes Oligonucleotids umfassende Ansätze wurden durchgeführt, und jedes Oligonucleotid wurde an einen festen Träger gebunden und mit einer Dimethoxytritylgruppe vollständig geschützt. Die Dimethoxytritylschutzgruppe wurde vom 5'-Ende entfernt, und (1) wurde an die 19 Einheiten umfassende Kette gebunden, und zwar ohne den DNA-Syntheseautomaten, aber unter Verwendung der gleichen Reagenzien und Bedingungen, die in der Maschine (Syntheseautomat) typischerweise angewandt werden.
  • Nach der Entfernung des Trägers ergibt sich als Produkt dieses Verfahrens ein Oligonucleotid mit einer 5'- (Aminoallyl)-5'-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin- Einheit am C-5'-Ende:
  • Die Tritylgruppe der Produktpolynucleotide wurde schließlich entfernt, indem sie kurz einer 3 %-igen Trichloressigsäurelösung ausgesetzt wurden, und anschließend wurden sie durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt.
  • Das Polynucleotid HB19A' ist ein Einheitspolynucleotid, das einem Abschnitt der menschlichen DNA, die für das Polypeptid ß-Hämoglobin codiert, und zwar speziell der Region der DNA entspricht, in der die Mutation liegt, die sich durch die Bildung von Sichelzellen-Hämoglobin und die als Sichelzellenanämie bekannte Erbkrankheit manifestiert.
  • Infrarotspektren (IR) wurden von Lösungen in CHCl&sub3; erhalten, falls nichts anderes angegeben ist. Die Bande bei 1602 cm&supmin;¹ eines Polystyrolfilms wurde als externer Standard zur Kalibration verwendet.
  • Protonenmagnetische Resonanzspektren (¹H-NMR) wurden in CDCl&sub3;-Lösungen erhalten, wenn nichts anderes angegeben ist. Chemische Verschiebungen werden in ppm in Tieffeldrichtung vom internen Standard Tetramethylsilan aus aufgeführt, falls nichts anderes angegeben ist.
  • Kohlenstoff-13 magnetische Resonanzspektren (¹³C-NMR) wurden in CDCl&sub3;-Lösungen erhalten, falls nichts anderes angegeben ist. Die Kohlenstoffverschiebungen sind in ppm in Tieffeldrichtung vom internen Standard Tetramethylsilan aus aufgeführt, falls nichts anderes angegeben ist.
  • Phosphor-31 magnetische Resonanzspektren (³¹P-NMR) wurden in CDCl&sub3;-Lösungen erhalten, falls nichts anderes angegeben ist. Die Phosphorverschiebungen sind in ppm in Tieffeldrichtung vom externen Standard (wäßrige 15 %-ige H&sub3;PO&sub4;-Lösung) aus angegeben.
  • Die Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde unter Verwendung von Kieselgelplatten der Bezeichnung 60F-254 der Firma E. Merck durchgeführt. Die Säulenchromatographie wurde unter Verwendung von Kieselgel der Bezeichnung 60 (70-230 mesh) der Firma E. Merck durchgeführt.
    • 5-Trifluoracetamidoallyl-2'-desoxyuridin (8)
  • Eine Suspension von 5-Chlormercuri-2'-desoxyuridin (5) (Bergstrom und Ruth, a.a.O.) (5,56 g, 12 mMol) in Methanol (120 ml) von HPLC-Reinheit (Hochleistungsflüssigchromatographie) wurde in einer Inertgasatmosphäre bei Umgebungstemperatur gehalten und mit 3-Trifluoracetamido-1-propen (7) (Pailer und Hubsch, a.a.O.) (7,33 g; 48 mMol; 4 Äquivalente) und K&sub2;PdCl&sub4; (4,28 g, 1,1 Äquivalente) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde allmählich schwarz. Es wurde 22 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde mehrere Minuten mit H&sub2;S-Gas behandelt, anschließend über Celite filtriert, mit Methanol gespült und unter vermindertem Druck auf einem Bad von 80ºC zur Trockene eingedampft, wobei man einen rohen, halbfesten Rückstand (7,0 g) erhielt. Der Rückstand wurde einer Chromatographie an einer Kieselgel- Säule unterworfen und mit CH&sub2;Cl&sub2;:MeOH (5 : 1) entwickelt. Die Bande, die nach Anfärben mit einem modifizierten p- Anisaldehydreagenz (Egon Stahl, Thin Layer Chromatography, 2. Auflage, Springer-Verlag, N.Y., S. 857 (1969)) eine blaue Farbe zeigte und einen Rf-Wert = 0,51 (CH&sub3;CN: MeOH 3 : 1) aufwies, wurde aufgefangen und im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei man eine farblose Form erhielt. Das Produkt wurde aus einer minimalen Menge an Methanol kristallisiert, filtriert, mit kaltem CHCl&sub3;:MeOH (3 : 1) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Mutterlauge wurde aufgearbeitet, wobei man eine zweite Gesamtausbeute von 1,01 g (22 %) erhielt. Nach Umkristallisieren aus MeOH erhielt man die Titelverbindung (8) als analytisch reine, dünne, weiße Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 183 bis 184ºC nach Trocknen im Vakuum (< 1,0 Torr) bei 64ºC über Nacht.
  • IR (KBr) cm&supmin;¹ 3420, 3260, 1718, 1683 (br) , 1560, 1478, 1283, 1190, 1102, 1061, 980, 788, 763, 737; ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) (Ref. DMSO-d&sub6;) &delta; 2,13 (d von d, J = 6 Hz, 2 H), 3,59 (br s, 2 H), 3,70-3,97 (m, 3 H), 4,25 (br s, 1 H), 5,06 (br m, 1 H), 5,20 (br m, 1 H), 6,05-6,65 (m&sub6;, 4 H), 8,01 (s, 1 H), 9,60 (br s, 1 H); ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;) (Ref. DMSO-d&sub6;) ppm 162,05, 155,29, 149,50, 138,05, 124,33, 124,14, 109,96, 87,53, 84,47, 70,23, 61,12, 39,93; (&alpha;)D = + 8,01º (c = 0,87, MeOH)
  • Elementaranalyse für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub6;N&sub3;O&sub6;F&sub3;:
  • berechnet: C 44,33; H 4,25; N 11,08;
  • gefunden: C 44,19; H 4,10; N 10,93.
    • 5-Trifluoracetamidoallyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'- desoxyuridin (9)
  • Eine Lösung von 8 (0,60 g; 1,58 mMol) in wasserfreiem Pyridin (8 ml) wurde unter einer Inertgasatmosphäre gehalten und bei Umgebungstemperatur mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid, 0,67 g; 1,25 Äquivalente) behandelt. Nach 18-stündigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch in Eiswasser (70 ml) unter heftigem Schütteln gegossen. Nach 20-minütigem Stehen bei 0ºC wurde ein gummiartiger Feststoff abgetrennt, wobei eine nahezu klare Lösung zurückblieb, die dekantiert wurde. Der Festkörper wurde einmal mit H&sub2;O (5 ml) gewaschen, anschließend in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) aufgenommen, einmal mit Kochsalzlösung (5 ml) gewaschen, dann wurde die CH&sub2;Cl&sub2;-Lösung über K&sub2;CO&sub3; getrocknet, filtriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei man einen bräunlichen Schaum erhielt. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie (Still et al., a.a.O.) auf einer Kieselgelsäule (Merck, Grade 60, 230-400 mesh, 60A) (75 g), die mit 4,0 % MeOH in CHCl&sub3;-Lösungsmittel (1,0 Liter) entwickelt wurde, gereinigt. Fraktionen von jeweils ca. 20 ml wurden in Reagenzgläsern, die Pyridin (10 ul) enthielten, um das Abspalten der Schutzgruppe von der 5'- Hydroxylgruppe zu hemmen, aufgefangen. Fraktionen, die die Bande des Hauptprodukts aufwiesen (Rf = 0,29; MeOH:CHCl&sub3; 7,93) wurden vereinigt, filtriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei man (9) (0,91 g; 85 %) als leicht gelblichen Schaum erhielt. Eine Fraktion aus der Mitte der Elutionsbande wurde vom Lösungsmittel befreit, in Ethylacetat (EtOAc) aufgenommen, mit "NORIT 211" (vertrieben von der Firma General Norit Co.) behandelt, über "CELITE" (eine analytische Filtrierhilfe, die von der Firma Chem Alert vertrieben wird) filtriert und unter Hochvakuum (< 1,0 Torr) bei 64ºC über Nacht zur Trockene eingedampft, wobei man eine analytische Probe als farblosen Schaum mit einem Schmelzpunkt von 105-110ºC (Zersetzung) erhielt.
  • IR (CHCl&sub3;) cm&supmin;¹ 3370, 2920, 1715, 1695, 1618, 1515, 1470, 1260, 1182, 1045, 842; ¹H-NMR (CDCl&sub3;) &delta; 2,38 (br m, 2 H), 3,25-3,75 (m, 5 H), 3,75 (s, 6 H), 4,10 (br m, 1 H), 4,60 (br s, 1 H), 5,39 (d, J = 16 Hz, 1 H), 6,10-6,55 (m, 2 H), 6,70- 6,95 (m, 5 H), 7,15-7,45 (m, 10 H), 7,84 (s, 1H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) (Ref. CDCl&sub3;) ppm 162,31, 158,74, 157,70, 156,01, 149,70, 144,04, 137,88, 135,65, 135,52, 130,12, 128,11, 127,26, 125,05, 113,48, 111,33, 86,94, 86,68, 85,25, 72,18, 63,60, 55,34, 42,66, 41,42.
  • Elementaranalyse für C&sub3;&sub5;H&sub3;&sub4;N&sub3;O&sub8;F&sub3;:
  • berechnet: C 61,67; H 5,03; N 6,16
  • gefunden: C 61,47; H 5,19; N 5,95.
    • 5-Trifluoracetamidoallyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'- desoxyuridin-3'-O-(N,N-diisopropylaminomethoxyphosphin) (1)
  • Eine Lösung von (9) (0,34 g; 0,5 mMol) in wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; (1,5 ml), die unter einer Argonatmosphäre bei Umgebungstemperatur gehalten wurde, wurde zuerst mit wasserfreiem Diisopropylethylamin (0,35 ml; 0,259 g, 2 mMol; 4 Äquivalente) behandelt und anschließend tropfenweise während 1 Minute mit N, N-Diisopropylaminomethoxychlorphosphin (vgl. McBride et al., a.a.O) (10) (0,19 ml; ca. 0,2 g; 2,2 Äquivalente) versetzt. Die resultierende farblose Lösung wurde 20 Minuten gerührt und anschließend mit EtOAc (20 ml) versetzt. Die EtOAc-Lösung wurde mit gesättigter wäßriger NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen, in einen Scheidetrichter überführt, viermal mit Kochsalzlösung (jeweils 35 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei man ein farbloses Glas (0,51 g) erhielt. Dieses Rohprodukt wurde in wasserfreiem Benzol (2 ml) aufgenommen und zur Ausfällung in schnell gerührtes, wasserfreies Pentan (60 ml) bei -78ºC in einer Argonatmosphäre gegeben. Die resultierende Suspension wurde filtriert, mit -78ºC kaltem Pentan gewaschen und im Vakuum bei < 1 Torr über KOH über Nacht getrocknet, wobei man die Titelverbindung (1) (0,38 g; 93 %) als weißes amorphes Pulver erhielt.
  • IR (CHCl&sub3;) cm&supmin;¹ 2965, 1722, 1698, 1618, 1518, 1470, 1262, 1185, 1045, 988, 842; ¹H-NMR (CD&sub2;Cl&sub2;) &delta; 0,95-1,30 (m, 12 H), 2,20-2,60 (m, 2 H), 3,24 und 3,37 (d von d, J = 13 Hz, 3 H) (P-O-CH&sub3;), 3,20-3,80 (m, 6 H), 3,75 (s, 6 H), 4,17 (br m, 1 H), 4,68 (v br m, 1 H), 5,42 (d, J = 16 Hz, 1 H), 6,15-6,55 (m, 3 H), 6,75-6,95 (m, 4 H), 7,20-7,50 (m, 10 H), 7,79 (s, 1 H); ¹³C-NMR (CD&sub2;Cl&sub2;) (Ref. CD&sub2;Cl&sub2;) ppm 162,40, 159,21, 157,78, 149,78, 144,71, 138,34, 136,00, 130,53, 128,71, 128,45, 127,54, 125,66, 125,27, 113,82, 111,48, 87,23, 86,31, 85,60, 55,75, 43,78, 43,20, 42,94, 24,99, 24,60; ³¹P-NMR (CD&sub2;Cl&sub2;) ppm 149,30, 148,87, 14,11 (ungefähr 12% Verunreinigung), 8,18 (ungefähr 4 % Verunreinigung).
    • Bindung von (1) an Oligonucleotide
  • Die 19 Einheiten umfassenden Oligonucleotide wurden unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten der Bezeichnung Applied Bio-systems Modell 380A auf einem festen Glasträger mit kontrollierten Poren synthetisiert. Unmittelbar vor der Bindung von (1) an das 5'-Ende des Oligomeren wurde die 5'-O- (4,4'-Dimethoxytrityl)-Schutzgruppe in der Maschine mit 3 % CCl&sub3;CO&sub2;H in CH&sub2;Cl&sub2; in 90 Sekunden abgespalten. Das trägergebundene 5'-ungeschützte Oligomere wurde mit CH&sub3;OH gewaschen und in einem Argonstrom getrocknet. Nachfolgende Stufen wurden ohne die Maschine (Syntheseautomat) durchgeführt, aber unter Anwendung der gleichen Chemie.
  • 1. Das trägergebundene Oligomere wurde aus dem für die automatische Synthese verwendeten Behälter (Säule) entnommen und in ein trockenes, mit einem Septum versehenes Glasfläschchen unter Argon-Atmosphäre überführt.
  • 2. Das gebundene Oligomere wurde mit einem 20- bis 30-fachen Überschuß an 0,5 m 1H-Tetrazol in wasserfreiem CH&sub3;CN behandelt. Es wurde 30 Minuten unter leichtem Schütteln inkubiert.
  • 3. Die Reagenzien wurden abpipettiert, und das gebundene Oligomere wurde mit drei Portionen CH&sub3;CN gewaschen.
  • 4. Der feste, das gebundene Oligomere enthaltende Träger wurde mit einem Überschuß an I&sub2;H&sub2;O-Lutidin-THF (0,1 m : 1:10 : 40) behandelt und 15 Minuten geschüttelt.
  • 5. Die Reagenzien wurden abpipettiert, und das gebundene Oligomere wurde mit vier Portionen CH&sub3;CN gewaschen.
  • 6. Der feste, das gebundene Oligomere enthaltende Träger wurde mit einem Überschuß an Thiophenol-Triethylamin- Dioxan 60 Minuten gewaschen.
  • 7. Die Reagenzien wurden abpipettiert, und das gebundene Oligomere wurde mit vier Portionen MeOH gewaschen.
  • 8. Der feste, das gebundene Oligomere enthaltende Träger wurde mit konzentrierter wäßriger NH&sub4;OH-Lösung 2 Stunden bei Umgebungstemperatur behandelt (dies entfernt das geschützte Oligonucleotid vom Träger).
  • 9. Um alle Schutzgruppen zu entfernen, wurde das Oligonucleotid mit konzentriert er wäßriger NH&sub4;OH-Lösung behandelt und über Nacht auf 50ºC erwärmt (dies entfernt alle Schutzgruppen, mit Ausnahme der Dimethoxytritylgruppe).
  • 10. Der Träger wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft, wobei man das rohe Oligonucleotid erhielt.
  • Die vorstehenden zehn Stufen wurden für alle Ansätze mit trägergebundenen Oligonucleotiden wiederholt. Die Behandlung eines Teils jedes Ansatzes auf einer Kieselgel-TLC-Platte mit 3% CCl&sub3;CO&sub2;H in CH&sub2;Cl&sub2; führte zur orangeroten Farbe des Dimethoxytrityl-Kations, was die erfolgreiche Einverleibung von (1) in die Oligonucleotide anzeigt.
  • Bei einem Ansatz für modifiziertes HB19A'-Oligonucleotid wurde die Tritylgruppe mit 3 % CCl&sub3;CO&sub2;H in CH&sub2;Cl&sub2; entfernt, und das Produkt wurde durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel gereinigt.
    • Beispiel 6b: Die Umsetzung eines spezifischen Oligonucleotids mit N-Rydroxysuccinimido-Biotin (NHS-Biotin)
  • 2 ug 19A'-Amin oder 19S'-Amin aus Beispiel 6a wurden in 20 ul 10 millimolarem Boratpuffer vom pH-Wert 8,16 gelöst. Dazu wurden 5 ul einer frisch hergestellten DMF-Lösung von N- Hydroxysuccinimido-Biotin (10 mg/ml), das von Pierce bezogen worden war, gegeben. Man ließ die Reaktion 16 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen. Nach der Reaktion wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft.
    • Beispiel 6c: Die Abtrennung des mit NES-Biotin umgesetzten 19A' vom Reaktionsgemisch
  • Die HPLC-Trennung wird über eine Säule der Bezeichnung Brownlee RP300 guard column, die mit einer Säule der Bezeichnung Synchropack RPP 4,1 · 10 cm (Synchrom; Linden, Indiana) gekoppelt ist, bei Umgebungstemperatur mit einem Gradienten von 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH-Wert 7,0, bis 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH-Wert 7, durchgeführt. 50% Acetonitril läßt man je nach Probe 10 bis 120 Minuten über die Säule laufen. Der Detektor wird auf 254 nm eingestellt, und der Vollausschlag ist 0,15 Absorptionseinheiten. Um den Ort des derivatisierten Oligonucleotidprodukts zu bestimmen, wird ein Leeransatz mit dem Reaktionsgemisch ohne das Oligonucleotid durchgeführt. Eine neue Bande tritt nach Zugabe des Oligonucleotids auf, und sie entspricht dem Reaktionsprodukt. Das Produkt wird getrennt und mit einem Fraktionssammler aufgefangen. Das Produkt wird durch Gelelektrophorese analysiert, und beim nächsten Ansatz wird festgestellt, daß eine analytische Bestimmung der richtigen Bande nicht erforderlich ist. Das Oligonucleotid wird dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.
    • Beispiel 6d: Rybridisierung und Nachweis eines hybridisierten Oligonucleotids
  • Zu Demonstrationszwecken wird gereinigte Blut-DNA auf Nitrocellulose-Papier immobilisiert, wie in Beispiel 3 prähybridisiert, mit dem biotinylierten Oligonucleotidprodukt aus Beispiel 6c unter den von Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80, S. 278 (1983) beschriebenen Bedingungen hybridisiert und durch eine Chemolumineszenzmethode wie in Beispiel 2 nachgewiesen.
    • Beispiel 7:
  • Die Beispiele 2, 3, 5 und 6 wurden unter Verwendung anderer Puffer anstelle von Tris + Ammonium wiederholt. Derartige andere Puffer wiesen folgende Bestandteile auf:
  • (i) 40 millimolar Tris + 40 millimolar Imidazol, pH-Wert: 8,1
  • (ii) 40 millimolar Tris + 10 millimolar Pyridin, pH-Wert: 8,1
  • (iii) 40 millimolar Tris + 10 millimolar Spermin, pH-Wert: 8,1.
  • Bessere Ergebnisse wurden mit Ammonium erzielt. Alle diese stickstoffhaltigen Verbindungen in den Puffern (i), (ii) und (iii) waren jedoch wirksam bei der Verzögerung der Chemolumineszenzemission und hielten das Enzym für eine lange Zeitspanne in der aktiven Form, verstärkten also die Emission.
    • Beispiel 8: Assay für anti-Röteln-IgG
  • Wie von Thorpe et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 119, S. 481 (1984)) beschrieben wurde, wird ein Rubazyme-Kit (Abbot Diagnostic) für diesen Assay verwendet. Polystyrolkügelchen werden mit dem Rötelnvirus überzogen. Die Probe wird dann mit den mit dem Virus überzogenen Kügelchen in einem Puffer (10 millimolar Tris (pH-Wert: 7,5)) inkubiert. Die nicht umgesetzten Testbestandteile werden durch Abtrennen und Waschen der Kügelchen entfernt.
  • Die Kügelchen werden dann mit einem anti-Human-IgG (Ziege) /Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (IgG-HRP) umgesetzt. Nach Entfernen von etwaigem nicht-umgesetztem IgG-HRP werden die Kügelchen in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte angeordnet. Ausreichend Puffer (ungefähr 1 ml) aus 40 millimolar Tris + 40 millimolar Ammoniumacetat (pH-Wert 8,1) wird zugegeben, um die Kügelchen zu bedecken. 40 ul eines 1 : 1 (Vol./Vol.)-Gemischs von 3 millimolar Luminol (in DMF) und 30 millimolar H&sub2;O&sub2; (in H&sub2;O) werden zugegeben. Die Lichtemission wird durch Belichten eines POLAROID-Sofortbildfilms wie in Beispiel 3 aufgezeichnet.
    • Beispiel 9: Synergistische Wirkung von Ammonium und Luciferin in einer von Meerrettich-Peroxidase vermittelten Chemolumineszenzreaktion
  • Die Lichtemission wurde unter Verwendung eines Spektralfluorimeters der Bezeichnung SLM4800 aufgezeichnet. Die Intensität wurde gegen die Zeit aufgetragen. Eine typische Messung ist in Fig. 10 gezeigt.
  • A : Puffer besteht aus 40 millimolar Tris und 40 millimolar Ammoniumacetat (pH-Wert: 8,1) ohne jegliche Verstärker.
  • L : Puffer besteht aus Tris (pH-Wert: 8,5); Verstärker ist Luciferin (40 uMol)
  • A+L : Puffer wie in A, Verstärker ist Luciferin (40 uMol) - : Nur Tris - kein Ammonium, kein Verstärker.
  • Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ul Meerrettich-Peroxidase zu 2 ml (A), (L) oder (A+L) und anschließende Zugabe von 40 il eines 1 : 1 (Vol./Vol.)-Gemischs von 39 millimolar Luminol (in DMF) und 30 millimolar H&sub2;O&sub2; (in H&sub2;O) initiiert. Fig. 1 zeigt klar den synergistischen Effekt. Mit anderen Worten, die Summe der Intensitäten der Emissionen von A und L allein ist geringer als die Intensität von A+L.
    • Beispiel 9A: Synergistische Wirkungen von Ammonium und Verstärkern auf eine von Meerrettich-Peroxidase vermittelte Chemolumineszenzreaktion
  • Ein Gemisch mit einem Gehalt an 2 ml Puffer, 100 ul 1 ng/ml (in Tris) biotinylierter Meerrettich-Peroxidase (Firma Sigma Chem. Co., St. Louis, Missouri, USA) und 1 bis 4 ul Verstärker, so daß man eine Endkonzentration von 60 umolar erhielt, wurden in eine Fluorimeterküvette gegeben. Die Küvette wurde in der Meßkammer eines Spektralfluorimeters der Bezeichnung SLM 4800 angeordnet. Alle Vorrichtungen mit Ausnahme der Lichtquelle wurden abgeschaltet. 40 ul H&sub2;O&sub2;- Luminol-Gemisch (Beispiele) wurden zugegeben. Die Emission wurde bis zu 12 Minuten gemessen. Eine typische Emission ist in Fig. 1 gezeigt.
  • Integrierte Werte der Lichtemission sind in der nachstehenden Tabelle angegeben: Gesamtzeit der Integration Tris Verstärker Intensität Plus Ammonium kein Ammonium Verbindung Integriertes Intensitätsverhältnis Willkürliche Einheiten Sekunden 4-Iodphenol keine Luciferin
  • Bei dem Puffer handelt es sich immer um Tris (pH-Wert: 8,5).
  • Aus der vorstehenden Tabelle ist klar, daß die gleichzeitige Anwesenheit von Ammonium und einem Verstärker eine synergistische Wirkung bei der Emission, wie sie mit dem Fluorimeter bestimmt wurde, ergibt.
    • Beispiel 10: Kupplung eines Verstärkers an eine DNA-Sonde
  • Leuchtkäfer-D-Luciferin
  • wird mit N-Hydroxysuccinimid wie in Beispiel 5 aktiviert und anschließend mit 4'-Aminomethyl-4,5'-dimethylangelicin wie in Beispiel 1 umgesetzt. Die Hybridisierung wird nach der gleichen Methode wie in Beispiel 3 durchgeführt. Der Nachweis erfordert die Zugabe von 1 ul (0,1 mg/ml) Meerrettich- Peroxidase, 0,1 ml eines 1:1-Gemischs von 0,5 millimolar Luminol (in DMF) und 5 millimolar H&sub2;O&sub2;. Dieses Verfahren verringert die Hintergrundemission, da eine verzögerte Verstärkerchemolumineszenz nur von der hybridisierten Sonde erzeugt wird.
    • Beispiele 11, 12 und 13
  • Die Beispiele 11, 12 und 13 wurden in der gleichen Weise wie Beispiel 2 durchgeführt, aber ohne Luciferin. Anstelle von Luciferin wurden in gleicher Konzentration folgende Substanzen verwendet:
  • 4-Iodphenol (Beispiel 11)
  • 6-Hydroxybenzothiazol (Beispiel 12) und
  • 4-Phenylphenol (Beispiel 13).
  • Die Stammlösungen dieser Verstärker wurden in Ethanol in einer 10-fach höheren Konzentration (2 millimolar) hergestellt, und es wurden nur 10 ul anstelle von 100 ul (verwendet für Luciferin) verwendet.
  • Vergleichsergebnisse zeigen, daß Iodphenol die größte Verstärkung zeigt, aber die Lichtemission fällt schneller ab als bei Luciferin oder 6-Hydroxybenzothiazol. 6- Hydroxybenzothiazol ist besser als Luciferin hinsichtlich der Verzögerung und der Verstärkung der Lichtemission. Phenylphenol zeigt ein ähnliches Verhalten wie Iodphenol. Diese Schlußfolgerungen werden aus der visuellen Analyse der belichteten Filme gezogen.
    • Beispiel 14: Die Wirkung von DNA und DNA-modifizierenden Mitteln auf die durch Luciferin verzögerte Chemolumineszenzreaktion
  • Fig. 1 zeigt den Einfluß von DNA auf die Lichtemissionsrate, die mit einem Spektralfluorimeter der Bezeichnung SLM 4800 gemessen wurde. Die Versuche wurden unter Zugabe von 200 ul 0,2 millimolar Luminol plus 5 millimolar Wasserstoffperoxid in einem 1 : 1-Gemisch zu einer 100 ul Nucleinsäure enthaltenden Lösung durchgeführt. Die Gesamtmenge an vorhandener Nucleinsäure in dem Gemisch betrug 1 ug, 5 ug bzw. 10 ug. Die Konzentration der Meerrettich-Peroxidase betrug 100 ng/ml. Die spezifische Aktivität betrug 250 Einheiten pro mg (bezogen von der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Die Meerrettich-Peroxidase wurde biotinyliert, so daß bei Untersuchung der Nucleinsäurehybridisierung das gleiche Enzym verwendet wurde. Das gesamte Endvolumen des Reaktionsgemischs wurde auf 2,4 ml durch Zugabe von 10 millimolarem Tris-Puffer (pH-Wert: 8,1) eingestellt. Fig. 1 zeigt klar, daß die Nucleinsäure praktisch keinen Effekt auf den Vorgang hat. Fig. 2 und Fig. 3 zeigen, daß unter identischen Bedingungen biotinylierte DNA einen gewissen Effekt auf die Emission haben kann. Photochemisch biotinylierte Nucleinsäure, die durch Umsetzung von DNA mit dem Biotin-Angelicin-Addukt biotinyliert und bei 346 nm bestrahlt worden war, zeigte diese Art von Effekt nicht, den Nick-translatierte, im Handel erhältliche Produkte zeigen. Der Effekt von Nick-translatierten Nucleinsäuren ist nicht klar verständlich, aber an diesem Punkt kann bei Durchführung einer photochemischen Biotinylierungsmethode der Effekt von Nucleinsäuren auf die Chemolumineszenzreaktionen durch die Verwendung von Avidin weiter vermindert werden. Fig. 4, Fig. 5 und Fig. 6 zeigen die Ergebnisse für die Effekte von Angelicin, Biotin bzw. Luciferin. Um einen von Meerrettich-Peroxidase vermittelten Vorgang zum Nachweis von Nucleinsäurehybriden zu verwenden, wurden vier verschiedene Arten von Formaten verwendet, so daß schließlich Meerrettich- Peroxidase aus einem ähnlichen Enzymassay zum Aufzeichnen der Ergebnisse der Endreaktion verwendet werden konnte.
  • In den vorstehenden Beispielen wurde die Chemolumineszenz mittels eines POLAROID-Filmhalters durch Photoradiographie bestimmt.
  • Der Film wurde belichtet, wobei die Licht-emittierende Sonde und der Film in der Kassette nur durch ein dünnes, durchsichtiges Stück eines festen Materials, z. B. "SARAN WRAP"-transparente Fasern, voneinander getrennt waren, oder durch eine ebene Seite einer Mikrotiterplatte.
    • Beispiele 15 bis 37
  • Die Versuchsdurchführung für die Beispiele 15 bis 37 war das gleiche wie für Beispiel 1A. Die relativen Intensitäten wurden durch Ausschneiden der aufgezeichneten Kurven und Wiegen auf einer analytischen Waage gemessen. Die Gewichte sind als relative Intensitäten in willkürlichen Einheiten tabelliert worden. Die Ergebnisse der Beispiele 15 bis 37 sind nachstehend angegeben. Beispiel 15: 1-H-Tetrazol als Amin im Puffer Verstärker Konzentration pH Puffer Relative Intensität (willkürl. Einheiten) Iodphenol 1-H-Tetrazol Beispiel 15: 1-H-Tetrazol als Amin im Puffer Verstärker Konzentration pH Puffer Relative Intensität (willkürl. Einheiten) Iodphenol 1-H-Tetrazol Beispiel 16: 1-Methylimidazol als Amin im Puffer 1-Methylimidizol Beispiel 17: 2-Methylimidazol als Amin im Puffer 2-Methylimidizol Beispiel 18: 4-Methylimidazol als Amin im Puffer 4-Methylimidazol * mM: millimolar Verstärker Konzentration pH Puffer Relative Intensität (willkürl. Einheiten) Beispiel 19: Imidazol als Amin im Puffer Iodphenol Imidizol Beispiel 20: Iodphenol (verschiedene Konzentrationen) in Tris-lmidizol (10 mM/40 mM) pH-Werte von 8,0, 8,5 und 9,0 Verstärker Konzentration pH Puffer Relative Intensität (willkürl. Einheiten) Iodphenol Imidizol Beispiel 21: Variation von Puffer, pH-Wert und Verstärkerkonzentration * Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminoethan ** A: Ammoniumacetat Verstärker Konzentration pH Puffer Relative Intensität (willkürl. Einheiten) Variation der Iodphenolkonzentration Iodphenol Variation des pH-Wertes Beispiele 22 und 23: Variation der Konzentration von Ammoniumacetat und Tris Verstärker Konzentration pH Puffer Relative Intensität (willkürl. Einheiten) Variation der Tris-Konzentration Iodphenol Beispiele 24 bis 27: Variation von Puffer und pH-Wert mit 6-Hydroxybenzothiazol als Verstärker Beispiel 24: Hydroxybenzothiazol Beispiel 25: Variation des pH-Wertes Verstärker Konzentration pH Puffer Relative Intensität (willkürl. Einheiten) Beispiel 26: Variation der Hydroxybenzoat-Konzentration Hydroxybenzothiazol Beispiel 27: Variation der Ammoniumacetat-Konzentration Beispiel 28 Verstärker Konzentration pH Puffer Relative Intensität (willkürl. Einheiten) Beispiele 29 bis 37: Einfluß von Nucleinbasen und Pyrrolderivaten Beispiel 29: Thymidin Adenin Adenosin Cytosinn Guanin Guanosin Pyrrolidincarbidithiosäure Beispiel 30: Beispiel 31: *H-ATP * 8-(6-Aminohexyl)-aminoadenosin-t'-triphosphat Verstärker Konzentration pH Puffer Relative Intensität (willkürl. Einheiten) H-ATP Beispiel 32: Thymidin Beispiel 33: Beispiel 34: Adenosin Verstärker Konzentration pH Puffer Relative Intensität (willkürl. Einheiten) Beispiel 35: Adenosin Beispiel 36: H-ATP/Thymidin H-ATP/Adenosin H-ATP/Hydroxybenzothiazol H-ATP/Iodphenol H-ATP/Luciferin Thymidin/Luciferin Thymidin/Iodphenol Thymidin/Hydroxybenzothiazol Adenosin/Hydroxybenzothiazol Adenosin/Iodphenol Adenosin/Luciferin Verstärker Konzentration pH Puffer Relative Intensität (willkürl. Einheiten) Beispiel 37: H-ATP/Thymidin H-ATP/Adenosin H-ATP/Hydroxybenzothiazol H-ATP/Iodphenol H-ATP/Luciferin Thymidin/Luciferin Thymidin/Iodphenol Thymidin/Hydroxybenzothiazol Adenosin/Hydroxybenzothiazol Adenosin/Iodphenol Adenosin/Luciferin

Claims (4)

1. Verstärkt chemolumineszierender Assay mit einer lumineszierenden Reaktion zwischen einer Peroxidase, einem Oxidationsmittel, einem chemolumineszierenden 2,3-Dihydro- 1,4-phthalazindion und einem Empfindlichkeitsverstärker, der in einem Puffer bei einem pH-Wert von 6 bis 10 ausgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das 2,3-Dihydro-1,4- phthalazindion die folgende allgemeine Formel aufweist:
wobei R&sub1; Amino bedeutet und jede der Gruppen R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; die Bedeutung H, unsubstituiertes oder substituiertes C&sub1;-C&sub6;- Alkyl oder -Alkenyl, Hydroxyl, C&sub1;-C&sub6;-Alkoxy, Carboxyl oder Amino hat oder wobei R&sub2; Amino bedeutet und jede der Gruppen R&sub1;, R&sub3; und R&sub4; die Bedeutung H, unsubstituiertes oder substituiertes C&sub1;-C&sub6;-Alkyl oder -Alkenyl, Hydroxyl, C&sub1;-C&sub6;- Alkoxy, Carboxyl oder Amino hat oder wobei R&sub1; und R&sub2; zusammen sind und ein Amino- oder substituiertes Aminoderivat einer Benzogruppe bedeuten und jede der Gruppen R&sub3; und R&sub4; die Bedeutung H, unsubstituiertes oder substituiertes C&sub1;-C&sub6;-Alkyl oder -Alkenyl, Hydroxyl, C&sub1;-C&sub6;-Alkoxy, Carboxyl oder Amino hat, wobei der Verstärker unter 4-Chlorphenol, 4-Bromphenol, 4-Iodphenol, 4-Brom-2-chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol, 3,4- Dichlorphenol, 4-Methylphenol, 4-tert.-Butylphenol, Ethyl-3- (4-hydroxyphenyl)-propionat, 4-Benzylphenol, 4-(3' Methylcrotyl)-phenol, 4-Styrylphenol, 4-(2',4'- Dinitrostyryl)-phenol, 4-Hydroxyzimtsäure, &alpha;-Cyano-4- hydroxyzimtsäure, 4-Phenylphenol, 4-(4'-Hydroxyphenyl)phenol, 2-Chlor-4-phenylphenol, 4-(4'-Hydroxyphenyl)benzophenon, 4-(Phenylazo)-phenol, 4-(2'-Carboxylphenylazo)phenol, 4-Phenoxyphenol, 4-(4'-Hydroxyphenoxy)-phenol, 4- Hydroxyphenylsulfid, 4-Hydroxyphenyldisulfid, 2-Naphthol, 1- Bromnaphth-2-ol, 6-Bromnaphth-2-ol, 1, 6-Dibromnaphth-2-ol und 6-Hydroxybenzothiazolen der folgenden Formel ausgewählt ist:
wobei R die Bedeutung H, CN oder unsubstituiertes oder substituiertes Thiazol hat, und wobei jede der Gruppen X&sub1;, X&sub2; und X&sub3; die Bedeutung H, substituiertes oder unsubstituiertes C&sub1;-C&sub6;-Alkyl oder -Alkenyl, Hydroxyl, substituiertes Hydroxyl, C&sub1;-C&sub6;-Alkoxy, Carboxyl, Amino oder substituiertes Amino hat, und wobei der Puffer Wasser und eine wasserlösliche Stickstoffverbindung umfaßt, die unter Ammoniak oder Arylaminen oder Benzylaminen oder Polyaminen unter Einschluß von Spermin, Spermidin, Putrescin, Butylendiamin oder einem Alkylamin der Formel
wobei X&sub1;, X&sub2; und X&sub3; gleich oder verschieden sind und unsubstituierte aliphatische gesättigte Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeuten, ausgewählt ist, oder die ein Heterocyclus ist, der unter Pyridin, Azolen, insbesondere Imidazol und Tetrazol und Derivaten davon und Thiazinen ausgewählt ist.
2. Chemolumineszenz-Assay nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Oxidationsmittel um Wasserstoffperoxid handelt.
3. Chemolumineszenz-Assay nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Peroxidase unter Meerrettich-Peroxidase, Microperoxidase und Lactoperoxidase ausgewählt ist.
4. Chemolumineszenz-Assay nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der während eines Nucleinsäure-Hybridisierungs-Assays durchgeführt wird.
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