DE68917387T2 - Dioxetane zur verwendung bei immuntests. - Google Patents

Dioxetane zur verwendung bei immuntests.

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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Dioxetanen, um eine Substanz in einer Probe nachzuweisen.
  • Dioxetane sind Verbindungen, die einen 4-gliedrigen Ring haben, in dem 2 der Glieder Sauerstoffatome sind, die aneinander gebunden sind. Dioxetane können thermisch oder photochemisch zersetzt werden, wobei sich Carbonyl- Produkte, z.B. Ketone oder Aldehyde bilden. Energieabgabe in Form von Licht (d.h. Lumineszenz) begleitet die Zersetzung.
  • Tetrahedron Letters, Vol. 28, No. 11, Seiten 1156-1162, 1987 beschreibt die Herstellung von einem 9H-Xanthenphosphat-substituiertem 1,2-Dioxetan und die enzymatische Spaltung des Dioxetans, welche als chemolumineszent beschrieben wird.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Im allgemeinen kennzeichnet die Erfindung ein Dioxetan mit der Formel
  • wobei T
  • eine substituierte (z.B. mit einer oder mehreren C&sub1;-C&sub7;- Alkylgruppen oder Heteroatom-enthaltenden Gruppen, z.B. Carbonylgruppen oder durch Enzyme spaltbare Gruppen, d.h. Gruppen die eine Bindung haben, die von einem Enzym gespalten werden kann, um einen elektronenreichen Teil an das Dioxetan gebunden zu ergeben, z.B. Phosphat) oder
  • eine unsubstituierte Aryl- (mit zwischen 6 und 12 Kohlenstoffatomen, inklusive, in dem Ring, z.B. Phenyl),
  • eine Polyaryl- (mit 2 oder mehr Ringen, z.B. Naphtyl),
  • eine Cycloalkyliden- (mit zwischen 6 und 12 Kohlenstoffatomen, inklusive, in dem Ring) oder
  • eine Polycycloalkylidengruppe (mit 2 oder mehr kondensierten Ringen, jeder Ring unabhängig mit zwischen 5 und 12 Kohlenstoffatomen, inklusive) ist,
  • die spiro-verknüpft mit dem Kohlenstoffatom 3 des Dioxetans ist;
  • X CR&sub7;R&sub8;, O, S oder N-R ist (wobei jeder von R&sub7;, R&sub8; und R, unabhängig voneinander H, eine verzweigtkettige oder unverzweigtkettige Alkylgruppe mit zwischen 1 und 20 Kohlenstoffatomen, inklusive, z.B. Methyl;
  • eine verzweigtkettige oder unverzweigtkettige Heteroalkylgruppe mit zwischen 1 und 7 Kohlenstoffatomen, inklusive, z.B. Methoxy-, Hydroxyethyl- oder Hydroxypropylgruppe;
  • Arylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z.B. Phenyl;
  • Heteroarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z.B. Pyrrolyl- oder Pyrazolylgruppe;
  • Cycloalkylgruppe mit zwischen 3 und 7 Kohlenstoffatomen, inklusive, in dem Ring, z.B. Dioxan;
  • Aralkylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z.B. Benzyl;
  • Alkarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z.B. Tolyl;
  • oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe, wie oben definiert)
  • und jeder von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; jeweils unabhängig voneinander H sein kann,
  • eine elektronenziehende Gruppe (z.B. eine Perfluoroalkylgruppe mit zwischen 1 und 7 Kohlenstoffatomen, inklusive, z.B. eine Trifluoromethyl-, Halogen-, -CO&sub2;H, -ZCO&sub2;H, -SO&sub3;H, -ZSO&sub3;H, -NO&sub2;, -ZNO&sub2;, -C=N oder -ZC=N-Gruppe, wobei Z eine verzweigtkettige oder unverzweigtkettige Alkylgruppe mit zwischen 1 und 7 Kohlenstoffatomen ist, inklusive, z.B. eine Methyl- oder eine Arylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z.B. Phenyl),
  • eine elektronenschiebende Gruppe (z.B. eine verzweigtkettige oder unverzweigtkettige C&sub1;-C&sub7;-Alkoxygruppe, z.B. eine Methoxy- oder Ethoxygruppe, eine Aralkoxygruppe mit 1 oder 2 Ringen, z.B. eine Phenoxygruppe, eine verzweigtkettige oder unverzweigtkettige C&sub1;-C&sub7;-Hydroxyalkylgruppe, z.B. eine Hydroxymethyl- oder Hydroxyethylgruppe, eine Hydroxyarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z.B. eine Hydroxyphenylgruppe, ein verzweigtkettiger oder unverzweigtkettiger C&sub1;-C&sub7;- Alkylester, z.B. Acetat, oder ein Arylester mit 1 oder 2 Ringen, z.B. Benzoat),
  • Heteroaryle mit 1 oder 2 Ringen, z.B. Benzoxazole, Benzthiazole, Benzimidazole oder Benztriazole, oder
  • eine durch Enzyme spaltbare Gruppe wie oben definiert.
  • Wo die Gruppe T eine Aryl- oder Polyarylgruppe ist, muß offensichtlich die Arylgruppe von derartiger Struktur sein, daß sie eine spiro-Verknüpfung zuläßt und daher sind Gruppen, z.B. eine Phenylgruppe, die nicht spiro-verknüpft werden können ausgeschlossen.
  • Zusätzlich müssen, wie aus dem folgenden Text klar werden wird, wo die Auslösung des Dioxetans durch die Spaltung der O-O-Bindung des Dioxetanringes stattfinden wird, weder die Gruppe T noch die den lumineszierenden Teil enthaltenden Gruppen R&sub1;-R&sub6; eine durch Enzyme spaltbare Gruppe enthalten. Wo die Auslösung durch die Spaltung einer durch Enzyme spaltbaren Gruppe stattfindet, muß entweder T oder der lumineszierende Teil eine solche Gruppe enthalten.
  • Das Dioxetan ist in der Lage, bei der Zersetzung eine lumineszierende Substanz (d.h. eine Substanz, die Energie in Form von Licht emittiert) zu bilden, die die folgenden Formel hat
  • Die Erfindung kennzeichnet ebenfalls verschiedene Verbindungen, die als Intermediate bei der Synthese der Dioxetane nützlich sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Gruppe X O, die Gruppen R&sub1;-R&sub3; und R&sub6; sind H und die Gruppen R&sub4; und R&sub5; sind unabhängig voneinander Phosphat oder H. Die Gruppe T des Dioxetans ist vorzugsweise eine Adamantylidengruppe. Das Dioxetan schließt vorzugsweise auch eine durch Enzyme spaltbare Gruppe ein, die an die Gruppe T gebunden sein kann, oder an den fluoreszierenden chromophoren Teil des Dioxetans (vorzugsweise an R&sub5;).
  • Die Dioxetane werden in einem Test-Verfahren benutzt, bei dem ein Mitglied von einem spezifischen Bindungspaar (d.h. zwei Substanzen, die spezifisch aneinander binden) durch eine optisch nachweisbare Reaktion nachgewiesen wird. Nach diesem Verfahren wird das Dioxetan mit einem Enzym in Kontakt gebracht, welches die Zersetzung des Dioxetans unter Bildung einer lumineszierenden Substanz bewirkt (d.h. einer Substanz, die Energie in Form von Licht emittiert). Die lumineszierende Substanz, welche die folgende Formel hat,
  • wird als ein Hinweis auf die Gegenwart der ersten Substanz nachgewiesen. Durch Messung der Intensität der Lumineszenz kann die Konzentration der ersten Substanz bestimmt werden.
  • Wenn das Enzym eine Oxido-Reduktase ist (vorzugsweise eine Peroxidase, z.B. Meerrettich-Peroxidase oder Mikroperoxidase), bewirkt es durch die Spaltung der O-O-Bindung des 4- gliedrigen Ringteils des Dioxetans die Zersetzung des Dioxetans. Das Enzym kann direkt auf das Dioxetansubstrat wirken, oder kann durch die Zugabe von Peroxid vermittelt werden.
  • Wenn das Dioxetan eine durch Enzyme spaltbare Gruppe (z.B. Phosphat) enthält, bewirkt das Enzym (z.B. Phosphatase) eine Zersetzung des Dioxetans durch Spaltung der durch Enzyme spaltbaren Gruppe von dem Dioxetan. Die Spaltung führt zu einem negativ geladenen Atom (z.B. einem Sauerstoff-Atom), welches an das Dioxetan gebunden ist und dann wieder das Dioxetan destabilisiert, was es dazu bringt sich zu zersetzen und Strahlung zu emittieren, welche dann wieder durch den Teil des Moleküls, der den fluoreszierenden Chromophor enthält absorbiert wird, der infolgedessen luminesziert.
  • Bevorzugte spezifische Bindungspaare, für die das oben beschriebene Test-Verfahren nützlich ist, schließen ein Antigen-Antikörper-Paar ein und ein Paar, bestehend aus einer Nukleinsäure und einer Probe, die in der Lage ist, an die gesamte oder einen Teil der Nukleinsäure zu binden. Die Dioxetane sind ebenfalls nützlich in einem Test-Verfahren zum Nachweis eines Enzyms in einer Probe.
  • Die Erfindung stellt ein einfaches, sehr sensitives Verfahren zum Nachweis von Substanzen in Proben, z.B. biologischen Proben, zur Verfügung und ist besonders nützlich für Substanzen, die in geringen Konzentrationen vorliegen. Da die Dioxetan-Zersetzung als Exzitationsenergiequelle für den Cumarin-Chromophor dient, ist eine externe Exzitationsenergiequelle, z.B. Licht, nicht notwendig.
  • Durch Enzyme ausgelöste Zersetzung erlaubt eine hohe Sensitivität, da ein Enzyinmolekül die Lumineszenz vieler Dioxetanmoleküle bewirken kann und so zu einem amplifizierenden Effekt führt. Zusätzlich kann durch geeignete Modifikationen der Gruppe T und des fluoreszierenden Chromophors die Löslichkeit des Dioxetans und die Kinetik der Dioxetanzersetzung variiert werden. Die Dioxetane können auch an eine Vielzahl von Molekülen, z.B. Proteine oder Haptene, oder Immobilisationssubstrate, z.B. polymere Membranen angehängt werden, oder als Seitengruppe in ein Homopolymer oder Kopolymer eingeschlossen werden.
  • Die spiro-Verknüpfung, die den Chromophor an den 4- gliedrigen Ringteil des Dioxetans bindet, stabilisiert das Dioxetan vor der Enzymaktivierung, was es leicht macht, das Dioxetan für ausgedehnte Zeitperioden zu lagern. Durch den Gebrauch von Cumarin als dem fluoreszierenden Chromophor, werden gute Quantenausbeuten an Lumineszenz erhalten (wie hier benutzt, bezieht sich "Quantenausbeute" auf die Anzahl der Photonen, die von dem lumineszierenden Produkt pro Anzahl von zersetzten Molen von Dioxetan emittiert werden).
  • Die Cumarin-substituierten Dioxetanmoleküle werden auch leicht in hoher Ausbeute synthetisiert.
  • Ein weiterer Vorteil ist, daß da, wo das Enzym direkt auf die O-O-Bindung wirkt, ein Engineering des emittierenden Chromophors nicht nötig ist.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Patentansprüchen klar werden.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Wir beschreiben nun die Struktur, Synthese und Verwendung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung.
    • Struktur
  • Die Erfindung benutzt Dioxetane der Formel
  • Der Zweck der Gruppe T ist es, das Dioxetan zu stabilisieren, d.h. vorzeitige Zersetzung zu verhindern. Große, sperrige, sterisch gehinderte Moleküle, z.B. kondensierte polycyclische Moleküle, sind die wirkungsvollsten Stabilisatoren. Zusätzlich enthält T vorzugsweise nur C-C- und C- H-Einzelbindungen. Das am meisten bevorzugte Molekül ist eine Adamantylidengruppe, die aus 3 kondensierten Cyclohexylringen besteht. Die Adamantylidengruppe ist spiro- gebunden an das Kohlenstoffatom 3 des Dioxetans.
  • Die Gruppe der Formel
  • (hierin als Gruppe V bezeichnet)
  • ist ein fluoreszierender Chromophor, welcher spiro-gebunden an das Kohlenstoffatom 4 des Dioxetans ist. Er wird lumineszent, wenn eine enzymatische Spaltung, entweder von einer durch Enzyme spaltbaren Gruppe, die an Gruppe T oder Gruppe V gebunden ist, oder von der O-O-Bindung des 4- gliedrigen Dioxetanringes vorkommt, welche die Zersetzung des Dioxetans bewirkt. Die Zersetzung produziert zwei individuelle, Carbonyl-enthaltende Verbindungen, von denen eine Gruppe T enthält und die andere Gruppe V enthält. Die Energie, die durch die Dioxetanzersetzung frei wird, bewirkt die Lumineszenz des Chromophors. Vorzugsweise ist die Energie des angeregten Zustands der Gruppe V (d.h. die Energie, die er besitzen muß, um Licht zu emittieren) geringer als die Energie des angeregten Zustands des Ketons, welches Gruppe T enthält, um die Lumineszenz auf Gruppe V zu begrenzen.
  • Das bevorzugte Dioxetan hat die Formel
  • wobei R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander H oder Phosphat sind und Ad eine Adamantylidengruppe ist. Die Zersetzung führt zu einem Cumarin-Molekül mit der Formel
  • dessen Energie im angeregten Zustand geringer ist, als die von Spiroadamantanon (dem anderen Zersetzungsprodukt).
  • Die Dioxetane werden im allgemeinen auf zwei wegen zersetzt. Ein Weg ist es, ein Oxido-Reduktase-Enzym zuzugeben, z.B. eine Peroxidase (vorzugsweise Meerrettich- oder Mikroperoxidase); das Enzym spaltet die O-O-Bindung des 4-gliedrigen Ringes und erzeugt dadurch das lumineszierende Molekül.
  • Ein zweiter Weg ist es, eine durch Enzyme spaltbare Gruppe an Gruppe T oder, besser noch, an Gruppe V zu binden. Kontakt mit dem geeigneten Enzym spaltet die durch Enzyme spaltbare Bindung, was eine elektronenreiche Komponente an Gruppe T oder V gebunden ergibt; diese Komponente initiiert die Zersetzung des Dioxetans in zwei individuelle Carbonyl- enthaltende Verbindungen. Beispiele für elektronenreiche Komponenten schließen Sauerstoff-, Schwefel- und Amin- oder Amido-Anionen ein. Die am meisten bevorzugte Komponente ist ein Sauerstoff-Anion. Beispiele für geeignete durch Enzyme spaltbare Gruppen, und die Enzyme, die für diese Gruppen spezifisch sind, sind unten in Tabelle 1 gegeben; ein Pfeil zeigt die durch Enzyme spaltbare Bindung an. Die am meisten bevorzugte Gruppe ist ein Phosphatester, welcher durch alkalische oder saure Phosphatase-Enzyme gespalten wird. Tabelle 1 Gruppe Enzym Phosphatester Acetatester Carboxyl 1-Phospho-2,3-diacylglyceride alkalische und saure Phosphatasen Esterasen Decarboxylasen Phospholipase D β-D-Xyloside β-D-Fucoside 1-Thio-D-glucoside Adenosindiphosphat-Analoge β-Xylosidase β-D-Fucosidase Thioglucosidase ADPase + Phosphatase Adenosinmonophosphat-Analoge Adenosin-Analoge β-D-Galaktosidase 5'-Nukleosidase + Phosphatase 5'-Nukleosidase + Ribofuranosidase β-D-Galaktoside α-D-Galaktoside α-D-Glukoside β-D-Glukoside α-D-Galaktosidase α-D-Glukosidase β-D-Glukosidase α-D-Mannoside β-D-Mannoside β-D-Fruktofuranoside α-D-Mannosidase β-D-Mannosidase β-D-Fruktofuranosidase β-D-Glukosiduronate p-Toluolsulfonyl-L-argininester p-Toluolsulfonyl-L-argininamid β-D-Glukosiduronase Trypsin Adenosintriphosphat-Analoge ATPase + Phosphatase
  • Vorzugsweise wird das Enzym kovalent an eine Substanz gebunden, die eine spezifische Affinität zu der Substanz hat, die nachgewiesen wird. Beispiele für spezifische Affinitäts-Substanzen umfassen Antikörper, z.B. anti-hCG, wo die Substanz, die nachgewiesen wird ein Antigen ist, z.B. hCG, Antigene, z.B. hCG, wo die Substanz, die nachgewiesen wird ein Antikörper ist, z.B. anti-hCG, oder eine Probe, die in der Lage ist, an die gesamte oder einen Teil einer Nukleinsäure zu binden, z.B. DNA oder RNA, die nachgewiesen wird. Die Bindung findet vorzugsweise durch eine Amidbindung statt.
    • Synthese
  • Im allgemeinen werden die Dioxetane der Erfindung in zwei Schritten synthetisiert. Der erste Schritt umfaßt die Synthese eines geeignet substituierten Olefins mit der Formel
  • wobei T und V so sind, wie oben beschrieben.
  • (Bevollmächtigter, hierdurch per Referenz eingefügt.)
  • Olefine, bei denen der Chromophor V spiro-gebunden an der Olefin-Doppelbindung ist, werden im allgemeinen nach einem der folgenden zwei synthetischen Verfahren synthetisiert.
  • Die erste Synthese umfaßt den Gebrauch der folgenden Reaktionsfolge: R ist H, C&sub1;-C&sub5;-Alkyl, Acetyl oder Phosphat
  • Die Reaktion wurde für den Fall, wo R eine Methylgruppe ist, wie im folgenden beschrieben durchgeführt.
  • Adamantan-2-carbonsäure (1,51 g, 8,38 mmol), hergestellt nach dem Verfahren von Farcasiu (Synthesis, 1972, 615), wurde in 35 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, um eine dünne Suspension herzustellen. Oxalylchlorid (0,88 ml, 10 mmol) wurde unter Rühren zugegeben. Die nachfolgende Zugabe von 2 Tropfen DMF führte zu sofortiger Gasentwicklung. Nach 15 Minuten wurde die Mischung auf Raumtemperatur erwärmt und das Rühren wurde für 2 Stunden fortgesetzt. Die flüchtigen Stoffe wurden dann bei reduziertem Druck entfernt. Das rohe Säurechlorid wurde mit 25 ml siebgetrocknetem (3Å) Pyridin verdünnt, was nach Kühlung in einem Eisbad eine leicht trübe, gelbe Lösung lieferte.
  • 2'-Hydroxy-4'-methoxyacetophenon (1,18 g, 7,12 mmol) in 5 ml Pyridin wurde tropfenweise zu der Lösung zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 0ºC gerührt und dann für weitere zwei Stunden auf Raumtemperatur erwärmt. Die Mischung wurde in eine gesättigte NaHCO&sub3;-Lösung (150 ml) gegossen und mit (3 x 20 ml) 25% Ethylacetat in Hexanen extrahiert. Die vereinigten organischen Stoffe wurden mit 1N HCl, gesättigtem NaHCO&sub3; und Wasser gewaschen, gefolgt von Trocknen über Na&sub2;SO&sub4;. Die Lösung wurde konzentriert, so daß 2,5 g von einem gelben Öl geliefert wurden. I.R. (Film): 2900 cm&supmin;¹ (Ester C=O), 1672 cm&supmin;¹ (Keton C=O). TLC- Analyse (Dünnschicht-Chromatographie-Analyse) zeigte, daß das Esterprodukt, 2'-(Adamantan-2-carbonyloxy)-4'-methoxyacetophenon genügend rein war für den nachfolgenden Gebrauch.
  • Der Ester, der oben erhalten wurde (1,53 g, 4,6 mmol), wurde als nächstes in 10 ml DMSO gelöst und dann tropfenweise zu einer Suspension aus NaH (60%ige Dispersion, 0,56 g, 13,97 mmol) in 35 ml DMSO zugegeben. Nachdem das Schäumen aufgehört hatte, wurde die braune Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde in gesättigte Oxalsäurelösung gegossen und mit 3 x 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Stoffe wurden mehrere Male mit Wasser und schließlich mit gesättigtem NaCl gewaschen. Konzentrierung und Chromatographie durch eine kurze Kieselgelsäule (plug) mit 10% Ethylacetat in Hexanen lieferte 1,58 g eines hellorangefarbenen Feststoffes. I.R. (CHCl&sub3;): 2900 cm&supmin;¹, 1695 cm&supmin;¹ (C=O). Eine analytische Probe von dem Produkt 1,3-Diketon, 2-(Adamantan-2-carbonyl)-2'-hydroxy-4'-methoxyacetophenon, umkristallisiert aus Hexanen, zeigte einen Schmelzpunkt von 105-108ºC.
  • Das rohe Diketonprodukt der vorhergehenden Reaktion (1,58 g) wurde in 40 ml Essigsäure suspendiert und mit 15 Tropfen konz. HCl behandelt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 100-110ºC erhitzt. Die Mischung wurde sorgfältig mit NaHCO&sub3;-Lösung neutralisiert und mehrere Male mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und gesättigtem NaCl gewaschen. Die Lösung wurde schnell über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und verdampft, um 1,5 g eines hellbraunen Feststoffes zu ergeben, welcher aus Ethylacetat umkristallisiert werden konnte, um 0,92 g (gms) des Chromenons 2-(Adamant-2-yl)-7-methoxy-4H-chromen- 4-on, als hellgelbbraune Kristalle zu ergeben. I.R. (CHCl&sub3;): 2900 cm&supmin;¹, 1630 cm&supmin;¹ (C=O), 1595 cm&supmin;¹, 1435 cm&supmin;¹, m.p. (Schmelzpunkt) 160-162ºC.
  • Eine Lösung des oben hergestellten Chromenons (0,62 g, 2 mmol) in 10 ml absolutem Methanol wurde mit 0,4 m CeCl&sub3; 7H&sub2;O in Methanol (5 ml, 2 mmol) behandelt. NaBH&sub4; (76 mg, 2 mmol) wurde in kleinen Portionen unter Rühren hinzugegeben. Nach 60 Minuten bei Raumtemperatur wurden 50 ml Wasser zugegeben und die Mischung mit 2 x 20 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden gewaschen, zuerst mit Wasser und dann mit gesättigtem NaCl. Die Lösung wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und in vacuo (im Vakuum) konzentriert, um den rohen allylischen Alkohol zu liefern. Das leicht strohfarbene Öl zeigte keine Carbonylabsorption (1630 cm&supmin;¹) im I.R. Spektrum, die auf das Ausgangsmaterial zurückzuführen war. Das Öl wurde in 25 ml CH&sub2;Cl&sub2; unter Argon gelöst und die Lösung wurde auf -20ºC gekühlt. Triethylamin (0,61 g, 6 mmol) wurde unter Rühren mit einer Spritze zugegeben. Methansulfonylchlorid (0,25 g, 2,2 mmol) wurden dann tropfenweise zugegeben. Die Mischung wurde langsam auf Raumtemperatur aufgewärmt, woraufhin das Rühren über Nacht fortgesetzt wurde. Die Mischung wurde mehrere Male mit Wasser extrahiert, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft (stripped), um Lösungsmittel und überschüssiges Triethylamin zu entfernen. Das Produkt, 7-Methoxy-2-adamantyliden- 3-chromen wurde in einer Ausbeute von 0,5 g erhalten. Um die phosphorylierte Version herzustellen, wird das Chrome mit Natriumethanthiolat in DMF demethyliert und dann mit 2- Chloro-2-oxo-1,3-dioxaphospholan phosphoryliert.
  • Die zweite Synthese umfaßt den Gebrauch der Barten-Reaktion gemäß der folgenden Reaktionsfolge: R ist H, C&sub1;-C&sub5;-Alkyl, Acetyl oder Phosphat.
  • Die Reaktion wurde für den Fall, wo R eine Methylgruppe ist, wie im folgenden ausgeführt.
  • 7-Methoxycumarin-2-thion (2 g, 10,4 mmol), erhalten durch das Verfahren von F. Tiemann (Ber. 19, 1661, 1886), und Hydrazinmonohydrat (0,55 ml, 11,3 mmol) wurden unter Rückfluß in absolutem Ethanol 4 Stunden lang erhitzt. Die Mischung wurde heiß filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde mehrere Male mit kochendem Petrolether (35-60ºC) extrahiert. Die Lösung wurde bis zur Trockenheit konzentriert und der Rückstand wurde aus Ethanol umkristallisiert, um das Hydrazon, 2-Hydrazono-7-methoxy-2H-benzopyran als einen hellgelben Feststoff zu liefern.
  • Eine Lösung des obigen Hydrazons (2 g, 10,5 mmol) und 2- Adamantanon (1,6 g, 10,7 mmol) in 50 ml absolutem Ethanol wurde mit 0,1 ml Triethylamin und 0,1 ml Eisessig behandelt. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und nachfolgend 3 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand wurde auf Kieselgel chromatographiert, um das gemischte Azin, 7-Methoxy-2-N-benzo-2H-pyranoadamantylidenazin als einen gelben Feststoff zu erhalten.
  • Das Azin (3,2 g, 10 mmol) wurde in 200 ml 1:1 Toluol- Dimethoxyethan gelöst. Diese Lösung wurde dann mit 2 mg p-Toluolsulfonsäure behandelt. Hydrogensulfid wurde langsam unter heftigem Rühren durch ein Gaszuleitungsrohr eingeleitet. Die Reaktion wurde durch TLC (Dünnschicht-Chromatographie) überwacht, welche nach 18 Stunden den vollständigen Verbrauch des Ausgangsmaterials zeigte. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, um einen Rückstand zu ergeben, der mit Hexanen verrieben und im Vakuum getrocknet wurde. Das Produkt wurde auf Kieselgel unter Benutzung von Ethylacetat-Dichlormethan chromatographiert, um das heterocyclische Produkt, 7-Methoxy-2H-benzopyranspiro-2'-(1',3',4'-thiadiazolidin)-5'-spiroadamantan in guter Ausbeute zu liefern.
  • Als nächstes wurde siebgetrocknetes Benzol (50 ml) während der Zugabe von CaCO&sub3; (3,5 g, 35 mmol) unter Argon gerührt. Bleitetraacetat (3,5 g, 7,9 mmol) wurde in kleinen Portionen zu der weißen Suspension zugegeben, welche dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt wurde. Eine Lösung des vorher erwähnten Thiadiazolidin (2,1 g, 6 mmol) in 50 ml Benzol wurde tropfenweise während einer Stunde zugegeben. Die Mischung wurde dann über Nacht gerührt. Wasser (200 ml) wurde unter heftigem Rühren zugegeben. Die wäßrige Schicht wurde mit 3 x 30 ml Benzol extrahiert und die vereinigten organischen Stoffe wurden mit 2 x 40 ml Wasser, 1 x 40 ml gesättigtem NaCl gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, um 3 g eines Rückstandes zu ergeben, der auf Kieselgel mit Dichlormethan-Hexanen chromatographiert wurde, um das fast weiße (off-white) kristalline Thiadiazin, 7-Methoxy-2H-benzopyranspiro-2'-(1',3',4'-thiadiazin)- 5'-spiroadamantan in guter Ausbeute zu liefern.
  • Eine Mischung von dem obigen Thiadiazin (1,77 g, 5 mmol) und Triphenylphosphin (3,1 g, 11,7 mmol) wurde unter Argon in einem Einschlußrohr bei 150ºC 18 Stunden lang erhitzt. Der Inhalt wurde in einer kleinen Menge von Methylenchlorid gelöst und auf eine Kieselgelsäule zur Schnell-Chromatographie (flash chromatography) aufgetragen, unter Benutzung von 5% CH&sub2;Cl&sub2;-Hexanen, um 7-Methoxy-2-adamantyliden-3-chromen zu ergeben. Das Produkt war in jeder Hinsicht mit dem Chromen, welches durch den ersten Syntheseweg erhalten wurde, identisch. Es konnte ebenfalls wie oben beschrieben phosphoryliert werden.
  • Der zweite Schritt in der Synthese der Dioxetane umfaßt die Umwandlung des oben beschriebenen Olefins zu dem Dioxetan. Vorzugsweise wird die Umwandlung photochemisch ausgeführt, durch eine Behandlung des Olefins mit Singulett-Sauerstoff (¹O&sub2;) in der Gegenwart von Licht. ¹O&sub2; addiert an die Doppelbindung, um eine Dioxetan wie folgt zu bilden:
  • Die Reaktion wird vorzugsweise bei +15ºC in einem halogenierten Lösungsmittel, z.B. Methylenchlorid, durchgeführt. ¹O&sub2; wird durch Benutzung eines Photosensibilisators erzeugt. Beispiele für Photosensibilisatoren schließen polymer-gebundenes Rose Bengal (kommerziell bekannt als Sensitox II und erhältlich bei Polysciences) und Methylenblau (einem wohlbekannten Farbstoff und pH-Indikator) ein. Der bevorzugteste Photosensibilisator ist Methylenblau.
  • Die Synthese des Dioxetans mit der Formel
  • wobei R&sub4; eine Phosphatgruppe ist, folgt.
  • In einem großen Kulturröhrchen werden 0,075 g (0,21 mmol) von dem Chromenphosphatsalz, hergestellt wie oben beschrieben, in 25 ml CHCl&sub3; gelöst. Eine Menge (0,210 g) von Methylenblau auf Kieselgel (0,0026 g Farbstoff/g SiO&sub2;) wurde als ein Sensibilisator zugegeben. Das Röhrchen wurde in ein versilbertes Dewar-Gefäß gestellt, welches eine 250 Watt-, Hochdruck-Natriumlampe in einem wassergekühlten Tauchrohr enthielt. Ein Stück von 5 Mil Kapton (Dupont), welches in das Rohr gestellt war, diente als ein U.V.- Filter. Eiswasser wurde durch die Apparatur gepumpt, um die Probentemperatur unter 15ºC zu halten. Ein kontinuierlicher Strom von trockenem Sauerstoff wurde durch ein Kapillarrohr in das Reaktionsgefäß geleitet. Der Gasfluß wurde so eingestellt, daß gerade eine gleichmäßige Suspension von festem Sensibilisator aufrecht erhalten werden konnte. Nach 25 Minuten Bestrahlungszeit verschwand die U.V.-Absorption des Ausgangsmaterials. Die hellgelbgrüne Lösung wurde filtriert, verdampft und mit 10 ml Wasser wiederhergestellt. Die wäßrige Probe wurde dann durch einen 0,45- Mikrometer-Nylonfilter filtriert und auf einer präparativen C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule chromatographiert, unter Verwendung eines Wasser/Acetonitril-Gradienten. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, um das Dioxetan, Dispiro(adamantan-2)-3'-(1',2'-dioxetan)- 4',2"-(7"-phosphoryloxy-3"-chromen)-Natriumsalz als einen weißen hygroskopischen Feststoff zu liefern.
    • Verwendung
  • Es existiert eine große Vielzahl von Tests, die visuell nachweisbare Mittel benutzt, um die Anwesenheit oder Konzentration einer bestimmten Substanz in einer Probe zu bestimmen. Die oben beschriebenen Dioxetane können in jedem dieser Tests benutzt werden. Beispiele von solchen Tests schließen Immunotests, um Antikörper oder Antigene, z.B. α- oder β-hCG, nachzuweisen, Enzymtests, chemische Tests, um z.B. Kalium- oder Natriumionen nachzuweisen, und Nukleinsäuretests, um z.B. Virusse (z.B. HTLV I oder III oder Cytomegalovirus) oder Bakterien (z.B. E. coli) nachzuweisen ein.
  • Wenn die nachzuweisende Substanz ein Antikörper, Antigen oder eine Nukleinsäure ist, ist das Enzym vorzugsweise an eine Substanz gebunden, die eine spezifische Affinität zu der nachzuweisenden Substanz hat (d.h. eine Substanz, die spezifisch an die nachzuweisende Substanz bindet), z.B. ein Antigen, Antikörper bzw. eine Nukleinsäurensonde.
  • Konventionelle Methoden, z.B. Carbodiimid-Kupplung, werden benutzt, um das Enzym an die Substanz mit spezifischer Affinität zu binden. Die Bindung findet vorzugsweise durch eine Amidverknüpfung statt.
  • Im allgemeinen werden die Tests wie folgt durchgeführt. Eine Probe, die im Verdacht steht eine nachweisbare Substanz zu enthalten, wird mit einer gepufferten Lösung in Kontakt gebracht, die ein Enzym enthält, welches an eine Substanz mit einer spezifischen Affinität zu der nachzuweisenden Substanz gebunden ist. Die resultierende Lösung wird inkubiert, damit die nachzuweisende Substanz an den spezifischen Affinitätsteil der spezifischen Affinitäts- Enzym-Verbindung binden kann. Überschüssige spezifische Affinitäts-Enzym-Verbindung wird dann durch Waschen entfernt und ein Dioxetan wird zugegeben. Im Fall von einem Oxido-Reduktase-Enzym wird die O-O-Peroxy-Bindung des Dioxetans gespalten, was dazu führt, daß das Dioxetan in zwei Ketone zerfällt, von denen eines den Chromophor enthält, z.B. Cumarin. Der Chromophor wird so angeregt und luminesziert. Lumineszenz wird z.B. durch einen Photoelektronenvervielfacher-Detektor oder eine Luminometer- Kamera als ein Hinweis auf die Gegenwart der nachzuweisenden Substanz in der Probe nachgewiesen. Die Lumineszenzintensität wird gemessen, um die Konzentration von der Substanz zu bestimmen.
  • Wo Gruppe T oder Gruppe V eine durch Enzyme spaltbare Gruppe enthält, z.B. Phosphat, spaltet das Enzym, z.B. Phosphatase, diese Gruppe, um Lumineszenz wie oben beschrieben hervorzurufen.
  • Wenn die nachzuweisende Substanz ein Enzym ist, ist eine spezifische Affinitäts-Substanz nicht notwendig. Stattdessen wird ein Dioxetan benutzt. Daher schließt ein Test für das Enzym die Zugabe von dem Dioxetan zu der Enzymenthaltenden Probe ein, und den Nachweis der resultierenden Lumineszenz als einen Hinweis auf die Gegenwart und die Konzentration des Enzyms.
  • Beispiele für spezifische Tests folgen.
    • A. Test für menschliches IgG
  • Eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wird mit anti-menschlichem IgG vom Schaf (F(ab)2-Fragment-spezifisch) überzogen. Eine Serum-Probe, die menschliches IgG enthält, wird dann in die Vertiefungen hinzugegeben und die Vertiefungen werden eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wird die Serum-Probe aus den Vertiefungen entfernt und die Vertiefungen werden viermal mit einer wäßrigen Pufferlösung gewaschen, die 0,15 M NaCl, 0,01 M Phosphat und 0,1% Rinderserumalbumin (pH 7,4) enthält.
  • Meerrettich-Peroxidase gebunden an anti-menschliches IgG wird in jede Vertiefung zugegeben und die Vertiefungen werden eine Stunde lang inkubiert. Die Vertiefungen werden dann viermal mit der obigen Pufferlösung gewaschen und eine Pufferlösung von einem Dioxetan wird zugegeben. Die resultierende Lumineszenz, die durch enzymatische Zersetzung des Dioxetans verursacht wird, wird in einem Luminometer nachgewiesen, oder mit photographischem Film in einer Luminometer-Kamera.
  • Ähnliche Ergebnisse werden mit einem phosphathaltigen Dioxetan und alkalischer Phosphatase statt Meerrettich- Peroxidase erhalten.
    • B. Test für hCG
  • Kaninchen anti-α-hCG wird an eine Nylonmaschen-Membran absorbiert. Eine Probenlösung mit hCG (HCG), z.B. Urin von einer schwangeren Frau, wird durch die Membran geblottet, wonach die Membran mit 1 ml einer Pufferlösung gewaschen wird, die 0,15 M NaCl, 0,01 M Phosphat und 0,1% Rinderserumalbumin (pH 7,4) enthält.
  • Mikroperoxidase-gelabeltes anti-β-hCG wird zu der Membran zugegeben und die Membran wird wieder mit 2 ml der obigen Pufferlösung gewaschen. Die Membran wird dann in die Küvette von einem Luminometer oder in eine Luminometer-Kamera gestellt, und mit einem Dioxetan in Kontakt gebracht. Die Lumineszenz, die aus der enzymatischen Zersetzung des Dioxetans resultiert, wird dann nachgewiesen.
  • Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn man mit alkalischer Phosphatase gelabeltes anti-β-hCG und ein phosphathaltiges Dioxetan benutzt.
    • C. Test für Serum-Mikroperoxidase
  • 2,7 ml einer wäßrigen Pufferlösung, die 0,84 M 2- Methyl-2-aminopropanol enthält, wird in ein 12x75 mm Pyrex-Teströhrchen überführt und 0,1 ml einer Serum- Probe, die Mikroperoxidase enthält werden zugegeben. Die Lösung wird dann bei 30ºC äquilibriert. 0,2 ml von einem Dioxetan werden zugegeben und das Teströhrchen wird sofort in ein Luminometer gestellt, um die resultierende Lumineszenz zu erfassen. Die Höhe der Lichtemission wird proportional zu der Rate der Mikroperoxidase-Aktivität sein.
  • Der oben beschriebene Test kann benutzt werden, um alkalische Phosphatase im Serum durch den Gebrauch eines phosphathaltigen Dioxetans nachzuweisen.
    • D. Nukleinsäure-Hybridisations-Test
  • Eine Probe von Cerebrospinal-Flüssigkeit (CSF), von der angenommen wird, daß sie Cytomegalovirus enthält, wird gesammelt und auf eine Nitrocellulosemembran aufgebracht. Die Probe wird dann chemisch mit Harnstoff oder Guanidiniumisothiocyanat behandelt, um die Zellwände auf zubrechen und um alle Zellkomponenten außer der viralen DNA abzubauen. Die Stränge von viraler DNA, die so hergestellt wurden, werden getrennt und auf den Nitrocellulosefilter aufgebracht. Eine DNA-Probe, die spezifisch für die virale DNA ist und mit Meerrettich- Peroxidase gelabelt ist, wird dann auf den Filter aufgetragen. Die Probe hybridisiert mit den komplementären viralen DNA-Strängen. Nach der Hybridisierung wird der Filter mit einer wäßrigen Pufferlösung, die 0,2 M NaCl und 0,1 mM Tris-HCl (pH=8,0) enthält gewaschen, um überschüssige Proben-Moleküle zu entfernen. Ein Dioxetan wird zugegeben und die aus dem enzymatischen Abbau des Dioxetans resultierende Lumineszenz wird in einem Luminometer gemessen oder mit einem photografischen Film nachgewiesen.
  • Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn alkalische Phosphatase benutzt wird, um die DNA-Probe zu labeln und ein phosphathaltiges Dioxetan.
  • Andere Ausführungsformen finden sich in den folgenden Patentansprüchen.
  • Beispielsweise kann die spezifische Affinitäts-Substanz anstelle des Enzyms über Gruppe T oder Gruppe V an das Dioxetan gebunden werden. In diesem Fall ist die Gruppe, an die das spezifische Affinitäts-Substrat gebunden wird, z.B. mit einem Carboxylsäure-, Amin- oder Maleinimid-Substituenten ausgestattet, um die Bindung zu erleichtern.
  • Gruppe T oder Gruppe V des Dioxetans können an eine polymerisierbare Gruppe gebunden werden z.B. eine Vinylgruppe, welche polymerisiert werden kann, um ein Homopolymer oder ein Kopolymer zu bilden.
  • Gruppe T oder Gruppe V des Dioxetans können z.B. an Membranen, Filme, Körnchen (beads) oder Polymere gebunden werden, für den Gebrauch in Immuno- oder Nukleinsäure- Tests. Die Gruppen werden mit z.B. Carboxylsäure-, Amino- oder Maleinimid-Substituenten versehen, um die Bindung zu erleichtern.
  • Gruppe T oder Gruppe V des Dioxetans können Substituenten enthalten, welche die Kinetik des Peroxidase-induzierten Dioxetan-Abbaus beschleunigen, z.B. elektronenreiche Komponenten (z.B. eine Methoxygruppe).
  • Ein anderes Beispiel einer chemischen Synthese umfaßt die Umwandlung des Olefin-Vorläufers zu einem 1,2-Bromohydroperoxid, durch Reaktion des Olefins mit H&sub2;O&sub2; und Dibromatin (1,3-Dibromo-5,5-dimethylhydantoin). Eine Behandlung des 1,2-Bromohydroperoxids mit einer Base, z.B. NaOH, oder Silbersalzen, z.B. Silberbromid, bildet das Dioxetan.
  • Eher als durch eine Behandlung des Olefins mit photochemisch erzeugtem Singulett-Sauerstoff, kann das Dioxetan durch Behandlung des Olefins mit Triphenylphosphitozonid oder Triethylsilylhydrotrioxid, wie in Posner et al., J. Am. Chem. Soc. 109:278-79 (1987) beschrieben, hergestellt werden.
  • Eine andere Methode zur Herstellung des Olefin-Vorläufers umfaßt die McMurry-Reaktion, in der der Chromophor und die Carbonylform des Gruppe-T-Olefins mit TiCl&sub3;/LAH umgesetzt werden, um das Olefin zu bilden. Modifizierte McMurry-Reaktionen, z.B. wo TiCl&sub4;/TMEDA/Zn anstelle von TiCl&sub3;/LAH benutzt wird, können ebenfalls benutzt werden.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Kit zum Nachweis einer ersten Substanz in einer Probe zur Verfügung, wobei das Kit ein Dioxetan der folgenden Formel enthält
  • wobei T eine substituierte oder unsubstituierte Aryl-, Polyaryl-, Cycloalkyliden- oder Polycycloalkylidengruppe ist, die spiro-verknüpft mit dem Kohlenstoffatom 3 des genannten Dioxetans ist, X CR&sub7;R&sub8;, O, S oder N-R ist (wobei jeder von R&sub7;, R&sub8; und R unabhängig voneinander H, eine Alkyl-, Heteroalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Cycloalkyl-, Cycloheteroalkyl-, Aralkyl-, Alkaryl- oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe ist) und jeder von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; unabhängig voneinander H, eine elektronenziehende Gruppe, eine elektronenschiebende Gruppe, eine Heteroaryl- oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe ist; und
  • das Enzym in der Lage ist, den Zerfall des Dioxetans zu verursachen, welches eine fluoreszierende Substanz mit der folgenden Formel bildet.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls eine Verbindung mit der folgenden Formel zur Verfügung
  • wobei jeder von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; unabhängig voneinander H, eine elektronenziehende Gruppe, eine elektronenschiebende Gruppe, eine Heteroaryl- oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe ist.

Claims (31)

1. Ein Dioxetan der Formel
wobei T eine substituierte oder unsubstituierte Aryl-, Polyaryl-, Cycloaklyliden- oder Polycycloalkylidengruppe ist, die spiro-verknüpft mit dem Kohlenstoffatom 3 des genannten Dioxetans ist;
X CR&sub7;R&sub8;, O, S oder N-R ist (wobei jeder von R&sub7;, R&sub8; und R jeweils unabhängig voneinander H, eine Alkyl-, Heteroalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Cycloalkyl-, Cycloheteroalkyl-, Aralkyl-, Arkaryl- oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe ist);
und jeder von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; unabhängig voneinander H, eine elektronenziehende Gruppe, eine elektronenschiebende Gruppe, eine Heteroarylgruppe oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe ist,
wobei das genannte Dioxetan in der Lage ist, bei seiner Zersetzung eine lumineszente Substanz der folgenden Formel zu bilden
2. Ein Dioxetan nach Anspruch 1, wobei mindestens eine der genannten Gruppen T, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; unabhängig voneinander eine durch Enzyme spaltbare Gruppe enthält.
3. Ein Dioxetan nach Anspruch 2, wobei die genannte durch Enzyme spaltbare Gruppe Phosphat enthält.
4. Ein Dioxetan nach Anspruch 1, wobei die Gruppe X O ist, Gruppen R&sub1;-R&sub3; und R&sub6; H sind und Gruppen R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander H oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe sind.
5. Ein Dioxetan nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gruppe T eine Polycycloalkyliden-Gruppe ist.
6. Ein Dioxetan nach Anspruch 5, wobei die Gruppe T Adamatyliden ist.
7. Eine Verbindung der Formel
wobei R H, C&sub1;-C&sub5;-Alkylgruppe, Acetyl- oder PO&sub4;-Gruppe ist.
8. Eine Verbindung der Formel
wobei R H, eine C&sub1;-C&sub5;-Alkylgruppe, Acetyl- oder PO&sub4;- Gruppe ist.
9. Eine Verbindung der Formel
wobei R H, eine C&sub1;-C&sub5;-Alkylgruppe, Acetyl- oder PO&sub4;- Gruppe ist.
10. Eine Verbindung der Formel
wobei R H, eine C&sub1;-C&sub5;-Alkylgruppe, Acetyl- oder PO&sub4;- Gruppe ist.
11. Eine Verbindung der Formel
wobei R H, eine C&sub1;-C&sub5;-Alkylgruppe, Acetyl- oder PO&sub4;- Gruppe ist.
12. Eine Verbindung der Formel
wobei jeder von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; unabhängig voneinander H, eine elektronenziehende Gruppe, eine elektronenschiebende Gruppe, eine Heteroarylgruppe oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe ist.
13. Ein Testverfahren, bei dem ein Mitglied von einem spezifischen Bindungspaar mittels einer optisch nachweisbaren Reaktion nachgewiesen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die optisch nachweisbare Reaktion die Reaktion von einem Dioxetan der folgenden Formel mit einem Enzym einschließt
wobei T eine substituierte oder unsubstituierte Aryl-, Polyaryl-, Cycloalkyliden- oder Polycycloalkylidengruppe ist, die spiro-verknüpft mit dem Kohlenstoffatom 3 des genannten Dioxetans ist;
X CR&sub7;R&sub8;, O, S oder N-R ist (wobei jeder von R&sub7;, R&sub8; und R jeweils unabhängig voneinander H, eine Alkyl-, Heteroalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Cycloalkyl-, Cycloheteroalkyl-, Aralkyl-, Arkaryl- oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe ist);
und jeder von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; unabhängig voneinander H, eine elektronenziehende Gruppe, eine elektronenschiebende Gruppe, eine Heteroarylgruppe oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe ist,
wobei das Enzym bewirkt, daß das Dioxetan zerfällt und dabei eine lumineszente Substanz der folgenden Formel bildet
14. Ein Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Gruppe X O ist, Gruppen R&sub1;-R&sub3; und R&sub6; H sind, und Gruppen R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander H oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe sind.
15. Ein Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das genannte Dioxetan eine durch Enzyme spaltbare Gruppe enthält und das genannte Enzym bewirkt, daß das genannte Dioxetan durch die Spaltung der genannten durch Enzyme spaltbaren Gruppe des genannten Dioxetans zerfällt.
16. Ein Verfahren nach Anspruch 15, wobei die genannte durch Enzyme spaltbare Gruppe Phosphat enthält und das genannte Enzym Phosphatase einschließt.
17. Ein Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das genannte Enzym eine Oxido-Reduktase ist und Dioxetan durch Spaltung der O-O-Bindung des 4-gliedrigen Ringteils des genannten Dioxetans dazu bringt, sich zu zersetzen.
18. Ein Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das genannte Enzym eine Peroxidase einschließt.
19. Ein Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das genannte Enzym Meerrettich-Peroxidase ist.
20. Ein Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das genannte Enzym Mikroperoxidase ist.
21. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 20, wobei das genannte spezifische Bindungspaar ein Antigen und einen Antikörper umfaßt.
22. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 20, wobei das genannte spezifische Bindungspaar eine Nukleinsäure und eine Probe umfaßt, die in der Lage ist, an die gesamte oder einen Teil der genannten Nukleinsäure zu binden.
23. Ein Verfahren zum Nachweis eines Enzyms in einer Probe, welches Verfahren die folgenden Schritte umfaßt
(a) man stellt ein Dioxetan der folgenden Formel zur Verfügung
wobei T eine substituierte oder unsubstituierte Aryl-, Polyaryl-, Cycloaklyliden- oder Polycycloalkylidengruppe ist, die spiro-verknüpft mit dem Kohlenstoffatom 3 des genannten Dioxetans ist;
X CR&sub7;R&sub8;, O, S oder N-R ist (wobei jeder von R&sub7;, R&sub8; und R jeweils unabhängig voneinander H, eine Alkyl-, Heteroalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Cycloalkyl-, Cycloheteroalkyl-, Aralkyl-, Arkaryl- oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe ist);
und jeder von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; unabhängig voneinander H, eine elektronenziehende Gruppe, eine elektronenschiebende Gruppe, eine Heteroarylgruppe oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe ist,
(b) man bringt das genannte Dioxetan mit der genannten Probe, die das genannte Enzym enthält in Kontakt,
woraufhin das genannte Enzym das genannte Dioxetan dazu bringt, sich zu zersetzen und eine lumineszente Substanz der folgenden Formel zu bilden;
(c) und man weist die genannte lumineszente Substanz, als einen Hinweis auf die Gegenwart des genannten Enzyms nach.
24. Ein Verfahren nach Anspruch 23, wobei die genannte Gruppe X O ist, Gruppen R&sub1;-R&sub3; und R&sub6; H sind und Gruppen R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander H oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe sind.
25. Ein Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei das genannte Dioxetan eine durch Enzyme spaltbare Gruppe enthält und das genannte Enzym das genannte Dioxetan durch die Spaltung der genannten durch Enzyme spaltbaren Gruppe des genannten Dioxetans zum Zersetzen bringt.
26. Ein Verfahren nach Anspruch 25, wobei die genannte durch Enzyme spaltbare Gruppe Phosphat enthält und das genannte Enzym Phosphatase einschließt.
27. Ein Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei das genannte Enzym eine Oxido-Reduktase ist und das genannte Dioxetan durch Spaltung der O-O-Bindung des 4- gliedrigen Ringteils des genannten Dioxetans dazu bringt sich zu zersetzen.
28. Ein Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei das genannte Enzyme eine Peroxidase einschließt.
29. Ein Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei das genannte Enzym Meerrettich-Peroxidase ist.
30. Ein Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei das genannte Enzym Mikroperoxidase ist.
31. Ein Kit für den Nachweis einer ersten Substanz in einer Probe, wobei das Kit ein Dioxetan der folgenden Formel enthält
wobei T eine substituierte oder unsubstituierte Aryl-, Polyaryl-, Cycloaklyliden- oder Polycycloalkylidengruppe ist, die spiro-verknüpft mit dem Kohlenstoffatom 3 des genannten Dioxetans ist;
X CR&sub7;R&sub8;, O, S oder N-R ist (wobei jeder von R&sub7;, R&sub8; und R jeweils unabhängig voneinander H, eine Alkyl-, Heteroalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Cycloalkyl-, Cycloheteroalkyl-, Aralkyl-, Arkaryl- oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe ist);
und jeder von R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; unabhängig voneinander H, eine elektronenziehende Gruppe, eine elektronenschiebende Gruppe, eine Heteroarylgruppe oder eine durch Enzyme spaltbare Gruppe ist,
und ein Enzym, welches in der Lage ist, die Zersetzung des genannten Dioxetans zu verursachen, wobei dieses eine fluoreszierende Substanz der folgenden Formel bildet
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