DE3788203T2 - Verfahren zum nachweis einer verbindung unter verwendung des enzymatisch induzierten zerfalls von dioxethanen. - Google Patents

Verfahren zum nachweis einer verbindung unter verwendung des enzymatisch induzierten zerfalls von dioxethanen.

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DE3788203T2 DE87902259T DE3788203T DE3788203T2 DE 3788203 T2 DE3788203 T2 DE 3788203T2 DE 87902259 T DE87902259 T DE 87902259T DE 3788203 T DE3788203 T DE 3788203T DE 3788203 T2 DE3788203 T2 DE 3788203T2
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Description

  • Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Dioxetanen zum Nachweis einer Substanz in einer Probe.
  • Dioxetane sind Verbindungen mit einem 4-gliedrigen Ring, wobei 2 der Glieder aneinander gebundene Sauerstoffatome sind. Dioxetane können thermisch oder photochemisch zur Bildung von Carbonylprodukten, d. h. Ketonen oder Aldehyden, abgebaut werden. Die Aufspaltungen sind von einer Energiefreisetzung in Form von Licht (d. h., Lumineszenz) begleitet.
  • Im allgemeinen stellt die Erfindung in einem ersten Merkmal eine Verbesserung in einem Testverfahren dar, wobei ein Glied eines spezifischen Bindungspaares (d. h. zwei Substanzen, die spezifisch aneinander binden) durch eine optisch nachweisbare Reaktion nachgewiesen wird. Die Verbesserung umfaßt die Reaktion mit einem Enzym eines Dioxetans mit der allgemeinen Formel
  • wobei T eine substituierte (d. h. eine oder mehr C&sub1;-C&sub7; Alkylgruppen oder Heteroatomgruppen, z. B. Carbonylgruppen, enthaltende) oder nichtsubstituierte Cycloalkyl- (mit 6 bis inklusive 12 Kohlenstoffatomen im Ring) oder Polycycloalkylgruppe (mit 2 oder mehr verschmolzenen Ringen, wobei jeder Ring unabhängig 5 bis inklusive 12 Kohlenstoffatome aufweist) ist, die an den 4-gliedrigen Ringteil des Dioxetans durch eine Spirobindung gebunden ist; V H oder eine enzymspaltbare Gruppe ist; Y ein fluoreszierender Chromophor ist (d. h., Y ist imstande, Energie zur Erzeugung eines angeregten, d. h. höheren Energie, Zustandes zu absorbieren, in dem es Licht emittiert, um in seinen ursprünglichen Energiezustand zurückzukehren); X H, eine Alkylgruppe mit gerader oder verzweigter Kette (mit 1 bis inklusive 7 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methyl), ein Heteroalkyl mit gerader oder verzweigter Kette (mit 1 bis inklusive 7 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methoxy, Hydroxyethyl oder Hydroxypropyl), Aryl (mit zumindest 1 Ring, wie z. B. Phenyl), Heteroaryl (mit zumindest 1 Ring, wie z. B. Pyrrolyl oder Pyrazolyl), Cycloalkyl (mit 3 bis inklusive 7 Kohlenstoffatomen im Ring, wie z. B. Cyclohexyl), Cycloheteroalkyl (mit 2 bis inklusive 7 Kohlenstoffatomen im Ring, wie z. B. Dioxan), Aralkyl (mit zumindest 1 Ring, wie z. B. Benzyl), oder Alkaryl (mit zumindest 1 Ring, wie z. B. Tolyl) oder eine enzymspaltbare Gruppe ist, d. h., eine Gruppe mit einer Bindung, die durch ein Enzym spaltbar ist, um eine elektronenreiche, an das Dioxetan gebundene Komponente zu erhalten, wie z. B. Phosphat, bei dem eine Phosphor-Sauerstoffbindung durch ein Enzym, z. B. Säurephosphatase oder alkalische Phosphatase, gespalten werden kann, um einen negativ geladenen, an das Dioxetan gebundenen Sauerstoff zu erhalten; und Z H, OH oder eine enzymspaltbare Gruppe (wie oben definiert) ist, mit der Bedingung, daß zumindest eines von V, X oder Z eine enzymspaltbare Gruppe sein muß, (so daß das Enzym die enzymspaltbare Gruppe zur Bildung eines negativ geladenen Substituenten (z. B. eines Sauerstoffanions), der an das Dioxetan gebunden ist, spaltet) wobei der negativ geladene Substituent bewirkt, daß das Dioxetan zur Bildung einer lumineszenten Substanz abgebaut wird (d. h., zu einer Substanz, die Energie in Form von Licht emittiert), die die Gruppe Y umfaßt. Die lumineszente Substanz wird als Hinweis auf die Gegenwart der ersten Substanz nachgewiesen. Durch Messung der Lumineszenzstarke kann die Konzentration der ersten Substanz bestimmt werden.
  • In bevorzugten Ausführungsbeispielen enthalten eine oder mehrere der Gruppen T, X oder Y ferner einen löslichmachenden Substituenten, z. B. Carbonsäure, Sulfonsäure oder quaternäres Aminosalz; die Gruppe T des Dioxetans ist eine Polycycloalkylgruppe, vorzugsweise Adamantyl; die enzymspaltbare Gruppe enthält Phosphat; und das Enzym besitzt Phosphataseaktivität.
  • Die Erfindung stellt auch eine Vorrichtung zum Nachweis einer ersten Substanz in einer Probe dar.
  • In einem zweiten Merkmal stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Enzyms in einer Probe dar. Das Verfahren beinhaltet das In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem obenbeschriebenen Dioxetan, wobei die Gruppe V, X oder Z von dem nachgewiesenen Enzym gespalten werden kann. Das Enzym (falls vorhanden) spaltet die Gruppe zur Bildung eines negativ geladenen Substituenten (z. B. eines Sauerstoffanions), der an das Dioxetan gebunden ist. Dieser Substituent destabilisiert das Dioxetan und kann bewirken, daß das Dioxetan zur Bildung einer lumineszenten Substanz abgebaut wird (die die Gruppe Y des Dioxetans enthält). Die lumineszente Substanz wird als Hinweis auf die Gegenwart des Enzyms nachgewiesen. Durch Messing der Lumineszenzstärke kann auch die Enzymkonzentration bestimmt werden.
  • Die Erfindung schafft ein einfaches, sehr empfindliches Verfahren zum Nachweis von Substanzen in Proben, z. B. biologischen Proben, und ist für Substanzen, die in geringen Konzentrationen vorliegen, besonders zweckmäßig. Da der Dioxetanabbau als Anregungsenergiequelle für Chromophor Y dient, ist keine externe Anregungsenergie, wie z. B. Licht, notwendig. Da sich außerdem die Dioxetanmoleküle bereits im richtigen Oxidationszustand für den Abbau befinden, ist es nicht notwendig, externe Oxidantien, wie z. B. H&sub2;O&sub2; oder O&sub2;, beizufügen. Der enzymatisch ausgelöste Abbau ermöglicht eine hohe Empfindlichkeit, da ein Enzymmolekül viele Dioxetanmoleküle zum Lumineszieren bringen kann, wodurch eine verstärkende Wirkung erzeugt wird. Ferner kann die Wellenlänge (oder Energie) der Emission und die Quantenausbeuten der Lumineszenz durch die Wahl des Y-Substituenten des Dioxetans verändert werden ("Quantenausbeute", wie hierin verwendet, bezeichnet die Anzahl von Photonen, die von dem lumineszenten Produkt pro Molzahl des abgebauten Dioxetans emittiert werden). Zusätzlich können durch geeignete Veränderungen der T, X und Y Gruppen des Dioxetans die Löslichkeit des Dioxetans und die Kinetik des Dioxetanabbaus verändert werden. Die Dioxetane können auch an eine Vielzahl von Molekülen, z. B. Proteine oder Haptene, oder Immobilisierungssubstraten, z. B. Polymermembranen, angeheftet oder als Seitengruppe in einem Homopolymer oder Copolymer enthalten sein.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsbeispiele und den Ansprüchen hervor.
  • Es werden nun die Struktur, Synthese und Verwendung einiger Ausführungsbeispiele der Erfindung beschrieben.
    • Struktur
  • In der Erfindung werden Dioxetane mit der oben definierten Struktur verwendet. Die Aufgabe der Gruppe T ist die Stabilisierung des Dioxetans, d. h. zu verhindern, daß das Dioxetan abgebaut wird, bevor die durch ein Enzym spaltbare Gruppe Z gespalten ist. Große, voluminöse, sterisch gehinderte Moleküle, z. B. verschmolzene polycyclische Moleküle, sind die wirksamsten Stabilisatoren. Zusätzlich enthält T vorzugsweise nur C-C und C-H Einzelbindungen. Das bevorzugteste Molekül ist eine Adamantylgruppe, bestehend aus 3 verschmolzenen Cyclohexylringen. Die Adamantylgruppe ist durch eine Spirobindung an den 4-gliedrigen Ringteil des Dioxetans gebunden.
  • Die Gruppe Y ist ein fluoreszierender Chromophor, der an die Gruppe Z gebunden ist. Y wird lumineszent, wenn ein Enzym die Gruppe V, X oder Z spaltet und dadurch eine elektronenreiche Komponente erzeugt, die das Dioxetan destabilisiert, wodurch ein Abbau des Dioxetans verursacht wird. Durch den Abbau werden 2 einzelne Ketone erzeugt, von welchen eines die Gruppe T und das andere die Gruppen X, Y und Z enthält; die Energie, die beim Dioxetanabbau freigesetzt wird, führt zu einem Lumineszieren der Y-Gruppe des letzteren Ketons (wenn die Gruppe X H ist, entsteht ein Aldehyd).
  • Die Energie des angeregten Zustandes des Chromophors Y (d. h., die Energie, die der Chromophor Y besitzen muß, um Licht zu emittieren) ist vorzugsweise geringer als die Energie des angeregten Zustandes des Ketons, das die Gruppe T enthält, um die Lumineszenz auf die Gruppe Y zu beschränken. Wenn zum Beispiel T Adamantyl ist, ist die Energie des angeregten Zustandes des Chromophors Y vorzugsweise geringer als die Energie des angeregten Zustandes von Spiroadamantanon.
  • Gemäß der Erfindung kann jeder Chromophor Y verwendet werden. Im allgemeinen ist es wünschenswert, einen Chromophor zu verwenden, der die Quantenausbeute maximiert, so daß die Empfindlichkeit erhöht wird.
  • Beispiele geeigneter Chromophoren umfassen folgende:
  • 1) Anthracen und Anthracenderivate, z. B. 9,10-Diphenylanthracen, 10-Methylanthracen, 9-Anthracencarboxaldehyd, Anthrylalkohole und 9-Phenylanthracen;
  • 2) Rhodamin und Rhodaminderivate, z. B. Rhodole, Tetramethylrhodamin, Tetraethylrhodamin, Diphenyldimethylrhodamin, Diphenyldiethylrhodamin und Dinaphthylrhodamin;
  • 3) Fluorescein und Fluoresceinderivate, z. B. 5-Jodacetamidofluorescein, 6-Jodacetamidofluorescein und Fluorescein-5-maleimid;
  • 4) Eosin und Eosinderivate, z. B. Hydroxyeosine, Eosin-5-jodacetamid und Eosin-5-maleimid;
  • 5) Cumarin und Cumarinderivate, z. B. 7-Dialkylamino-4-methylcumarin, 4-Bromomethyl-7-methoxycumarin und 4-Bromomethyl-7-hydroxycumarin;
  • 6) Erythrosin und Erythrosinderivate, z. B. Hydroxyerythrosine, Erythrosin-5-jodacetamid und Erythrosin-5-maleimid;
  • 7) Aciridin und Aciridinderivate, z. B. Hydroxyaciridine, und 9-Methylaciridin;
  • 8) Pyren und Pyrenderivate, z. B. N-(1-Pyren)-jodacetamid, Hydroxypyrene und 1-Pyrenmethyljodacetat;
  • 9) Stilben und Stilbenderivate, z. B., 6,6'-Dibromostilben und Hydroxystilbene;
  • 10) Naphthalen und Naphthalenderivate, z. B. 5-Dimethylaminonaphthalen-1-sulfonsäure und Hydroxynaphthalen;
  • 11) Nitrobenzoxadiazole und Nitrobenzoxadiazolderivate, z. B. Hydroxynitrobenzoxadiazole, 4-Chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol,2-(7-Nitrobenz-2-oxa- 1,3-diazol-4-yl)methylaminoacetaldehyd und 6-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) aminohexansäure;
  • 12) Chinolin und Chinolinderivate, z. B. 6-Hydroxychinolin und 6-Aminochinolin;
  • 13) Acridin und Acridinderivate, z. B. N-Methylacridin und N-Phenylacridin;
  • 14) Acidoacridin und Acidoacridinderivate, z. B. 9-Methylacidoacridin und Hydroxy-9-methylacidoacridin;
  • 15) Carbazol und Carbazolderivate, z. B. N-Methylcarbazol und Hydroxy-N-methylcarbazol;
  • 16) Fluoreszierende Cyanine, z. B. DCM (ein Laserfarbstoff), Hydroxycyanine, 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien, 1-(4-Dimethylaminophenyl)-6-phenyl -hexatrien und die entsprechenden 1,3-Butadiene;
  • 17) Carbocyanin und Carbocyaninderivate, z. B. Phenylcarbocyanin und Hydroxycarbocyanine;
  • 18) Pyridiniumsalze, z. B. 4(4-Dialkyldiaminostyryl) N-Methylpyridiniumjodat und Hydroxy-substituierte Pyridiniumsalze;
  • 19) Oxonole; und
  • 20) Resorofine und Hydroxyresorofine.
  • Die bevorzugtesten Chromophore sind Hydroxyderivate von Anthracen oder Naphthalen; die Hydroxygruppe erleichtert die Bindung an die Gruppe Z.
  • Die Gruppe Z ist vorzugsweise durch eine enzymspaltbare Bindung an den Chromophor Y gebunden. Der Kontakt mit dem richtigen Enzym spaltet die enzymspaltbare Bindung, wodurch eine elektronenreiche Komponente erhalten wird, die an den Chromophor Y gebunden ist; diese Komponente löst den Abbau des Dioxetans in 2 einzelne Ketone oder in ein Keton und einen Aldehyd, wenn die Gruppe X H ist, aus. Beispiele solcher elektronenreichen Komponenten umfassen Sauerstoff, Schwefel und Amin oder Amidoanionen. Die bevorzugteste Komponente ist ein Sauerstoffanion. Beispiele für geeignete enzymspaltbare Gruppen und Enzyme, die für diese Gruppen spezifisch sind, werden in der folgenden Tabelle 1 angeführt; ein Pfeil zeigt die enzymspaltbare Bindung. Die bevorzugteste Gruppe ist ein Phosphatester, der durch alkalische oder saure Phosphataseenzyme gespalten wird.
    • Tabelle 1
  • Enzymspaltbare Gruppe Enzym
  • 1) alkalische und saure Phosphatasen
  • Phosphatester
  • 2) Esterasen
  • Acetatester
  • 3) Decarboxylasen
  • Carboxyl
  • 4) Phospholipase D
  • 1 -Phospho-2,3-diacyl Glyceride
  • 5) β-Xylosidase
  • β-D-Xylosid
  • 6) β-D-Fucosidase
  • β-D-Fucosid
  • 7) Thioglucosidase
  • 1-Thio-D-Glucosid
  • 8) ATPase
  • Adenosintriphosphatanaloge
  • 9) ADPase
  • Adenosindiphosphatanaloge
  • 10) 5'Nucleotidase
  • AMP Analoge
  • 11) β-D-Galactosidase
  • Bezugszeichenliste
  • -D-Galactosid
  • 12) α-D-Galactosidase
  • α-D-Galactosid
  • 13) α-D-Glucosidase
  • α-D-Glucosid
  • 14) β-D-Glucosidase
  • β-D-Glucosid
  • 15) α-D-Mannosidase
  • α-D-Mannosid
  • 16) -D-Mannosidase
  • β-D-Mannosid
  • 17) β-D-Fructofuranosidase
  • β-D-Fructofuranosid
  • 18) β-D-Glucosiduronase
  • β-D-Glucosiduronat
  • 19) Trypsin
  • p-Toluensulfonyl-L-arginin Farbstoffester
  • 20) Trypsin
  • p-Toluensulfonyl-L-arginin Farbstoffamid
  • Geeignete X Gruppen sind oben beschrieben. Vorzugsweise enthält X einen oder mehr löslichmachende Substituenten, d. h. Substituenten, die die Löslichkeit des Dioxetans in wässeriger Lösung verstärken. Beispiele für löslichmachende Substituenten umfassen Carbonsäuren, z. B. Essigsäure; Sulfonsäuren, z. B. Methansulfonsäure; und quaternäre Aminosalze, z. B. Ammoniumbromid; der bevorzugteste löslichmachende Substituent ist Methan oder Ethansulfonsäure.
  • Vorzugsweise ist das Enzym, das die Gruppe V, X oder Z spaltet, kovalent an eine Substanz mit einer spezifischen Affinität für die nachzuweisende Substanz gebunden. Beispiele für Substanzen mit spezifischer Affinität umfassen Antikörper, z. B. Anti-hCG, wobei die nachzuweisende Substanz ein Antigen ist, z. B. hCG; Antigene, z. B., hCG, wobei die nachzuweisende Substanz ein Antikörper ist, z. B. Anti-hCG; oder eine Sonde, die imstande ist, an jede oder einen Teil einer nachzuweisenden Nulceinsäure zu binden, z. B. DNA oder RNA. Die Bindung ist vorzugsweise eine Amidbindung.
    • Synthese
  • Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Dioxetane in zwei Schritten synthetisiert. Der erste Schritt umfaßt das Synthetisieren eines richtig substituierten Olefins mit der Formel
  • wobei T, X, Y und Z wie oben beschrieben sind. Diese Olefine werden vorzugsweise unter Verwendung der Wittig-Reaktion synthetisiert, wobei ein Keton, das die T-Gruppe enthält, mit einem Phosphorylid (vorzugsweise auf der Basis von Triphenylphosphin), das die X, Y und Z Gruppen enthält, wie folgt zur Reaktion gebracht wird:
  • Die Reaktion wird vorzugsweise bei -78ºC in einem etherischen Lösungsmittel, z. B. Tetrahydrofuran (THF), durchgeführt.
  • Das Phosphorylid wird hergestellt, indem Triphenylphosphat mit einer halogenierten Verbindung, die die X, Y und Z Gruppen enthält, in Gegenwart einer Base zur Reaktion gebracht wird; Beispiele für bevorzugte Basen umfassen n-Butyllithium, Natriumamid, Natriumhydrid und Natriumalkoxid; die bevorzugteste Base ist n-Butyllithium. Der Reaktionsablauf ist wie folgt:
  • wobei Q ein Halogen ist, z. B. Cl, Br oder I. Das bevorzugte Halogen ist Br. Die Reaktion wird vorzugsweise bei -78ºC in THF durchgeführt.
  • Das Olefin, bei dem T Adamantyl (Ad), X Methoxy (OCH&sub3;), Y Anthracen (An) und Z Phosphat (PO&sub4;) ist, kann wie folgt synthetisiert werden.
  • wird durch Behandlung mit dem Produkt der An-OH
  • Phosphorsäure, die in Gegenwart von HgCl&sub2; mit N-Methylimidazol zur Reaktion gebracht wurde, phosphoryliert; das Endergebnis ist der Austausch der Hydroxylgruppe von An durch eine Phosphatgruppe. Das phosphorylierte Produkt wird dann mit Triphenylphosphin bei 78ºC in THF zur Reaktion gebracht zur Bildung des Phosphorylids mit der Formel
  • Die Reaktion wird in einer trockenen Ar Atmosphäre durchgeführt. Spiroadamantanon (Ad=O) wird dann der Lösung, die das Ylid enthält, beigegeben, während die Temperatur bei 78ºC gehalten wird, um das Olefin mit der Formel
  • zu bilden. Das Olefin wird dann unter Anwendung herkömmlicher Chromatographieveffahren gereinigt.
  • Der zweite Schritt in der Synthese der Dioxetane umfaßt die Umwandlung des zuvor beschriebenen Olefins in das Dioxetan. Vorzugsweise wird die
  • Umwandlung photochemisch durch Behandlung des Olefins mit Singulettsauerstoff (10- in Gegenwart von Licht durchgeführt. 102 wird zur Bildung des Dioxetans wie folgt über die Doppelbindung eingefügt:
  • Die Reaktion wird vorzugsweise bei 78ºC in einem halogenierten Lösungsmittel, z. B. Methylenchlorid durchgeführt. 102 wird bei Verwendung eines Photosensibilisators erzeugt. Beispiele für solche Photosensibilisatoren umfassen polymergebundenes Rose Bengal (im Handel als Sensitox I bekannt und von Hydron Laboratories, New Brunswick, N.J., erhältlich) und Methylenblau (ein allgemein bekannter Farbstoff und pH-Indikator). Der bevorzugteste Sensibilisator ist Rose Bengal.
  • Es folgt die Synthese von Dioxetan mit der Formel
  • Das Olefin mit der Formel
  • wird in Methylenchlorid gelöst, und die Lösung wird in ein 2-cm² Pyrexröhrchen, das mit einem Glaspaddelrührer ausgestattet ist, eingebracht; das Paddel wird von oben durch einen befestigten, in Glas eingeschlossenen, Stabmagnet angetrieben. Die Lösung wird auf 78ºC gekühlt und 1g polymergebundenes Rose Bengal unter Rühren beigegeben. Dann wird Sauerstoff über die Oberfläche der gerührten Lösung geleitet, während das Reagensglas dem Licht einer 500W Wolfram-Halogenlampe (GE QSOO C1) ausgesetzt wird, die mit einem UV-Trennfilter (Corning 3060: Durchlässigkeit bei 365 nm = 0,5%) ausgestattet ist. Das Verschwinden des Olefins und gleichzeitige Auftreten des Dioxetans wird mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) aufgezeichnet. Nach Beendigung der Reaktion (wie durch TLC angezeigt), wird das Lösungsmittel entfernt und das Dioxetan isoliert.
    • Verwendung
  • Es gibt eine Vielzahl von Tests, die visuell nachweisbare Mittel zur Bestimmung der Gegenwart oder Konzentration einer bestimmten Substanz in einer Probe verwenden. Die obenbeschriebenen Dioxetane können bei jedem dieser Tests eingesetzt werden. Beispiele für solche Tests umfassen Immunotests für den Nachweis von Antikörpern oder Antigenen, z. B. - oder β-hCG; Enzymtests; chemische Tests für den Nachweis von z. B. Kalium oder Natriumionen; Nucleinsäuretests für den Nachweis von z. B. Viren (z. B. HTLV III oder Cytomegalovirus, oder Bakterien (z. B. E. Coli)).
  • Wenn die nachweisbare Substanz ein Antikörper, Antigen oder eine Nucleinsäure ist, ist das Enzym, das imstande ist, die Gruppe Z des Dioxetans zu spalten, vorzugsweise an eine Substanz gebunden, die eine spezifische Affinität für die nachweisbare Substanz besitzt (d. h. eine Substanz, die spezifisch an die nachweisbare Substanz bindet), z. B. ein Antigen, Antikörper bzw. eine Nucleinsäurensonde. Zur Bindung des Enzyms an die Substanz mit spezifischer Affinität werden herkömmliche Verfahren, z. B. die Carbodiimidkopplung, verwendet; die Bindung erfolgt vorzugsweise durch eine Amidbindung.
  • Im allgemeinen werden die Tests wie folgt durchgeführt. Eine Probe, von der vermutet wird, daß sie eine nachweisbare Substanz enthält, wird mit einer gepufferten Lösung in Kontakt gebracht, die ein Enzym enthält, das an eine Substanz mit einer spezifischen Affinität für die nachweisbare Substanz gebunden ist. Die erhaltene Lösung wird inkubiert, so daß die nachweisbare Substanz an den Teil mit spezifischer Affinität der Enzymverbindung mit spezifischer Affinität binden kann. Überschüssige Enzymverbindung mit spezifischer Affinität wird dann abgewaschen und ein Dioxetan mit einer Gruppe Z zugefügt, die durch den Enzymteil der Enzymverbindung mit spezifischer Affinität gespalten werden kann. Das Enzym spaltet die Gruppe Z, bewirkt den Abbau des Dioxetans in 2 Ketone (oder einen Aldehyd und ein Keton, wenn die Gruppe X H ist); der Chromophor Y, der an eines der Ketone gebunden ist, wird somit angeregt und luminesziert. Die Lumineszenz wird unter Verwendung z. B. einer Küvette oder eines Kameraluminometers als Hinweis auf die Gegenwart der nachweisbaren Substanz in der Probe nachgewiesen. Zur Bestimmung der Konzentration der Substanz wird die Lumineszenzstarke gemessen.
  • Wenn die nachweisbare Substanz ein Enzym ist, ist keine Substanz mit spezifischer Affinität notwendig. Statt dessen wird ein Dioxetan mit einer Z Gruppe, die durch das nachgewiesene Enzym spaltbar ist, verwendet. Daher beinhaltet ein Test auf das Enzym die Zugabe des Dioxetans zu der enzymhaltigen Probe und den Nachweis der entstehenden Lumineszenz als Hinweis auf die Gegenwart und Konzentration des Enzyms.
  • Beispiele für Tests gemäß der vorliegenden Erfindung sind in der Folge angeführt.
    • A. fest auf Human-IgG
  • Eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wird mit Schaf-Anti-Human-IgG (spezifisch für das F(ab)&sub2;-Fragment) beschichtet. Ein Serumprobe, die Human-IgG enthält, wird dann in die Vertiefungen eingebracht, und die Vertiefungen werden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationszeit wird die Serumprobe den Vertiefungen entnommen, und die Vertiefungen werden viermal mit einer wässerigen Pufferlösung gewaschen, die 0, 15M NaCl, 0,01M Phosphatase und 0,1% Rinderserumalbumin (pH 7,4) enthält.
  • Jeder Vertiefung wird alkalische Phosphatase, die an Anti-Human-IgG gebunden ist, beigegeben, und die Vertiefungen werden 1 Stunde inkubiert. Die Vertiefungen werden dann viermal mit der obigen Pufferlösung gewaschen und eine Pufferlösung eines phosphathältigen Dioxetans zugegeben. Die durch den enzymatischen Abbau des Dioxetans entstehende Lumineszenz wird in einem Luminometer oder mit einem photographischen Film in einem Kameraluminometer nachgewiesen.
    • B. Test auf hCG
  • Kaninchen-Anti-α-hCG wird auf einer Nylonmaschenmembran absorbiert. Eine hCG-hältige Probelösung, z. B. Harn von einer schwangeren Frau, wird durch die Membran fließen gelassen, wonach die Membran mit 1 ml einer Pufferlösung gewaschen wird, die 0, 15M NaCl, 0,01M Phosphat und 0, 1% Rinderserumalbumin (pH 7,4) enthält.
  • Mit alkalischer Phosphatase markiertes Anti-ß-hCG wird der Membran zugegeben, und die Membran wird neuerlich mit 2 ml der obigen Pufferlösung gewaschen. Die Membran wird dann in die Küvette eines Luminometers oder in ein Kameraluminometer eingebracht und mit einem phosphathältigen Dioxetan in Kontakt gebracht. Dann wird die durch den enzymatischen Abbau des Dioxetans entstehende Lumineszenz nachgewiesen.
    • C. Test auf alkalische Serumphosphatase
  • 2,7 ml einer wässerigen Pufferlösung, die 0,84M 2-Methyl-2-aminopropanol enthält, wird in ein 12·75 mm Pyrexreagensglas eingebracht und 0, 1 ml einer Serumprobe, die alkalische Phosphatase enthält, beigefügt. Die Lösung wird dann auf 30ºC äquilibriert. 0,2 ml eines phosphathältigen Dioxetans werden zugegeben und das Reagensglas sofort in ein Luminometer gestellt, um die entstehende Lumineszenz aufzuzeichnen. Der Wert der Lichtemission ist dem Maß der alkalischen Phosphataseaktivität proportional.
    • D. Nucleinsäurehybridisierungstest
  • Eine Probe einer Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), von der angenommen wird, daß sie ein Cytomegalovirus enthält, wird gesammelt und auf eine Nitrocellulosemembran gebracht. Die Probe wird dann chemisch mit Harnstoff oder Guanidiniumisothiocyanat zum Aufbrechen der Zellwände und zum Abbau aller zellulären Komponenten mit Ausnahme der viralen DNA behandelt. Die Stränge der so erhaltenen viralen DNA werden getrennt und auf den Nitrocellulosefilter geheftet. Eine DNA-Sonde, die für die virale DNA spezifisch und mit alkalischer Phosphatase markiert ist, wird dann auf den Filter aufgebracht; die Sonde hybridisiert mit den komplementären viralen DNA-Strängen. Nach der Hybridisierung wird der Filter mit einer wässerigen Pufferlösung, die 0,2 M NaCl und 0, 1 mM Tris-HCl (pH=8,0) enthält, zur Entfernung überschüssiger Sondenmoleküle gewaschen. Ein phosphathältiges Dioxetan wird dann beigefügt und die aus dem enzymatischen Abbau entstehende Lumineszenz des Dioxetans in einem Luminometer gemessen oder mit einem photographischen Film nachgewiesen.
  • Es sind natürlich andere Ausführungsbeispiele gemäß der Erfindung möglich.
  • Zum Beispiel kann die enzymspaltbare Gruppe Z an die Gruppe X des Dioxetans anstatt an die Gruppe Y gebunden sein. Die Substanz mit spezifischer Aktivität kann an das Dioxetan durch die Gruppen X, Y oder T (vorzugsweise Gruppe X) anstelle des Enzyms gebunden sein. In diesem Fall ist die Gruppe, an die die Substanz mit spezifischer Aktivität gebunden ist, mit z. B. einem Carbonsäure, Amino oder Maleimidsubstituenten versehen, um die Bindung zu erleichtern.
  • Die Gruppen X, Y oder T des Dioxetans können an eine polymerisierbare Gruppe, z. B. eine Vinylgruppe, die zur Bildung eines Homopolymers oder Copolymers polymerisiert werden kann, gebunden sein.
  • Die Gruppen X, Y oder T des Dioxetans können z. B. an Membranen, Filme, Körner oder Polymere zur Verwendung in Immuno oder Nucleinsäuretests gebunden sein. Die Gruppen sind z. B. mit einem Carbonsäure, Amino oder Maleimidsubstituenten versehen, um die Bindung zu erleichtern.
  • Die Gruppen X, Y oder T des Dioxetans können Substituenten enthalten, die die Kinetik des enzymatischen Abbaus des Dioxetans verstärken, wie z. B. elektronenreiche Komponenten (z. B. Methoxy).
  • Die Gruppen Y oder T des Dioxetans, wie auch die Gruppe X, können löslichmachende Substituenten enthalten.
  • Richtig substituierte Dioxetane können chemisch wie auch photochemisch synthetisiert werden. Zum Beispiel kann das Olefin, das durch die Wittig-Reaktion hergestellt wurde, unter Verwendung einer Persäure, z. B. p-Nitroperbenzoesäure, epoxydiert werden. Das epoxydierte Olefin kann dann durch Behandlung mit einem Ammoniumsalz, z. B. Tetramethylammoniumhydroxid, zu dem Dioxetan umgewandelt werden.
  • Ein weiteres Beispiel einer chemischen Synthese umfaßt die Umwandlung des Olefins, das durch die Wittig-Reaktion erhalten wurde, in ein 1,2 Bromohydroperoxid, indem das Olefin mit H&sub2;O&sub2; und Dibromantin (1,3-Dibromo-5,5-dimethylhydantoin) zur Reaktion gebracht wird. Die Behandlung des 1,2-Bromohydroperoxids mit einer Base, z. B. OH oder Silbersalzen, z. B. Silberbromid, bildet das Dioxetan.
  • Olefinvorläufer für das Dioxetan können synthetisiert werden, indem ein Keton mit einem Perester in Gegenwart von TiCl&sub3; und Lithiumaluminiumhydrid (LAH) zur Reaktion gebracht wird. Zum Beispiel wird zur Synthetisierung eines Olefins, wobei T Adamantyl (Ad), X Methoxy (OCH&sub3;), Y Anthracen (An) und Z Phosphat (PO&sub4;) ist, der folgende Reaktionsablauf verwendet:
  • Zur Phosporylierung des Chromophor Y, z. B. Anthracen, kann ein Hydroxylderivat des Chromophor, z. B. Hydroxyanthracen, mit einem cyclischen Acylphosphat mit der folgenden Formel:
  • zur Reaktion gebracht werden. Das Reaktionsprodukt wird dann mit Wasser hydrolysiert, um den phosporylierten Chromophor zu erhalten. Das cyclische Acylphosphat wird hergestellt, indem 2,2,2-Trimethoxy-4,5-dimethyl- 1,3-dioxaphospholen mit Phosgen bei 0ºC zur Reaktion gebracht und anschließend 2 Stunden bei 120ºC erwärmt wird.

Claims (9)

1. Verfahren zum Nachweis eines Glieds eines bestimmten Bindungspaares durch eine optisch nachweisbare Reaktion, wobei die optisch nachweisbare Reaktion die Reaktion mit einem Enzym eines Dioxetans mit der allgemeinen Formel
umfaßt, wobei T eine Cycloalkyl- oder Polycycloalkylgruppe ist, die an den 4-gliedrigen Ringteil des Dioxetans durch eine Spirobindung gebunden ist; V H oder eine enzymspaltbare Gruppe ist; Y ein fluoreszierender Chromophor ist; X H, Alkyl, Aryl, Aralkyl, Alkaryl, Heteroalkyl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloheteroalkyl oder eine enzymspaltbare Gruppe ist; und Z an X oder Y gebunden und H, OH oder eine enzymspaltbare Gruppe ist, mit der Bedingung, daß zumindest eines von V, X oder Z eine enzymspaltbare Gruppe sein muß,
und wobei das Dioxetan wahlweise eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften besitzt:
eine spezifische Affinitätssubstanz ist an die Gruppe X, Y oder T gebunden;
die Gruppe X, Y oder T umfaßt eine Gruppe zur Erleichterung der Bindung einer spezifischen Affinitätssubstanz;
die Gruppe X, Y oder T ist an eine polymerisierbare Gruppe gebunden;
die Gruppe X, Y oder T ist an eine Membran, einen Film, ein Korn oder ein Polymer gebunden;
die Gruppe X, Y oder T umfaßt eine Gruppe zur Erleichterung der Bindung an eine Membran, einen Film, ein Korn oder ein Polymer;
die Gruppe X, Y oder T enthält einen kinetikverstärkenden Substituenten;
die Gruppe X, Y oder T enthält einen löslichmachenden Substituenten; und das Herbeiführen des Zerfalls von Dioxetan zur Bildung einer lumineszenten Substanz, welche die Gruppe Y umfaßt.
2. Verfahren nach Anspruch l, wobei das spezifische Bindungspaar ein Antigen und einen Antikörper umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das spezifische Bindungspaar eine Nucleinsäure und eine Sonde umfaßt, die die gesamte Nucleinsäure oder einen Teil davon binden kann.
4. Verfahren zum Nachweis eines Enzyms in einer Probe, umfassend: das In-Kontakt-Bringen eines Dioxetans mit der allgemeinen Formel
wobei T eine Cycloalkyl- oder Polycycloalkylgruppe ist, die an den 4-gliedrigen Ringteil des Dioxetans durch eine Spirobindung gebunden ist; V H oder eine enzymspaltbare Gruppe ist; Y ein fluoreszierender Chromophor ist; X H, Alkyl, Aryl, Aralkyl, Alkaryl, Heteroalkyl, Heteroaryl, Cycloalkyl oder eine Cycloheteroalkylgruppe oder eine Gruppe ist, die durch ein Enzym spaltbar ist; und Z H, OH oder eine Gruppe ist, die durch ein Enzym spaltbar ist, mit der Bedingung, daß zumindest eines von V, X oder Z eine Gruppe sein muß, die durch ein Enzym spaltbar ist; wobei die Probe das Enzym enthält; und den Nachweis der lumineszenten Substanz als Hinweis für das Vorhandensein des Enzyms.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei jede oder alle der Gruppen T, X oder Y unabhängig zusätzlich einen löslichmachenden Substituenten umfassen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Gruppe T eine Polycycloalkylgruppe ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Gruppe T eine Adamantylgruppe ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die enzymspaltbare Gruppe eine Phosphatgruppe umfaßt und das Enzym Phosphataseaktivität besitzt.
9. Satz zum Nachweis einer ersten Substanz in einer Probe, die ein Dioxetan mit der allgemeinen Formel
umfaßt, wobei T eine Cycloalkyl- oder Polycycloalkylgruppe ist, die an den 4-gliedrigen Ringteil des Dioxetans durch eine Spirobindung gebunden ist; V H oder eine enzymspaltbare Gruppe ist, Y ein fluoreszierbarer Chromophor ist; X H, Alkyl, Aryl, Aralkyl, Alkaryl, Heteroalkyl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloheteroalkyl oder eine enzymspaltbare Gruppe ist; und Z H, OH oder eine enzymspaltbare Gruppe ist, mit der Bedingung, daß zumindest eines von V, X oder Z eine enzymspaltbare Gruppe sein muß; und ein Enzym, das zur Spaltung der enzymspaltbaren Gruppe des Dioxetans imstande ist, um eine lumineszente Substanz zu erzeugen.
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