JPH09507571A

JPH09507571A - 化学発光エネルギー移動検定

Info

Publication number: JPH09507571A
Application number: JP51762995A
Authority: JP
Inventors: ブロンスタイン，イレーナ; エドワーズ，ブルックス; ヴォイタ，ジョン
Original assignee: Tropix Inc
Current assignee: Tropix Inc
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-23
Publication date: 1997-07-29
Also published as: EP0736174A1; DE69430322D1; DE69430322T2; CA2179726A1; US6287767B1; ATE215696T1; US5849495A; US5753436A; EP0736174A4; EP0736174B1; AU1518195A; WO1995017672A1

Abstract

(57)【要約】１，２−ジオキセタン類と、酵素ラベル化標的もしくはプルーブのための化学発光基質としてのAttoPhos^TMとを一緒に使用する結合アッセイにおいて、バイオポリマーの存在もしくは量を決定するための化学発光アッセイを提供する。さらに、ａ）酵素複合体；ｂ）１，２−ジオキセタン類；およびｃ）AttoPhos^TMを含む、バイオポリマーの存在もしくは量のためのバイオアッセイを行うためのキットを開示する。

Description

【発明の詳細な説明】化学発光エネルギー移動検定技術分野本発明は、１，２−ジオキセタン類を、疎水性蛍光測定基質、例えばAttoPhos^TM とともに、酵素標識蛍光測定基質標的またはプローブのための化学発光基質として使用して、表面結合検定における生物学的物質の存在または量を決定するためのエネルギー移動化学発光検定に関する。ジオキセタン・AttoPhos^TM受容体基質の対の化学発光は、ポリマーエンハンサの添加によって増強することができる。まずAttoPhos^TMを加え、次に１，２−ジオキセタン類を加えることにより、さらなる増強を達成することができる。背景技術近年、生物学的物質の存在または濃度を検出するための化学発光検定が、バイオアッセイを実施するための高速かつ高感度で読取り易い方法としてますます注目を浴びるようになった。このような検定においては、化学発光化合物をリポータ分子として使用すると、このリポータ分子が、疑いのあるバイオポリマーの存在または不在に応答して化学発光する。リポータ分子として使用するために、多様な化学発光化合物が確認されている。とりわけ注目を浴びているある分類の化合物は、１，２−ジオキセタン類である。１，２−ジオキセタン類は、ジオキセタン環の炭素原子の少なくとも１個に安定化基を付加することによって安定化させることができる。安定化基の例は、スピロ結合したアダマンタンである。このようなジオキセタン類はさらに、他の炭素位置がアリール基、好ましくはフェニルまたはナフチルで置換されていることができ、そのアリール基が酸素で置換され、その酸素が次いで酵素不安定基に結合している。不安定基を開裂させることができる酵素と接触すると、そのジオキセタンのオキシアニオンが形成し、そのジオキセタンの分解および自然発生的な化学発光が起こる。そのような多様なジオキセタン類が米国特許第５，１１２，９６０号明細書に開示されている。この特許は、アダマンチル安定化基上に置換基、例えばハロ置換基、アルキル基、アルコキシ基などを有するジオキセタン類に重点をおいている。このようなジオキセタン類は、以前から認識されていたジオキセタン類、例えば３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン］−４−イル）フェニルホスフェート、特に、一般にＡＭＰＰＤと呼ばれるその二ナトリウム塩を超える進歩を表す。安定化アダマンチル基を、分解反応を進行させることができる受動性基から、ジオキセタンアニオンのより速い分解、より大きな信号対雑音比およびより高い感度により、増強された化学発光信号をもたらす能動性基に転換する塩素置換された相当物をＣＳＰＤと呼ぶ。他のジオキセタン類、例えばフェニルオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＡＭＰＧＤ）もまた周知であり、リポータ分子として使用することができる。これらのジオキセタン類およびそれらの調製は、そのものが本明細書の発明の態様を構成しない。これらのジオキセタン類を用いる検定は、従来の検定、例えばサザン、ノーザンおよびウエスタンブロット検定、ＤＮＡ配列決定、ＥＬＩＳＡならびに膜およびビーズにおいて実施される他の液相および混合相の検定を含むことができる。一般に、手順は、検出工程を除き、標準的な周知のプロトコルにしたがって実行される。ＤＮＡ検定においては、標的の生物学的物質を、ＤＮＡプローブにより、それに共有結合または間接的に結合した酵素に結合させ、そのプローブを、膜に固定化された試料と添加混合して、ハイブリッド形成させる。その後、過剰の酵素複合体を除去し、ハイブリッド形成させた試料にジオキセタンを加える。ハイブリッド形成が起こっているならば、ジオキセタンは、結合した酵素によって活性化されて、ジオキセタンの分解、そして化学発光が生じる。溶液相検定においては、酵素をしばしば核酸プローブと複合させるか、標的の生物学的物質に応答する抗体とで免疫的に複合させ、未結合成分を除去し、ジオキセタンを加えると、存在する酵素の量によって活性化されるジオキセタンの分解によって化学発光が起こる。酵素そのものが標的である場合、ジオキセタンを試料に加えるだけでよい。ここでもまた、米国特許第５，１１２，９６０号明細書および米国特許第４，９７８，６１４号明細書に開示されているような多様な検定様式が開発されている。ジオキセタン分解がプロトン性溶剤、例えば水の中で起こるならば、消光反応が起こることが周知である。対象の分析対象物を含有するか、欠いている疑いのある試料は一般に生物学的試料であるため、これらの検定は一般に水性環境で実施される。したがって、消光反応が、ジオキセタン類の分解によって実際に見られる化学発光を実質的に減少させるおそれがある。特定の分析対象物、例えば核酸、ウイルス抗体およびその他のタンパク質、特に溶液または溶液−固相系中で調製される分析対象物の低レベル検出を伴う検定においては、不可避なバックグラウンド信号とともに見られる化学発光の減少が検定の感度を下げ、その結果、極低レベルの生物学的物質を検出することができないおそれがある。この問題を扱う一つの方法は、米国特許第５，１４５，７７２号明細書に詳細に開示されているような、天然および合成の両分子を包含しうる水溶性高分子の添加である。この特許の開示を参考文献として本明細書に含める。同様な趣旨として、米国特許第４，９７８，６１４号明細書は、試料への各種の水溶性「増強」剤の添加を扱っているが、同特許は、固体状態検定における非特異的結合反応を抑制する問題に言及している。米国特許第５，１１２，９６０号明細書には、信号−雑音比を高めることによって化学発光を増強し、より高い感度を提供する水溶性ポリマー第四級アンモニウム塩として、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド）（ＴＭＱ）ポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド）（ＴＢＱ）およびポリ（ビニルベンジルジメチルベンジルアンモニウムクロリド）（ＢＤＭＱ）のような好適な水溶性ポリマー第四級アンモニウム塩が識別されている。また、同様なホスホニウムおよびスルホニウムポリマー塩が開示されている。この増強は、少なくとも一部には、ジオキセタンオキシアニオンが封鎖される疎水性領域の形成によって達成される。水による消光反応が抑制されるため、これらの疎水性領域における分解は化学発光を増強する。確認された、用いられる水溶性第四級ポリマー塩のうち、ＴＢＱが、この疎水性領域形成機構を通じて、予想外に優れた増強を提供する。水溶性ポリマー物質、例えばアンモニウム、ホスホニウムおよびスルホニウムポリマー塩の添加によって達成される化学発光の増強は、ジオキセタンのオキシアニオンと、結果的に生じる励起状態の発光体であるリポーティング分子とを疎水性領域に封鎖する第四級ポリマー塩の能力を改善する添加物を水性試料に含めることにより、さらに改善することができる。このように、ポリマー第四級塩と添加物との併用は、ポリマー第四級塩、または、界面活性剤もしくは水溶性ポリマーそのものであるときは限られた程度にしか化学発光を増強できない添加物の添加によって別々に得られる増大をはるかに超える増大を増強においてもたらす。ポリマー第四級塩と添加物との相乗的な組合せは、１，２−ジオキセタン類を用いることにより、水性試料中でさえ信頼できる低レベル検出を可能にする増強効果を与える。添加物と組み合わされるポリマー第四級塩は、０．００５％未満から０．００１％までのレベルで、４〜５倍の劇的な増大を示すのに十分に強力なエンハンサである。５０％またはそれ以上にも達する量の、さらなる量のポリマー第四級塩、添加物またはその両方の添加により、増大した信号および改良された信号／雑音比が達成される。一般に、ポリマー第四級塩および添加物の両方のレベルは、好ましくは０．０１〜２５重量％、より好ましくは０．０２５〜１５重量％の範囲であることができる。この改良の詳細は、本明細書に参考文献として含める米国特許出願第０８／０３１，４７１号明細書に開示されている。米国特許第５，２０８，１４８号明細書は、グリコシダーゼ酵素を産生する細胞を検出するための蛍光基質の一類を記載している。この基質は、細胞中のグリコシダーゼ酵素によって加水分解されるまでは非蛍光基質であり、この加水分解により約４６０nm〜５５０nmの間で励起することができる蛍光検出産物を生じさせるフルオレセインジグリコシドである。蛍光酵素的加水分解産物は、特異的に形成され、生体細胞中に適切に保持され、そのような細胞に対して非毒性である。基質は、生理的条件のもとで細胞膜を透過することができる。したがって、この発明は、細胞の分析、分類およびクローニングならびに細胞発現のインビトロ（試験管内）およびインビボ（生体内）でのモニタを可能にする。しかし、これらの蛍光産物は、基質のスペクトル特性がその主波長のアルゴンレーザによって励起されたあとでしか、単細胞中および単細胞の特異的オルガネラ内では検出されない。既知の蛍光発光体がジオキセタン類とともにバイオアッセイに使用されてきた。米国特許第４，９５９，１８２号明細書および第５，００４，５６５号明細書は、１，２−ジオキセタン類からの化学発光のエネルギー移動増強のための方法および組成物を記載している。これらの特許は、界面活性剤と、使用される緩衝溶液の凝集相に存在する蛍光補助界面活性剤とを含む蛍光ミセルを用いる。蛍光補助界面活性剤は、エネルギー移動に基づく蛍光が常に可能である形態で存在する。酵素標識リガンド結合対を含む固相と接触すると、その蛍光部分が、凝集相中でミセルと接した状態を維持する傾向を示す。蛍光補助界面活性剤が固相に付着されているならば、これは、固定化されたリガンド結合対を含む区域と、前記対を含まない区域とで無差別に起こる。したがって、蛍光発光体が固定化された酵素結合体と接した状態にない、または接した状態を維持しない結果、問題が生じる。このように、ジオキセタンから蛍光発光体へのエネルギー移動に必要な近接が効率的ではない。さらに、蛍光発光体は、固相マトリックス上のどこにでも付着してしまうため、この方法は、結合検定に使用される場合、特異性を考慮しない。’１８２号および’５６５号の特許における実施例の大部分は、溶液相酵素検定または酵素を用いない化学的誘発の実験である。これらの実施例は、ジオキセタンアニオン産物とエネルギー受容性蛍光界面活性剤との近接を促進する手段としての凝集相共ミセルとより適合している。固相検定の唯一の実施例は、コラム２９および３０で見られる。このＥＬＩＳＡ検定は、１１２ng〜１．３ngのＳ抗原の範囲にわたってウェル面上で光が発されることを示す。しかし、同じ用量−反応実験から、ただし蛍光補助界面活性剤の非存在下でジオキセタンおよびＣＴＡＢ界面活性剤を使用して発光を証明する対照実験が存在しない。したがって、固体表面でのエネルギー移動が実際にはどれくらい効率的であるかを判定することはできない。しかし、確かには、この蛍光補助界面活性剤は、AttoPhosのような非蛍光酵素基質ではない。したがって、ジオキセタンエネルギー供与体を触媒的に分解する同じ酵素によって蛍光エネルギー受容体を直接的に表面上で局所的に製造する本発明は、これら従来技術の参考文献によって示唆されてはいない。表面またはブロッティング実験に使用される蛍光基質に関する基本的問題がいくつかある。一つは、脱リン酸化発色団の励起を、フィルタまたはモノクロメータを備えたレーザまたはランプで実施しなければならないことである。これらの光源は、扱いにくいだけでなく、検定の費用を増す。ＵＶ／青色光を用いて達成されるこの必要かつ重要な励起工程の結果、元来、蛍光増白剤および他の励起性蛍光団を含有する膜もしくは表面および他の固体支持体ならびに生物学的試料中に含まれる励起性発色団（すなわち、タンパク質および核酸）の自己蛍光という第二の問題が生じる。表面もしくは膜支持体および脱リン酸化もしくは活性化された基質以外のソースのこのような蛍光信号は、検定の感度および特異性を実質的に下げて、そのような基質を使用できなくする、許容できないレベルのバックグラウンドに寄与する。既知の蛍光発光体がジオキセタン類とともに非結合検定に使用されてきた。しかし、蛍光発光体が酵素結合体と接した状態にとどまらない結果、問題が生じる。したがって、ジオキセタンから蛍光発光体へのエネルギー移動に必要な近接が不可能である。さらに、蛍光発光体が酵素結合体と接した状態にとどまらないため、発光体は、結合検定で使用される場合、特異性を考慮しない。したがって、上記検定によって扱われる化学発光技術における進歩にもかかわらず、試料中の生物学的物質の存在、濃度またはその両方を測定するために、高価で扱いにくいレーザまたはランプを使用することなく、全体的により強い信号を提供し、ひいては、より高い感度および特異性を示す化学発光検定を提供するという産業的な目標が残る。そのような化学発光検定のためのレポータ分子として優れた潜在性を示す１，２−ジオキセタン化合物がすでに開発されている。しかし、ジオキセタンと近接した状態にとどまって、それにより、必要なエネルギー移動を可能にし、さらに、高感度かつ特異的な標的の測定を可能にする効率的な蛍光受容発光体を提供することにより、１，２−ジオキセタン分子の化学発光の感度および特異性に改良を加えることがなおも必要である。発明の開示したがって、本発明の目的は、生物学的表面結合および溶液相検定において、１，２−ジオキセタン供与体分子を蛍光受容発光体と組み合わせて使用して、生物学的物質の存在または量を決定する方法であって、励起のために外部光源を使用することなく、感度または信号対雑音比の増大をもたらす方法を提供することにある。上記目的は、生物学的試料中の生物学的物質の存在または量を測定するための方法であって、ａ）試料からの生物学的リガンドとで酵素複合結合体（抗体またはＤＮＡプローブ）を形成する工程と、ｂ）AttoPhos^TMのような疎水性の蛍光測定基質および１，２−ジオキセタン類を、結合した酵素複合結合体に加える工程と、ｃ）酵素結合バイオポリマーの酵素が、AttoPhos^TMおよびそのジオキセタンからの酵素開裂性基、例えばリン酸基を開裂させて、そのジオキセタンを励起状態発光体形態を経て分解させて、励起状態の化学発光体から脱リン酸化AttoPhos^TM へのエネルギー移動が起こるようにして、この基を発光させる工程と、ｄ）生物学的物質の存在または量を、蛍光の量の関数として決定する工程とを含む方法を提供する本発明によって満たされた。目的はさらに、表面に結合した状態または溶液検定中で検出される生物学的物質の存在または濃度に関してバイオアッセイを実施するためのキットであって、ａ）表面結合した生物学的物質に安定に結合する酵素複合体と、ｂ）酵素複合体と接触すると分解して、そのエネルギーを移動させることができる分解生成物になる１，２−ジオキセタン類と、ｃ）AttoPhos^TMとを含むキットをさらに提供する本発明によって満たされた。図面の簡単な説明図１は、エネルギーをＣＳ−Ｄから脱リン酸化Attoに移動させて、それにより、そのエネルギーを蛍光の形態で放出する本発明の方法を示す図である。図２（Ａ）〜（Ｄ）は、ニトロセルロース膜上のウサギＩｇＧのウエスタンブロット分析のＣＣＤ画像である。図２の詳細な説明は、実施例１に見いだすことができる。図３は、化学発光度（平均および最大）を示す、ニトロセルロース膜上のウサギＩｇＧのウエスタンブロット分析のグラフである。図４（Ａ）〜（Ｄ）は、ＰＶＤＦ膜上のウサギＩｇＧのウエスタンブロット分析のＣＣＤ画像である。図４は、実施例１で具体的に説明する。図５は、化学発光度（平均および最大）を示す、ＰＶＤＦ膜上のウサギＩｇＧのウエスタンブロット分析のグラフである。図６（Ａ）〜（Ｂ）は、ＰＳＡ（前立腺特異性抗原）の５秒間の化学発光検出を、ＣＳＰＤとＣＳＰＤ＋AttoPhos^TMとの間で比較して示す、ng/mL対ＲＬＵのグラフである。図７は、実施例３に記載するようにして、０．２５mM ＣＳＰＤ、５０％Atto Phos^TMおよびアルカリホスファターゼを用いて得られた化学発光スペクトル（光度対波長）である。図８は、実施例３に記載するようにして、１．０mM ＣＳＰＤ、５０％ AttoPhos^TMおよびアルカリホスファターゼを用いて得られた化学発光スペクトル（光度対波長）である。図９は、実施例３に記載するようにして、０．１mM ＣＳＰＤ、５０％AttoPh os^TM、２０％ＢＤＭＱおよびアルカリホスファターゼを用いて得られた化学発光スペクトル（光度対波長）である。図１０は、実施例３に記載するようにして、０．２５mM ＣＳＰＤ、５０％At toPhos^TM、２０％ＢＤＭＱおよびアルカリホスファターゼを用いて得られた化学発光スペクトル（光度対波長）である。図１１は、実施例３に記載するようにして、０．５mM ＣＳＰＤ、５０％Atto Phos^TM、２０％ＢＤＭＱおよびアルカリホスファターゼを用いて得られた化学発光スペクトル（光度対波長）である。図１２は、実施例３に記載するようにして、１．０mM ＣＳＰＤ、５０％Atto Phos^TM、２０％ＢＤＭＱおよびアルカリホスファターゼを用いて得られた化学発光スペクトル（光度対波長）である。図１３は、実施例３に記載するようにして、１．０mM ＣＳＰＤ、５０％Atto Phos^TM、１０％ＢＤＭＱおよびアルカリホスファターゼを用いて得られた化学発光スペクトル（光度対波長）である。図１４は、実施例３に記載するようにして、１．０mM ＣＳＰＤ、１０％Atto Phos^TM、２０％ＢＤＭＱおよびアルカリホスファターゼを用いて得られた化学発光スペクトル（光度対波長）である。図１５は、実施例３に記載するようにして、１．０mM ＣＳＰＤ、５０％Atto Phos^TM、２．０mg/mlポリビニルベンジルトリフェニルホスホニウムクロリド− コポリビニルベンジレンジルジメチルアンモニウムクロリド（４０モル％ＴＰＰ／６０モル％ＢＤＭＱ）およびアルカリホスファターゼを用いて得られた化学発光スペクトル（光度対波長）である。図１６は、実施例３に記載するようにして、１．０mM ＣＳＰＤ、５０％Atto Phos^TM、２．０mg／mlポリビニルベンジルトリフェニルホスホニウムクロリド− コポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（４５モル％ＴＰＰ／５５モル％ＴＢＱ）およびアルカリホスファターゼを用いて得られた化学発光スペクトル（光度対波長）である。図１７は、実施例３に記載するようにして、５０％AttoPhos^TM、２０％ＢＤＭＱ中でアルカリホスファターゼを３０分間プレインキュベートしたのち、ゼロ時間でＣＳＰＤ（０．２５mM最終濃度）を添加することによって得られた化学発光スペクトル（光度対波長）である。図１８は、図７〜１４および図１７のデータから得られた、５４５nm／４６５ nmの発光比を示すグラフである。図１９は、図７〜１４および図１７のデータから得られた、４６５nmでの発光と５４５nmでの発光との合計を示すグラフである。図２０は、図１５および１６のデータから得られた５４５nm／４６５nmの発光比を示すグラフである。図２１は、図１５および１６のデータから得られた、４６５nmでの発光と５４５nmでの発光との合計を示すグラフである。図２２は、ビオチニル化ＤＮＡの存在を検出したＣＣＤカメラ画像である。発明を実施する最良の形態ここで、本発明の好ましい実施態様を示す添付の図面を参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。しかし、本発明は、数多くの異なる形態に具現化することができ、本明細書に示す実施態様に限定されるものと解釈すべきではない。それどころか、本出願人は、この開示が完全なものとなり、本発明の範囲が当業者に十分に理解されるよう、これらの実施態様を提示するものである。蛍光基質は、以下に論じる疎水性を除き、具体的には限定されないことに注意すべきである。基質の例は、参考文献として本明細書に含める米国特許第５，２０８，１４８号明細書に開示されている。本発明は、疎水性蛍光測定基質を利用する。これによって意味するものは、酵素によって活性化されると、励起状態のジオキセタン分解産物供与体からのエネルギー移動に応答して、発光するように誘発されることができる化合物である。その供与体が疎水性であるため、エネルギーおよび移動が起こるためには、活性化の際、その供与体がそこに移動する同じ疎水性領域で封鎖されるように、十分な疎水性をその基質が有しなければならない。本発明は、疎水性蛍光測定基質AttoPhos^TMを使用することにより、１，２−ジオキセタン類を使用する溶液相検定生物学的物質中で測定される物質の存在または量を決定する方法に関して説明する。物質の存在または量を決定するための本発明のキットは、好適な酵素結合体、１，２−ジオキセタン類およびAttoPhos^TM を使用して説明する。他の蛍光測定基質を使用してもよい。本発明者は、１，２−ジオキセタンが、AttoPhos^TMと組み合わさると、表面結合検定の特異性および感度の両方を改善するということを初めて見いだした。さらに、１，２−ジオキセタンをAttoPhos^TMとともに使用するこれらの検定は、励起に必要な光源の必要性を緩和する。具体的には、本発明は、蛍光の高い量子収率、AttoPhos^TMが有する表面に対する親和力を、脱リン酸化AttoPhos^TMのための励起光源としての１，２−ジオキセタンの酵素活性化化学発光と結合させて使用する。このようにして、脱リン酸化 AttoPhos^TMが表面に製造され、検定の期間を通じて酵素環境と近接した状態にとどまり、外部の機器を使用することなく、また、脱リン酸化AttoPhos^TM以外の発色団を励起させるおそれもなく、受容体である脱リン酸化AttoPhos^TMの励起を実行することができる。本方法は、生物学的試料中の生物学的物質の存在または量を測定するのに使用することができる。この方法は、ａ）生物学的試料からの生物学的物質とで酵素複合結合体（抗体または核酸プローブ）の複合体を形成する工程と、ｂ）Attoph os^TMおよび１，２−ジオキセタン類を、結合した酵素結合体生物学的物質複合体に加える工程と、ｃ）酵素結合体の酵素が、AttoPhos^TMおよびジオキセタンからのリン酸基を開裂させて、それにより、ジオキセタンを励起状態を経て分解させて、ジオキセタンの励起状態供与体から脱リン酸化AttoPhos^TM受容体へのエネルギー移動を起こして、それを発光させる工程と、ｄ）生物学的物質の存在または量を、発光の量の関数として決定する工程とを含む。本発明のキットはまた、バイオポリマーの存在または濃度を測定するためのものであり、ａ）生物学的物質と添加混合すると、それに結合する酵素複合体と、ｂ）酵素複合体の酵素と接触すると、分解して、励起状態にある分解生成物になる１，２−ジオキセタン類と、ｃ）AttoPhos^TMとを含む。本発明の検定およびキットは、水溶性の化学発光性１，２−ジオキセタン類を用いる。上記のとおり、これらのジオキセタン類は当該技術において十分に確立されており、それらの化学式および調製そのものは、本発明の新規な態様を構成しない。一般に、検定を実施するのに十分な、水性緩衝剤中の可溶性および安定性を示し、酵素との相互作用および、該酵素による、分解を誘発する酵素不安定基の開裂によって分解し、化学発光することができるいかなる化学発光性ジオキセタン類をも、本発明に関して使用することができる。典型的には、本発明に有用な１，２−ジオキセタン類は、一般式（Ｉ）：（式中、Ｚは、Ｈ、Ｃｌ、その他のハロゲン、アルキル、カルボキシルまたはアルコキシル基であり、Ｒ¹は、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₁₂アリールもしくはアラルキルであり、Ｙは、非置換であるか、電子供与基または電子吸引基で置換されているフェニルまたはナフチルであり、Ｒ²は、ジオキセタンに関してＹ上にメタ置換されているか、共役的に結合していないＯＸであり、Ｘは、開裂されると、ジオキセタンのフェノキシまたはナフトキシアニオンを残す酵素開裂性基である）で示される。好適なジオキセタン類は、開示内容全体を参考として本明細書に含める米国特許出願第０８／０５７，９０３号明細書に開示されているジオキセタン類である。好ましいジオキセタン類は、Ｘがリン酸基であるジオキセタン類を含む。特に好ましいジオキセタン類は、ＡＭＰＰＤ、特にその二ナトリウム塩およびＣＳＰＤ、特にその二ナトリウム塩を含む。これらのジオキセタン類を調製する方法は、上記に参照した、譲受人を同じくする特許ならびに、例えば、ウエイン州立大学に譲渡された米国特許第４，８５７，６５２号明細書に開示されている。ジオキセタン類の調製、精製および単離そのものは、本明細書に開示され、特許請求される本発明の新規な態様を構成しない。 AttoPhos^TMは、アルカリホスファターゼの検出のための高感度の蛍光測定基質である。AttoPhos^TMの化学構造は現在のところ知られていない。しかし、AttoPh os^TMの化学的性質は既知である。AttoPhos^TMは、JBLScientific社によって開発されたもので、JBL-Scientificカタログ（１９９３）からカタログ番号１６７０Ａで購入することができる。 AttoPhos^TMの化学的および物理的性質は次のとおりである。AttoPhos^TMは、約５８０g/molの分子量を有する薄黄色の結晶質固体である。AttoPhos^TMの代謝回転数は、２．４０M ＤＥＡ（ジエタノールアミン）pH９．０、０．２３mM ＭｇＣｌ₂および０．００５％ＮａＮ中、重量で、毎分アルカリホスファターゼ分子１個あたりAttoPhos^TM分子８５，４００個である。AttoPhos^TMの溶解度は、pH９．０の２．４M ＤＥＡ水性緩衝液中で≧１０mMである。最適なアルカリホスファターゼ代謝回転は、０．５〜１．５mM AttoPhos^TMの基質濃度で起こる。AttoPh os^TMは、０．０３０mMのKm値および３１．４１２のモル吸光係数を有している。アルカリホスファターゼと接触すると、AttoPhos^TMは、蛍光発光体になることが知られている。蛍光発光体の分子量は約２９０g/モルである。この蛍光発光体は、４３０〜４５０nmの可視範囲で最大励起を有し、その蛍光は、ＤＥＡ緩衝液中、５５０〜５７０nmで確認される。最良の条件は、５５０nmの発光の励起の場合で４４０nmである。蛍光発光体はまた、５６０nmで最大発光を示し、１４０nmで大きなストークスシフトを示す。ウォータ・ラマン発光が４７０nmで起こり、そのときの励起は４１３nmである。蛍光発光体は、４１８nmで最大値を有し、０．３９２M Ｎａ₂ＣＯ₃中で２６，４８４の係数および１１．０のpHを有し、pH＞１０．０で十分にイオン化される。ジオキセタンは、生物性結合体（抗体または核酸プローブ）に結合した酵素複合体に加えられる。酵素複合体はまた、標的生物性基質に結合している。したがって、ジオキセタンは酵素に対する基質であり、ジオキセタンの本体からの基質の不安定基の酵素触媒開裂が、不安定なオキシアニオンの形成およびそれに続くジオキセタンの分解を招く。酵素は通常、生物学的物質への結合を助けるため、結合体成分、例えばハイブリッド形成工程ではＤＮＡプローブと、またはインキュベーション工程では適当な抗体と複合させる。ハイブリッド形成工程は、標準的な周知の手順により、好適なプローブを使用して実施することができる。ハイブリッド形成の代替として、好適な抗体を使用して、インキュベーション工程を通常の方法で実施することもできる。酵素結合体は、生物学的物質に安定に結合することができるいかなる酵素結合体であることもできる。酵素結合体の例は、リガンド−結合体の対、酵素と共有結合的に付いたプローブまたはアルカリホスファターゼで直接標識された抗体である。あるいはまた、ビオチン−ストレプトアビジンまたは抗原抗体（例えばデゴキシゲニン−アンチジゴキシゲニン、フルオレセイン−アンチフルオレセイン）および他のタイプのカップリングを介して、核酸プローブおよび抗体を酵素で間接的に標識してもよい。誘導体化されたアルカリホスファターゼ、例えばストレプトアビジン−アルカリホスファターゼで標識された抗体およびＤＮＡプローブが、本発明に有用な好ましい酵素複合体である。酵素結合体−生物学的物質複合体が形成されたのち、AttoPhos^TMおよび１，２ −ジオキセタンを、生物学的物質と複合した結合酵素結合体に同時に加えるか、 AttoPhos^TMを始めに加え、脱リン酸化させたのち、１，２−ジオキセタン類を加える。エネルギー供与性ジオキセタン発光体フラグメントを、同じ酵素によって局所的に製造されるAtto^TMに近接させて配置するのは、酵素開裂の過程であることが当業者に明白であろう。AttoPhos^TMそのものは、他の蛍光測定酵素基質と同様に、凝集相中で非蛍光性である。したがって、雑音信号をもたらすであろうジオキセタンの非酵素的分解が、凝集相ではエネルギー移動によっては増幅されない。このように、疎水性の蛍光形態を生じさせて、検定を実行するのに使用される表面への固定化を可能にするのは、酵素反応である。また、他の疎水性の蛍光測定酵素基質を本発明に使用することもできることが明白である。上記で参照した米国特許第５，２０８，１４８号明細書は、平面的な蛍光団そのものに付いたある範囲の疎水性成分を含めることによって特異的に変性されたフルオレセインジグリコシド類を記載している。このような疎水性基質は本発明のバイオアッセイを実行するのに有用であり、用いられる酵素標識はグリコシダーゼ、例えばβ−ガラクトシダーゼであり、ジオキセタンが、上記に示す、例えばＺ＝Ｃｌ、Ｒ¹＝メチル、Ｙ＝フェニレン、Ｘ＝β−Ｄ−ガラクトピラノシドである一般構造であるものである。当然、代わりに、ジグリコシド類の先駆物質としてこの特許に示す疎水性ヒドロキシフルオレセイン類を公知の技術によってリン酸化して、本発明に有用である疎水性フルオレセインモノ−およびジホスフェート誘導体を得てもよい。酵素は、１，２−ジオキセタン類およびAttoPhos^TMの両方からのリン酸基を開裂させる。１，２−ジオキセタン類が酵素によって脱リン酸化されるとき、形成するオキシアニオンが励起状態の供与体になり、そのエネルギーが、近接して配置された受容体、すなわち脱リン酸化AttoPhos^TM発光体に移動して、それを発光させる。図１は、１，２−ジオキセタン（ＣＳ^-Ｄ）から脱リン酸化AttoPhos^TM にエネルギーが移動し、このAttoPhos^TMが次いで、エネルギーを発光の形態で放出することを示す。AttoPhos^TMの脱リン酸化生成物、すなわち受容体が疎水性であり、表面／生物学的物質のサイトに固定化され、したがって、エネルギー供与体である化学発光性脱リン酸化１，２−ジオキセタンの励起状態フラグメントに非常に近接すると、エネルギー移動効率が高められる。１，２−ジオキセタン類は、０．０１〜２．５mM、好ましくは０．２５〜１mM の量で、生物学的物質と複合した結合酵素結合体に加える。もっとも好ましくは、１，２−ジオキセタンは、０．２５mMの量で加える。２．４０Mジエタノールアミン（ＤＥＡ）水性緩衝液中のAttoPhos^TMは、１〜１００容量％、好ましくは２５〜７５容量％の量で、酵素または生物学的物質と複合した酵素もしくは酵素複合結合体に加える。もっとも好ましくは、１０〜５０容量％のAttoPhos^TMを加える。上述したように、AttoPhos^TMをまず加え、脱リン酸化させたのち、１，２−ジオキセタン類を加えることが好ましい。AttoPHos^TMの添加と１，２−ジオキセタン類の添加との間の期間は、好ましくは１０〜６０分、より好ましくは２０〜４０分、もっとも好ましくは２５〜３０分である。 AttoPhos^TMまたは他の疎水性蛍光測定酵素基質とともに水溶性の高分子を加えることにより、信号をさらに増強することができる。本発明を実施するのに有用である好ましい水溶性ポリマーは、一般に、ポリマーオニウム塩に基づくもの、特に、ホスホニウム、スルホニウムおよび、好ましくは、アンモニウム成分に基づく第四級塩である。そのようなポリマーは、以下に示す一般式（Ｉ）で示される。式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、それぞれ、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐鎖状非置換アルキル基、例えばメチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ −ブチル、ヘキシル等；１個以上のヒドロキシル、アルコキシル、例えばメトキシ、エトキシ、ベンジルオキシもしくはポリオキシエチルエトキシ、アリールオキシ、例えばフェノキシ、アミノもしくは置換アミノ、例えばメチルアミノ、アミド、例えばアセトアミドもしくはウレイド、例えばフェニルウレイドで置換された１〜２０個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐鎖状アルキル基；あるいはフルオロアルキルまたはフルオロアリール、例えばヘプタフルオロブチル基、３〜１２個の環炭素原子を有する非置換モノシクロアルキル基、例えばシクロヘキシルまたはシクロオクチル、１個以上のアルキル、アルコキシもしくは縮合ベンゾ基で置換された３〜１２個の環炭素原子を有する置換モノシクロアルキル基、例えばメトキシシクロヘキシルもしくは１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、それぞれが５〜１２個の炭素原子を有する縮合環を２個以上有する、非置換であるか、または１個以上のアルキル、アルコキシもしくはアリール基で置換されたポリシクロアルキル基、例えば１−アダマンチルもしくは３−フェニル−１−アダマンチル、非置換であるか、１個以上のアルキル、アリール、フッ素もしくはヒドロキシル基で置換された、少なくとも１個の環および全部で６〜２０個の炭素原子を有するアリール、アルカリールまたはアラルキル基、例えばフェニル、ナフチル、ペンタフルオロフェニル、エチルフェニル、ベンジル、ヒドロキシベンジル、フェニルベンジルもしくはデヒドロアビエチルであることができ；Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³のうち少なくとも２個は、それらが結合している第四級窒素原子とともに、飽和または不飽和の、３〜５個の炭素原子および１〜３個のヘテロ原子を有し、かつベンゼン環が縮合していてもよい、窒素、リンまたは硫黄を含有する非置換または置換された環、例えば１−ピリジニウム、１−（３−アルキルもしくはアラルキル）イミダゾリウム、モルホリノ、アルキルモルホリニウム、アルキルピペリジニウム、Ｎ−アシルピペリジニウム、ピペリジノもしくはアシルピペリジノ、ベンズオキサゾリウム、ベンズチアゾリウムまたはベンズアミダゾリウムを形成することができる。記号Ｘ^-は、単独で、または合わさって、ハロゲンイオン、すなわちフッ素イオン、塩素イオン、臭素イオンまたはヨウ素イオン、硫酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、例えばメチルスルホン酸イオン、アリールスルホン酸イオン、例えばｐ−トルエンスルホン酸イオン、置換アリールスルホン酸イオン、例えばアニリノナフチレンスルホン酸イオン（各種の異性体）、ジフェニルアントラセンスルホン酸イオン、過塩素酸イオン、アルカン酸イオン、例えば酢酸イオン、アリールカルボン酸イオン、例えばフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体、ベンゾ複素環式アリールカルボン酸イオン、例えば７−ジエチルアミノ−４−シアノクマリン−３−カルボン酸イオンのような部分を含むことができる対イオンを表し、ｐ −テレフタル酸イオンなどの有機ジアニオン類もまた、Ｘ^-によって表されてもよい。記号ｎは、そのようなポリ（ビニルベンジル第四級塩）の分子量が、固有粘度またはＬＡＬＬＳ法を用いて測定して約８００〜約２００，０００（重量平均）、好ましくは約２０，０００〜約７０，０００の範囲に及ぶような数を表す。Ｍが窒素であるこれらのポリマー、関連のコポリマーおよび関連の出発材料を調製する方法は、G.D．JonesらのJournal of Polymer Science、第25巻201ページ（1958年）、米国特許第２，７８０，６０４号、第３，１７８，３９６号明細書、第３，７７０，４３９号明細書、第４，３０８，３３５号明細書、第４，３４０，５２２号明細書、第４，４２４，３２６号明細書およびドイツ国公開特許第２，４４７，６１１号公報に開示されている。記号Ｍは、リンまたは硫黄を表してもよく、ここで、対応するスルホニウムまたはホスホニウムポリマーが従来技術に記載されている（米国特許第３，２３６，８２０号明細書および第３，０６５，２７２号明細書）。本発明の２種のポリマーの調製法は、参照した米国特許明細書に説明されており、そのものは本発明のいかなる態様をも構成しない。２個以上の異なるオニウム基を有するコポリマーもまた、本明細書に記載する発明に利用することができる。記号Ｘ、Ｍ′、Ｒ¹'、Ｒ²'、Ｒ³'は、Ｘ、Ｍ、Ｒ¹〜Ｒ³について上記したとおりである。記号ＹおよびＺは、コポリマーを構成する個々のモノマーのモル分率を表す。したがって、記号ＹおよびＺは、個々には０．０１から０．９９まで異なり、合計は常に１に等しい。好ましい成分として、ＭはＮまたはＰであり、Ｒ¹〜Ｒ³は、それぞれ独立して、１〜２０個の炭素原子を有する、非置換であるか、ヒドロキシル、アミノ、アミド、ウレイド基でさらに置換されたアルキル、シクロアルキル、ポリシクロアルキル（例えばアダマンタン）、アラルキルまたはアリールであるか、あるいは合わさって、Ｍ原子とのスピロ結合を介して複素環式の（場合により、他のＮ、ＳまたはＯのヘテロ原子を含む芳香族、脂肪族もしくは混合の）オニウム基を形成する。Ｘは、好ましくは、溶解性を改善し、イオン強度を望みどおりに変化させるように選択され、好ましくはハロゲン、サルフェート類、スルホネート類である。コポリマーにおいて、Ｒ¹〜Ｒ³のそれぞれは、対応するＲ¹〜Ｒ³と同じであっても異なってもよい。好ましいポリマーの例には、以下のものがある。ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリドポリビニルベンジルトリオクチルホスホニウムクロリド／ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリドポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド／ポリビニルベンジルトリフェニルホスホニウムクロリドポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリドポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリドポリビニルベンジルトリヘキシルアンモニウムクロリド／ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＴＨＱ−ＴＢＱ）これらのビニルベンジル第四級アンモニウム塩ポリマーは、適当な先駆物質モノマーのフリーラジカル重合によって、または、ポリ塩化ビニルベンジルまたは塩化ベンジル基を含むコポリマーによる対応する第三級アミン類またはホスフィン類の徹底的なアルキル化によって調製することができる。他のポリマーアルキル化剤、例えばクロロメチル化ポリフェニレンオキシドまたはポリエピクロロヒドリンを用いて、この同じアプローチをとることができる。同じポリマーアルキル化剤を、オキサゾリン開環重合の開始剤として使用すると、加水分解ののち、ポリエチレンイミングラフトコポリマーを得ることができる。そして、そのようなコポリマーを、好ましくはアラルキル基によって第四級化して、最終的なポリマーを得ることができる。 Bronstein-Bonteらの米国特許第４，１２４，３８８号明細書に開示され、特許請求されている、式（III）（式中、各Ｒ₄は、同じまたは異なる脂肪族置換基であり、Ｘ₁はアニオンである）で示されるホルミルベンジル第四級塩およびポリビニルアルコールの水溶性アセタール類を、本発明を実施するのに使用することもできる。そして、上記式Ｉのポリ（ビニルベンジル第四級アンモニウム塩）を調製するのに使用される個々のビニルベンジル第四級アンモニウム塩モノマーを、第四級アンモニウム官能基を有しない他のエチレン性不飽和モノマーとで共重合させて、Landらの米国特許第４，３２２，４８９号明細書、Bronstein-Bonteらの米国特許第４，３４０，５２２号明細書、Landらの米国特許第４，４２４，３２６号明細書、Bronst ein-Bonteの米国特許第４，５０３，１３８号明細書、Bronstein-Bonteの米国特許第４，５６３，４１１号明細書およびCohenらの米国特許第３，８９８，０８８号明細書に開示され、特許請求されているようなポリマーを得ることもできる。このようなポリマーはすべて、本発明を実施するのに増強剤物質として使用することができる。好ましくは、これらの第四級化ポリマーは、式Ｉのポリ（ビニルベンジル第四級アンモニウム塩）について上記した範囲内の分子量を有する。当業者には明白であるように、カチオン性ミクロゲルまたは架橋ラテックスの使用は、流延膜の直接形成により適しているが、前形成した膜の上塗りに使用することもできる。そのような材料は写真用媒染剤として周知であり、２個のエチレン性不飽和基によって置換された架橋性成分を含有するモノマー混合物を使用して合成することができる。第四級アンモニウムまたはホスホニウム塩含有ラテックスは、Campbellらの米国特許第３，９５８，９９５号明細書に記載の方法を使用して調製することができる。式IVは、一般に、記号Ｘ^-、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³が上記のとおりであるような水溶性ラテックスコポリマーの有用なサブセットを表す。記号Ｘ、ＹおよびＺは、１にするために一緒に加えなければならないモル分率である。好ましくは、ポリマーエンハンサ、例えばＢＤＭＱを、酵素もしくは酵素結合体生物学的物質源に、０．０１〜２６％(０．１〜２５０mg/ml)、より好ましくは０．０２５〜１５％(２５〜１５０mg/ml)の量で加える。もっとも好ましくは、ＢＤＭＱは、０．１〜０．２％(１〜２mg/ml)の量で加える。脱リン酸化Attophos^TMから得られる放出信号は、励起状態ジオキセタンちょう密フラグメントからのエネルギー移動励起による。発された信号は、緑色感知膜または光度計、ＣＣＤカメラで捕らえることができる。検出される発光の量は、バイオポリマーの存在および表面結合バイオポリマーの量の両方に応答する。生物学的物質の量は、発光の光度の関数である。本発明の方法およびキットは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質およびハプテンをはじめとする生物学的物質の存在または濃度を測定するのに使用することができる。さらに、本発明の方法およびキットは、膜上で実施される検出、例えばウエスタン、サザン、ノーザンブロッティングおよびＤＮＡ配列決定に使用することができ、また、溶液相検定にも使用することができる。溶液ベースの検定において、または増強性ポリマーを用いる場合、これらは、AttoPhos^TMおよび１，２−ジオキセタンの両基質の脱リン酸化生成物を要求して、供与体成分と受容体成分との近接を増すことができる。実施例実施例１ニトロセルロースおよびＰＶＤＦ上でのウエスタンブロッティング(Photometr ics Star １ＣＣＤカメラに写した、膜上でのタンパク質ＩｇＧの検出）標準的な既知の方法を使用して、ウサギＩｇＧの希釈物を１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ＩｇＧ試料は、ニトロセルロースの場合でレーンあたり２００、６６．７、２２．２、７．４および２．４ngであり、ＰＶＤＦの場合でレーンあたり１００、３３．３、１１．１、３．７および１．２ngであった。次に、以下のようにして、タンパク質を膜に移動させた：ゲルを移動緩衝液（５mM ＭＯＰＳ、２mM 酢酸ナトリウム、２０％メタノール、pH７．５）中で平衡させたのち、９０ボルトおよび４℃で１時間、ニトロセルロース（Schleich er and Schuell BAS85）またはＰＶＤＦ（Tropix）に電気移動させた。移動後、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で膜をすすぎ、ＰＢＳ中０．２％カゼイン、０．１％Tween-20（遮断緩衝液）で遮断し、遮断緩衝液中アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（ＧＡＲ−ＡＰ）の１−１０，０００希釈物で３０分間インキュベートし、ＰＶＤＦ膜を遮断緩衝液中５分間ずつ２回洗浄し、ニトロセルロース膜をＰＢＳ中０．１％Tween-20中で２回洗浄し、すべての膜を０．１ Mジエタノールアミン、１mM ＭｇＣｌ₂、pH１０（基質緩衝液）中で５分間ずつ２回洗浄し、基質緩衝液中Nitro-Block（Tropix）の１−２０希釈物中で５分間インキュベートし、基質緩衝液中５分間ずつ２回洗浄し、基質緩衝液およびAttoPhos^TM中０．２５mM ＣＳＰＤ中で種々の条件下に５分間インキュベートし、プラスチックのレポートカバーに封止し、約１時間インキュベートし、Star ＩＣＣＤカメラ（ Photometrics）を用いて５分間写した。 IPLab Spectrumソフトウェアを使用するApple Macintosh IIciコンピュータにインタフェースさせたStar １ＣＣＤカメラを用いて化学発光信号を５分間積分することにより、化学発光画像を得た。ＣＣＤ画像をＮＩＨ Imageソフトウェアパッケージに転送し、バンドごとに平均および最大のピクセル光度を測定した。図２および４に示すＣＣＤ画像は、ウエスタンブロット画像を合成したものである。ブロットＡは、基質緩衝液中０．２５mMＣＳＰＤ中でインキュベートしたものである。ブロットＢは、０．２５mM ＣＳＰＤおよび５０％AttoPhos^TM（５０％AttoPhos^TM緩衝液）中で同時にインキュベートしたものである。ブロットＣは、はじめに５０％AttoPhos^TM（５０％基質緩衝液）中で３０分間インキュベートし、AttoPhos^TMを除去し、膜を基質緩衝液中で５分間ずつ２回洗浄し、基質緩衝液中０．２５mM ＣＳＰＤを加えたものである。ブロットＤは、未希釈のAtto Phos^TM標準溶液で３０分間インキュベートしたのち、膜を基質緩衝液中で５分間ずつ２回洗浄し、続いて基質緩衝液中０．２５mM ＣＳＰＤで洗浄したものである。ＣＳＰＤを最初に加えてから約１時間後に画像が得られた。図３および５に示すように、上記の条件それぞれのトップ希釈物について平均および最大の信号光度をプロットした。図２〜５に示す結果は、AttoPhos^TMを加え、一定期間ののち、続いて１，２−ジオキセタン類を加えることにより、最大光度が得られることを実証する。実施例２ＰＳＡ免疫検定［Hybritech前立腺特異性抗原（ＰＢＡ）］ Hybritech Tandem-E ＰＳＡキット（カタログ番号４８２３）の標準溶液を、検出工程を除き、同製造業者によって供給されるプロトコルおよび試薬を使用して定量した。検定は次のように実施した。各標準溶液１００μｌを１２×７５mm のガラス管に等分した（６等分、ゼロを三つ、他の標準溶液を三つ）。アルカリホスファターゼ結合マウス抗ＰＳＡ１００μlを各管に加え、続いて、捕獲用抗ＰＳＡ抗体を付着させたビーズ１個を加えた。次に、これら管を振とう台に載せて１７０RPMおよび室温で２時間インキュベートした。ビーズを、Hybritech洗浄溶液２mlずつで３回洗浄し、０．１Mジエタノールアミン、１mM ＭｇＣｌ₂、pH １０（基質緩衝液）で１回洗浄した。そこで基質を各管に加えた。以下の３種の基質組成物(管あたり２００μl)を試験した。基質緩衝液中０．２５mM ＣＳＰＤ、１mg/ml ＢＤＭＱをゼロ時間で添加したもの。基質緩衝液中０．２５mM ＣＳＰＤ、１mg/ml ＢＤＭＱ、５０％AttoPhos^TMをゼロ時間で添加したもの。基質緩衝液中５０％AttoPhos^TM、１mg/ml ＢＤＭＱを加えて３０分間おいたのち、ＣＳＰＤ（最終濃度０．２５mM）を加えたもの。ＣＳＰＤ（またはＣＳＰＤ／Atto Phos^TM混合物）を加えてから２５分後に、Berthold９５２Ｔ光度計を用いて化学発光信号を測定した。図６（Ａ）および（Ｂ）は、信号および信号／雑音比がいずれも、ＣＳＰＤのみの場合よりもＣＳＰＤおよびAttoPhos^TMを用いた場合の方が大きいことを実証する。したがって、信号の増大は、ＣＳＰＤを AttoPhos^TMとともに使用した結果であった。実施例３溶液エネルギー移動（脱リン酸化AttoPhos^TMと脱リン酸化ＣＳＰＤとの間でのエネルギー移動）以下は、Spex発光スペクトルに使用した試料の一覧である。すべての試料に関して、０．１Mジエタノールアミン、１mM ＭｇＣｌ₂、pH１０を使用して、最終容量を２mlに調節した。１００％Sapphireは、１０．０mg/ml ＢＤＭＱに等しい。１．図７０．２５mM ＣＳＰＤ、５０％AttoPhos^TM ２．図８１．０mM ＣＳＰＤ、５０％AttoPhos^TM ３．図９０．１mM ＣＳＰＤ、５０％AttoPhos^TM、２０％ＢＤＭＱ４．図１００．２５mM ＣＳＰＤ、５０％AttoPhos^TM、２０％ＢＤＭＱ５．図１１０．５mM ＣＳＰＤ、５０％AttoPhos^TM、２０％ＢＤＭＱ６．図１２１．０mM ＣＳＰＤ、５０％AttoPhos^TM、２０％ＢＤＭＱ７．図１３１．０mM ＣＳＰＤ、５０％AttoPhos^TM、１０％ＢＤＭＱ８．図１４１．０mM ＣＳＰＤ、１０％AttoPhos^TM、２０％ＢＤＭＱ９．図１５１．０mM ＣＳＰＤ、５０％AttoPhos^TM、２．０mg/ml ＴＰＰ（０．４）／ＢＤＭＱ（０．６）１０．図１６１．０mM ＣＳＰＤ、５０％AttoPhos^TM、２．０mg/ml ＴＰＰ（０．４５）／ＴＢＱ（０．５５）１１．図１７アルカリホスファターゼを５０％AttoPhos^TM、２０％ＢＤＭＱ中で３０分間プレインキュベートしたのち、時間ゼロでＣＳＰＤ（０．２５mM 最終濃度）を加えた。時間＝０で、アルカリホスファターゼを各試料に加え（最終濃度１．１２×１０^-11M）、キュベットを蛍光計（Spex Fluorolog）に挿入した。１０mmに設定したモノクロメータスリットを用いて発光スペクトルを得、信号をnm あたり０．５秒間、積分した。たいていの場合、スペクトルを、２、１０、２０、３０、４０、５０および６０分で記録した。結果を図７〜２１に示す。この一連の実験は、緩衝液中でのＣＳＰＤからAtto Phos^TMへのエネルギー移動を示す。このような溶液ベースの検定は、緩衝液中で実行される免疫検定とともに使用される。図７〜２１は、ＣＳＰＤの脱リン酸化発光体と脱リン酸化AttoPhos^TMとの間にエネルギー移動があることを実証する。図９〜１７はさらに、増強性ポリマーの存在により、このエネルギー移動が大幅に改善されることを示す。図７および８は、供与体である脱リン酸化ＣＳＰＤ発光体の増大が、エネルギー移動、すなわちAttoemissionを介して信号を増大させるということを実証する。この場合、青色の発光（ＣＳＰＤ化学発光）が増大する。これは、Atto^-受容体のエネルギー移動距離の範囲にないメチルメタオキシベンゾエートアニオン（ＣＳＰＤ発光体）の集団によるかもしれない。AttoPhos^TM の濃度が低いとき、エネルギー移動信号もまた非常に低いため、図１４は、緑色の信号がAtto^-から発生することを実証する。図１２は、基質を順次に加える、すなわち、まず、脱リン酸化されてグラウンド状態発光体を創製するAttoPhos^TM を加えたのち、脱リン酸化されると、分断し、そのエネルギーを脱リン酸化したAttoPhos^TMからの蓄積した受容体に移動する励起状態供与体を発生させるＣＳＰＤを加えたときの相対エネルギー移動信号を示す。実施例４ビオチン化ＤＮＡの検出ストレプトアビジンアルカリホスファターゼと結合させ、続いて、アルカリホスファターゼに対するＣＳＰＤ１，２−ジオキセタン基質またはＣＳＰＤと蛍光アルカリホスファターゼ基質AttoPhos^TMとの混合物のいずれかを用いてインキュベートすることにより、ビオチン化ＤＮＡを検出した。具体的には、Pall Biodyne Aナイロン膜上において、トップスポット中にビオチン化３５量体を２１０pgスポットしたのち、連続して１：３に希釈したものをスポットした。基質インキュベート工程までTropix Southern-LightTm手順を実行することにより、ＤＮＡを検出した。そして、以下に示す異なる基質溶液を用いて各膜を個々にインキュベートした。１）検定緩衝液中０．２５mM ＣＳＰＤ（０．１M ＤＥＡ pH１０、１mM ＭｇＣｌ₂）２）５０％AttoPhos^TM溶液、検定緩衝液中５０％１mM ＣＳＰＤ３）５０％AttoPhos^TM溶液、検定緩衝液中５０％０．２５mM ＣＳＰＤ４）AttoPhos^TM溶液中１mM ＣＳＰＤ５）脱リン酸化AttoPhos^TMで被覆したのち、検定緩衝液中０．２５mM ＣＳＰＤでインキュベートした膜６）AttoPhos^TM溶液外部光源を用いず、遮光箱の中でPhotometrics Star１ＣＣＤカメラを使用して、画像を得た。図２２は、Attophos^TMをＣＳＰＤと組み合わせた試料からの光信号の増大を示す。本出願人は、可能な組み合わせの広範な実施態様によって本発明を説明しようと試みた。それにもかかわらず、可能な組み合わせは無限であり、くまなく具現化することができないことが認められる。上記教示を与えられるならば、当業者であれば、前記出願に具体的に例示されていない増強剤および添加物に到達するであろう。実施例は、限定を加えるためのものではなく、前記開示を与えられたならば、他の組み合わせの識別は、不要な実験を行うことなく、本技術を実施する当業者の熟練の範囲内である。そのような組み合わせもまた、以下に述べる請求の範囲によって明示的に限定または除外されるものを除き、発明の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヴォイタ，ジョンアメリカ合衆国、マサチューセッツ 01776、サッドマリー、メイナード・ファーム・ロード 99

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的試料中の物質の存在または量を決定するための方法であって、ａ）酵素もしくは酵素結合体と該試料からの該物質とを複合させる工程と、ｂ）該結合した酵素複合体に対し、疎水性蛍光測定基質および以下の式（Ｉ）（式中、Ｚは、Ｈ、Ｃｌ、その他のハロゲン、アルキル、カルボキシルまたはアルコキシル基であり、Ｒ¹は、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₁₂アリールもしくはアラルキルであり、Ｙは、非置換であるか、電子供与基または電子吸引基で置換されているフェニルまたはナフチルであり、Ｒ²は、ジオキセタンに関してＹ上にメタ置換されているか、共役的に結合していないＯＸであり、Ｘは、酵素開裂性基であり、Ｘが開裂されると、そのジオキセタンが疎水性になる）で示される１，２−ジオキセタン類を加える工程と、ｃ）該酵素複合体の酵素が、該疎水性蛍光測定基質およびジオキセタンそれぞれの酵素開裂性基を開裂させて、それにより、該ジオキセタンを分解させて励起状態供与体を形成し、該励起状態発光体から受容体としての該蛍光測定基質へのエネルギー移動が起こるようにして、該受容体を発光させる工程と、ｄ）該物質の存在または量を発光の量の関数として決定する工程と、を含む方法。２．該物質と複合した該酵素もしくは酵素結合体に対し、アンモニウム、ホスホニウムおよびスルホニウムポリマー塩からなる群より選択される１種以上の増強ポリマー塩を加える工程をさらに含む、請求の範囲第１項記載の方法。３．ポリマー塩が、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド）（ＴＭＱ）、ポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド）（ＴＢＱ）およびポリビニルベンジルジメチルベンジルアンモニウムクロリド）（ＢＤＭＱ）からなる群より選択される、請求の範囲第２項記載の方法。４．該物質が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質およびハプテンからなる群より選択される、請求の範囲第１項記載の方法。５．疎水性蛍光測定基質を、該物質とで複合した酵素もしくはは酵素結合体に加え、該酵素が該蛍光測定基質の酵素開裂性基を開裂させるのに十分な時間ののち、続いて該１，２−ジオキセタンを加える、請求の範囲第１項記載の方法。６．時間が２５〜３０分である、請求の範囲第５項記載の方法。７．該１，２−ジオキセタンが０．２５〜１．０mMの濃度で存在する、請求の範囲第１項記載の方法。８．該蛍光測定基質がAttoPhos^TMであり、２．４０Mジエタノールアミン（ＤＥＡ）水性緩衝液中１０〜１００容量％の濃度で存在する、請求の範囲第１項記載の方法。９．工程ｂ）で、AttoPhos^TMおよび該１，２−ジオキセタンに加えて、ポリ（ビニルベンジルジメチルベンジルアンモニウムクロリド）（ＢＤＭＱ）を１〜２ mg/mlの量で加える、請求の範囲第８項記載の方法。１０．工程ｂ）の前に、ハイブリッド形成または免疫複合化工程を実施する、請求の範囲第１項記載の方法。１１．該酵素複合体が膜またはビーズに結合している、請求の範囲第１項記載の方法。１２．該疎水性蛍光測定基質がAttoPhos^TMである、請求の範囲第１項記載の方法。１３．生物学的試料中の物質の存在または濃度に関するバイオアッセイを実施するためのキットであって、ａ）生物学的物質と添加混合すると、それと複合する酵素もしくは酵素結合体と、ｂ）該酵素または該酵素複合体と接触すると分解して、疎水性励起状態供与体を形成する分解生成物になる１，２−ジオキセタン類と、ｃ）疎水性蛍光測定基質と、を含むキット。１４．生物学的試料中の酵素の存在または量を決定する方法であって、ａ）該試料に対し、疎水性蛍光測定基質および式（Ｉ）（式中、Ｚは、Ｈ、Ｃｌ、その他のハロゲン、アルキル、カルボキシルまたはアルコキシル基であり、Ｒ¹は、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₁₂アリールもしくはアラルキルであり、Ｙは、非置換であるか、電子供与基または電子吸引基で置換されているフェニルまたはナフチルであり、Ｒ²は、ジオキセタンに関してＹ上にメタ置換されているか、共役的に結合していないＯＸであり、Ｘは、酵素開裂性基であり、Ｘが開裂されると、そのジオキセタンが疎水性になる）で示されるジオキセタン類を加える工程と、ｂ）添加混合後、該疎水性蛍光基質からの発光の存在または量を検出する工程とを含み、該酵素が、該疎水性蛍光基質および該ジオキセタンの酵素開裂性基を開裂させて、該ジオキセタンの励起状態分解生成物から該疎水性蛍光ジオキセタンへのエネルギー移動が起こるようにする方法。１５．生物学的試料中の酵素の存在または量を決定する方法であって、ａ）該試料に対し、疎水性蛍光測定基質および式（Ｉ）（式中、Ｚは、Ｈ、Ｃｌ、Ｃｌ以外のハロゲン、アルキル、カルボキシルまたはアルコキシルであり、Ｒ¹は、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₁₂アリールもしくはアラルキルであり、Ｙは、非置換であるか、電子供与基または電子吸引基で置換されているフェニルまたはナフチルであり、Ｒ²は、ジオキセタンに関してメタ置換されているか、共役的に結合していないＯＸであり、Ｘは、酵素開裂性基であり、Ｘが開裂されると、そのジオキセタンが疎水性になる）で示されるジオキセタンを加える工程と、ｂ）添加混合後、該疎水性蛍光基質からの発光の存在または量を検出する工程とを含み、該酵素が、該疎水性蛍光基質および該ジオキセタンの酵素開裂性基を開裂させて、該ジオキセタンの励起状態分解生成物から該疎水性蛍光ジオキセタンへのエネルギー移動が起こるようにする方法。１６．生物学的試料中の物質の存在または量を決定するための方法であって、ａ）酵素もしくは酵素結合体を該試料からの該物質と複合させる工程と、ｂ）疎水性蛍光団を該複合体に加える工程と、ｃ）該複合体および該蛍光団に対し、以下の式（式中、Ｚは、Ｈ、Ｃｌ、Ｃｌ以外のハロゲン、アルキル、カルボキシルまたはアルコキシル基であり、Ｒ¹は、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₁₂アリールもしくはアラルキルであり、Ｙは、非置換であるか、電子供与基または電子吸引基で置換されているフェニルまたはナフチルであり、Ｒ²は、ジオキセタンに関してＹにメタ置換されているか、共役的に結合していないＯＸであり、Ｘは、酵素開裂性基であり、Ｘが開裂されると、そのジオキセタンが疎水性になる）で示される１，２−ジオキセタン類を加える工程と、該複合体の酵素が、該ジオキセタンの酵素開裂性基を開裂させて、それにより、該ジオキセタンを分解させて励起状態供与体を形成し、該励起状態供与体から受容体としての該蛍光団へのエネルギー移動が起こるようにして、該受容体を発光させる工程と、該物質の存在または量を発光の量の関数として測定する工程と、を含む方法。