JP2984282B2 - エンハンサーを用いる化学発光測定法 - Google Patents
エンハンサーを用いる化学発光測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、エンハンサーの存在下および該エンハンサ
ーとは異なる蛍光剤の存在下に、酵素反応体として酸ホ
スファターゼ部分又はアルカリホスファターゼ部分を有
する酵素反応体と、一般式 （式中Ｔはスピロアダマンチル基、Ｒは低級アルキル基
であり、Ｍは陽イオンであり、Arは芳香族基である。） で表されるジオキセタン反応体とを接触させ、それによ
りエンハンサー不存在下よりも多く発光させることから
なる、化学反応による発光を生じさせる方法に関する。
ーとは異なる蛍光剤の存在下に、酵素反応体として酸ホ
スファターゼ部分又はアルカリホスファターゼ部分を有
する酵素反応体と、一般式 （式中Ｔはスピロアダマンチル基、Ｒは低級アルキル基
であり、Ｍは陽イオンであり、Arは芳香族基である。） で表されるジオキセタン反応体とを接触させ、それによ
りエンハンサー不存在下よりも多く発光させることから
なる、化学反応による発光を生じさせる方法に関する。
（従来の技術） 発光測定法には化学発光及び生物発光反応にもとづく
ものとがあり、高感度な超微量分析法として利用されて
いる。例えば、化学発光測定法には、アルカリ存在
下、ルミノール／フェリシアン化カリウムによるH2O2の
測定〔Bostick et al.,Anal.Chem.,47,447−452（197
5）〕、 ルミノール−グルコースオキシダーゼによるグルコー
スの測定〔Bostick et al.,Anal.Chem.,47,447−452
（1975）〕、 アルカリ存在下、ルミノール/H2O2によるヘモグロビ
ンの測定〔Ewetz L., et al.,Anal.Biochem.,71,564
−570（1976）〕の方法等が知られている。一方、生物
発光測定法には、（イ）ホタルの発光酵素ルシフェリン
−ルシフェラーゼによるATPの測定（Addanki et al.,
Anal.Biochem.,14,261−264（1976）、（ロ）アクエオ
リンによる細胞遊離カルシウムイオンの測定〔Blinks
et al.,Pharmacol.Rev.,28,1−93（1976）〕、（ハ）
バクテリアルルシフェラーゼによるNADHの測定〔Hastin
g,J.W.et al.,Annu.Rev.Microbial.,31,549（1977）〕
の方法等が知られている。
ものとがあり、高感度な超微量分析法として利用されて
いる。例えば、化学発光測定法には、アルカリ存在
下、ルミノール／フェリシアン化カリウムによるH2O2の
測定〔Bostick et al.,Anal.Chem.,47,447−452（197
5）〕、 ルミノール−グルコースオキシダーゼによるグルコー
スの測定〔Bostick et al.,Anal.Chem.,47,447−452
（1975）〕、 アルカリ存在下、ルミノール/H2O2によるヘモグロビ
ンの測定〔Ewetz L., et al.,Anal.Biochem.,71,564
−570（1976）〕の方法等が知られている。一方、生物
発光測定法には、（イ）ホタルの発光酵素ルシフェリン
−ルシフェラーゼによるATPの測定（Addanki et al.,
Anal.Biochem.,14,261−264（1976）、（ロ）アクエオ
リンによる細胞遊離カルシウムイオンの測定〔Blinks
et al.,Pharmacol.Rev.,28,1−93（1976）〕、（ハ）
バクテリアルルシフェラーゼによるNADHの測定〔Hastin
g,J.W.et al.,Annu.Rev.Microbial.,31,549（1977）〕
の方法等が知られている。
（発明が解決しようとする課題） しかしながら、前記した化学発光測定法のの方法
は、発光に使用する酸化剤で試料が分解したり、酸化剤
自体が分解するため正確な測定ができず、の方法は、
発光に使用する試薬の水溶性が低く、水系での測定が困
難であり、の方法は、発光反応が間けつ的であるため
測定のタイミングをとるために熟練さを要求されるなど
の欠点を有している。又、前記した生物発光測定法の
（イ）、（ロ）及び（ハ）の方法は、化学発光測定法に
比べると使用する酵素が極めて高価であったり、免疫測
定法に利用すると酵素が失活するなどの欠点を有してい
る。
は、発光に使用する酸化剤で試料が分解したり、酸化剤
自体が分解するため正確な測定ができず、の方法は、
発光に使用する試薬の水溶性が低く、水系での測定が困
難であり、の方法は、発光反応が間けつ的であるため
測定のタイミングをとるために熟練さを要求されるなど
の欠点を有している。又、前記した生物発光測定法の
（イ）、（ロ）及び（ハ）の方法は、化学発光測定法に
比べると使用する酵素が極めて高価であったり、免疫測
定法に利用すると酵素が失活するなどの欠点を有してい
る。
（課題を解決するための手段） 本発明者等は、高感度、高精度及び簡便な化学発光測
定法を見出すべく鋭意研究した結果、特定の化合物の存
在下に酸又はアルカリホスファターゼを用い、前記一般
式（Ｉ）で表されるジオキセタン誘導体を分解し、化学
発光させることによりその目的を達成することができ、
発明を完成させるに至ったものである。
定法を見出すべく鋭意研究した結果、特定の化合物の存
在下に酸又はアルカリホスファターゼを用い、前記一般
式（Ｉ）で表されるジオキセタン誘導体を分解し、化学
発光させることによりその目的を達成することができ、
発明を完成させるに至ったものである。
本発明は、エンハンサーの存在下に行うことが必須の
要件である。本発明におけるエンハンサーとは、そのも
のを存在させることにより発光の効果の上る化合物を言
うものである。エンハンサーとして使用できるものは、
有機エンハンサー又は螢光剤であって、両者混合して用
いても何ら差支えない。有機エンハンサーとしては、例
えば、ポリ（ビニルベンジルトリメチル アンモニウム
クロライド）、ポリ〔ビニルベンジル（ベンジルジメ
チル アンモニウム クロライド）〕、ベンジルジメチ
ルセチル アンモニウム クロライド、ポリメタアクリ
アミドプロピレンメチル アンモニウム クロライド、
ポリビニルレピロリドン、ポリエチルオキサゾリン、1,
5−ジメチル−1,5−ジアゾ−ウンデカメチレン ポリメ
トブロマイド、ポリメチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジ
ン、ポリジアリル ジメチルアンモニウム クロライド
等を使用することができる。又、螢光剤としては、例え
ば、フルオレッセイン、シス−ジクロロビス（2,2′−
ビピリジン）ルテニウム（II）ハイドレート、カルセイ
ン、ウンベリフェロン、４−メチルウンベリフェロン又
は７−フルオロ−４−ニトロベンゾキサジアゾール若し
くは４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザンとアミノ
酸、ペプチドあるいは蛋白質との結合物等を使用するこ
とができる。エンハンサーの使用量は発光反応系の0.00
01〜10重量％である。
要件である。本発明におけるエンハンサーとは、そのも
のを存在させることにより発光の効果の上る化合物を言
うものである。エンハンサーとして使用できるものは、
有機エンハンサー又は螢光剤であって、両者混合して用
いても何ら差支えない。有機エンハンサーとしては、例
えば、ポリ（ビニルベンジルトリメチル アンモニウム
クロライド）、ポリ〔ビニルベンジル（ベンジルジメ
チル アンモニウム クロライド）〕、ベンジルジメチ
ルセチル アンモニウム クロライド、ポリメタアクリ
アミドプロピレンメチル アンモニウム クロライド、
ポリビニルレピロリドン、ポリエチルオキサゾリン、1,
5−ジメチル−1,5−ジアゾ−ウンデカメチレン ポリメ
トブロマイド、ポリメチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジ
ン、ポリジアリル ジメチルアンモニウム クロライド
等を使用することができる。又、螢光剤としては、例え
ば、フルオレッセイン、シス−ジクロロビス（2,2′−
ビピリジン）ルテニウム（II）ハイドレート、カルセイ
ン、ウンベリフェロン、４−メチルウンベリフェロン又
は７−フルオロ−４−ニトロベンゾキサジアゾール若し
くは４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザンとアミノ
酸、ペプチドあるいは蛋白質との結合物等を使用するこ
とができる。エンハンサーの使用量は発光反応系の0.00
01〜10重量％である。
本発明は、エンハンサーの存在下および該エンハンサ
ーとは異なる蛍光剤の存在下に、酵素反応体として酸ホ
スファターゼ部分又はアルカリホスファターゼ部分を有
する酵素反応体と、一般式 （式中Ｔはスピロアダマンチル基、Ｒは低級アルキル基
であり、Ｍは陽イオンであり、Arは芳香族基である。） で表されるジオキセタン反応体とを接触させ、それによ
りエンハンサー不存在下よりも多く発光させることから
なる、化学反応による発光を生じさせる方法である。
ーとは異なる蛍光剤の存在下に、酵素反応体として酸ホ
スファターゼ部分又はアルカリホスファターゼ部分を有
する酵素反応体と、一般式 （式中Ｔはスピロアダマンチル基、Ｒは低級アルキル基
であり、Ｍは陽イオンであり、Arは芳香族基である。） で表されるジオキセタン反応体とを接触させ、それによ
りエンハンサー不存在下よりも多く発光させることから
なる、化学反応による発光を生じさせる方法である。
本発明に用いる酸又はアルカリホスファターゼは、動
物若しくは植物から分離精製して得たものを使用するも
のであるが、市販品として容易に入手が可能である。
物若しくは植物から分離精製して得たものを使用するも
のであるが、市販品として容易に入手が可能である。
又、本発明に用いる基質であるところのジオキセタン
誘導体は、例えば、ヨーロッパ特許出願公開254051、PC
T出願公開WO8800695、Tetrahedron Lett.,28,1155−115
8（1987）あるいは米国特許出願第213672号（1988年６
月30日）をもとに優先権主張して出願した平成元年６月
30日の出願に記載の方法と同様にして製造することがで
きる化合物である。前記一般式中のＲとしては、メチル
基、エチル基、プロピル基、ブチル基等の低級アルキル
基であり、Arとしては、フェニレン基、ナフチレン基、
アントラニル基等の芳香族基である。殊にフェニレン基
及びナフチレン基を有するジオキセタン誘導体の使用が
好ましく、更にフェニレン基は、置換位が のもの、ナフチレン基は、置換位が 及び のものが発光量が多い点で使用に適している。
誘導体は、例えば、ヨーロッパ特許出願公開254051、PC
T出願公開WO8800695、Tetrahedron Lett.,28,1155−115
8（1987）あるいは米国特許出願第213672号（1988年６
月30日）をもとに優先権主張して出願した平成元年６月
30日の出願に記載の方法と同様にして製造することがで
きる化合物である。前記一般式中のＲとしては、メチル
基、エチル基、プロピル基、ブチル基等の低級アルキル
基であり、Arとしては、フェニレン基、ナフチレン基、
アントラニル基等の芳香族基である。殊にフェニレン基
及びナフチレン基を有するジオキセタン誘導体の使用が
好ましく、更にフェニレン基は、置換位が のもの、ナフチレン基は、置換位が 及び のものが発光量が多い点で使用に適している。
尚、前記一般式（Ｉ）で表されるジオキセタン誘導体
の陽イオンとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカ
リ金属、アンモニウム、Ｎ（R2）4 +（式中、R2はメチ
ル、エチル等のアルキル基、ベンジル等のアラルキル基
である。）で表される四級アンモニウムを例示すること
ができる。
の陽イオンとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカ
リ金属、アンモニウム、Ｎ（R2）4 +（式中、R2はメチ
ル、エチル等のアルキル基、ベンジル等のアラルキル基
である。）で表される四級アンモニウムを例示すること
ができる。
本発明における酵素反応は、酸ホスファターゼを用い
る場合pH4〜pH7で反応を行うことが好ましく、アルカリ
ホスファターゼを用いる場合は、pH7〜pH10で行うこと
が好ましい。
る場合pH4〜pH7で反応を行うことが好ましく、アルカリ
ホスファターゼを用いる場合は、pH7〜pH10で行うこと
が好ましい。
本方法を実施するにあたっては、酵素反応を行った後
にエンハンサーを添加し、反応を行うこともできる。
にエンハンサーを添加し、反応を行うこともできる。
本発明は、酵素免疫測定法として採用することができ
る。その際測定できる抗原としては、血清あるいは尿な
どに含まれる薬物、ホルモンあるいは各種疾患に由来す
る微量成分などである。又、使用する抗体は、公知の方
法に従い取得したものを使用することができる。例え
ば、うさぎ、ひつじ、馬、モルモット、ニワトリなどの
温血動物に、リガンド又は酵素を体重1kg当り0.3〜2mg
程度１〜数回背中皮下、フットパッド、大腿筋等にアジ
ュバンドとともに注射して当該動物の体内に抗体を形成
させることができる。得られた抗体は、ペプシン等の蛋
白質分解酵素でＦ（ab′）２、Fab′、Fabなどに分解し
て用いることもできる。
る。その際測定できる抗原としては、血清あるいは尿な
どに含まれる薬物、ホルモンあるいは各種疾患に由来す
る微量成分などである。又、使用する抗体は、公知の方
法に従い取得したものを使用することができる。例え
ば、うさぎ、ひつじ、馬、モルモット、ニワトリなどの
温血動物に、リガンド又は酵素を体重1kg当り0.3〜2mg
程度１〜数回背中皮下、フットパッド、大腿筋等にアジ
ュバンドとともに注射して当該動物の体内に抗体を形成
させることができる。得られた抗体は、ペプシン等の蛋
白質分解酵素でＦ（ab′）２、Fab′、Fabなどに分解し
て用いることもできる。
一方、モノクロナール抗体として取得することもでき
る。その場合には、マウスに前記のリガンドあるいは酵
素をアジュバンドとともに数回腹腔等に注射し、脾臓細
胞を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマウ
スミエローマ細胞と融合させ、その細胞のうち、当該抗
体を産生するものをクローニングによってモノクローン
細胞として増殖させることによって得ることができる。
る。その場合には、マウスに前記のリガンドあるいは酵
素をアジュバンドとともに数回腹腔等に注射し、脾臓細
胞を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマウ
スミエローマ細胞と融合させ、その細胞のうち、当該抗
体を産生するものをクローニングによってモノクローン
細胞として増殖させることによって得ることができる。
免疫測定の方法としては、「酵素免疫測定法」医学書
院（1987年版）に記載の各方法、例えば、固定化抗体上
に抗原を反応させ、その抗原に酵素標識した抗体を反応
させ測定する方法等を採用することができる。
院（1987年版）に記載の各方法、例えば、固定化抗体上
に抗原を反応させ、その抗原に酵素標識した抗体を反応
させ測定する方法等を採用することができる。
又、本発明は、ポリヌクレオチド測定法として採用す
ることができる。その方法としては、「Molecular and
Cellular Probe」Vol1177（1987年）に記載の各方
法：例えば、ニトロセルロースフィルターに固定させた
検体のDNAにハプテン標識相補プローブDNAを反応させ、
さらに抗ハプテンアルカリホスファターゼ結合体を作用
させ、このアルカリホスファターゼ活性をジオキセタン
誘導体を基質として用い測定することができる。
ることができる。その方法としては、「Molecular and
Cellular Probe」Vol1177（1987年）に記載の各方
法：例えば、ニトロセルロースフィルターに固定させた
検体のDNAにハプテン標識相補プローブDNAを反応させ、
さらに抗ハプテンアルカリホスファターゼ結合体を作用
させ、このアルカリホスファターゼ活性をジオキセタン
誘導体を基質として用い測定することができる。
（作 用） 本発明は、エンハンサー存在下、酵素反応を行い、前
記一般式（Ｉ）で表されるジオキセタン誘導体を分解
し、その化学発光を測定することにより行う。
記一般式（Ｉ）で表されるジオキセタン誘導体を分解
し、その化学発光を測定することにより行う。
（実施例） 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
実施例１（AFPの測定） 10μのAFPを含むサンプル（０、20、50ng/m）に
抗AFP Fab′を結合させたアルカリホスファターゼコン
ジュゲート150μ（コンジュゲート濃度0.5μg/m、
0.1Mトリス塩酸、２％BSA、1mM MgCl2、0.1mM ZnC
l2、pH7.5）を混合しこれに抗AFPマウスIgGをコートし
たポリスチレンビーズ１個（直径1/8インチ）を加え、
室温下20分間放置した。このビーズを蒸留水で３回洗浄
した後、ポリ（ビニルベンジル（ベンジルジメチル ア
ンモニウム）クロライド）（以下BDMQと記す）0.02％
又、ポリジアリールジメチルアンモニウム クロライド
（以下PDDACと記す）0.01％及び３−（２′−スピロア
ダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリル
オキシ）フェニル−1,2−ジオキセタン・２ナトリウム
塩（以下AMPPDと記す） 100μg/mを含む基質液（0.1Mトリス塩酸、1M MgCl2、
0.1M ZnCl2、pH9.8）200μを加え、室温で反応させ
た。20分後に直ちにルミノメーターでその発光量をカウ
ントし10秒間の積算値を求めた。対照としてエンハンサ
ーの含まない基質液200μを加え、酵素反応を行なっ
た。その結果を第１図に示した。
抗AFP Fab′を結合させたアルカリホスファターゼコン
ジュゲート150μ（コンジュゲート濃度0.5μg/m、
0.1Mトリス塩酸、２％BSA、1mM MgCl2、0.1mM ZnC
l2、pH7.5）を混合しこれに抗AFPマウスIgGをコートし
たポリスチレンビーズ１個（直径1/8インチ）を加え、
室温下20分間放置した。このビーズを蒸留水で３回洗浄
した後、ポリ（ビニルベンジル（ベンジルジメチル ア
ンモニウム）クロライド）（以下BDMQと記す）0.02％
又、ポリジアリールジメチルアンモニウム クロライド
（以下PDDACと記す）0.01％及び３−（２′−スピロア
ダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリル
オキシ）フェニル−1,2−ジオキセタン・２ナトリウム
塩（以下AMPPDと記す） 100μg/mを含む基質液（0.1Mトリス塩酸、1M MgCl2、
0.1M ZnCl2、pH9.8）200μを加え、室温で反応させ
た。20分後に直ちにルミノメーターでその発光量をカウ
ントし10秒間の積算値を求めた。対照としてエンハンサ
ーの含まない基質液200μを加え、酵素反応を行なっ
た。その結果を第１図に示した。
実施例２（各種のエンハンサーの使用例） 表１に示した有機ポリマーあるいは螢光剤を用いその
エンハンス効果を比較した。0.125mM AMPPD、表に示し
た濃度の各エンハンサー、1mM MgCl2及び0.1M炭酸ナト
リウムを含む基質液（pH9.5）1mに10μの4.25×10
-8Mのアルカリホスファターゼを加え、30℃で反応さ
せ、20分間の発光量を測定した。表は、エンハンサーを
未添加で測定した発光量を１とした時の相対値を示して
いる。
エンハンス効果を比較した。0.125mM AMPPD、表に示し
た濃度の各エンハンサー、1mM MgCl2及び0.1M炭酸ナト
リウムを含む基質液（pH9.5）1mに10μの4.25×10
-8Mのアルカリホスファターゼを加え、30℃で反応さ
せ、20分間の発光量を測定した。表は、エンハンサーを
未添加で測定した発光量を１とした時の相対値を示して
いる。
（１）ベンジルジメチルセチル アンモニウム クロラ
イド （２）ポリ（ビニルベンジルトリメチル アンモニウム
クロライド （３）ポリメチルアクリルアミドプロピレンメチルアン
モニウム クロライド （４）ポリビニルピロリドン （５）ポリエチルオキサゾリン （６）1,5−ジメチル−1,5−ジアゾ−ウンデカメチレン
ポリメトキシブロマイド （７）ポリエチレンイミン 実施例３（BDMQの濃度の効果） 15μのAFPを含むサンプル（50ng/m）に抗AFP Fa
b′を結合したアルカリホスファターゼコンジュゲート1
35μ（コンジュゲート濃度0.5μg/m、0.1Mトリス塩
酸、２％BSA、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、pH7.5）を混合
し、これに抗AFPマウスIgGをコートしたポリスチレンビ
ーズ１個（直径1/8インチ）を加え、室温下２時間放置
した。このビーズを蒸留水で３回洗浄した後、BDMQ
（０、0.001、0.005、0.01、0.02％）及びAMPPD100μg/
mを含む基質液（0.1Mトリス塩酸、1mM MgCl2、0.1mM
ZnCl2、pH9.8）200μを加え室温で反応させた。20分
間反応を行った後にルミノメーターで測定した。表２
は、各濃度のBDMQ添加時の５秒間の発光の積算値であ
る。
イド （２）ポリ（ビニルベンジルトリメチル アンモニウム
クロライド （３）ポリメチルアクリルアミドプロピレンメチルアン
モニウム クロライド （４）ポリビニルピロリドン （５）ポリエチルオキサゾリン （６）1,5−ジメチル−1,5−ジアゾ−ウンデカメチレン
ポリメトキシブロマイド （７）ポリエチレンイミン 実施例３（BDMQの濃度の効果） 15μのAFPを含むサンプル（50ng/m）に抗AFP Fa
b′を結合したアルカリホスファターゼコンジュゲート1
35μ（コンジュゲート濃度0.5μg/m、0.1Mトリス塩
酸、２％BSA、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、pH7.5）を混合
し、これに抗AFPマウスIgGをコートしたポリスチレンビ
ーズ１個（直径1/8インチ）を加え、室温下２時間放置
した。このビーズを蒸留水で３回洗浄した後、BDMQ
（０、0.001、0.005、0.01、0.02％）及びAMPPD100μg/
mを含む基質液（0.1Mトリス塩酸、1mM MgCl2、0.1mM
ZnCl2、pH9.8）200μを加え室温で反応させた。20分
間反応を行った後にルミノメーターで測定した。表２
は、各濃度のBDMQ添加時の５秒間の発光の積算値であ
る。
実施例４（TSHの測定） 15μのTSHを含むサンプル（２μU/m）に抗TSH Fa
b′を結合したアルカリホスファターゼコンジュゲート1
35μ（コンジュゲート濃度0.5μg/m、0.1Mトリス塩
酸、２％BSA、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、pH7.5）を混合
し、これに抗TSHマウスIgGをコートしたポリスチレンビ
ーズ１個（直径1/8インチ）を加え、室温下放置した。
このビーズを蒸留水で３回洗浄した後、PDDAC（０、0.0
5、2.0％）及びAMPPD100μg/mを含む基質液（0.1Mト
リス塩酸、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、pH9.8）200μを
加え室温で反応させた。反応後ルミノメーターで測定し
た。表３は、その時の０％のカウント値を100として計
算した結果である。
b′を結合したアルカリホスファターゼコンジュゲート1
35μ（コンジュゲート濃度0.5μg/m、0.1Mトリス塩
酸、２％BSA、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、pH7.5）を混合
し、これに抗TSHマウスIgGをコートしたポリスチレンビ
ーズ１個（直径1/8インチ）を加え、室温下放置した。
このビーズを蒸留水で３回洗浄した後、PDDAC（０、0.0
5、2.0％）及びAMPPD100μg/mを含む基質液（0.1Mト
リス塩酸、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、pH9.8）200μを
加え室温で反応させた。反応後ルミノメーターで測定し
た。表３は、その時の０％のカウント値を100として計
算した結果である。
実施例５（ヒト肝炎Ｂ型ウイルス表面抗原（HBVs）DNA
の検出） HBVsDNA（100、10、１、0.1pg/m）を等量の0.6N Na
OHを添加することにより変性させ、弱く吸引することに
よりナイロンメンブラン（Hybond−Ｎ、アマシャム社
製）にプロットした。このメンブランを2Mアンモニア及
び５×sccで洗浄後、このDNAをUV照射によりメンブラン
に固定した。固定化したメンブランをプレハイブリダイ
ゼーション緩衝液（５×scc、５×デンハート溶液、0.1
％SDS）で15分間、50℃でインキュベートした。この溶
液2mに10μのプローブDNA（アルカリ性ホスファタ
ーゼ標識オリゴヌクレオチド DNA、Dupont社製）を加
え、50℃で30分間ハイブリダイゼーションした。その
後、このメンブランを１×ssc、１％SDSを含む溶液で１
回につき室温で５分間浸して２回洗浄し、更に１×ss
c、１％トリトンメ−100を含む溶液で１回につき50℃で
５分間浸して２回洗浄した。最後にこのメンブランを攪
拌しながら１×sscを含む溶液で１回につき室温で５分
間浸して２回洗浄した。アルカリホスファターゼの活性
測定はAMPPD（100μg/m）及びBDMQ（0.02％）を含む
基質液を用い室温で40分間浸すことにより行い、その
後、直ちにΧ線フィルムにこのメンブランを３分間感光
させた。対照としてBDMQを含まない基質に浸し、フィル
ムに感光させた。表４はその時の各濃度における感光ス
ポットである。
の検出） HBVsDNA（100、10、１、0.1pg/m）を等量の0.6N Na
OHを添加することにより変性させ、弱く吸引することに
よりナイロンメンブラン（Hybond−Ｎ、アマシャム社
製）にプロットした。このメンブランを2Mアンモニア及
び５×sccで洗浄後、このDNAをUV照射によりメンブラン
に固定した。固定化したメンブランをプレハイブリダイ
ゼーション緩衝液（５×scc、５×デンハート溶液、0.1
％SDS）で15分間、50℃でインキュベートした。この溶
液2mに10μのプローブDNA（アルカリ性ホスファタ
ーゼ標識オリゴヌクレオチド DNA、Dupont社製）を加
え、50℃で30分間ハイブリダイゼーションした。その
後、このメンブランを１×ssc、１％SDSを含む溶液で１
回につき室温で５分間浸して２回洗浄し、更に１×ss
c、１％トリトンメ−100を含む溶液で１回につき50℃で
５分間浸して２回洗浄した。最後にこのメンブランを攪
拌しながら１×sscを含む溶液で１回につき室温で５分
間浸して２回洗浄した。アルカリホスファターゼの活性
測定はAMPPD（100μg/m）及びBDMQ（0.02％）を含む
基質液を用い室温で40分間浸すことにより行い、その
後、直ちにΧ線フィルムにこのメンブランを３分間感光
させた。対照としてBDMQを含まない基質に浸し、フィル
ムに感光させた。表４はその時の各濃度における感光ス
ポットである。
実施例６（TBRCの効果） 0.1Mトリス塩酸、1mM MgCl2、pH9.8にAMPPDを200μg/
mとなるように溶かした。この基質液100μにシス−
ジクロロビス（2,2′−ビピリジン）ルテニウム（II）
ハイドレート（以下TBRCと記す）水溶液（０〜20mg/m
）50μを加え、更にアルカリホスファターゼ（10-6
mg/m）50μを添加し、室温で反応させた。17分後に
５秒間の発光量を測定した。この結果を第２図に示し
た。
mとなるように溶かした。この基質液100μにシス−
ジクロロビス（2,2′−ビピリジン）ルテニウム（II）
ハイドレート（以下TBRCと記す）水溶液（０〜20mg/m
）50μを加え、更にアルカリホスファターゼ（10-6
mg/m）50μを添加し、室温で反応させた。17分後に
５秒間の発光量を測定した。この結果を第２図に示し
た。
実施例７（各種螢光剤による効果） 0.1Mトリス塩酸、1mM MgCl2、pH9.8にAMPPDを10μg/m
になるように溶かし、BDMQを終濃度0.025％となるよ
うに添加した。基質液1mを第３〜５図に示した如き螢
光剤を第３〜５図に示した濃度の1mを加えた。この20
0μにアルカリホスファターゼ10μ（10-4μg/m）
を加え、室温で反応させた。その発光量をルミノメータ
ーで測定した。
になるように溶かし、BDMQを終濃度0.025％となるよ
うに添加した。基質液1mを第３〜５図に示した如き螢
光剤を第３〜５図に示した濃度の1mを加えた。この20
0μにアルカリホスファターゼ10μ（10-4μg/m）
を加え、室温で反応させた。その発光量をルミノメータ
ーで測定した。
実施例８（AMPNDを用いたBDMQの効果） 0.05M炭酸塩、1mM MgCl2、pH9.5に0.4mM AMPND（1,3
−誘導体、2,7−誘導体、1,6−誘導体）を溶かし、BDMQ
が0.02％になる様に添加した。溶液中に1.00μg/mの
アルカリホスファターゼを（1/4）倍（ｎ＝０〜13）で
希釈した。
−誘導体、2,7−誘導体、1,6−誘導体）を溶かし、BDMQ
が0.02％になる様に添加した。溶液中に1.00μg/mの
アルカリホスファターゼを（1/4）倍（ｎ＝０〜13）で
希釈した。
上記のアルカリホスファターゼ溶液を含み、かつ0.4m
Mの各AMPNDを含む反応液を30℃で20分インキュベートし
た。インキュベーション後、ルミノメーターで30秒間の
発光積分量を測定した。検出感度限界は、表５に示し
た。対照としてBDMQを含まない場合の結果も示した。
Mの各AMPNDを含む反応液を30℃で20分インキュベートし
た。インキュベーション後、ルミノメーターで30秒間の
発光積分量を測定した。検出感度限界は、表５に示し
た。対照としてBDMQを含まない場合の結果も示した。
実施例９ 0.1Mトリス塩酸、1mM MgCl2、pH9.8にAMPPD1.0mg/m
となるように溶かし、BDMQを終濃度0.2％となるように
添加した。この溶液1mにアルカリホスファターゼ（0.
1mg/m）500μ加えNBD−Ｆ（0.0004、0.004、0.04、
0.4mg/m）を500μ添加し直ちに螢光光度計で波長40
0〜600nmの発光を測定した。表６は490nmと520nmの発光
ピークの比である。
となるように溶かし、BDMQを終濃度0.2％となるように
添加した。この溶液1mにアルカリホスファターゼ（0.
1mg/m）500μ加えNBD−Ｆ（0.0004、0.004、0.04、
0.4mg/m）を500μ添加し直ちに螢光光度計で波長40
0〜600nmの発光を測定した。表６は490nmと520nmの発光
ピークの比である。
（発明の効果） 本発明は、有機エンハンサー及び螢光剤のいずれか若
しくは混合物の存在下、酵素として酸又はアルカリホス
ファターゼと基質として前記一般式（Ｉ）で表されるジ
オキセタン誘導体とを反応させ、分解することにより、
極めて発光量の多い化学発光法を提供することができ
た。
しくは混合物の存在下、酵素として酸又はアルカリホス
ファターゼと基質として前記一般式（Ｉ）で表されるジ
オキセタン誘導体とを反応させ、分解することにより、
極めて発光量の多い化学発光法を提供することができ
た。
【図面の簡単な説明】 第１図はBDMQ、PDDACのそれぞれの効果をAFPの測定をも
って示したグラフである。第２図は、TBRCの添加量の発
光量増加効果を示したグラフである。第３図は、カルセ
インの添加の効果を示したグラフであり、第４図は、ウ
ンベリフェロンの同じく効果を示したグラフであり、第
５図は、同じく４−メチルウンベリフェロンの効果を示
したグラフである。
って示したグラフである。第２図は、TBRCの添加量の発
光量増加効果を示したグラフである。第３図は、カルセ
インの添加の効果を示したグラフであり、第４図は、ウ
ンベリフェロンの同じく効果を示したグラフであり、第
５図は、同じく４−メチルウンベリフェロンの効果を示
したグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン・シー・ヴォイタ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01864，ノース・リーディング，ウィリ アムズ・ロード 20 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/42 G01N 33/535 G01N 33/532
Claims (2)
- 【請求項１】有機エンハンサーの存在下および該エンハ
ンサーとは異なる蛍光剤の存在下に、酵素反応体として
酸ホスファターゼ部分又はアルカリホスファターゼ部分
を有する酵素反応体と一般式 （式中Ｔはスピロアダマンチル基、Ｒは低級アルキル基
であり、Ｍは陽イオンであり、Arは芳香族基である。） で表されるジオキセタン反応体とを接触させ、それによ
りエンハンサー不存在下よりも多く発光させることから
なる、化学反応による発光を生じさせる方法であって：
有機エンハンサーが、ポリ（ビニルベンジルトリメチル
アンモニウム クロライド）、ポリ［ビニルベンジル
（ベンジルジメチル アンモニウム クロライド）］、
ベンジルジメチルセチル アンモニウム クロライド、
ポリメタアクリルアミドプロピレンメチル アンモニウ
ム クロライド、ポリビニルピロリドン、ポリエチルオ
キサゾリン、1,5−ジメチル−1,5−ジアゾ−ウンデカメ
チレン ポリメトブロマイド、ポリメチレンイミン、ポ
リ−Ｌ−リジンおよびポリジアリル ジメチルアンモニ
ウム クロライドからなる群から選択され、 蛍光剤がフルオレッセイン、シス−ジクロロビス（2,
2′−ビピリジン）ルテニウム（II）ハイドレート、カ
ゼイン、ウンベリフェロンおよび４−メチルウンベリフ
ェロンからなる群から選択される方法。 - 【請求項２】Arがフェニレン又はナフチレンである、請
求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1188682A JP2984282B2 (ja) | 1989-06-27 | 1989-07-20 | エンハンサーを用いる化学発光測定法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8914749A GB2233451B (en) | 1989-06-27 | 1989-06-27 | Chemiluminescence enhancement |
| JP1188682A JP2984282B2 (ja) | 1989-06-27 | 1989-07-20 | エンハンサーを用いる化学発光測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0353897A JPH0353897A (ja) | 1991-03-07 |
| JP2984282B2 true JP2984282B2 (ja) | 1999-11-29 |
Family
ID=26295548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1188682A Expired - Fee Related JP2984282B2 (ja) | 1989-06-27 | 1989-07-20 | エンハンサーを用いる化学発光測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2984282B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007142314A1 (ja) | 2006-06-08 | 2007-12-13 | Fujirebio Inc. | 発光増幅剤 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09507571A (ja) * | 1993-12-23 | 1997-07-29 | トロピックス・インコーポレーテッド | 化学発光エネルギー移動検定 |
| JP4576752B2 (ja) * | 2001-05-29 | 2010-11-10 | 富士レビオ株式会社 | 化学発光増強剤 |
| AU2003239890A1 (en) * | 2002-05-23 | 2003-12-12 | Brij Pal Giri | POLYMERIC AMMONIUM AND OR PHOSPHONIUM SALTS HAVING ADDED Pi-ELECTRONS AND HIGHER MOLECULAR WEIGHT AS ENHANCERS FOR CHEMILUMINESCENT SYSTEMS |
| EP1542013B1 (en) * | 2002-06-24 | 2016-04-13 | Fujirebio Inc. | Chemiluminescence enhancer |
| WO2007052613A1 (ja) | 2005-10-31 | 2007-05-10 | National University Corporation Hokkaido University | 非液相型化学発光酵素免疫測定法および測定キット |
-
1989
- 1989-07-20 JP JP1188682A patent/JP2984282B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007142314A1 (ja) | 2006-06-08 | 2007-12-13 | Fujirebio Inc. | 発光増幅剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0353897A (ja) | 1991-03-07 |
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