CN1067257A

CN1067257A - 化学发光方法和组合物

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Publication number: CN1067257A
Application number: CN92103938.7A
Authority: CN
Inventors: M·H·阿克万-塔夫蒂
Original assignee: Lumigen Inc
Current assignee: Lumigen Inc
Priority date: 1991-05-24
Filing date: 1992-05-21
Publication date: 1992-12-23
Also published as: JPH0773515B2; EP0516948B1; AU656572B2; CA2061189A1; DE69231114D1; ATE193602T1; AU1476992A; DE69231114T2; EP0516948A1; TW201342B; JPH05115300A

Abstract

描述了一种化学发光方法，该方法使用了一种受护增强剂化合物，该化合物由水解酶触发可增强化学发光反应。该反应涉及到一种氨基取代的酰基酰肼，该化合物在活化增强剂化合物存在下被过氧化物和过氧化物酶活化而发光。结果使该反应发出的光得到增强。水解酶单独存在或者在免疫测定、DNA探针测定或其他测定中作为标记物与报道分子相结合。

Description

本发明涉及一种化学发光方法，该方法借助一种酶的作用由一种受护增强剂生成第二种酶的增强剂，而第二种酶本身又催化一个化学发光反应。本发明还涉及使用该方法来检测第一种酶。进一步，本发明涉及使用该方法对结合在第一种酶上的各种生物分子进行检测和定量。例如，该方法可借助免疫测定技术用来单独检测第一种酶或用第一种酶标记的半抗原、抗原和抗体;以Western印迹法检测蛋白质;分别以Southern印迹法和Northern印迹法检测DNA和RNA。该方法还可以在DNA顺序测定中用于检测DNA。

a.鲁米诺及有关化合物的化学发光氧化作用

氨基取代的环酰基酰肼，如鲁米诺和异鲁米诺，能够在碱性条件下与H₂O₂和过氧化物酶催化剂（如辣根过氧化物酶，简称HRP）反应而发光。该反应曾用作检测H₂O₂的分析方法及金属离子分析方法的基础。鲁米诺和异鲁米诺可以直接与所要检测的物质结合。用鲁米诺作标记物的第一个化学发光免疫试验，是由Schroeder报导的一种生物素测定法（H.R.Schroeder，P.O.Vogelhut，R.J.Carrico，R.C.Boguslaski，R.T.Buckler，Anal.Chem.，48：1933，1976）。从此便有了许多有关用鲁米诺衍生物作标记物应用的报导（H.R.Schroeder in Luminescent Immunoassays：Perspectives in Endocrinology and Clinical Chemistry，M.Serio and M.Pazzagli，Eds.，Raven Press，New York，pp129-146（1982）;M.Pazzagli，G.Messeri，A.L.Caldini，G.Monetti，G.Martinazzo，M.Serio，J.Steroid Biochem.，19：407，1983;Bioluminescence and Chemiluminescence New Perspectives，J.Scholmerich，et al，Eds.，J.Wiley & Sons，Chichester（1987））。还曾使用各种增强剂与鲁米诺合用以提高发光强度。这些增强剂包括D-荧光素（T.P.Whitehead，G.H.Thorpe，T.J.Carter，C.Groucutt，L.J.Kricka，Nature 305：158，1983）及对碘苯酚和对苯基苯酚（G.H.Thorpe，L.J.Kricka，S.B.Mosely，T.P.Whitehead，Clin.Chem.，31：1335，1985）。

b.酶催化的化学发光反应

1.稳定化1，2-二氧杂环丁烷的酶促触发。最近开发的热稳定性二氧杂环丁烷类，可以用化学方法或酶法触发，产生所需求的化学发光（A.P.Schaap，美国专利4，857，652;A.P.Schaap，R.S.Handley，B.P.Giri，Tetrahedron Lett.，935（1987）;A.P.Schaap，T.S.Chen，R.S.Handley，R.DeSilva，B.P.Giri，Tetrahedron Lett.，1155（1987）;A.P.Schaap，M.D.Sandison，R.S.Handley，Tetrahedron Lett.，1159（1987））。这些二氧杂环丁烷类具有几个关键特征：（1）利用了螺环稠合的金刚烷基的稳定化影响，使二氧杂环丁烷类的“贮存寿命”在室温下达数年之久;（2）有一个富电子芳香基团，它使激发态得以有效产生，并在受到激发时发出荧光;（3）有一个保护基，该基团能防止化学发光分解作用，直到该基团由酶或其他化学反应脱除为止。

反应式1

例如，对衍生自3-羟基苯甲酸甲酯和金刚烷酮的磷酸酯基取代的二氧杂环丁烷（1）（Lumigen PPD），观察到了碱性磷酸酯酶的酶促触发作用。将酶加到二氧杂环丁烷溶液中产生持续数分钟的化学发光。发现总发光量与二氧杂环丁烷浓度呈线性关系。发光衰减速度是酶浓度的函数，而总发光量则与酶浓度无关。由于二氧杂环丁烷在缓冲液中缓慢水解而造成的本底发光很弱，所以在增强剂存在下能检测到低于10^-18摩尔（1）微微微摩尔）的碱性磷酸酯酶（A.P.Schaap，H.Akhavan，L.J.Romano，Clin.Chem.，35：1863，1989）。其他酶即β-半乳糖苷酶、酯酶和硫酸酯酶类似的受护二氧杂环丁烷底物，也已被开发出来。市场上销售的许多用于检测蛋白质和核酸的产品，都是采用Lumigen PPD检测碱性磷酸酯酶化学发光（D.Pollard-Knight，A.C.Simmonds，A.P.Schaap，H.Akhavan，M.A.W.Brady，Anal.Biochem.，185：353-358，1990;J.M.Clyne，J.A.Running，R.Sanchez-Pescador，D.Besemer，M.Stempien，A.P.Schaap，R.S.Stephens，M.S.Urdea，J.Biolumin.Chemilumin.2：193，1988）。

2.过氧化氢的酶促生成。已知有各种不同的酶促反应都能生成过氧化氢。所生成的过氧化氢又能用来氧化一种发光化合物。例如，葡萄糖氧化酶与O₂和葡萄糖反应生成H₂O₂。同样，氨基酸氧化酶与氨基酸和O₂反应也生成H₂O₂。能被过氧化氢氧化而发光的化合物的例子有：鲁米诺和异鲁米诺、光泽精、N-甲基吖啶的酯类以及草酸的酯类和酰胺类。曾利用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和半乳糖-6-磷酸脱氢酶使氧经电子传递体系被还原，从而间接生成H₂O₂是（K.Tanabe，T.Kawasaki，M.Maeda，A.Tsuji，M.Yabuuchi，Bunseki Kagaku，36：82，1987;A.Tsuji，M.Maeda，H.Arakawa，Anal.Sci.，5：497，1989）。

3.由鲁米诺-NAG结合物酶促生成鲁米诺。化合物邻氨基邻苯二甲酰肼-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷（鲁米诺-NAG）是N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶的底物，该化合物是鲁米诺的掩蔽形式。一旦酶作用于该底物，即释放出鲁米诺，便可如上所述进行检测（K.Sasamoto，Y.Ohkura，Chem.Pharm.Bull.，38（5）：1323，1990）。

4.荧光虫或细菌荧光素酶的生物发光检测。有一类酶称为荧光素酶，这类酶催化许多活体中某些称作萤光素的底物的自氧化。荧火虫就是一个例子，它的生物发光过程以88%的效率使其荧光素发生氧化而发光。曾有人报导了一种DNA斑点杂交分析法，该方法采用碱性磷酸酯酶由磷酸盐生成游离的荧光虫荧光素。在最终步骤中加入荧光素酶使荧光素发生化学发光氧化（R.Huber，R.Geiger，Nuc.Ac.Res.，16（3）：1213，1988）。该方法中仅涉及一个酶增强步骤，因为第一种酶只生成第二种酶的底物。

c.化学发光在酶免疫测定法和DNA杂交测定法中的应用。涉及酶的生物测定法，如酶免疫测定法和DNA探针测定法，采用多种多样的底物，这些底物在与酶反应时或者生色（产色作用），或者发荧光（产生荧光作用），或者发光（化学发光）。在这三种选择中，化学发光的灵敏度最高。在测定中，酶（报道酶）与所要检测的分子结合，或者与能选择性地与所要检测的分子结合的某些其他物质结合。一旦将结合的报道酶与未结合的酶分离，就加入一种底物，报道酶则与该底物产生一种信号。迄今所用过的化学发光底物包括可用酶触发的二氧杂环丁烷类，如碱性磷酸酯酶底物Lumigen PPD。该底物已广泛应用于酶联免疫测定法和DNA探针中。在酶免疫测定法和DNA杂交测定法中业已广泛应用辣根过氧化物酶，并用鲁米诺或异鲁米诺作底物进行化学发光检测（T.P.Whitehead，G.H.Thorpe，T.J.Carter，C.Groucutt，L.J.Kricha，Nature 305，158（1983）;G.H.Thorpe，L.J.Kricka，S.B.Mosely，T.P.Whitehead，Clin.Chem.，31，1335（1985）;G.H.Thorpe，S.B.Mosely，L.J.Kricha，R.A.Stott，T.P.Whitehead，Anal.Chim.Acta，170，107（1985）;J.A.Matthews，A.Batki，C.Hynds，L.J.Kricka，Anal.Biochem.，151，205（1985））。市售的用于HRP与增强的鲁米诺化学发光检测结合的试剂盒以商品名Amerlite^TM出售。

d.灵敏检测的酶级联顺序。曾有人报道了一种用于碱性磷酸酯酶比色检测的偶联酶级联反应（D.M.Obzansky，D.M.Severino，Abstracts of 23rd Oak Ridge Conference on Advanced Analytical Concepts for the Clinical Laboratory，1991年4月12日）。在这一方案中，碱性磷酸酯酶生成的一种物质能与第二种酶的无活性形式反应，将其转化为活性态。第二种酶与其自身的底物反应生成H₂O₂。H₂O₂则通过后续的比色步骤来检测。

有人曾报道了一种比色酶免疫测定法，该方法用在夹层免疫测定中结合上的HRP来催化H₂O₂与生物素一苯酚结合物的氧化沉积。氧化产物沉积在测定容器的固体表面上。利用结合的生物素捕获另一些酶-抗生蛋白链菌素结合物。捕获的酶可以是更多的HRP，也可以另一种酶，即碱性磷酸酯酶或β-半乳糖苷酶。未采用化学发光检测（M.N.Bobrow，T.D.Harris，K.J.Shaughnessy，G.J.Litt，J.Immun.Meth.，125，279（1989））。

已知有一种以酶促释放一种酶抑制剂为特征的方法（Anal.Biochem.，179，229（1989））。该方法的基础是将一种抑制剂酶促释放给第二种酶。其灵敏度与第一种酶的浓度呈负相关关系，并且局限于检测第二种酶时所能达到的灵敏度。并没有由于使用两种酶而达到真正的增强作用。

曾利用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和半乳糖-6-磷酸脱氢酶使氧经电子传递体系被还原，从而间接生成H₂O₂（K.Tanabe，T.Kawasaki，M.Maeda，A.Tsuji，M.Yabuuchi，Bunseki Kagaku，36，38（1987）;A.Tsuji，M.Maeda，H.Arakawa，Anal.Sci.，5，497（1989））。在这些方法中，增强作用仅仅是由于酶的快速循环而产生的，而不是由于生成了另一种具有催化活性的物质。

美国专利4，318，980公开了一种不均一结合测定法，该方法采用具有催化作用的循环剂（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD）作为分析物的标记。随后由化学发光反应来检测循环剂。结果只涉及一个酶增强步骤。

美国专利4，598，042公开了用于磷酸酯酶结合物的免疫测定法，其中的磷酸酯酶将NADP转化为NAD。NAD在其氧化形式和还原形式之间循环，所形成的NAD起到了醇脱氢酶循环剂辅因子的作用，并催化有色化合物的形成。但没有公开化学发光或过氧化物酶的使用。

美国专利4，498，042公开了使用一种酶作标记物的免疫测定法，该酶将第二种酶的无活性形式转化为其活性形式。第二种酶则通过与底物的反应来检测。也可以是第二种酶发生反应产生第三种酶，随后通过与底物反应检测第三种酶。

由过氧化物酶催化的过氧化物使氨基取代的环酰基酰肼的氧化，所产生的化学发光检测具有良好的灵敏度。加入增强剂使该反应增强，就能用更低水平的过氧化物酶对化学发光进行测量。然后将该酶与目标生物分子偶联，就能以很高的灵敏度检测该生物分子。该技术的实用性仅限于使用过氧化物酶。需要对这种业已增强的化学发光加以利用，而这样做则需要用其他酶来启动氨基取代的环酰基酰肼的催化发光。如果使另一种酶成为该体系中的检测标记物，结果便是对已由酶增强的化学发光信号的进一步增强。这种对增强作用的增强将会实现对逐渐减小的酶量的检测，因而也将会实现对目标生物分子的检测。开发超灵敏的检测体系的一个关键设想是，要使相对于所要测量信号的本底信号保持在可能的最低水平。在所提出的任何检测方法中至关重要的是，通过增强作用得到尽可能大的信号，而本底信号不同步增强（即，只应增强目标信号）。

所以，本发明的一个目的是提供一种方法和可由酶触发的受护增强剂，用于借助过氧化物酶的作用产生化学发光，以检测生物物质和化合物。本发明的另一个目的是提供一种方法和可由酶触发的受护增强剂，用于借助过氧化物酶的作用产生化学发光，以用于在溶液中进行的免疫测定。本发明的再一个目的是提供一种方法和可由酶触发的受护增强剂，用于借助过氧化物酶的作用产生化学发光，以用Western印迹法检测蛋白质，用Southern印迹法和其他DNA杂交测定法检测DNA。

图1是采用实施例1所述的反应体系时化学发光强度作为时间函数的曲线。用Turner Designs TD20-e型发光计在室温下测量化学发光。用200倍中性滤光片使光衰减。通过加入碱性磷酸酯酶来启动反应。

图2显示了人转铁蛋白的化学发光Western印迹法的结果。正文中描述了Western印迹法的实验条件。各甬道中人转铁蛋白的用样量从左到右分别为5ng、1ng、200pg、50pg、20pg。将滤膜洗涤并封闭后在试剂中保温5分钟，对柯达X-OMAT AR胶片曝光5秒。

本发明涉及一种发光方法，该方法包括混合以下各成分：一种水解酶;一种受护增强剂化合物、一种过氧化物、以及一种与过氧化物和过氧化物酶反应时发光的氨基取代的酰基酰肼，其中受护增强剂化合物的化学式为ArOX，其中X为易与水解酶反应的离去基团，Ar为环中可含有C、O、S或N的无干扰芳环基团，水解酶与受护增强剂化合物反应而脱除X，从而与不加增强剂化合物时的发光水平相比较，氨基取代的酰基酰肼的发光水平得以增强。

本发明特别涉及一种借助于某个第一种酶的作用产生一种催化剂或循环剂的方法，第一种酶具有增强或放大第二种酶的作用，第二种酶本身又催化一个化学发光反应。本发明还涉及使用该方法以高灵敏度检测第一种酶。进一步，本发明涉及使用该方法对借助化学键或通过物理相互作用结合在上述酶上的各种生物分子进行检测和定量。所产生的化学发光的强度，对带标记有机或生物分子的数量构成了一种直接的量度。例如，该方法可借助免疫测定技术检测半抗原、抗原和抗体，以Western印迹法检测蛋白质，分别用Southern和Northern印迹法检测DNA和RNA。该方法还可以用于DNA顺序测定操作中检测DNA。

所述化合物优选具有下式的苯酚类化合物：

其中R是一个无干扰基团，该基团可以是杂环的，也可以与苯环的其他部位相连。

因此，R可以选自卤素（Cl、Br、F或I）、含有1-30个碳原子的烷基（可以是环烷基）、含有1-30个碳原子的芳烷基，其中烷芳基或芳烷基可以被卤素取代，也可以由O、N或S置换碳原子。

进一步，本发明涉及一种用于以某种测定法检测水解酶的试剂盒，该试剂盒包括一种受护增强剂化合物、一种过氧化物、一种过氧化物酶以及一种与过氧化物和过氧化物酶反应时发光的氨基取代的酰基酰肼，其中增强剂化合物的化学式为ArOX，其中X为易与水解酶反应的离去基团，Ar为环中可含有O、S或N的无干扰芳环基团;其中水解酶与增强剂化合物反应脱除X，从而与不加增强剂化合物时的发光水平相比较，氨基取代的酰基酰肼的发光水平得以增强。

最后，本发明涉及一种用于与水解酶反应的组合物，该组合物包含一种氨基取代的酰基酰肼和一种化学式为ArOX的受护增强剂化合物，其中X为易与水解酶反应的离去基团，Ar为环中可含有O、S或N的无干扰芳基，其中水解酶与增强剂化合物反应脱除X，从而与不加增强剂化合物时的发光水平相比较，氨基取代的酰基酰肼在过氧化物和过氧化物酶存在下的发光水平得以增强。

反应式2

受护增强剂化合物中的X基团被水解酶脱除后，生成了一种增强剂化合物，如苯酚类化合物，这种化合物大大增强了第二种酶即辣根过氧化物酶催化剂鲁米诺与过氧化氢氧化反应发光的能力。掩蔽或受护增强剂化合物（ArOX）的一些实例中给出了具体的离去基团X。各种特异酶类与受护增强剂化合物反应时，都脱除X基团，并释放出芳羟基化合物或芳氧化物离子。可能的X基团包括在使用条件下适宜的任何化学离去基团，该基团在后续步骤中用适当的酶处理带有X基团的标记分子时可被脱除。相应的OX基团包括（但不限于）烷基或芳基羧基酯、无机含氧酸盐和氧-吡喃糖苷。

本发明的一个必不可少的要素是，可以把氨基取代的环酰基酰肼、过氧化物、过氧化物酶和抑制剂混合在同一个溶液中贮存备用，而不会产生大的化学发光本底信号。鉴于氨基取代的环酰基酰肼、过氧化氢和过氧化物酶的混合物通常将构成强度很高的化学发光反应体系，预计不会产生大的化学发光本底信号。另外，在这个混合物中加入受护催化剂也不会产生大的化学发光本底信号。

本发明涉及借助酶或酶结合物与一种混合物作用而产生化学发光的方法，所述混合物为一种缓冲水溶液，其中含有氨基取代的环酰基酰肼、过氧化物、过氧化物酶、受护增强剂化合物（ArOX）和抑制剂。本发明还涉及使用该方法检测溶液中的生物分子，如半抗原、抗原、抗体和核酸。本发明还涉及使用该方法在固体载体如硝化纤维素膜或尼龙膜上以Western印迹法检测蛋白质、以Southern印迹法和其他DNA杂交测定法检测DNA，以Northern印迹法检测RNA。

本方法涉及由化学式Ar-OX表示的受护增强剂化合物，该化合物选自表1中OH中的H被X置换的化合物，其中Ar为选自芳基、芳烷基或杂芳基的无干扰基团，X为能被酶脱除从而生成芳羟基化合物或芳氧化物离子的化学上不稳定的取代基，OX则选自烷基或芳基羧基酯、无机含氧酸盐和氧-吡喃糖苷。

表1.芳族增强剂化合物（ArOH）

荧光虫荧光素邻苯基苯酚

脱氢荧光素对羟基肉桂酸

6-羟基苯并噻唑邻羟基肉桂酸

2-氰基-6-羟基苯 2-氯-4-苯基苯酚

并噻唑

对碘苯酚 2-萘酚

邻碘苯酚 1-溴-2-萘酚

对溴苯酚 1，6-二溴-2-萘酚

对氯苯酚对羟基苯基乙酸

2，4-二氯苯酚

对苯基苯酚邻羟基苯基乙酸

本方法优选涉及由下式表示的受护增强剂化合物：

其中，R选自I、Ph或-HC＝CH-COOH，X为可被酶脱除从而生成苯酚或苯酚盐离子的化学上不稳定的取代基，OX则选自烷基或芳基羧基酯、无机含氧酸盐和氧-吡喃糖苷。

本方法特别涉及由下式表示的受护增强剂化合物

其中，R选自H、CN或

X为可被酶脱除从而生成苯酚或苯酚盐离子的化学上不稳定的取代基，OX选自烷基或芳基羧基酯、无机含氧酸盐和氧-吡喃糖苷。

本发明涉及到一种缓冲水溶液，该溶液中含有：（1）受护增强剂化合物;（2）过氧化物，该过氧化物可以是过氧化氢、过硼酸盐、过氧化脲或有机过酸;（3）过氧化物酶，该酶可以是辣根过氧化物酶、微过氧化物酶或乳过氧化物酶;（4）氨基取代的环酰基酰肼，该氨基取代的环酰基酰肼可以选自3-氨基邻苯二甲酰肼（鲁米诺）、3-（N-烷基氨基）邻苯二甲酰肼、3-（N，N-二烷基氨基）邻苯二甲酰肼、6-烷基-3-氨基邻苯二甲酰肼、4-氨基邻苯二甲酰肼（异鲁米诺）、4-（N-烷基氨基）邻苯萘二甲酰肼、7-氨基萘二甲酰肼、7-（N-烷基氨基）萘二甲酰肼和7-（N，N-二烷基氨基）萘二甲酰肼;（5）抑制剂，该抑制剂可以选自脱脂乳、碘封阻液、牛血清清蛋白、明胶或各种表面活性剂（包括非离子型、阳离子型、阴离子型和两性离子型表面活性剂）。

仪器

除非另外指明，核磁共振（NMR）谱用通用电气公司QE300^TM型波谱仪以CDCl₃溶液测得，用四甲基硅烷作内标。质谱用Kratos MS-80型或AEI MS-90型质谱仪测得。用Mettler AE 163型分析天平称重。化学发光的测量或者用Turner TD 20e型发光计进行，或者用本实验室自制的与Apple Macintosh型计算机接口的装置进行。

材料

除另外指明外，从各种商业来源得到的溶剂和试剂为现有的最好等级，并且不经进一步纯化即使用。溶剂用加氢化钠或氢化钙进行蒸馏的方法进行干燥。各种酶是从商业来源购得，并且不经进一步纯化即使用。辣根过氧化物酶IgG结合物购自Cappel Products公司。由于游离酶显示出磷酸酯酶活性，所以在这些研究中使用上述结合物而不使用游离的商品酶。

酶底物的合成

对碘苯基磷酸二钠盐。将吡啶（0.395克，5毫摩尔）溶于15ml CH₂Cl₂。将溶液冷却至约5℃，在搅拌的同时缓慢加入POCl₃（2.30克，15毫摩尔）。接着，用5分钟的时间滴加对碘苯酚（1.10克，5毫摩尔）在10ml CH₂Cl₂中的溶液。撤去冷却浴，继续搅拌30分钟。减压除去溶剂，加入15ml CH₃CN以溶解固体物。在搅拌下滴加NaOH（0.80克，20毫摩尔）在1ml水中的溶液，生成白色沉淀物。放置10分钟后收集固体物，并用大量的CH₃CN洗涤，然后用丙酮洗涤，空气干燥。

对苯基苯酚磷酸酯二钠盐。将吡啶（0.395克，5毫摩尔）溶解在15ml CH₂Cl₂中。将溶液冷却至约5℃，在搅拌的同时缓慢加入POCl₃（2.30克，15毫摩尔）。接着，用5分钟的时间滴加对苯基苯酚（0.85克，5毫摩尔）在10ml CH₂Cl₂中的溶液。撤去冷却浴，继续搅拌30分钟。减压除去溶剂，并加入15mlCH₃CN以溶解固体物。在搅拌下滴加NaOH（0.80克，20毫摩尔）在1.2ml水中的溶液，生成白色沉淀物。放置10分钟后收集固体物，并用大量CH₃CN洗涤，然后用丙酮洗涤，空气干燥。

对碘苯基-β-D-半乳吡喃糖苷。将对碘苯酚（1克，4.5毫摩尔）溶于3ml丙酮中，并用3ml 5M KOH水溶液处理。在搅拌下向溶液中分次加入乙酰溴半乳糖（5.6克，13.6毫摩尔）。先加入4.1克，同时加入1ml 5M KOH，然后每隔2-3小时加入0.5克乙酰溴半乳糖，同时加入0.5ml 5M KOH，直到加入总量为5.6克（3当量）。继续搅拌过夜。加入水，溶液用二氯甲烷萃取，然后用乙酸乙酯萃取。合并有机层并蒸发，粗产物进行硅胶柱层析纯化，用30%乙酸乙酯的甲醇溶液洗脱除去未反应的糖。从适当的洗脱液级分中除去溶剂后，得到所要化合物的四乙酸酯。将300毫克所要化合物溶解在2ml丙酮中，并与650μl 10M KOH一起搅拌过夜，从而实现水解。蒸去丙酮并加入30ml水。加入氯化铵使pH达中性，所得溶液用乙酸乙酯萃取。用1∶1乙酸乙酯/甲醇进行硅胶柱层析后，蒸除乙酸乙酯。

对苯基苯酚-β-D-半乳吡喃糖苷。将对苯基苯酚（0.25克，1.5毫摩尔）溶于1.5ml丙酮中，并用0.5ml 10M KOH水溶液处理。在搅拌下向溶液中分两次加入乙酰溴半乳糖（1.8克，4.4毫摩尔）。先加入1.5克，同时加入0.5ml 10M KOH。两小时后，加入0.3克乙酰溴半乳糖，同时加入0.5ml 10M KOH。继续搅拌过夜。待薄层层析表明起始原料已消耗完时，再加入1ml 10M KOH，继续搅拌1天。蒸去丙酮，残留物用乙酸乙酯萃取5次。合并有机层，干燥和蒸发后，粗产物用30%甲醇的乙酸乙酯溶液进行硅胶柱层析纯化。

对苯基苯酚乙酸酯。将吡啶（2ml）溶于15ml CH₂Cl₂中，将溶液冷却至约5℃，在搅拌的同时缓慢加入乙酰氯（1.8克，4.4毫摩尔）。接着，用15分钟的时间滴加对苯基苯酚（0.85克，5毫摩尔）在20ml CH₂Cl₂中的悬浮液。撤去冷却浴，继续搅拌30分钟。减压除去溶剂，加入50ml乙酸乙酯以溶解固体物。溶液用水萃取，用Na₂SO₄干燥，减压蒸发。

标记酶的化学发光检测

实施例1

用于增强碱性磷酸酯酶检测的典型反应液的组成为：

2-甲基-2-氨基-1-丙醇缓冲液 0.1M，pH9.4

Mg（OAc）₂8.8×10^-4M

H₂O₂0.3%（v/v）

鲁米诺 1×10^-3M

对苯基苯酚磷酸酯 1×10^-3M

辣根过氧化物酶-IgG 1×10^-10-1×10^-18摩尔

按照典型方法，将200μl试剂移入置于Turner TD 20e型发光计或其他合适发光计中的聚丙烯管中。测量本底发光5分钟，然后加入5μl碱性磷酸酯酶溶液试样。图1显示了在25℃下进行该反应时得到的光强度与时间关系曲线。该方法能在205μl的体积中测量出低至6×10^-18摩尔的碱性磷酸酯酶，信号/本底比为4。

实施例2

使用实施例1的溶液并加入0.1%脱脂奶粉（NFM），结果与实施例1类似，所不同的是本底明显地降低了。

实施例3

使用实施例1的溶液并加入5%碘封阻液，结果与实施例1类似，所不同的是本底明显地降低了。

实施例4

使用实施例1的溶液并用对碘苯基磷酸酯代替对苯基苯酚磷酸酯，结果与实施例1类似。

实施例5

用于增强β-半乳糖苷酶检测的典型试剂溶液的组成为：

磷酸盐缓冲液 0.1M，pH7.6

Mg（OAc）₂8.8×10^-4M

H₂O₂0.3%（v/v）

鲁米诺 1×10^-3M

对苯基苯酚半乳糖苷 1×10^-3M

辣根过氧化物酶-IgG 10^-10-10^-18摩尔

脱脂奶粉（NFM） 0.1%（w/v）

按照典型方法，将200μl试剂移入置于Turner TD 20e型发光计或其他合适发光计中的聚丙烯管中。测量本底发光5分钟，然后加入5μlβ-半乳糖苷酶溶液试样。立即开始发出化学光，在不到5分钟内达到最强，发光强度与β-半乳糖苷酶的量成正比。发光强度缓慢衰减1小时以上。

实施例6

使用实施例5的溶液并用对碘苯基半乳糖苷代替对苯基苯酚半乳糖苷，结果与实施例5类似。

实施例7

用于增强酯酶检测的典型试剂溶液的组成为：

磷酸盐缓冲液 0.1M，pH7.6

Mg（OAc）₂8.8×10^-4M

H₂O₂0.3%（v/v）

鲁米诺 1×10^-3M

对苯基苯酚乙酸酯 1×10^-3M

辣根过氧化物酶-IgG 10^-10-10^-18摩尔

脱脂奶粉（NFM） 0.1%（w/v）

按照典型方法，将200μl试剂移入置于Turner TD 20e型发光计或其他合适发光计中的聚丙烯管中。测量本底发光5分钟，然后加入5μl酯酶溶液试样。立即开始发出化学光，在不到5分钟内达到最强，发光强度与酯酶的量成正比。发光强度缓慢衰减1小时以上。

用Western印迹法进行蛋白质

的化学发光检测

羊非免疫血清、人全血清和兔抗羊IgG-碱性磷酸酯酶结合物得自CappeI Products公司（Durham，NC）。人转铁蛋白、经过分级分离的羊抗人转铁蛋白血清以及硝化纤维素膜，购自Sigma化学公司（St.Louis，MO）。每个血清和IgG样品都在10，000g下离心2分钟，用上清液进行免疫反应。Immobilon-P转移膜和尼龙转移膜分别得自Millipore公司（Bedford，MA）和MSI公司（Micron Separations，Inc.，Westboro，MA）。测定步骤中使用柯达X-OMAT AR X光胶片。

利用前人所述的缓冲体系进行SDS-PAGE（U.K.Laeammli，Nature，227：680，1970）。浓缩胶为4.38%丙烯酰胺∶0.12%双丙烯酰胺。分离胶为6.81%丙烯酰胺∶0.19%双丙烯酰胺。电泳后，凝胶用含有20mM Tris、153mM甘氨酸和20%（v/v）甲醇的转移缓冲液平衡7-8分钟。将凝胶夹在一片Immobilon-P转移膜和一片层析纸3MM（Whatmann）之间，放入转移装置（Bio-RadLaboratories，Richmond，CA）。在4℃下以100伏的恒压将凝胶中的蛋白质电洗脱60-80分钟。然后于4℃下将膜在pH7.4的50mM Tris-HCl缓冲液中放置过夜。这段时间之后，用TBS洗膜15分钟。

在室温下，用含有1% NFM的0.05%吐温-20在50mM Tris-HCl缓冲生理盐水中的溶液（T-TBS）（pH为7.4）将膜处理1小时。于室温下，用含有1% NFM的T-TBS将这个封闭膜与第一抗体（1∶500稀释剂的羊抗人转铁蛋白IgG部分）一起保温75分钟。

在室温下，将膜与第二抗体（1∶5000稀释的兔抗羊IgG-碱性磷酸酯酶结合物）在含有1%NFM的T-TBS中保温1小时。保温后，将该膜用T-TBS淋洗，并用T-TBS洗涤4次，每次10分钟，然后在TBS中洗涤10分钟。将该膜用蒸馏水淋洗三次。

将洗过的膜浸泡在试剂溶液中5分钟，放出试剂溶液，将膜置于支持物（透明膜）中，对X光胶片曝光5秒至30分钟，然后显影。图2显示了条形化学发光Western印迹，其中使不同浓度的人转铁蛋白与抗体-碱性磷酸酯酶结合物在Immobilon-P尼龙膜上结合，并使其与实施例1所述的化学发光试剂溶液接触。

这种化学发光方法能测量出500毫微微克（5×10^-13克）/条的人转铁蛋白。另外，该方法能在X光胶片上得到永不褪色的实验记录，而且有可能以很短的曝光时间安全而方便地检测少量蛋白质。

以上叙述只打算说明本发明，本发明只由后附的权利要求书来限定。

Claims

1、一种发光方法，该方法包括混合以下各成分：

(a)一种水解酶；

(b)一种受护增强剂化合物、一种过氧化物、一种与过氧化物和过氧化物酶反应时发光的氨基取代的酰基酰肼，其中受护增强剂化合物的化学式为ArOX，其中X为易与水解酶反应的离去基团，Ar为环中可含有C、O、S或N的无干扰芳环基团，水解酶与受护增强剂化合物反应而脱除X，从而与不加增强剂化合物时的发光水平相比，氨基取代的酰基酰肼的发光水平得以增强。

2、权利要求1的方法，其中水解酶与一种生物分子相连。

3、权利要求1的方法，其中水解酶与一种抗体相连。

4、权利要求1的方法，其中水解酶与测定中构成结合对一部分的分子相连。

5、权利要求1的方法，其中水解酶与核酸相连。

6、权利要求1的方法，其中混和和检测操作在膜上进行。

7、权利要求1的方法，其中膜为Immobilon^TM-P。

8、权利要求1的方法，其中在加入水解酶之前加入一种抑制剂，以阻滞发光。

9、权利要求1的方法，其中OX选自烷基羧基酯、羧基酯、无机含氧酸盐和氧吡喃糖苷取代基。

10、权利要求1的方法，其中水解酶选自碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶和酯酶。

11、一种用于某种测定法检测水解酶的试剂盒，该试剂盒包括一种受护增强剂化合物、一种过氧化物、一种过氧化物酶以及一种与过氧化物和过氧化物酶反应时发光的氨基取代的酰基酰肼，其中增强剂化合物的化学式为ArOX，其中X为易与水解酶反应的离去基团，Ar为环中可含有C、O、S或N的无干扰芳环基团;水解酶与受护增强剂化合物反应脱除X，从而与不加增强剂化合物时的发光水平相比，氨基取代的酰基酰肼的发光水平得以增强。

12、权利要求11的试剂盒，该试剂盒还包括一种在其上检测水解酶的膜。

13、权利要求11的试剂盒，该试剂盒还包括与测定中某一结合对中的一个成分偶联的水解酶。

14、权利要求11的试剂盒，该试剂盒还包括与水解酶偶联的抗体。

15、权利要求11的试剂盒，该试剂盒还包括与水解酶偶联的抗原。

16、权利要求11的试剂盒，该试剂盒还包括与水解酶偶联的核酸。

17、权利要求11的试剂盒，其中还包括一种在不加水解酶时阻滞发光的抑制剂。

18、权利要求17的试剂盒，其中抑制剂选自蛋白质和表面活性剂。

19、权利要求11的试剂盒，其中OX选自烷基羧基酯、羧基酯、无机含氧酸盐和氧吡喃糖苷取代基。

20、一种用于与水解酶反应的组合物，该组合物包含：

（a）一种氨基取代的酰基酰肼;

（b）一种化学式为ArOX的受护增强剂化合物，其中X为易与水解酶反应的离去基团，Ar为环中可含有C、O、S或N的无干扰芳基，其中水解酶与受护增强剂化合物反应脱除X，从而与不加增强剂化合物时的发光水平相比，氨基取代的酰基酰肼在过氧化物和过氧化物酶存在下的发光水平得以增强。

21、权利要求20的组合物，该组合物与过氧化物酶和过氧化物及一种抑制剂混合。

22、权利要求21的组合物，其中抑制剂选自蛋白质和表面活性剂。

23、权利要求20的组合物，其中OX选自烷基羧基酯、羧基酯、无机含氧酸盐和氧吡喃糖苷取代基。

24、一种发光方法，该方法包括混合以下各成分：

（a）一种水解酶;

（b）一种受护增强剂化合物、一种过氧化物、一种与过氧化物和过氧化物酶反应时发光的氨基取代的酰基酰肼，其中增强剂化合物的化学式为：

其中X为易与水解酶反应的离去基团，R为无干扰基团，其中水解酶与受护增强剂化合物反应脱除X，从而与不加增强剂化合物时的发光水平相比，氨基取代的酰基酰肼的发光水平得以增强。

25、权利要求24的方法，该方法还包括一种抑制剂，阻滞在不加水解酶时发光。

26、一种检测水解酶存在的方法，该方法包括：

（a）混合下列各成分：水解酶、一种受护增强剂化合物、一种过氧化物酶、一种过氧化物、一种在与过氧化物和过氧化物酶反应时发光的氨基取代的酰基酰肼，其中受护增强剂化合物的化学式为：

其中X为可被水解酶脱除的离去基团，R为无干扰的有机基团，其中水解酶与受护增强剂化合物反应脱除X，从而与不加增强剂化合物时的发光水平相比，氨基取代的酰基酰肼的发光水平得以增强;

（b）检测该水解酶，其中酶量是氨基取代的酰基酰肼发光强度的函数。

27、权利要求26的方法，该方法还包括一种抑制剂以阻滞在不存在水解酶时发光。

28、权利要求26的方法，其中水解酶与一种生物分子相连。

29、权利要求26的方法，其中水解酶与抗体相连。

30、权利要求26的方法，其中水解酶与测定中构成结合对一部分的分子相连。

31、权利要求26的方法，其中水解酶与核酸相连。

32、权利要求26的方法，其中混合和检测操作在一种膜上进行。

33、权利要求32的方法，其中膜为Immobilon^TM_P。

34、权利要求24的方法，其中OX选自烷基羧基酯、羧基酯、无机含氧酸盐和氧吡喃糖苷取代基。

35、权利要求24的方法，其中水解酶选自碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶和酯酶。

36、权利要求26的方法，其中水解酶选自碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶和酯酶。

37、一种用于某种测定法检测水解酶的试剂盒，该试剂盒包括一种受护增强剂化合物、一种过氧化物、一种过氧化物酶、一种与过氧化物和过氧化物酶反应时发光的氨基取代的酰基酰肼，其中受护增强剂化合物的化学式为：

38、权利要求37的试剂盒，该试剂盒还包括一种在其上检测水解酶的膜。

39、权利要求37的试剂盒，该试剂盒还包括与测定中某一结合对中的一个成分偶联的水解酶。

40、权利要求37的试剂盒，该试剂盒还包括与水解酶偶联的抗体。

41、权利要求37的试剂盒，该试剂盒还包括与水解酶偶联的抗原。

42、权利要求37的试剂盒，其中还包括一种在不加水解酶时阻滞发光的抑制剂。

43、权利要求42的试剂盒，其中抑制剂为蛋白质。

44、权利要求37的试剂盒，其中OX选自烷基羧基酯、羧基酯、无机含氧酸盐和氧吡喃糖苷取代基。

45、一种用于与水解酶反应的组合物，该组合物包含：

（a）一种氨基取代的酰基酰肼;

（b）一种具有如下化学式的受护增强剂化合物：

其中X为易与水解酶反应的离去基团，R为无干扰基团，其中水解酶与受护增强剂化合物反应脱除X，从而与不加增强剂化合物时的发光水平相比，氨基取代的酰基酰肼在过氧化物和过氧化物酶存在下的发光水平得以增强。

46、权利要求45的组合物，该组合物与过氧化物酶和过氧化物及一种抑制剂混合。

47、权利要求45的组合物，其中抑制剂为蛋白质。

48、权利要求45的组合物，其中OX选自烷基羧基酯、羧基酯、无机含氧酸盐和氧吡喃糖苷取代基。

49、权利要求24的方法，其中，R选自卤素、含1-30个碳原子的烷基、含1-30个碳原子的芳基、含1-30个碳原子的芳烷基，其中烷基、芳基或芳烷基可被卤素取代，其中的芳基可含有置换碳原子的O、N或S;OX位于R的对位。

50、权利要求26的方法，其中，R选自卤素、含1-30个碳原子的烷基、含1-30个碳原子的芳基、含1-30个碳原子的芳烷基，其中烷基、芳基或芳烷基可被卤素取代;OX位于R的对位。

51、权利要求37的试剂盒，其中，R选自卤素、含1-30个碳原子的烷基、含1-30个碳原子的芳基、含1-30个碳原子的芳烷基，其中烷基、芳基或芳烷基可被卤素取代;OX位于R的对位。

52、权利要求45的组合物，其中，R选自卤素、含1-30个碳原子的烷基、含1-30个碳原子的芳基、含1-30个碳原子的芳烷基，其中烷基、芳基或芳烷基可被卤素取代;OX位于R的对位。