TW201342B - - Google Patents

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1,01342 經 濟 部 屮 央 標 準 局 员 工 消 Λ6 B6 五、 »發明説明 ( !) 發 明 背 景 (1 ) 發 明 1 鳙 本 發 明 係 醑 於 —· 種 由 化 學 方 法 産 生 光 (化學發光） 之 方 法 » 乃 由 一 種 酵 素 f 其 可 由 被 m 增 強 子 (e n h an c e r )竄 生 第 二 酵 素 的 增 強 子 » 再 由 第 二 酵 素 催 化 化 學 發 光 反 應 ο 本 發 明 亦 關 用 於 使 用 此 方 法 以 偵 测 此 第 . 酵 素 〇 此 外 • 本 發 明 係 關 於 使 用 此 方 法 以 偵 測 並 定 量 各 種 與 第 一 酵 素 結 合 之 生 物 分 子 » 例 如 $ 可 使 用 此 方 法 以 偵 测 第 m 素 或 作 為 免 疫 分 析 技 術 中 半 抗 原 > 抗 原 及 抗 鱺 之 棵 定 物 ， 西 方 墨 漬 之 蛋 白 質 南 方 及 北 方 <3p 漬 之 DN A及R N A之 標 定 物 $ 此 方 法 亦 可 於 DNA定序列之反應中偵測D N A 〇 (2 ) 先 前 枝 M. 說 明 a . ;&来络ί Jji i j η 〇 1 ) 及 相 期 化 a 物 化 學 發 光 氬 什丨 作 闬 將 已 取 代 以 胺 基 之 琢 m 餅 $ 如 魯 米 諾 及 異 魯 米 諾 於 m 性 及 發 光 之 下 » 與 Η . 0 0 及 過 氣 化 酶 催 化 劑 (如 辣 根 過 氣 m 9 HRP)反 應 » 使 用 此 方 法 作 為 偵 测 Η , 0 . 及 金 属 離 子 之 分 析 方 法 的 基 礎 » 可 將 魯 米 諾 及 異 魯 米 諾 直 接 與 待 偵 测 物 連 結 » 使 魯 米 諾 為 標 定 物 之 化 學 發 光 免 疫 分 析 首 由 Sc hr 〇 e d e Γ 之 生 物 分 析 方 法 中 刊 載 [Η .R * Sc hr 〇 e d e r , P .0 • Vo g e 1 h u t 1 R . j . C a r r i C 0 » R . C . Β 0 g U S 1 a s k i , R .T * B u c k 1 e Γ , L JLa. C h -fiJl _9 48 , 1 9 3 3 ( 19 76 )] 〇 此 後 > 亦 刊 載 數 篇 使 用 魯 米 諾 衍 生 物 為 標 定 物 之 方 法 [Η .R • Sc hr o e d e Γ 於 L U ID in _fiJL t La IQ U η 〇 -s_a. 1·· E_a. Γ 8 P ft c t i γ i η En do c Γ in 〇 1 〇 K γ λ η ή Cl J-0. i c ^JL C h e mi s t r γ _1 Μ . S e r ίο 與 Μ . P a z z a g 1 i . Ε d s • > 裝 訂 線 太從/i ils If! Ψ K W 定;找报 i CNS) V 4Μ格 f 2 ] Γι X 297公修） ? 先 閲ii 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 L01342 A 6 B6 五、發明説明（2) 經濟部中央標準局貝工消贽合作社印製 R a v e η P r e s S , N e w Y o r k , Ρ ρ 12 9 - 146 (1 9 8 2 ) ]； Μ • Pa Ζ - z a si i , G • Me S S e r i , A . L . Cal d i n i > G . M on e t t i 梦 G . Ma r t in a ζ 2 0 $ Μ . e r i ο ,L s t_£ r.Q ί <J _a i 〇 -cJl —· 1 9 , 4 0 7 (1 9 8 3 ) ； B i 〇 1 U B -Ln e_n c 钤 and C h e d i 1 u n in ft 8 r, β n c ρ Η e ν P e ρ Q t i v ft _s__. j Sc h o 1 n e r ί c h 等 人 9 Ed s , j W i 1 e y & So ns 9 C h i c he S t e r (1 9 8 7 ) ]0 可 結 合 使 用 各 捶 增 強 子 及 魯 米 諾 以 增 強 所 放 出 光 之強 度 ,其 包 含 D - 螢 光 素 [τ .P • U h i · t e he a d ， G . Η . T ho Γ Ρ e , T .J .C a r t e r t C . G Γ 0 U C U t t , L • K . K r i c k a , N at u r e , 3 0 5 » 15 8 (1 9 8 3 ) ] 及 對 一 碘 酚 及 對 一 苯 酚 t G . Η * Th or P e , L . J . Kr i c k a » S . Β • Mo s e w 1 y , T . P • Wh it eh e a d (a. "in..·_ C h 3 1 , 1 3 3 5 (1 9 8 5) ]0 b . ύ i酵袤催化乏仆，璺發来砭贏 1 由 醉 素 所 引 發 ：>播 ψ 的1 · ?, -- :氳璁z烷 近 來 以 發 展 由 化學 或 酵素 方 法 可 得 熱 m 定 之 二 氣 琛 乙 院 以 産 生 欲 得 之 化 學發 光 [A . P • Sc ha a ρ 9 美 國 専 利 第 48 5 7 6 5 2號； A • Ρ > S c h a a Ρ 1 R . s. Η an d 1 e y f Β . Ρ G i Γ i Te t r a h e d r ο η L e t t .jk, 9 3 5 ( 19 8 7 ); A • P . s c h a a Ρ > T • S . he n , R • s. Η an d 1 e y .R . D eS i 1 v a » B . P < G i r ί » t r a - hL^ jLtl SUL _L ft t t, · 11 5 5 ( 1 9 8 7 )；及 A . P * Sc ha a p ， Μ . D • S a n d is on f R . s • Ha n d 1 e y * T G t x_a. h e dr SLIL L -fi_L t , ·» 11 5 9 (1 9 8 7 ) ]ο 此二氣琛乙烷表現出數舾持質： 0)东 t大氣之下， 使 用 融 為 螺 旋 形 之 金 剛基 之 穩定 影 m 力 以 提 供 二 氣 琛 乙 烷 有 數 年 之 適 用 期 » 且 ¢)具 有 寓含 霣 子 之 芳 香 基 ， 使 得 可 有 效 地 産 生 撖 活 態 且 當 激活 時 可産 生 螢 光 t 以 及 (3) _. 個 保 護 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· •町_

L0134S Λ 6 Β6

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部屮央標準沿貝工消費合作杜印製 例如，由3 -羥苯甲酸甲酯及金剛酮（Lu^igent· PPD)衍 生之己取代以磷酸鹽的二氣琛乙烷（L)中可觀察到由鹼性 去磷酸_所催化之酵素反應。將酵素加至二氣琛乙烷溶液 中可造成數分鐘的化學發光，總發射光與二《琛乙烷濃度 之關供為線形，發射率的衮退為酵素義度的函數，然而總 發射光則與酵素濃度無鼷。由於二氣琛乙烷於緩衝液中之 緩慢水解所造成之發光背景非常低，因此鹹性去磷酸醑之 促進子的存在可偵測至10'1β B〇l (1 att〇B〇l) [A. P. Schaap, H. Akhavan, L . J . Romano, Clin. Cham. . 3 5 , 1863 (1989)]。 亦已研發出其他酵素，如/9-半乳糖苷酶 、酯酶及硫酸酯酶，使用相似之已保護二氣琛乙烷為受質 。市售可得之偵测蛋白質及核苷酸之産物多使用鹸性去磷 酸《與金剛酮（Lunigent» PPD)之化學發光偵測作用 （D. Pollard-Knight, A. C . Simnonds, A. P. Schaap, H . Akhavan, H. A. W. Brady , Anal. B ϊ 〇 c h e a . . 1 8 5 , 3 5 3 - 太燴ili闲Ψ因闽定说准（CNS) Ή抝格（210x297公册） 裝· 訂_ -線- Μ 01343 A 6 Β6 五、發明説明（4) 3 5 8 ( 1 9 9 0 ) ； J . M· C 1 y n e , J· A. Running, R . Sanchez- a c s e

D e s e Μ c a a

R s 2 n e

e d Γ u s M 2 過 生 d 生 所 其 i s 之 知 己 為 £ 化 氧 過 生 _M産 4t_t? 應 反 素 酵 •it 種 多 化 H 成 之成生 光生而 發而應 可應反 化反0. 氧糖及 以萄酸 用葡基 再及胺 可 Ο 與 氫與酶 化酶化 氣化氣 過氣酸 之糖基 成萄胺 物 合 同 葡將氳 將可化 ,,« 如地過 例樣由 精糖 澤萄 光 《 、 用 諾使 米己 魯 。 異胺 及酵 諾及 米酯 魯之 為酸 子醯 例草 物及 合 、 化酯 的的 光啶 生-T 産基 以甲 化N-氣 、 放 釋 子 霣 由 _ 氫 去 鹽 酸 m - 6 -* 糖 乳 半 及 酶0 去0 酸 磷 生 産 地 接 間 以 原 邇 氣 將 統 条 a n a 3 W a (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂- a s un s Μ

C η U s Μ

H a w" a k a Γ 5 ώ 生 一 結 ul- θ· - 基0 乙 1 Ν 轉 肼 酞 胺 - 郯 物 合 化 受 之 酶 胺 糖^ 0 米 0 ftD- 經濟部屮央標準局Μ工消费合作社印製 時 用 作 質 受 此 與 素 . 酵 f 當諾 ，米 式魯 形的 裝放 偽釋 的所 諾到 米測 魯偵 為法 且上 ，依 質可 用 作 0 俏0 物 牛 的0 光 萑0 細 或 虫 火0 則

a Γ U 如光 化發 催物 内生 鼸 的 活虫 些火 一 螢 於如 可例 素 ， 酵用 的作 酶化 光氣 螢鼸 為自 名行 lii 一 質 知受 已之 素 光 發 太《.袼 /f i,«s ifl Ψ a Μ 玄找准fCNSWM抝格297公:修） 1,0134^ A 6 D6 經濟部屮央標準局员工消t合作社印製 五、發明説明（句 作用可氣化自身的螢光素以産生881效率之光。已報導一 篇 DHA 點雜合分析（DNA dot-hybridization assay),其 中使用鹼性去磷酸_以由磷酸鹽産生游離之螢火虫螢光素 ，於最後一個步®加入螢光酶可導致螢光素的化學發光氣 化作用[R. Huber, R . Geiger, N u c. Ac. Res., 16(3), 1213 (1988)]。因為第一個酵素僅生成第二個酵素的受質 ，於此方法中僅包含一値酵素擴增步驟。 c . 於酵袤分析及DNA雜会分析中化璺發来夕用徐 如酵素免疫分析及DNA探針分析之生物分析中含有可利 用多種變化受質之酵素，當與此酵素反應時，可生成顔色 (發光）、變成螢光（生成螢光）或發光（化學發光）。於此三 種情形下，化學發光最具雄敏性。於分析中，將酵素（通 知酵素reporter enzyme)與待偵測分子或其他可具趣擇性 地與待偵拥（分子結合之物質連接或結合。一旦結合之通知 酵素由未結合酵素中分離出來，則提供受質使得通知酵素 可生成訊息。目前所用化學發光受質包括可由酵素催化之 二氣環乙烷，如鹼磷酸酶受質Lunigente PPD等。此受霣 常用於酵素連結免疫分析及DNA探針分析中，於酵素免疫 分析及DNA雜合分析中，常使用辣根過氧化酶之酵素及魯 米諾或異魯米諾為受質以進行化學發光偵澜[T. P. White head, G . H. Thorpe , Τ. J . Carter , C . Groucutt, L . J. K r i c k a , Nature 3 0 5, 1 5 8 ( 1 9 8 3 )； G. H . Thorpe, L . K. Kricka, S.B. Mosely, T.P. Whitehead, Clin. C h e m 31 1 3 3 5 ( 1 9 8 5 ) ； G. H . Thorpe, S. B. Mosely, L . J . (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝< 訂_ 線-

L0134S A 6 B6 五、發明説明（6) 經濟部+央標準A员工消费合作杜印製 Kr i c k a > R . A • St 0 t t , T • P . V hi t e he a d $ An Α.1 SLk i Q -1. Lq, t a _， 17 0 , 1 0 7 ( 19 8 5 )； J * A . Μ at t h e w s , A • B a t k 1 . C . H y η d s t L . J • K r i c k s LH a_L -«— B i ϋ-CL h e ffl · > 15 1 , 2 0 5 (1 9 8 5 ) ]ο 可得增強之魯米諾化學發光偵測fl e用且與Η R P 連 接 之 可 得 試 劑 組 係 以 An e r 1 i t e t m 商 品 明 稱 行 銷 市 面 〇 d . 用以S敏掐湘醵袤瞄式：席Ϋ l 用 以 鹸 性 磷 酸 银 之 比 色 偵 测 的 偶 合 酵 素 階 式 反 窿 已 有 報 導 (D .Μ • 0 b z a ns ky » D . Μ . S e v e r in 0 . Ab s t Γ a c t S 0 f 2 3 r d 0 a k R i d g e Co n f e r e η c e 0 η Ad v a n c e d A n a 1 y t i c a 1 Co n c e - p t s f 0 r t h e Cl in i c a 1 L a b or at or y . A P r i 1 1 2 , 1 9 9 1 ) ο 於 此 反 應 中 « 由 鹺 性 磷 酸 酶 所 生 成 之 受 霣 會 與 不 活 化 之 第 二 酵 素 反 應 t 並 将 其 轉 為 活 化 狀 態 » 第 二 酵 素 再 與 其 本 身 受 質 反 應 而 生 成 Η . 0 a » 此 Η . 0 8 可 由 比 色 分 析 法 偵 測 之 0 己 知 之 比 色 酵 素 免 疫 分 析 法 為 将 已 結 合 於 夾 層 免 疫 分 析 中 之 HR P 催 化 已 與 Η . 0 α 連 接 之 生 物 素 — 酚 進 行 氣 化 分 解 > 所 得 氣 化 産 物 會 沉 m 於 分 析 管 的 固 驩 表 面 〇 可 使 用 己 結 合 之 生 物 素 補 捉 額 外 之 酵 素 一 鐽 抗 生 阮 連 接 物 » 所 補 捉 之 酵 素 可 為 HR P 或 不 同 之 酵 素 > 如 鹼 性 m 酸 鴯 或 β 一 半 乳 糖 苷 梅 t 不 使 用 任 何 化 學 發 光 偵 測 法 〇 [Μ • Η . Bo b r 0 W 1 T . D . Ha Γ Γ is t K . j * S h a u g h n e S S y . G • j. L it t , ι — I B n u η , He _Lk -Λ··_, 1 2 5 > 2 7 9 (1 9 8 9 ) ]〇 已 知 一 種 方 法 • 其 待 色 為 酵 素 抑 制 子 會 進 行 酵 素 性 釋 放 A η a 1 * B i 0 C he m . > 17 9 , 2 2 9 ( 19 8 9 ) 9 此 方 法 是 基 於 進 行 酵 素 性 釋 放 抑 制 子 至 第 二 酵 素 » 其 31 敏 度 與 第 酵 素 之 濃 太址後 κ ifl Ψ a 03 姒格（210x297公艰） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂_

L0134S A 6 B6 經濟部屮央標準局员工消费合作社印製 五、發明説明（7) 度成反比，且會局限於第二酵素所能偵拥I者，使用此二酵 素不會逹到真實之擴增作用。 使用葡萄糖-6-磷酸鹽去氫《及半乳糖-6-磷酸鹽去氫_ ，由霄子釋放条統邇原氣可間接地産生H，〇e U. Tanabe, T. Kawasaki, Μ. H a e d a , A. T s u j i , M. Yabuuchi, B u n -seki K a κ a k u . 36, 82 ( 1 9 8 7 ) ； A. Tsuji, M. Maeda, H . Arakawa, Anal. Sc i . . 5, 497(1989)]。於此方法中•僅 可由快速地循璨此条統而得增強的結果，而無法由生成另 一個催化活性物而達增強之結果。 於美國專利第4318980號中載有一種使用催化性循琛繭 (菸鹸酵胺腺嗶昤二核苷酸，HAD),為標的物之異質结合分 析法(heterogeneous binding assay),由此化學發光反 應可偵測到循環剤，僅可得一值酵素擴增之步»。 於美國專利第4598042號中載有一種磷酸醐連接物之免 疫分析法，其中磷酸酶可將NADP轉為NAD ,於其氣化及邇 原態間循環所形成之NAD可作為乙酵去氳《循琛劑的共同 因子.且可催化形成有色化合物，但並無刊_化學發光或 過氧酶之用途。 於美國專利第4498042號中記載使用可將第二酵素之不 活化形式轉為活化形式之酵素為標的物之免疫分析法，再 與受質反應而可偵測到第二酵素，此外，第二酵素亦可生 成第三酵素，第三酵素瞬可與受霣反醮而偵拥（到。 (3 )摘 m 由過氣化酶催化生成過氣化物，再由此氣化物將取代以 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂_ 線· A 6 13 6 經濟部屮央標準局员工消费合作社印製 五、發明説明（8) 胺基之琿醯肼《化所完成之載化學發光偵澜作用具有良好 蚕敏度，當加入增強劑後，可增強反應，因而可於使用更 低量之過氣化_之下測量化學發光度。將此酵素與待測生 物分子偶合則可逛敏地偵測到此生物分子。於此技術中僅 能使用過氧化酶，但痛先使用其他酵素以增強催化生成取 代以胺基之環醛肼之化學發光。當此条統中使用其他酵素 偵測標定物時，則可將由酵素擴增化學發光訊號再進行一 次擴增作用，此二次擴增作用可偵測到更少量之酵素及待 測之生物分子。於發展超雄敏度偵測糸統的關鍵考量乃維 持背景訊號為相對於待測訊號的最低量。於任何建議之偵 測方法中，最重要的是由擴增作用提供最強的訊號，且不 會增強背景訊號（如僅鑛增欲得之訊號）。 本發明之目的 本發明目的之一為提供一種方法及由酵素可催化之被護 增強子以用於生成化學發光，其偽由過氣化酶之作用而偵 測到生物物質及化合物。本發明之另一目的為提供一種方 法及由酵素可催化之被護增強子以用於生成化學發光，其 係由免疫分析溶液中過氣化_作用而完成。此外，本發明 之又一目的乃為提供一種方法及由酵素可催化之被護增強 子以用於生成化學發光，其係由過氣化_之作用以於西方 墨漬中偵測蛋白質及南方墨潰和其他DNA雜合分析中偵測 D N A 〇 圖式；說明 圖1為使用例1之反應糸統所得化學發光與時間之闋傈 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- ，可_ 線· 01343 A 6 B6 經濟部屮央標準局貞工消#合作社印製 五、發明説明（9 ) 圖，於室溫下，使用Turner Designs型號TD20-e拥光器可 潮得化學發光，使用200x中性密度濾器可減弱光線，此反 應是由加入性磷酸酶而起始。 圖2為人轉印素（transferrin)之西方墨潰化學發光， 西方墨漬之實»條件如於本文中所述，格子槽由左至右依 序各加人5ng, lng, 200pg, 50pg及20pg人轉印素，將已 清洗及攤開之膜於試剤中培養5分鐘後以KODAK X-OMAT AR 底片曝光5秒鐘。 槪休 本發明係闋於一種産生光之方法，其包含将水解_、被 護之增強子化合物、過氣化物及取代以胺基醯肼（其與過 氣化物及過氣化酶混合反應時會産生光），其中被護增強 子化合物具有ArOX之化學式，而X為對水解酶有活性之離 去基，且Ar為環中含C, 0, S或N之非干擬性芳香琢，水解 _可與被之增強子化合物反應而除去X ，並相對於無增強 子化合物所得光量，可提高由取代以胺基之醯肼所産生之 光量。 本發明特別包含一種可由增強或擴增第二酵素作用之第 一酵素反應而生成催化劑或琛化劑之方法，再由第二酵素 可催化化學發光反應。本發明亦闋於使用此方法以®敏地 偵拥I第一酵素。此外，本發明亦闋於使用此方法以偵澜及 定量各種由化學鍵或物理作用與酵素結合之生物分子，所 得化學發光強度可提供一種直接定量已標定之有機分子或 生物分子之方法。例如，可使用此方法以偵拥免疫分析之 ......······· ^.........裝.：.訂：：線.·( (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 太冲 iii in Ψ M W 宠:找rniCNS) 格（210x297公;«·)

0134S A6 B6 五、發明説明（1 0) 方法中的半抗原、抗原及抗體，西方墨漬之蛋白®、及南 方和北方墨漬中之DNA及RNA。亦可於定DNA序列時，使用 此方法以偵测DNA。 此化合物以如下式之酚化合物較佳：

式中R為非干擾基，且可連接至苯環之其他部位的雜琛基 。因此R可選自一群含鹵素（Cl, Br, F1或I), Ct-"烷基 (可為環形），Ct-3。芳烷基，且其中烷基或芳烷基可将磺 原子取代以鹵素，0, N或S。 此外，本發明像期於一組偵測水解酶之試劑，其中包含 被護增強子化合物、過氣化物、過氣化酶及取代以胺基醯 肼，其與過氣化物及過氣化®混合反應時會産生光，而增 強子化合物之化學式為ArOX,其中X為對水解酶有活性之 離去基，且Ar為環中含0, S或N之非干擾性芳番環，水解 酶可與增強子化合物反應而除去）（,並相對於無增強子化 合物所得光量，可提高由取代以胺基之醯肼所産生之光量 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· - 線. 經濟部屮央標準局Μ工消费合作社印製 最後，本發明像鼷於一種與水解酶反應之組成物，其中 包含：取代以胺基酷胼與一種被護增強子化合物，其化學 式為ArOX,其中X為對水解酶有活性之離去基，Ar為可含 0, S或N環中之非干擾性芳香琛，而水解酶可與增強子化 合物反應而除去X ,並於存在過«化物及過氣化®之下， 太邙 κ 冲谝 Ifl Ψ a 03¾½mίCNS) Ψ4姐格m0X297公；»·)

L0134S A 6 B6 五、發明説明（1 1) 增強由取代以胺基醯肼所産生之光量，此光量較無增強子 化合物所産生者為高。

酵素 已保W增強子 X - ΡΟ,Ν», 6-D-半乳糖 G酿基 如驗性鱗酸梅 &·半乳糖苷酶 赔酶

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

辣根通氧化酶 增強子

光 經濟部屮央標準局貝工消费合作社印製 將被護增強子化合物以水酶除去X基可産生增強子化合 物，如酚化合物，其可增強第二酵素之活性，即X辣根過 氧化酶，使魯米諾與Ha〇a進行氣化而産生光。數掴偽装或 被護之增強子化合，物（ArOX)例子皆有専一的離去基X 。許 多專一酵素可經由切除X基並釋放芳羥基化合物或芳氧離 子而與被護增強子化合物反應。X基可為任何化學雔去基 ，只要可於使用條件下穩定且適當處理，以薄有X基之已 標定分子及適雷酵素時可除去者。柑對之0X基包含羥酸院 酿或羥酸芳酯、無機含氣酸鹽及m-i吡喃苷X ,但不僅限 於此。 本發明之完整成份含取代以胺基之琢醯肼、過氣化物、 過氣化酶及可将其組合與一溶液中以待使用且不會生成太 01342 經濟部屮央標準局員工消费合作杜印製 Λ6 __ B6_ 五、發明説明（1公 大之化學發光訊號之背景之抑制劑，此不被預期乃因將取 代以胺基之環醯肼、Η·〇8及過氣化酶組合一般會構成高化 學發光反應糸統。此外，亦可將被護之催化劑加入此混合 液且不會引起太大之背景化學發光訊號。 本發明偽關於一種産生化學發光之方法，其俱由酵素或 酵素連接物與取代以胺基之環醯肼、過氣化物、過氧化酶 、被護增強子化合物（ArOX)及抑制劑之緩衝液反應而得， 本發明亦關於使用此方法以偵測溶液中的生物分子，如半 抗原、抗原、一抗體及核酸。本發明亦關於使用此方法以 於硝化纖維膜或尼龍膜之固醱支持物上進行偵測，如西方 墨漬上的蛋白質、南方墨潰及其他DNA雜合分析中的DNA及 北方墨漬上的RNA 。 本發明偽關於一種如Ar-ΟΧ所示之被_增強子化合物， 其為選自表1化合物且將0H中的Η用X來取代，其中Ar為 選自芳基、芳烷基或雜芳基之非干擬性基，且X為由酵素 可除去之化學取代基，因而可産生芳羥基化合物或芳氣離 子，且0X為S自羥酸烷酯或羥酸芳酯、無機含氧酸鹽及氧 -1吡喃苷所組成之族群中。 表1 芳香族增強子化合物（ArOH) 螢火蟲螢光素 磷-苯酚 二氳螢光素 對-羥肉桂酸 6 -羥苯駢f;塞唑 鄰-羥肉桂酸 2 -氮基-6 -羥苯駢α塞唑 2 -氰-4-苯酚 對-碘酚 2-祭酚 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 太蚯张 K i,ii Ifl ψ Β 03 宠:找 m (CNS) Ψ 4 tw格 ί 210 乂 297 公:«)

0134S Λ6 B6 五、發明説明（1 3) 鄰-碘酚 對-溴酚 對-氛酚 2 , 4-二氛酚 對-苯酚 1-溴-2-祭酚 1，6-二溴-2-祭酚 對-羥苯乙酸 鄰-羥苯乙酸 本發明之方法最好偽鬭於一種如下所示之被護增強子化 合物： 』

式中R為選自I, Ph或- HC = CH-COOH,其中X為得以酵素除 去以因而産生酚或酚鹽離子之取代基，0X為蘧自羥酸烷酯 或羥酸芳酯、無機含氣酸鹽及氣-1吡喃苷組成之族群中。 本發明之方法特別是鬭於一種如下所示之被護增強子化 合物 式中R係選自H , CN或

-<：TC (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂_ 線· 經濟部中央標準局员工消f合作社印製 式中X係得以酵素除去以産生酚或酚鹽離子之化學取代2 ,0X為選自羥酸烷酯或羥酸芳酯、無機含氣酸鹽及氣-1HH 喃苷組成之族群中。 本發明包括一種级衝液，包含：⑴被護增強子化合物， ⑵過氣化物，如H«»0,、過硼酸麵、過氧化尿或有機過酸（3 過氣化如辣根過氧化酶、撖過氧化酶或乳過氣化物期 ，⑷取代以胺基之環醯肼，其可為遘自一群含3 -胺酞醯联 (魯米諾）、3-(N -烷胺基）酞醯肼、3-(N,N -二烷胺基）秘 *·丨丨_

0134S A 6 B6 經濟部屮央標準XJ貝工消f合作社印製 五、發明説明（1 4) 肼、6-烷基-3-胺酞肼、4-胺酞肼（異魯米諾）、4-(N-烷胺 基）酞肼、4-(N,N-二烷胺基）酞肼、7-胺酞肼、7-(N-烷胺 基）酞肼、7-(N,N -二烷胺基）酞肼及 ©抑制爾，其可遵自 一群含無脂牛乳、碘護溶液、小牛血清蛋白、明膠或各種 表面活性劑，包括非離子性、陰離子、陽離子與兼有二性 之表面活性劑。 梓宙説明 儀器 一般N M R光譜是使用G e n e r a 1 E 1 e c t r ί c Q E 3 0 0 * ·光譜儀 ,除另有註明外，以四甲矽烷為内在擦準，由CDC13之溶 液測得。使用Kratos MS-80tm或AEI MS-90tB<可測得質薄 。由Mettler AE 163*分析平衡儀可渕得重量。使用介面 至A p p 1 e M a c i n t 〇 s h * *霉腦之T u r n e r T D 2 0 e拥I光器或實驗 室中之其他設備以测量化學發光。 材料 最好使用各種市售可得之溶劑與試劑，且如無待別註明 ，皆可不再經純化而直接使用。由Cappel roducts可麻 得辣根過氣化_IgG連結物。由於游離態酵素具有磷酸酶 活性，因此最好使用其連結物來作研究。 合成酵袤勞g

?oci3

ί. HjO/MeCN NaOH

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^ «. R /i i,Si )ίΐ Ψ κ 03 m (CJS) Ψ 4 *0 ^ f 210 χ 297 i!-) ,0134¾ A6 B6 經濟部屮央標準局貝工消t合作杜印製

五、發明説明（1 5) 對-碥荣85酴软.二納禱 將吡啶（0.395g, 5β·ο1)溶於 15·1 CH«C1·,冷卻至5Ό 並於攛拌下緩慢加入P0C13 (2.30g, 15bbo1)。於5分鐘之 期間，滴加入含對-碘酚（1.10g, 5酿1〇1)之CH»C1· lOnl, 移開冷卻液並攪拌30分，減壓蒸除溶劑並加入15·1 CH3CN 以溶解固體，於攪拌下滴加人含NaOH (0.80g, 20··〇1)之 水la丨使引起白色沉澱，靜置10分鐘後，收集固龌並依序 以大量的CHaCN及丙酮淸洗後風乾。 ι.ροα, Z Hf/MeCN hfaOH OH 對-¾酚8S敌二納期 將吡啶（0.395g, 5bbo1)溶於15·1 CH-C1·中，将溶液冷 卻至51C並於播拌下缓慢加人POCU (2.30g, 15ββο1)。於 5分鐘之期間，滴加入含對-苯酚（0.85g, 5·πιο1)之CH,Cla 10b1,移開冷卻液並攪拌30分，滅壓蒸除溶劑並加入15·1 CH3CN以溶解固體，於攢拌下滴加入含NaOH (0.80g, 20 Bm〇l)之水1.2·1且引起白色沉澱，靜置10分鐘後，收集固 體並依序以大置的CHaCH及丙酮清洗後風乾。 CO) + OH

太泞 m Φ Μ 闽 «iSmiCNS) Ψ4姐格公:修） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝- 訂_ -線：ί ___136_ 01342 A6 五、發明説明（1 6) 對- 碘荣甚-θ -D-帐酿半乳嫌苷 將對-碘酚（lg, 4.5BB01)溶於3ml丙酮中並以3·丨之5 Μ Κ0Η (aq)處理之，於贗拌下分批加入乙醛溴半乳糖與5. 13.6mB〇l)。起先的4.1g是與lml之5 ILK0H —起加入，於 2-3小時間.將每0.5g乙醯溴半乳糖與0.5b1之5 Μ_Κ0Η — 同加入直到總加入量為5. 6g,攪拌過一夜，加入水並依序 以二氱甲烷及乙酸乙酯萃取，將結合之有機層蒸發並将粗 製産物由矽膠柱層析純化，再以含30¾乙酸乙酯之甲醇來 除去未反應之糖。除去適當匾域中之溶劑可製得目的化合 物之四乙酸酯.將300mg目的化合物溶於2·丨丙酮，並與 650 ml 10 1LK0H攪拌過一夜，可將目的化合物水解，蒸 除丙酮並加入30«1水，加入氨化胺以中和之，並將所得溶 液再以乙酸乙酯中和之，當由矽謬柱靥析（乙酸乙酯：甲 醇為1:1)後蒸除乙酸乙酯。

(請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部屮央標準局貝工消t合作社印製 OH 對-茱酚-θ - I) - 喃半乳纊 將對-苯酚（0.25g, 1.5nnol)溶於1.5b1丙酮中並以0.5 ml之10 Μ_Κ0Η (水溶液）處理之，於攪拌下分批加入乙醯 溴半乳糖（1.8g, 4.4«mol),起先的1.5g是與0.5al之10 Η Κ0Η —起加入，於2小時之後，将每0.3g乙釀溴半乳糖與 大紙弦尺泞d丨巾《因宅熄谁（CNS)屮4拟格（210 X 297公帒） Α6 Β6 五、發明説明（1 7) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 0.5ml之10 ILKOH —同加入，攪拌過一夜，由TLC顯示原料 已消耗，再加入In丨之10 Μ_Κ0Η並攪拌一天，蒸除丙酮並 將殘液以乙酸乙酯萃取5次，將結合之有機層乾燥、蒸發 並以矽膠柱層析（含30%甲酵之乙酸乙酯）純化粗製産物。

入CC1齡 CH2aa X X 對-采酚Z酴皤 將吡啶（2b1)溶於15ml CHoCl，中，將溶液冷卻至510 並 於榭拌下缓慢加入乙醏氯（1.8g, 4.4ββ〇1)。於15分期間 ，滴加入含對-苯酚（0.85g, 5b«o1)之CH»C1· 20·1,移開 冷卻液並*拌30分，滅壓蒸除溶_並加入50b \乙酸乙酯以 溶解固體，將溶液以水萃取，於NaaS0«下乾燥減壓蒸發。 樺宙_袤夕化墼發来偵湘I作用 例1 : 一種用以擴增偵測鹾性磷酸酶之典型反應液含： 2 -甲基-2 -胺基-1 -丙醇缓衝液 0.1M, pH 9.4 經濟部屮央標準局貝工消赀合作社印製

M g ( 0 A C ) a H . 0 > 魯米諾 對-苯酚磷酸鹽 辣根過氣化酶- IgG 8.8 X 10 - 4 Μ 0.3¾ (v/v ) 1 x 1 0 * * Μ 1 χ 10 - 3 Μ (1 χ 1 0 * 1 0 - 1 χ 1 0 - 1 8 ο ο 1 )

0134S A 6 B6 經濟部屮央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（1 8) —- 般 而 言 1 将 2 0 0 丨試薄（移至聚丙 烯 管 中並置於 Tu r η TD 20e 或其他適當測光器中， 當加 入 5 Μ L齡 性磷酸 酶 溶 後 t 測 置 5 分 鐘 期 間 之 發 光 背 景。圖1 為於 25 t：下 ， 由 反 應 可 産 生 之 光 強 度 與 時 間 之 關像圖， JL·； (此 方法可 m 量 度 小 至 當 20 5 u L中所含_性磷酸_之 量 低 至6 ί X 10- 1 8 〇 ,且訊號/背景之比值為4 〇 例 2 使 用 例 1 之 溶 液 並 加 入 0 . 1 %無 脂 奶 粉< ：HFM). 可 得 似 例 1 之 結 果 t 但 其 背 景 顯 著 降低。 例 3 ： 使 用 例 1 之 溶 液 並 加 入 5 % 磧護溶液， 可 得類似 例 1 結 果 > 但 其 背 景 m 替 降 低 〇 例 4 使 用 例 1 之 溶 液 » 但 以 磷 酸對- 碘 苯 酯取代對- 苯 酚 酸 鹽 t 可 得 類 似 例 1 之 結 果 〇 例 5 ： 一 種 用 以 擴 增 偵 測 β -半乳糖苷 银 之 典型反應液含： 磷 酸 鹽 緩 衝 液 0 .1 Μ , pH 7.6 Mg (0 Ac )8 8 .8 X 1 0 - 4 Μ Η > 0 . 0 .3% (V/ V ) 魯 米諾 1 X 1 〇 -8 Η 對 -苯酚半乳糖苷 1 X 1 〇 -3 Μ 辣 根過氣化酶-I g G 1 〇 - 1 0 _ 1 0 - 1 β (〇 1 ) 無脂奶粉（NFM) 0.IX (w/v) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂- 線· 太紙泞ΐΛ用Ψ «闽定找摧（CNS) Ψ4相格ΟX297公修） ,01342 Λ 6 ____Β6_ 五、發明説明（1旮 一般而言，將200uL試劑加人聚丙烯管中並置於 Turner TD 20e或其他適當测光器中，當加入5mL半乳糖苷® 溶液後，於5分鐘期間内測量發光背景。在不到5分鐘内， 化學發光會快速地閬始並達到棰大值，且強度與/8 -半乳 糖苷酶之量成正比，而光度之缓慢衮退可逹一小時以上。 例6 : 使用例5之溶液，但以對-碘苯半乳糖苷取代對-苯酚 半乳糖苷，可得類似例5之結果。 例7 : 一種用以擴增偵澜酯酶之典型試劑含： 磷酸鹽缓衝液 0.1M,pH7.3

Mg (0 Ac ) . 8.8 x 10 - 4 Η Η . 0 > 0.3¾ ( ν/ν ) 魯米諾 1 χ 1 0 - 3 Μ 對-苯酚乙酸鹽 1χ10_3Μ 辣根過氣化酶-IgG 10-1° - 10-1β(Β〇1) 無脂奶粉（NFM) O.lXU/v) 經濟部屮央標準局员工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 一般而言，將2 0 0 mL試劑加入聚丙烯管中並置於 Turner TD 20e或其他適當測光器中，酋加入5WL酯酶溶液後，於 5分鐘期間内测*發光背景。在不到5分鏈内，化學發光 會快速地開始並逹到極大值，且其強度與酯醮之量成正比 ,而光度之缓慢衰退可達一小時以上。 由化里發来俏湘I西方滬瀋夕番白》 由Cappelte Products (Durha·， NC)可得羊非免疫血清 L01342 經濟部中央標準局貝工消贽合作社印製 A 6 B6 五、發明説明（2 0) 、人全血清及兔子抗羊之IgG-鹼性磷酸酶連結物。由Sig- a X Chemical公司（St. Louis, M0)可購得人轉移素、分 層之羊抗人轉移素之血清及硝化繼維膜。将各血淸與 IgG 樣品於10, 000g下離心2分鐘，並以上清液進行免疫反應。 由 Millipore Corp. (Bedford, ΜΑ)及 MSI(Micorn Separa-tions, Inc., Westboro, MA)分別可得 I_*obilontlB-P 轉 移膜及尼鲔轉移膜，於此分析中使用Kodak X-OMAT AR X-光膜(Rochester, N Y) 〇 使用如前述之緩衝条統以進行SDS-PAGE[U.K. LaeBBli, Nature, 227, 680 (1970)],粘合顧（stacking gel)為 4. 38¾ 丙酵[胺：0, 12X 雙丙醯胺，分離 B8 (separating gel) 為6. 81X丙醯胺 ：0. 19X雙丙醯胺，進行《泳之後，將謬以 含20mM Tris, 153·Μ甘胺酸及20X (v/v)甲酵之轉栘缓衝 液平衡7-8分鐘，將驪上下夾以I»a〇bil〇nf-P轉移膜與層 析紙 3MM (Whataan),並置於轉移單元（Bio-Rad Labora-t o r i e s , R i c h η ο n d , C A )。將謬中之蛋白質於4 及1 0 0 V之 電壓下進行電溶離60-80分鐘。將膜置於41C以50bM Tris -HC1缓衝之生理食鹽水pH 7.4 (TBS)中過一夜，再以 TBS 洗15分鐘。 將膜以含0.05XTween-20及 IX NFM之已用50·Μ Tria-HCl 緩衝之生理食鹽水pH 7.4 (T-TBS)中，於室溫下觴處理1 小時，將此護住膜於含IX NPM之T-TBS中，於室溫下與第 一抗龌（将羊抗人轉移素之UG以1:500進行稀釋）培餐75分 鐘。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂_ L01342 Λ 6 Β6 五、發明説明（2 l) 將膜再於含IS! NFM之T-TBS中，於室溫下與第二抗《(兔 子抗羊之IgG-齡性磷酸酶連結物以1:500進行稀釋）培養1 小時，然後將膜依序以T-TBS重覆洗4次10分鐘後再以TBS 洗10分鐘，然後再以蒸皤水洗3次。 將膜浸於試劑中5分鐘，排出水後，置於支掙物上（透 明膜）並於X-光片下曝光5秒至30分鐘後顯像之。圖2為 西方墨漬之化學發光，其中將不同濃度之人移轉素與 I·-mabil〇nt--P尼龍膜上之鹼性磷酸_相連之抗醱結合像以 例1所述化學發光試劑溶液接觸而得。 此化學發光方法可測量500fg (5 X 10_ia)人轉移素。 此外，此方法可提供一種記錄於X-光片之永久賁驗記錄， 且可於棰短曝光時間内，安全地且便利地偵測小蛋蛋白質 Ο 本發明僅藉以上所述作一説明，而其請求専利之範圍則 以下列為限。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部屮央橾準局Μ工消费合作社印製

Claims (1)

1. ,0134

   A 7 B7 C7 D7 牦濟部中夬標苹.¾¾工消#合作-ft印t 六、申請專利範圍 01 1 . 一種發光方法，其包含混合： (a )水解酶；與 (b)被護增強子化合物、過氣化物、可與過氣化物反 醮産生光之取代以胺基之醯阱及過«化酶，而其增強子 化合物之式為ArOX,其中X為與水解_有活性之離去基 ，且Ar偽可含C, 0, S或Η於琛中之非干擾性芳番琛，水 解®與被護增強子化合物反應以除去X ,而使由取代以 胺基之醒肼所産生之光董高於由無增強子化合物所産生 者。 2. 依申請專利範圃第1.項之發光方法，其中該水解酶與 一生物分子相連。 3. 依申請專利範困第1.項之發光方法，其中該水解酶與 一抗體相連。。 4. 依申請專利範圓第1.項之發光方法，其中該水解_與 一為分析中結合對的一部份之分子結合。 5. 依申誚專利範圍第1.項之發光方法，其中該水解酶與 一核酸相達。 6. 依申誚專利範圍第1.項之發光方法，其中該混合與偵 测傜於一膜上進行。 7. 依申請專利範圍第1.項之發光方法，其中該膜偽 I»-mobi lonta-P〇 8. 依申請專利範圍第1.項之發光方法，其中包含一抑制 劑以阻礙於加入水解_前光之生成。 9. 依申請專利範園第1.項之發光方法，其中0X係遘自羧 .............i ..................发..............................打…：(....................線 ........................... ' _ # (熗先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 木紙诋尺度適川屮阐w :iami-(CNS) 格（210x21)7公垃） 01342_^_ AT B7 經濟部中央標苹局轉工消費合作杜印製 六、申請專利範園 〇 2 酸烷酯、羧醮、無機含氣酸β及氧吡晡苷所組成之族群 中。 10. 依申請專利範画第1.項之發光方法，其中該水解酶偽 蓓自鍮性磷酸酶、/3 -半乳糖苷_及酯酶所組成之族群 中。 11. 一組用以偵測分析中之水解酶之試痢，包含被護增強 子化合物、遇氧化物、過氧化酶及與«氣化物與《氧化 BS反應時可産生光之取代以胺基之醯肼，其中被護增強 子化合物具有ArOX之化學式，而X為對水解酶有活性之 離去基，且Ar為可含C, 0, S或N於琢中之非干擾性芳香 琛，水解酶可與被護增強子化合物反*以除去X .而使 由已取代以胺基之釀肼所産生之光麗較無增強子化合物 所産生者為离。 12. 依申請專利範園第11項之試其中亦包含欲偵测水 解_所用之膜。 13. 依申請専利範國第11項之試劑，其中亦包含與分析中 結合對之一偶合之水解_。 14. 依申請專利範圄第11項之試劑，其中亦包含與水解酶 偶合之一抗釀。 15. 依申_專利範園第11項之試劑，其中亦包含與水解《 偶合之一抗原。 16. 依申請專利範園第11項之試劑，其中亦包含與水解酶 禺合之一核酸。 17f 依申請專利範困第11項之試其中亦包含一種抑制 (锖先閱讀背面之注意事峭再填寫本頁) 木紙張尺度通川‘I，W W :jC#;|l(CNS) i|M规格(210父297公焚） 晚濟部中夬標';^rJHx消#合作杜印製 A 701342 C7 __D7_ 六、申諸專利範圊 03 薄！，其可阻礙無水解_所産生之光。 18. 依申請專利範困第17項之試劑，其中該抑制蕹涤灌自 蛋白質與表面活性劑所組成之族群中。 19. 依申請專利範圃第11項之試劑，其中0X偽理自含羧酸 烷酯、羧酯、無機含氣酸鹽及氣毗喃苷所組成之族群中 2 0. —種與水解酶反應之組成物.其包含： (a) 取代以胺基之醱胼；與 (b) 含ArOX之化學式之被護增強子化合物，其中X為與 水解酶有活性之離去基，且Ar*為可含C, 0, S或N於琛中 之非干擾性芳番基，水解《可與被護增強子化合物反應 以除去X ,而使由己取代以胺基之S肼與過氣化物及過 氣化酶所産生之光*較無增強子化合物所産生者為离。 2U 依申請專利範鼷第20項之組成物，與過氣化酶和抑制 劑之遇氧化物混合者。 2 2.依申請專利範圃第21項之組成物，其中該抑制為灌 自蛋白質與表面活性劑所組成之族群中。 23.依申請專利範園第20項之組成物，其中0X换S自羧酸 烷酯，羧酯，無機含氣酸鹽及氣-吡喃苷取代基所組成之 族群中。 24 —種發光之方法，其包含混合： (a) 水解酶；與 (b) 被護增強子化合物，過氧化物，可與過氣化物及遇 氧化_反應産生光之取代以胺基之醯肼，而其增強子化 合物之化學式如下所示： ................{ .................^..............................#r……i ....................#............··-·. * (¾先閱讀背面之注意事項再填商本頁) .木紙張尺度適川||，W 格（210父297公焚） 1)01342 b7 C7 __D7 六、申請專利範S 04

   其中X為對水解酶有活性之離去基，且R為非干擾性基 ,其水解酶可與被護增強子化合物反應以除去X ,而使 由取代以胺基之醒胼所産生之光量高於由無增強子化合 物所産生者。 25 依申請專利範圃第24項之發光方法，其中亦包含一抑 制劑以阻礙於無水解酶時發光之生成。 26. —種偵測水解»之方法，其包含： (a)混合水解酶、被護增強子化合物、過«化酶、遇 氣化物及可舆過氣化物及過氣化«反«産生光之取代以 胺基之酵阱，其中被護增強子化合物如下所示：

   經濟部中央標，局Μ工消费合作杜印製 其中X為可由水解_除去之離去基，且R為非干擾性有 機群，其水解_可與被護增強子化合物反應以除去X , 因而可增強由取代以胺基之醯肼所産生之光悬且較由無 增強子化合所産生者為高；與 (b)偵測水解》•其中酵素之《為取代以胺基之醯胼 所産生光量之函數。 27.依申請専利範圃第26項之方法，其中亦含有一抑制劑 ..................................ί ................^..............................tr.......《................... ·· (¾先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 木紙张尺度適』1]屮W W家標哗（CNS)〒4规格（210X297公焚） 时济部中夬標黎局S工消#合作杜印製 ^01342 Μ________DT_ 六'申锖專刊範園 〇 5 以阻礙無水解酶時發光之産生。 28. 依申_專利範園第26項之方法，其中該水解酶與一生 物分子相連。 29. 依申謓專利範困第26項之方法，其中該水解®與一抗 體相連。 30. 依申請專利範圍第26項之方法，其中該水解_與分析 中為結合對之一部份分子相連。 31 依申請專利範圍第26項之方法，其中該水解酶與一核 酸相連。 32. 依申_專利範園第26項之方法，其中該混合及偵拥I偽 於一膜上進行。33. 依申II專利範困第32項之方法，其中該膜偽1»«»〇1)1-1 ο η * " - P 〇 34 依申請専利範圔第24項之方法，其中X傜蘧自羧酸烷 酯，羧酯，無機含氧酸鹽及《吡喃苷取代基所組成之族群 中。 35、 依申請專利範困第24項之方法，其中該水解_僳邐自 酴性磷酸酶，/?-半乳糖苷醻及酯酶所組成之族群中。 36. 依申請專利範圍第26項之方法，其中該水解梅偽選自 鹸性磷酸酶，/?-半乳糖苷酶及酯酶所組成之族群中。 3 7. —組用以偵測分析中水解_之試劑，其包含被HI增強 子化合物、過氧化物、過氣化酶及可與過氧化物及過氣 化酶反應産生光之取代以胺基之醯肼，其中被護增強子 化合物如下所示： (J4先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 木紙张尺度〗丨1屮闹W家標平（CHS) ιρ 4规格(210 X 2<J7公焚） - 01342 A I B7 C? D7 六、申請專利.苑® 06

   經濟部中央標^rJHr消#合作社印製 其中X為對 ，其中水解 而可增強由 強子化合所 38. 依申請專 水解酶所用 39. 依申請専 結合對之一 40. 依申誚專 酶偶合之一 41. 依申讅専 酶偶合之一 42 .依申請専 以咀礙於無 43.依申諳専 44 依申請專 酯，羧酯，無 水解《有活性之離去基，且R為非干擾性基 _可與被護增強子化合物反應以除去X .因 取代以胺基之酵胼所産生之光量且較由無增 産生者為高。 利範園第37項之試薄，其中亦包含欲偵測該 之膜。 利範圃第37項之試劑，其中亦包含與分析中 偶合之水解酶。 利範園第37項之試薄，其中亦包含與該水解 抗錶。 利範臞第37項之試其中亦包含與該水解 抗原。 利範圃第37項之試其中亦包含一抑制劑 水解誨時發光之産生。 利範圍第42項之試剷，其中該抑制劑係蛋白 利範園第37項之試劑，其中0X你逸自羧酸院 機含氣酸鹽及氧吡喃苷取代基所組成之族群 中。 45· —種與水解酶反應之組成物，其包含： (a)取代以胺基之醯胼；與 木紙張尺度適川tww家櫺哗（CNS)T4M格（210x297公釐） (锜先聞讀背^之注意事項再填寫本百 .U" •訂· .線， AT Β7 C7 D7 六、申請專利範園 07 (b)如下式所示之被護增強子化合物

   纯濟部屮夬標^局肖工消費合作杜印製 其中0X為與水解®有活性之離去基，且R為非干«性基 ，其中水解酶可與被護增強子化合物反應以除去X ,因 而可增強由取代以胺基之醯肼所産生之光量且較由無增 強子化合所産生者為离。 46. 依申謓專利範園第45項之組成物，並将其舆遇氣化酶 混合，且將遇《化物與抑制_混合。 47. 依申請專利範圍第45項之組成物，其中該抑制劑供蛋 白質。 48. 依申請專利範困第45項之組成物，其中0X你灌自羧酸 烷酯，羧酯，無機含«酸豔及氤吡_苷取代基所组成之族 群中。 49. 依申請專利範園第24項之方法，其中R傈蠹自鹵素、 Cl-3D院基、Cl-3。方基、Ci-ae方院基所組成之族群中 ,該烷基、芳基或芳烷基可取代以鹵素，而其中該芳基 可含有0, N,或S以取代一傾«原子，且0X你與R相對。 50. 依申請専利範圃第26項之方法，其中R你S自鹵素、 Ο,-，。烷基、ChU芳基、Ct-3»芳烷基所組成之族群中 ，而其中該烷基、芳基或芳烷基可取代以鹵素，且0X偽 與R相對。 51. 依申請専利範醑第37項之試劑，其中R供灌自齒素、 (J4先W讀背*之注意事頊再填寫本頁) 木纸張尺度逋川十w W家榀哗（CNS)〒4规格（210X297公;)^) r AT ^0134^ b? C7 _D7_ 六、申汸專利苑園 08 Ci-3。烷基、Ci-3»芳基、Ci -3 -芳烷基所組成之族群中 ，而其中該垸基、芳基或芳烷基可取代以鹵素，且0X你 與R相對。 52.依申請專利範園第45項之組成物，其中R像選自鹵素 、Cl-3D院基、Cl-3D方基、Cl-3。方院基所組成之族群 中，而其中該烷基、芳基或芳烷基可取代以鹵素，且0X 係與R相對。 (請先閱讀背面之注意事項再填"本頁) :哎濟部中央標^^Mx消费合作杜印製 木紙張尺度適川，丨，W W家樑苹（CNS)〒4规格（210χ297Α«)