JP2017519219A - ビタミンdアッセイにおけるビタミンdエピマーに特異的な結合パートナー - Google Patents
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Abstract
Description
(R1)p−(L)q−Z (I)
ここで、R1は、
式中、Yは、O、S、CR又はNR4であり、
Xは、−O−(CH2)n−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−(CH2)x−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−NH(CH2)y−C(O)−、−NR3C(O)−であり、
Rは、独立して、水素原子又はアルキル基であり、
R2は、独立して、水素原子又はアルキル基であり、
R3、R4、R5及びR6は、独立して、水素原子若しくはアルキル基であるか、又は、R4及びR5が一緒になって結合を形成するか、又は、R5とR6が一緒になって結合を形成し、
R3、R4、R5及びR6は、独立して、水素原子若しくはアルキル基であるか、又は、R4及びR5が一緒になって結合を形成するか、又は、R5とR6が一緒になって結合を形成し、
R11は、水素原子、アルキル基又はアシル基であり、
nは、1から10の整数であり、
wは、0から10の整数であり、
xは、1から10の整数であり、
yは、1から10の整数であり、
pは、1から10の整数であり、
Lは、結合基であり、
qは、0又は1であり、
Zは、ポリ(アミノ酸)免疫原性担体又は非ポリ(アミノ酸)免疫原性担体である。
NHR1’−(CH2)r’−NR1’’−((CH2)r’−NR1’’’)s’−(CH2)r’−NR7’−Z’(II)
式中、
R1’、R1’’又はR1’’’は、各々独立して、
R1’、R1’’又はR1’’’のうちの少なくとも1つは水素原子ではなく、
n’は、1から10の整数であり、
r’は、独立して1から10の整数であり、
s’は、1から10の整数であり、
R7’は、水素原子又はアルキル基であり、
R11’は、水素原子、アルキル基又はアシル基であり、
Z’は、ポリ(アミノ酸)免疫原性担体又は非ポリ(アミノ酸)免疫原性担体である。
上記のように、本明細書に記載の原理に従う幾つかの例は、式(I)の化合物及びその2つ以上の混合物に対して生じた、例えばアプタマー及び抗体のような、結合パートナーに関する。
(R1)p−(L)q−Z (I)
ここで、R1は、
式中、Yは、O、S、CR又はNR4であり、
Xは、−O−(CH2)n−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−又は−NR3−C(O)−であり;幾つかの例では、例えばYがNR4であるとき、Xは、−O−(CH2)n−C(O)−であり、例えばYがO又はSであるとき、Xは、−(CH2)w−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−(CH2)x−C(O)−又は−(CH2)w−C(O)−NH(CH2)y−C(O)−であり、例えばYがCRであるとき、Xは、−NR3−C(O)−であり、
Rは、独立して、水素原子又はアルキル基であり、
R2は、独立して、水素原子又はアルキル基であり、
R3、R4、R5及びR6は、独立して、水素原子若しくはアルキル基であるか、又は、R4及びR5が一緒になって結合を形成するか、又は、R5及びR6が一緒になって結合を形成し、
R11は、水素原子、アルキル基又はアシル基であり、
nは、例えば、1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10の整数であり、
wは、例えば、0〜10、1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10の整数であり、
xは、例えば、1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10の整数であり、
yは、例えば、1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10の整数であり、
pは、例えば、1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10の整数であり、
Lは結合基であり、
qは、0又は1であり、
Zは、OR8(ここで、R8は、水素、アルキル又はNR9R10(ここで、R9及びR10は、独立して水素又はアルキルである。)、ポリ(アミノ酸)免疫原性担体部分、非ポリ(アミノ酸)免疫原性担体部分、ポリ(アミノ酸)標識部分、非ポリ(アミノ酸)標識部分、非標識ポリ(アミノ酸)部分、非免疫原性担体ポリ(アミノ酸)部分、又は支持体である。
式(IV)の化合物は、式(I)の化合物において、R1が
ここで、少なくとも1つのR1が水素原子ではない化合物である。
式(V)の化合物は、式(I)の化合物において、R1が
式(VI)の化合物は、式(I)の化合物において、
(R1)p−(L)q−が、NHR1−(CH2)r−NR1−((CH2)r−NR1)s−(CH2)r−NR7−であり、
ここで、R1は、独立して、
ここで、少なくとも1つのR1が水素原子ではなく、
p、q及びnは、上記のとおり定義され、
rは、独立して、例えば、1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10の整数であり、
sは、例えば、1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10の整数であり、
R7は、水素原子又はアルキル基である。
式(II)の化合物は、
NHR1’−(CH2)r’−NR1’’−((CH2)r’−NR1’’’)s’−(CH2)r’−NR7’−Z’ (II)
であり、式中、
R1’、R1’’又はR11’’’は、各々独立して、
ここで、R1’、R1’’又はR1’’’のうちの少なくとも1つは、水素原子ではなく、
r’は、独立して、例えば、1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10の整数であり、
s’は、例えば、1〜10、又は1〜9、又は1〜8、又は1〜7、又は1〜6、又は1〜5、又は1〜4、又は1〜3、又は1〜2、又は2〜10、又は2〜9、又は2〜8、又は2〜7、又は2〜6、又は2〜5、又は2〜4、又は2〜3、又は3〜10、又は3〜9、又は3〜8、又は3〜7、又は3〜6、又は3〜5、又は3〜4、又は4〜10、又は4〜9、又は4〜8、又は4〜7、又は4〜6、又は4〜5、又は5〜10、又は5〜9、又は5〜8、又は5〜7、又は5〜6、又は6〜10、又は6〜9、又は6〜8、又は6〜7、又は7〜10、又は7〜9、又は7〜8、又は8〜10、又は8〜9、又は9〜10の整数であり、
R7’は、水素原子又はアルキル基であり、
R11’は、水素原子、アルキル基又はアシル基であり、
Z’は、ポリ(アミノ酸)免疫原性担体又は非ポリ(アミノ酸)免疫原性担体である。
本明細書に記載の原理に従うHMCHEMOIO誘導体である化合物の調製方法の例を以下に示すが、これらは説明を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。他のアプローチを採用して、本明細書に記載の原理と一致する上記の化合物及び他の化合物を生成させてもよい。
Zがポリ(アミノ酸)免疫原性担体又は非ポリ(アミノ酸)免疫原性担体である、本明細書に記載の原理に従う化合物の例を用いて、例えば、ビタミンDに対するアプタマー又はビタミンDに対する抗体等の、ビタミンDに対する結合パートナーを調製することができ、これらの例としては、例えば、ビタミンD3に特異的な抗体、ビタミンD2に特異的な抗体、25−ヒドロキシビタミンD3に特異的な抗体、25−ヒドロキシビタミンD2に特異的な抗体、3−エピ−25−ヒドロキシビタミンD3に特異的な抗体及び3−エピ−25−ヒドロキシビタミンD2に特異的な抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。特に興味深い例としては、3−エピ−25−ヒドロキシビタミンD3に特異的な抗体、3−エピ−25−ヒドロキシビタミンD2に特異的な抗体及び他のビタミンD化合物のエピマーに特異的な抗体(「ビタミンDエピマーに対する抗体」という。)が挙げられ、これらは、3−エピ−25−ヒドロキシビタミンD3及び3−エピ−25−ヒドロキシビタミンD2のアッセイに使用するか、又は、非エピマービタミンDのアッセイに使用することにより、ビタミンDの存在を検出すべき試料中に存在しうる、例えば3−エピ−25−ヒドロキシビタミンD3及び3−エピ−25−ヒドロキシビタミンD2等の、エピマー形態のビタミンDによる干渉を減少し又は排除することができる。
本明細書に記載の原理に従う抗体は、ビタミンD被検体の非エピマー形態のアッセイにおいて、3−エピマーとの交差反応性の最小化又は除去に使用できる。3−エピマービタミンDとビタミンD被検体に対する抗体との交差反応性に起因する全非エピマービタミンD被検体の過大評価が、ブロッキング剤として、Zが免疫原性担体である式(I)の化合物である免疫原に対して調製された抗体を使用することにより、実質的に回避され得る。
ビタミンD被検体のアッセイは、Zがポリ(アミノ酸)標識又は非ポリ(アミノ酸)標識又は支持体である式(I)の化合物を用いて実施できる。
アッセイ方法の次のステップでは、媒体について、ビタミンD被検体とビタミンD被検体に対する抗体とを含有する複合体、及び/又は、ビタミンD類縁体とビタミンDに対する抗体とを含有する複合体の存在を試験する。これらの複合体の一方又は両方の存在及び/又は量は、試料中のビタミンD被検体の存在及び/又は量を示す。
アッセイ実施用試薬を含むキットは、具体的なアッセイの性質に基づき調製できる。本明細書に記載の原理に従う幾つかの例では、キットは、例えば、Zが免疫原性担体である式(I)の化合物である免疫原に対して生じた抗体等の、結合パートナーを含んでいてもよい。本明細書に記載の原理に従う幾つかの例では、キットは、Zが支持体を含むポリ(アミノ酸)標識部分又は非ポリ(アミノ酸)標識部分である式(I)の化合物である試薬を含んでいてもよい。キットは、ビタミンD被検体の具体的なアッセイを行なうための他の試薬も含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、キットは、例えば、粒子に結合したアビジン又はストレプトアビジン、ビオチン化された式(I)の化合物、ビタミンD被検体に対する標識された抗体等の、ビオチン−結合パートナーを、一括された組合せで含む。当該キットは、アッセイを実施するための他の試薬を更に含んでもよく、その性質は具体的なアッセイフォーマットに依存する。
[定義]
mg=ミリグラム
g=グラム
ng=ナノグラム
mL=ミリリットル
μL=マイクロリットル
μmol=マイクロモル
℃=摂氏温度
min=分
sec=秒
hr=時間
w/v=重量/体積
TLC=薄層クロマトグラフィー
HPLC=高速液体クロマトグラフィー
EDA=エチレンジアミン
EtOAc=酢酸エチル
DMF=ジメチルホルムアミド
DMSO=ジメチルスルホキシド
MeOP=1−メトキシ−2−プロパノール
MES=2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸
CMO=カルボキシメトキシオキシム
TMB=テトラメチルベンジジン
SNHS=スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド
高pH洗浄緩衝剤=5.5mMのNa3PO4+4.4mMのNa2CO3(pH11)
ハプテン洗浄緩衝剤=50mMのHEPES、300mMのNaCl、1mMのEDTA、0.1%のTRITON(登録商標)X405、0.15%のPROCLIN(登録商標)防腐剤及び1mg/mLのネオマイシン
DI=脱イオンされた
ELISA=酵素結合免疫吸着測定法
UPA=超粒子アナライザー
LOCI=発光酸素チャネリング免疫測定法
BSA=ウシ血清アルブミン
BGG=ウシガンマグロブリン
mIgG=マウス免疫グロブリン
MS=質量分析法
[R11がアセチル基である図2の化合物の調製]
5−アンドロステン−3α−オール−17−オン アセテート(VIII)(100mg)を、ベンゼン中、一晩還流下に、エチレングリコール(0.245mL)及びp−トルエンスルホン酸一水和物(4mg)と反応させ、5−アンドロステン−3α−オール−17−オン アセテート エチレンケタール(IX)(112mg)を得た。エチレンケタールIX(112mg)を、ヘキサン(13mL)中、30分間、還流下に、N−ブロモスクシンイミド(69mg)/アゾイソブチロニトリル(3.3mg)で臭素化して化合物Xを得、次に、THF(7.3mL)中、室温で、2時間、テトラブチルアンモニウムフルオライド(THF(1.6mL)中、1M)で脱臭化水素化し、アンドロスタ−5,7−ジエン−3α−オール−17−オン アセテート エチレンケタール(XI)(55mg)を得た。アンドロスタ−5,7−ジエン−3α−オール−17−オン アセテート エチレンケタール(XI)(55mg)を、メタノール(10mL)中、室温で約5時間、1N水酸化ナトリウム(2mL)と反応させ、アンドロスタ−5,7−ジエン−3α−オール−17−オン エチレンケタール(XII)(48mg)を得た。アンドロスタ−5,7−ジエン−3α−オール−17−オン エチレンケタール(XII)(48mg)を、アセトン(5mL)及び水(0.2mL)の混合液中、室温で一晩、p−トルエンスルホン酸一水和物(35mg)と反応させ、アンドロスタ−5,7−ジエン−3α−オール−17−オン(XIII)(43.4mg)を得た。アンドロスタ−5,7−ジエン−3α−オール−17−オン(XIII)(43.4mg)を、エーテル(1,100mL)中、−20〜0℃で、VYCOR(登録商標)フィルター(Ace Glass社、ニュージャージー州、ヴァインランド)を備えた450wの水銀ランプ下で5分間照射し、プレHMCHEMOIOを得、これをエタノール(15mL)中、3時間還流し、HMCHEMOIO(VII)(13.5mg)を得た。
[抗体の調製]
AJ種のマウス(メス、少なくとも8週齢)を免疫して、モノクローナル抗体を産生させた。上記で得た100μgの免疫原(HMCHEMOIO−CMO BSA)を、Fruendsの完全補助剤(Sigma−Aldrich社、Cat#F5881)中に添加し100μLとし、1回目の免疫を行なった。3週後、同じ免疫原100μgをFruendの不完全補助剤(Sigma−Aldrich社、Cat#F5506)中に添加し100μLとし、ブースト免疫を行なった。更に3週後にも、同じ免疫原100μgをFruendの不完全補助剤中に添加し100μLとし、第二のブースト免疫を行なった。最後のブースト免疫の1週間後、マウスから採血し、抗血清を、抗−3−エピマー抗体に関してELISAで試験した。次に、潅流ブーストを同じ免疫原で融合前の3日間連続して行なった(PBS中、50μL中20μg、補助剤なし)。4日目にマウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。脾臓細胞を分離し、P3−X63Ag8.653(ATCC CRL−1580(商標))と称される非分泌マウス骨髄腫細胞株を用いた標準法により細胞融合を行なった。標準法によりクローニングを行なった。
上述のように調製したHMCHEMOIO−CMO BSAを、500μg/回、用いてウサギを免疫した。1回の初回免疫及び5回ブースト免疫を2週間隔で実施し、2匹の試験個体と1匹の生産個体を集め、上記のように、抗血清をELISA試験した。
[25OHビタミンDに対する免疫測定法]
[免疫測定法手順]
使用した25OHビタミンD(25(OH)D)免疫測定法フォーマットは、LOCI(登録商標)アッセイ法に基づく均質な競合化学発光免疫測定法である。当該アッセイは、Siemens Dimension(登録商標)EXLで自動化された統合臨床化学システム(シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド社、イリノイ州、ディアフィールド)で実施した。アッセイにおいて、血清試料中及び血漿試料中の25(OH)D2及び/又は25(OH)D3の総濃度を測定した。LOCI(登録商標)アッセイ試薬には、放出試薬、2つの合成ビーズ試薬及びビオチン化モノクローナル抗25OHビタミンD抗体試薬が含まれていた。第一ビーズ試薬(「センシビーズ(Sensibeads)」と称する。)は、ストレプトアビジンで被覆され、感光性色素を含有していた。第二ビーズ試薬(「ケミビーズ(Chemibeads)」と称する。)は、25(OH)D3類縁体で被覆され、化学発光色素を含有していた。試料を放出試薬とインキュベートし、ビタミンD結合タンパク質から3−エピマー化合物を含む25(OH)D分子を放出させた。次に、反応混合物をビオチン化抗体とインキュベートし、ビオチン化25(OH)D抗体複合体を生成させた。ビオチン化抗体(ヒツジモノクローナル抗体)が、3−エピ−25(OH)Dと交差反応したため、抗−3−エピマー−VD抗体である8F10.1の100μg/mLを添加し、3−エピマービタミンD化合物に由来するアッセイ信号を最小にした。ケミビーズを添加し、過剰なフリーのビオチン化抗体と結合させた。次に、センシビーズを添加し、ビオチン化抗体のビオチン部分と結合させた。その結果、ケミビーズ−類縁体/抗体−ビオチン/ストレプトアビジン−センシビーズの凝集体が形成された。反応混合物の680nmの光による照射により、センシビーズから一重項酸素が発生し、これがケミビーズに拡散し、化学発光反応を誘発した。得られる化学発光信号を612nmで測定した結果、試料中の全25(OH)Dの濃度に逆比例していた。
[25(OH)D3ケミビーズの合成]
25(OH)D3カルバメートとEPRM−EDAとを結合させることにより、25(OH)D3ケミビーズを合成した。使用した材料は、EPRM−EDAビーズ、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)、Fluka スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド(SNHS)、25(OH)D3−3−カルバメート、GAFAC(登録商標)界面活性剤溶液(16%)、無水DMSO、10%のMeOP及び1%のGAFAC(登録商標)界面活性剤を含む50mMのMES緩衝剤(pH6)である。
EPRMビーズ(2,000mg、20.0mL)を40mLのバイアルに添加する。EPRMビーズは、特許文献23に記載の手順と同様の方法で調製し、化学発光化合物は、2−(4−(N,N−ジ−テトラデシル)−アニリノ−3−フェニルチオキセンのユウロピウムキレートとする。EDA(800mg、890μL)を、10mLのMES緩衝剤(pH6)(「緩衝剤」)及び約4.2mLの6N HClと合一する。混合物のpHは、約6.9であるか又は約6.9に調整する。EDA溶液をEPRMビーズにボルテックスしながら添加し、混合物を15分間室温で振とうする。ナトリウムシアノボロハイドライド(400mg)を、15mLのバイアル中で10mLのDI水と合一し、当該合一物を上記のビーズ混合物に添加する。混合物を18〜20時間、37℃で振とうする。ビーズを6本の40mLの遠心チューブへ移す。MES緩衝剤を添加して35mLの体積とし、混合物を、30分間、19,000rpmで遠心分離する。上清をデカントし、撹拌ロッドで撹拌しながら2mLの緩衝剤中でビーズを再懸濁し、更に緩衝剤を添加して35mLとする。混合物を氷冷しながら30秒間18ワットの電力で混合物を超音波処理する。洗浄/超音波処理ステップを4回実施し、全ての活性化化合物を除去する。MES緩衝剤の最後の遠心分離後、5%のMeOP及び0.1%のTWEEN(登録商標)20を含有する緩衝剤(「第2緩衝剤」)をチューブに2mL添加し、再懸濁ステップを行なう。超音波処理の前に、更なる第2緩衝剤を添加して35mLとする。ビーズ懸濁液を30分間、19,000rpmで遠心分離する。上清を廃棄する。最後の超音波処理では、各チューブに第2緩衝剤を12mL用い、25mg/mLの希釈液を得る。UPA装置で測定した結果、粒径は277nmである。
ChemReagents.com(テキサス州、シュガーランド)から購入した22mg(55μmol)の25(OH)D3と、100mg(420μmol)のジスクシンイミジルカーボネート(DSC)と、1mLの無水のアセトニトリル中の100μLのトリエチルアミンとの混合物を、ホイルでカバーした5mLのフラスコ中、室温、窒素下で18時間、撹拌し、活性化25(OH)D3を調製した。TLC(EtOAc:ヘキサン=2:1)では、残留出発物質が検出されなかった。10mLのフラスコに、150mgのカルボキシメトキシルアミンヘミヒドロクロライド(CMO)、0.3mLのトリエチルアミン及び1mLのDMFを添加し、懸濁液を調製した。CMO懸濁液に、撹拌しながら、活性化25(OH)D3を含有する溶液を滴下添加し、更に18時間撹拌を継続した。真空状態とし、可能な限り多量の溶媒を除去した(温浴の温度を50℃以下に維持した。)。EtOAc(25mL)を残渣に添加し、2mLのブラインで3回洗浄した。有機相を無水Na2SO4で乾燥し、濾過し、ロータリエバポレーターを用いて溶媒を除去した。乾燥の後、粗生成物(42mg)を得、HPLCで精製した。高真空下での乾燥の後、純粋な生成物(24mg)を得た。生成物を1.2mLの無水DMSO中に溶解した。アリコートをバイアルに移し、−70℃で保存した。
1.2mgのハプテンを2mLのバイアルに添加した。11.2mgのEDAC、15.5mgのSNHS、及び3.73mLの無水DMSOを5mLのバイアルに添加した。EDAC/SNHS溶液を回転させ、内容物を溶解させた。1.14mLのEDAC/SNHS溶液を、ハプテンを含有するバイアルに添加した。混合物を22時間回転した。EPRM−EDA(200mg)を、高pH洗浄緩衝剤で1回、次いでMES緩衝剤(pH6)で洗浄した。5mLのバイアルに、1.08mL(100mg)の洗浄緩衝剤、続いて143mLの1.6%のGAFAC(登録商標)界面活性剤を添加した。小型の試験管に、256の無水DMSO、続いて49μLのEDAC/SNHS/ハプテンを添加した。DMSO/ハプテン溶液をビーズ混合物に滴下添加した(添加の間、ボルテックスを行なった)。ビーズ/ハプテン混合物を室温で一晩回転した。
NHS−PEO4−ビオチン(Pierce Chemical社、イリノイ州、ロックフィールド)を、抗−25(OH)D抗体(ヒツジモノクローナル抗体、Bioventix社製、英国、サリー州、ファーナム)にカップリングさせた。3mgの抗−25(OH)D抗体を、各10mLの抗体透析緩衝剤(10mMのNaH2PO4、pH7.0/300mMのNaCl)/10mL Amiconで、2回、緩衝剤交換し、3.0mg/mLまで濃縮した。1mgのNHS−PEO4−ビオチンを、100μLの抗体透析緩衝剤中に溶解し、10mg/mLのビオチン試薬液を調製し、それ(35μL)を抗−25(OH)D抗体溶液に添加した。反応混合物を一晩室温で振とうした。各10mLの抗体透析緩衝剤/10mL Amiconで混合物を3回洗浄し、次いで、約1mLまで濃縮した。UV A280により濃度を測定した。ビオチン化された抗−25(OH)D抗体試薬を、25mMのクエン酸緩衝剤、300mMのNaCl、1mMのEDTA、ブロッキングタンパク質及び防腐剤を含有する水性緩衝剤(pH5.0)中に調製した。
ストレプトアビジン−増感剤ビーズを、特許文献24、特許文献28、特許文献29及び特許文献25に記載された方法と同様の方法を使用して調製した。光増感剤を、ビス−(トリヘキシル)−シリコン−t−ブチル−フタロシアニンとした。Sensibead試薬の濃度は、150mMのNaClを含有するHEPES緩衝剤(pH8.0)中、200μg/mLであった。
5mMのHEPES緩衝剤中のサリチル酸ナトリウム。
アッセイにおける3−エピマーの交差反応性に対する抗−3−エピマー−VD抗体8F10.1(抗−3−エピマーVD Ab)の添加の効果を表1に示す。25(OH)D2又は25(OH)D3化合物を含有する10の患者血清を、シグマ社から購入した100ng/mLの3−エピマービタミンD3化合物(ストックNo.751324)でスパイクした。3−エピマーの交差反応性は、25(OH)D2又は25(OH)D3の、スパイクとしての3−エピマー化合物の有無による相違を、添加した3−エピマー化合物の量で除算することにより算出した。抗−3−エピマー−VD抗体8F10.1の100μg/mLの添加により、3−エピマー交差反応性の平均値が13.7%から2%未満まで減少した。
[3−エピ−25OHビタミンDに対する免疫測定法]
[免疫測定法手順]
3−エピ−25OHビタミンD(3−エピ−25(OH)D)の測定では、上記実施例3で述べたと同様のLOCI(登録商標)アッセイ法に基づく均質競合化学発光免疫測定法を使用した。当該アッセイは、Siemens Dimension(登録商標)EXLで自動化された統合臨床化学システム(シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド社)で実施した。3−エピ−25(OH)Dの測定に用いられるLOCI(登録商標)アッセイ試薬は、放出試薬、2つの合成ビーズ試薬及びビオチン化モノクローナル抗−3−エピマー抗体試薬を含むものであった。第1ビーズ試薬(センシビーズ)は、ストレプトアビジンで被覆され、感光性色素を含有していた。第二ビーズ試薬(ケミビーズ)は、上記実施例1と同様の方法で調製した3−エピマー類縁体(上記式(IIa)の化合物、式中、Z’は非ポリ(アミノ酸)標識である。即ち、EPRM−EDAケミビーズである。)で被覆されていた。試料を放出試薬とインキュベートして、ビタミンD結合タンパク質から3−エピマー化合物を始めとする25(OH)D分子を放出させた。次いで、反応混合物をビオチン化抗体とインキュベートして、3−エピ−25(OH)D/ビオチン化抗体複合体を生成させた。ケミビーズを添加し、過剰のフリーのビオチン化抗体を捕捉した。次に、センシビーズを添加し、ビオチン化抗体のビオチン部分と結合させた。その結果、ケミビーズ−類縁体/抗体−ビオチン/ストレプトアビジン−センシビーズの凝集体が形成された。反応混合物を680nmの光で照射すると、センシビーズから一重項酸素が発生し、これがケミビーズ中に拡散し、化学発光反応を誘発した。得られた化学発光信号を612nmで測定したところ、試料中の総3−エピ−25(OH)Dの濃度に逆比例していた。
[3−エピマー類縁体ケミビーズの合成]
この3−エピ−25(OH)Dの検出アッセイに用いるケミビーズを、25(OH)D3ケミビーズの合成に関する実施例3に記載の方法と同様の方法で調製した。このとき、ハプテンは、Z’がケミビーズである式(IIa)の化合物である。
50nMのMES緩衝剤中の3−エピマー類縁体ケミビーズ。
抗−3−エピマー−VD抗体8F10.1のビオチン化は、抗−25(OH)D抗体のビオチン化に関する上記実施例3に記載の方法と同様の方法で実施した。
25mMのクエン酸緩衝剤中の、上記ビオチン化抗−3−エピマー−VD抗体8F10.1。
センシビーズ試薬は、実施例3の場合と同様とした。
図10は、抗−3−エピマー−VD抗体8F10.1を用いた試料における3−エピ−25(OH)D測定免疫測定の標準曲線を示す。化学発光のキロカウントは、上記のようにして測定された化学発光信号を表す。
Claims (20)
- ビタミンD被検体を含有すると考えられる試料中の前記ビタミンD被検体の量を測定する方法であって、
(a)アッセイ媒体中に、
(i)前記試料、
(ii)ビタミンDエピマーに特異的なビタミンDエピマー結合パートナーであって、前記ビタミンD被検体とは如何なる検出可能な程度にも結合しないビタミンDエピマー結合パートナー、及び
(iii)前記ビタミンD被検体に特異的なビタミンD結合パートナー
の合一物を調製し、
(b)前記アッセイ媒体を、前記ビタミンDエピマー結合パートナーが前記ビタミンDエピマー被検体に結合し、前記ビタミンD結合パートナーが前記ビタミンD被検体に結合してビタミンD結合パートナー結合複合体を生成する条件下で、インキュベートし、そして、
(c)ビタミンD結合パートナー結合複合体の量を測定し、このビタミンD結合パートナー結合複合体の量を、前記試料中の前記ビタミンD被検体の量と関連付ける
ことを含んでなる方法。 - 前記ビタミンD結合パートナーが信号生成システムの部材又は固体支持体を含有してなる請求項1に記載の方法。
- 前記ビタミンD結合パートナーが、標識である信号生成システムの部材を含有してなる請求項2に記載の方法。
- 前記合一物が更に、信号生成システムの部材を含有してなるビタミンD類縁体を、含有する請求項1に記載の方法。
- 前記信号生成システムの部材が標識である請求項4に記載の方法。
- 前記ビタミンD類縁体が下記式の化合物である請求項4に記載の方法。
(R1)p−(L)q−Z
ここで、R1は、
式中、Yは、O、S、CR又はNR4であり、
Xは、−O−(CH2)n−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−(CH2)x−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−NH(CH2)y−C(O)−又は−NR3C(O)−であり、
Rは、独立して、水素原子又はアルキル基であり、
R2は、独立して、水素原子又はアルキル基であり、
R3、R4、R5及びR6は、独立して、水素原子若しくはアルキル基であるか、又は、R4及びR5が一緒になって結合を形成するか、又は、R5とR6が一緒になって結合を形成し、
R3、R4、R5及びR6は、独立して、水素原子若しくはアルキル基であるか、又は、R4及びR5が一緒になって結合を形成するか、又は、R5とR6が一緒になって結合を形成し、
R11は、水素原子、アルキル基又はアシル基であり、
nは、1から10の整数であり、
wは、0から10の整数であり、
xは、1から10の整数であり、
yは、1から10の整数であり、
pは、1から10の整数であり、
Lは、結合基であり、
qは、0又は1であり、
Zは、標識である。 - 前記ビタミンDエピマー結合パートナーが下記式の化合物又は前記化合物の2つ以上の混合物に対して生じたものである請求項1に記載の方法。
(R1)p−(L)q−Z
ここで、R1は、
Yは、O、S、CR又はNR4であり、
Xは、−O−(CH2)n−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−(CH2)x−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−NH(CH2)y−C(O)−又はNR3C(O)−であり、
Rは、独立して水素原子又はアルキル基であり、
R2は、独立して水素原子又はアルキル基であり、
R3、R4、R5及びR6は、独立して水素原子若しくはアルキル基であるか、又は、R4及びR5が、一緒になって結合を形成するか、又は、R5及びR6が一緒になって結合を形成するか、又は、R及びR5が一緒になって結合を形成し、
R11は、水素原子、アルキル基又はアシル基であり、
nは、1から10の整数であり、
wは、0から10の整数であり、
xは、1から10の整数であり、
yは、1から10の整数であり、
pは、1から10の整数であり、
Lは、結合基であり、
qは、0又は1であり、
Zは、免疫原性担体である。 - 前記化合物において、
R1が
又は
R1が
請求項7に記載の方法。 - 前記化合物において、(R1)p−(L)q−が、
NHR1−(CH2)r−NR1−((CH2)r−NR1)s−(CH2)r−NR7−である
請求項7に記載の方法。
ここで、R1は、独立して
rは、独立して1〜10の整数であり、
sは、1〜10の整数であり、
R7は、水素原子又はアルキル基である。 - 前記化合物において、
rが2であり、sが1であり、R7が水素原子であり、1つのR1が
rが2であり、sが1であり、R7が水素原子であり、2つのR1が
rが2であり、sが1であり、R7が水素原子であり、3つのR1が
- 前記ビタミンDエピマー結合パートナーが下記式の化合物に対して生じるか又は当該化合物の2つ以上の混合物に対して生じる請求項1に記載の方法。
NHR1’−(CH2)r’−NR1’’−((CH2)r’−NR1’’’)s’−(CH2)r’−NR7’−Z’
ここで、R1’、R1’’又はR1’’’は、各々独立して、
R1’、R1’’又はR1’’’のうちの少なくとも1つは、水素原子ではなく、
n’は、1から10の整数であり、
r’は、独立して1から10の整数であり、
s’は、1から10の整数であり、
R7’は、水素原子又はアルキル基であり、
R11’は、水素原子、アルキル基、又はアシル基であり、
Z’は、ポリ(アミノ酸)免疫原性担体又は非ポリ(アミノ酸)免疫原性担体である。 - ビタミンD被検体を含有すると考えられる試料中の前記ビタミンD被検体の量を測定する方法であって、
(a)アッセイ媒体中に、
(i)前記試料、
(ii)前記ビタミンD被検体に特異的であるビタミンD抗体である捕捉抗体、及び
(iii)前記ビタミンDエピマー被検体に特異的なビタミンDエピマー抗体であって、前記ビタミンD被検体には如何なる検出可能な程度にも結合しないビタミンDエピマー抗体
の合一物を調製し、
(b)前記アッセイ媒体を、前記ビタミンD抗体が前記ビタミンD被検体に結合してビタミンD抗体結合複合体を形成し、前記ビタミンDエピマー抗体がビタミンD被検体のエピマーに結合する条件下で、インキュベートし、
(c)前記ビタミンD抗体結合複合体を、前記ビタミンD抗体結合複合体中の前記ビタミンD被検体に結合する検出抗体であって信号生成システムの部材を含有する検出抗体に、結合させ、そして、
(d)前記信号生成システムにより生成される信号を測定して、当該信号の量を前記試料中の前記ビタミンD被検体の量と関連づける
ことを含んでなる方法。 - 更に、媒体から、前記抗体結合複合体を分離することを含んでなる請求項12に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が固体支持体を含有する請求項12に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、粒子を含有してなり、該粒子が磁気粒子であるか又は光増感剤又は化学発光化合物の1つを含有する粒子である請求項12に記載の方法。
- 前記ビタミンDエピマー抗体が下記式の化合物又は当該化合物の2つ以上の混合物に対して生じたものである請求項12に記載の方法。
(R1)p−(L)q−Z
ここで、R1は、
Yは、O、S、CR又はNR4であり、
Xは、−O−(CH2)n−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−(CH2)x−C(O)−、−(CH2)w−C(O)−NH(CH2)y−C(O)−又はNR3C(O)−であり、
Rは、独立して水素原子又はアルキル基であり、
R2は、独立して水素原子又はアルキル基であり、
R3、R4、R5及びR6は、独立して水素原子若しくはアルキル基であるか、又は、R4及びR5が、一緒になって結合を形成するか、又は、R5及びR6が一緒になって結合を形成するか、又は、R及びR5が一緒になって結合を形成し、
R11は、水素原子、アルキル基又はアシル基であり、
nは、1から10の整数であり、
wは、0から10の整数であり、
xは、1から10の整数であり、
yは、1から10の整数であり、
pは、1から10の整数であり、
Lは、結合基であり、
qは、0又は1であり、
Zは、免疫原性担体である。 - 前記化合物において、(R1)p−(L)q−が、
NHR1−(CH2)r−NR1−((CH2)r−NR1)s−(CH2)r−NR7−である、
請求項7に記載の方法。
ここで、R1は、独立して
rは、独立して1〜10の整数であり、
sは、1〜10の整数であり、
R7は、水素原子又はアルキル基である。 - 前記化合物において、
rが2であり、sが1であり、R7が水素原子であり、1つのR1が
rが2であり、sが1であり、R7が水素原子であり、2つのR1が
rが2であり、sが1であり、R7が水素原子であり、3つのR1が
- 前記ビタミンDエピマー抗体が下記式の化合物又は当該化合物の2つ以上の混合物に対して生じたものである請求項12に記載の方法。
NHR1’−(CH2)r’−NR1’’−((CH2)r’−NR1’’’)s’−(CH2)r’−NR7’−Z’
ここで、R1’、R1’’又はR1’’’は、各々独立して、
R1’、R1’’又はR1’’’のうちの少なくとも1つは、水素原子ではなく、
n’は、1から10の整数であり、
r’は、独立して1から10の整数であり、
s’は、1から10の整数であり、
R7’は、水素原子又はアルキル基であり、
R11’は、水素原子、アルキル基、又はアシル基であり、
Z’は、ポリ(アミノ酸)免疫原性担体又は非ポリ(アミノ酸)免疫原性担体である。 - 前記化合物において、
R1が
又は
R1が
請求項7に記載の方法。
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