ES2287006T3 - Vehiculos revestidos con polisacaridos, su preparacion y uso. - Google Patents

Abstract

Un vehículo revestido de polisacárido que comprende un vehículo que tiene un revestimiento de al menos dos capas sucesivas de polisacáridos, en el que una primera capa de polisacárido de asocia espontáneamente con una segunda capa de polisacárido por grupos funcionales que están cargados opuestamente o por grupos funcionales que se acoplan covalentemente y en el que la primera y segunda capa de polisacárido son diferentes polisacáridos, por sus propiedades físico-químicas.

Description

Vehículos revestidos con polisacáridos, su preparación y uso.

Campo del invento

Este invento se refiere a vehículos que tienen un revestimiento superficial de al menos dos capas de polisacáridos para uso en los campos de la medicina y química clínica. Estos vehículos son particularmente útiles en métodos diagnósticos y terapéuticos. El invento se refiere además a métodos para preparar los vehículos.

Antecedentes del invento

En el campo de la medicina y química clínica, se usan a menudo in vitro, vehículos tales como partículas magnéticas y no magnéticas, esferas, tubos, pocillos, placas de microvaloración, tiras y láminas, por ejemplo, en ensayos de unión específica tales como un soporte sólido y/o como un marcador, para purificación por afinidad de sustancias, para separación de células o como vehículos de enzimas en procedimientos enzimáticos; o in vivo, por ejemplo, como sistemas de reparto de medicamentos, para la localización de sitios de enfermedad o para medir el flujo de sangre en un órgano. Normalmente, los vehículos se asocian con una o más parejas de par de unión específica.

Algunas de las dificultades asociadas con el uso de los vehículos son (1) acoplar parejas de unión específica al vehículo y (2) impedir uniones no específicas de sustancias no deseadas al vehículo a partir de muestras puestas en contacto con el vehículo. Una unión no específica es el resultado de uniones no covalentes entre moléculas que es relativamente independiente de las estructuras superficiales específicas. Una unión no específica puede ser resultado de varios factores que incluyen interacciones hidrófobas entre moléculas.

Las consecuencias de estos problemas incluyen un inaceptablemente bajo número de parejas de unión específica asociadas al vehículo, pobre eficacia de los ensayos de unión específica (alto fondo y baja sensibilidad) y baja pureza en purificaciones por afinidad. Existen problemas particulares para vehículos en forma de partículas que pueden aglutinarse no específicamente y, en consecuencia, pueden formar precipitados no deseables de partículas
agregadas.

Las soluciones a estos problemas se han aproximado a través del uso de vehículos con revestimientos de polisacáridos hidrófilos. En el documento de patente WO 90/04178 se describe un vehículo inmunoreaccionante, en el que una capa de polisacárido se reviste en la superficie del vehículo por una unión covalente. El vehículo descrito en el documento de patente WO 84/03358 se caracteriza por una superficie que está revestida sólo parcialmente con un polisacárido y en otra parte no se recubre por tal revestimiento, pero sin embargo se acopla una pareja de unión específica. El uso de partículas magnéticas como agentes farmacéuticos se describe en el documento de patente WO 96/27394, en el que estas partículas se revisten con polisacáridos tratados con álcali. Las nano-partículas conteniendo hierro que comprenden un núcleo que contiene hierro y dos revestimientos poliméricos se conocen del documento de patente WO 96/04017. Las partículas de látex modificadas con carboxilato tintado cuadrado pueden revestirse con aminodextrano maleimidado según el documento de patente EP 0 275 139.

Las partículas que tienen un revestimiento múltiple de aminodextranos se describen en los documentos de patente de EE.UU. 5.639.620 y 5.707.877. Aquí, se describe que las capas múltiples de aminodextranos pueden reticularse a través del uso de agentes reticulantes bifuncionales tal como gluteraldehido. El acoplamiento de una sustancia biológica a grupos de amina libre de la capa externa de dextrano implica también el uso del agente reticulante. Mientras que este procedimiento tiene en cuenta partículas con múltiples revestimientos de amino dextrano que debería por lo tanto disminuir la unión no específica, la preparación de las partículas y acoplamiento a sustancias biológicas implican el uso del reactivo reticulante. Esto añade una etapa extra durante la síntesis del vehículo o el acoplamiento de sustancias biológicas. Además, las reacciones que implican al reactivo reticulante deben controlarse cuidadosamente para evitar la reticulación intra-capa e inter-partícula. Por consiguiente, es todavía deseable tener un vehículo en el que se cubra toda la superficie con un revestimiento hidrófilo que se prepara fácilmente y al que puedan acoplarse fácilmente las parejas de par de unión específica.

El documento de patente WO 94/09368 describe un vehículo revestido que tiene una primera capa de gelatina reticulada biodegradable y una segunda capa de aminodextrano. La gelatina es un polipéptido.

El documento de patente WO 99/30160 describe partículas que tienen un revestimiento de dextrano o un revestimiento derivado de dextrano. El dextrano se oxida con agentes oxidantes seleccionados tales como compuestos perhalogenados y agentes oxidantes similares.

El documento de patente de EE.UU. 5.466.609 describe una partículas que tiene un núcleo sólido y revestido con una primera capa de una gelatina soluble en agua y una segunda capa de aminodextrano. La gelatina es un polipéptido.

Exposición del invento

El presente invento proporciona un vehículo revestido con polisacárido que comprende un vehículo que tiene un revestimiento de al menos dos capas sucesivas de polisacáridos. La primera capa de polisacárido se asocia espontáneamente con la segunda capa de polisacárido. Cada capa sucesiva de polisacárido se asocia espontáneamente con la capa de polisacárido anterior.

Los polisacáridos tienen grupos funcionales en cadenas laterales y los grupos funcionales de las sucesivas capas de polisacárido se cargan preferentemente opuestamente a los grupos funcionales de las capas de polisacárido anteriores. Las capas de polisacárido pueden acoplarse covalentemente una a otra por una reacción entre los grupos funcionales de las sucesivas capas con un grupo funcional de una capa anterior. Esta reacción puede ser una reacción espontánea.

Preferentemente, los grupos funcionales de las sucesivas capas de polisacárido alternan entre grupos funcionales de amina y grupos funcionales de amina reactiva. Los grupos funcionales de amina reactiva pueden ser un aldehído o un grupo carboxilo.

Una realización adicional del invento es que la primera capa de polisacárido se asocia espontáneamente con el vehículo. Tanto el vehículo como el polisacárido pueden tener grupos funcionales en cadenas laterales que provocan preferentemente la asociación espontánea. Los grupos funcionales del vehículo y los grupos funcionales de la primera capa de polisacárido pueden cargarse opuestamente o los grupos funcionales del vehículo pueden reaccionar espontáneamente con los grupos funcionales de la primera capa de polisacárido. El vehículo puede acoplarse covalentemente a la capa de polisacárido por reacción entre los grupos funcionales del vehículo y los grupos funcionales de la primera capa de polisacárido. Se prefiere que los grupos funcionales del vehículo sean grupos funcionales de amina reactiva y los grupos funcionales de la primera capa de polisacárido son grupos funcionales de amina. El grupo funcional de amina reactiva puede ser un grupo aldehído o un grupo carboxilo.

En un aspecto del invento, el polisacárido de la primera capa de revestimiento se acopla covalentemente a dicho vehículo por reacción entre los grupos funcionales de amina reactiva del vehículo y grupos amina del polisacárido de la primera capa de revestimiento. El polisacárido de la segunda capa de revestimiento se acopla covalentemente a la primera capa de revestimiento por reacción entre los grupos funcionales de amina de la primera capa de revestimiento y los grupos funcionales de amina reactiva del polisacárido de la segunda capa de revestimiento.

En otra realización preferida del presente invento, el polisacárido de la primera capa de revestimiento se acopla covalentemente a dicho vehículo por reacción entre los grupos funcionales de amina del vehículo y los grupos de amina reactiva del polisacárido de la primera capa de revestimiento. El polisacárido de la segunda capa de revestimiento se acopla covalentemente a la primera capa de revestimiento por reacción entre los grupos funcionales de amina reactiva de la primera capa de revestimiento y los grupos funcionales de amina del polisacárido de la segunda capa de revestimiento.

El uso de al menos dos capas de polisacárido y particularmente cuando las dos moléculas de polisacárido son diferentes por sus propiedades físico-químicas, da como resultado una mejor cobertura de la superficie del vehículo y minimiza la unión no específica. Los grupos funcionales cargados opuestamente en la superficie del vehículo, por ejemplo, grupos COO^{-} - y en el polisacárido de la primera capa de revestimiento, por ejemplo, grupos N^{+}H_{3}-, se atraen unos a otros (se asocian espontáneamente) y en presencia de exceso de polisacáridos, la superficie del vehículo se cubre rápida y eficazmente. Alternativamente, los grupos aldehído, grupos -CO, de una molécula de polisacárido obtenida de un aldehído reaccionará espontáneamente con un grupo amino de la superficie del vehículo obtenido de una amina o con un polisacárido. Pueden usarse como cantidades en exceso de polisacáridos para la primera y otras reacciones de revestimiento, no hay necesidad de una monitorización fina de la concentración de polisacárido durante las reacciones. Se ha encontrado que el revestimiento alternativo del polisacárido con grupos funcionales de amina y polisacárido con grupos funcionales de amina reactiva es particularmente ventajoso en relación a una mejor cobertura del vehículo y la sencillez del procedimiento de revestimiento.

La reacción entre los grupos funcionales de amina de la primera capa de revestimiento y los grupos funcionales de amina reactiva del polisacárido de la segunda capa de revestimiento o alternativamente la reacción entre los grupos funcionales de amina reactiva de la primera capa de revestimiento y los grupos funcionales de amina del polisacárido de la segunda capa de revestimiento, conduce también a una reticulación eficaz de los polisacáridos y, en consecuencia, a un revestimiento del vehículo hidrófilo estable. Además, los grupos funcionales de amina reactiva en cadenas laterales de la segunda capa de revestimiento o más externa, respectivamente, pueden reaccionar fácilmente con los grupos amino de las proteínas o péptidos. Las partículas revestidas preparadas según este invento demuestran buena estabilidad coloidal durante varios meses sin precipitado observable en el tubo de almacenamiento.

Una realización específica del presente invento es un vehículo que tiene un revestimiento superficial proporcionado con una pluralidad de grupos funcionales en cadenas laterales, en el que (i) dicho revestimiento superficial comprende al menos dos capas revestidas alternativamente de polisacárido con grupos funcionales; (ii) el polisacárido de la primera capa de revestimiento se acopla covalentemente a dicho vehículo por reacción entre los grupos funcionales del vehículo y los grupos funcionales del polisacárido de la primera capa de revestimiento; en el que los grupos funcionales del vehículo y los grupos funcionales del polisacárido de la primera capa de revestimiento están cargados opuestamente; y (iii) el polisacárido de la segunda capa de revestimiento se acopla covalentemente a la primera capa de revestimiento por reacción entre los grupos funcionales de la primera capa de revestimiento y los grupos funcionales del polisacárido de la segunda capa de revestimiento, en el que los grupos funcionales de la primera capa de revestimiento y los grupos funcionales del polisacárido de la segunda capa de revestimiento están cargados opuestamente.

Un vehículo preferido según el presente invento es un vehículo que tiene un revestimiento superficial proporcionado con una pluralidad de grupos funcionales en cadenas laterales, en el que (i) dicho revestimiento superficial comprende al menos dos capas revestidas alternativamente de polisacárido con grupos funcionales de amina y grupos funcionales de amina reactiva; (ii) el polisacárido de la primera capa de revestimiento se acopla covalentemente a dicho vehículo por reacción entre grupos funcionales de amina reactiva del vehículo y grupos amina del polisacárido de la primera capa de revestimiento; y (iii) el polisacárido de la segunda capa de revestimiento se acopla covalentemente a la primera capa de revestimiento por reacción entre los grupos funcionales de amina de la primera capa de revestimiento y los grupos funcionales de amina reactiva del polisacárido de la segunda capa de revestimiento.

Otro vehículo preferido según el presente invento es un vehículo que tiene un revestimiento superficial proporcionado con una pluralidad de grupos funcionales en cadenas laterales, en el que (i) dicho revestimiento superficial comprende al menos dos capas revestidas alternativamente de polisacárido con grupos funcionales de amina reactiva y grupos funcionales de amina; (ii) el polisacárido de la primera capa de revestimiento se acopla covalentemente a dicho vehículo por reacción entre grupos funcionales de amina del vehículo y grupos de amina reactiva del polisacárido de la primera capa de revestimiento; y (iii) el polisacárido de la segunda capa de revestimiento se acopla covalentemente a la primera capa de revestimiento por reacción entre los grupos funcionales de amina reactiva de la primera capa de revestimiento y los grupos funcionales de amina del polisacárido de la segunda capa de
revestimiento.

Incluso otro vehículo preferido según el presente invento es un vehículo en el que dicho material vehículo se selecciona del grupo que consiste en polímeros que suceden naturalmente modificados o sintéticos, naturales tales como agarosa, celulosa, nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliestireno, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliacrilamida, polimetacrilato, polietilentereftalato, nylon, polivinilbutirato o poliacrilato; siliconas, vidrios, cerámicos; polvos inorgánicos tales como sílice, sulfato de magnesio y alúmina; materiales magnéticos; metales o una combinación de los mismos.

Otra realización del presente invento es un vehículo seleccionado del grupo que consiste en tubos, placas de microvaloración, esferas, partículas y, preferentemente una partícula magnética o no magnética, lo más preferentemente una partícula de látex carboxilada magnética o no magnética. Si el vehículo es una partícula, el tamaño preferido está en el intervalo de 0,1 a 10 \mum, preferentemente 0,1 a 5 \mum, lo más preferentemente 0,15 a 3 \mum. El vehículo puede asociarse con sustancias tal como una molécula indicadora seleccionada del grupo que consiste en tintes, radiomarcadores, sensibilizadores, fluorescentes y/o quimiluminiscentes.

Otro vehículo más preferido según este invento es un vehículo en el que el polisacárido de la segunda capa de revestimiento son dextranos, en el que los grupos funcionales de amina reactiva se seleccionan del grupo que consiste en aldehidos y grupos carboxilo. Dichos dextranos tiene un peso molecular preferido de 10.000 a 2.000.000, preferentemente alrededor de 500.000.

Alternativamente, el vehículo según el presente invento puede ser un vehículo en el que el polisacárido de la primera capa de revestimiento es dextrano con grupos funcionales de amina reactiva y, preferentemente, el polisacárido de la segunda capa de revestimiento es aminodextrano.

Otra realización del presente invento es un vehículo en el que los grupos funcionales en cadenas laterales se seleccionan del grupo que consiste en aminas, aldehidos, grupos carboxilo, grupos maleimido, grupos sulfhidrilo y similares.

Incluso otra realización del presente invento es un vehículo en el que los grupos funcionales en cadenas laterales se usan para unir parejas de unión específica al revestimiento superficial del vehículo. Se prefiere tal vehículo en el que dichas parejas de unión específica se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, receptores, oligonucleótidos, proteínas de unión a oligonucleótidos, lectinas, haptenos, antígenos, proteínas de unión a inmunoglobulina, avidina, estreptavidina y biotina.

Otra realización del presente invento es un vehículo según este invento para uso en métodos de diagnosis in vitro y/o in vivo, particularmente en un método para la determinación cuantitativa y/o cualitativa de un analito y en métodos terapéuticos.

Incluso otra realización del presente invento es una composición que comprende un vehículo según este invento, preferentemente una partícula en un medio aceptable farmacéuticamente.

Otra realización del presente invento es un método para la determinación cuantitativa o cualitativa de un analito en una muestra que usa un vehículo según este invento.

Incluso otra realización del presente invento es un método para preparar un vehículo según este invento, comprendiendo dicho método: (i) acoplar covalentemente el polisacárido de la primera capa de revestimiento a dicho vehículo por reacción entre los grupos funcionales de amina reactiva del vehículo y los grupos amina del polisacárido de la primera capa de revestimiento; y (ii) acoplar covalentemente el polisacárido de la segunda capa de revestimiento a la primera capa de revestimiento por reacción entre los grupos funcionales de amina de la primera capa de revestimiento y los grupos funcionales de amina reactiva del polisacárido de la segunda capa de revestimiento. Un método preferido para preparar un vehículo según este invento es un método en el que se usa la química de conjugación de la carbodiimida para el acoplamiento del polisacárido de la primera capa de revestimiento a dicho vehículo.

Otra realización del presente invento es un método para preparar un vehículo según este invento, comprendiendo dicho método: (i) acoplar covalentemente el polisacárido de la primera capa de revestimiento a dicho vehículo por reacción entre los grupos funcionales de amina del vehículo y los grupos de amina reactiva del polisacárido de la primera capa de revestimiento; y (ii) acoplar covalentemente el polisacárido de la segunda capa de revestimiento a la primera capa de revestimiento por reacción entre los grupos funcionales de amina reactiva de la primera capa de revestimiento y los grupos funcionales de amina del polisacárido de la segunda capa de revestimiento. Un método preferido para preparar un vehículo según este invento es un método en el que se usa la química de conjugación de la carbodiimida para el acoplamiento del polisacárido de la primera capa de revestimiento a dicho vehículo.

Otro método preferido para preparar un vehículo según este invento es un método en el que el acoplamiento del polisacárido de la segunda capa de revestimiento a la primera capa de revestimiento se hace en presencia de un agente reductor suave, tal como, por ejemplo, cianoborohidruro de sodio.

Incluso otro método preferido para preparar un vehículo según este invento es un método en el que se usa la química de conjugación de la carbodiimida para el acoplamiento del polisacárido de la segunda capa de revestimiento a la primera capa de revestimiento.

Uno de los métodos más preferidos para preparar un vehículo según este invento es un método en el que las parejas de unión específica se unen covalentemente al revestimiento superficial por reacción entre los grupos funcionales en cadenas laterales del revestimiento superficial y los grupos funcionales de las parejas de unión específica.

Las realizaciones preferidas del invento se describen por las reivindicaciones 1 a 39.

Descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B son representaciones esquemáticas de dos de las realizaciones preferidas de los vehículos según el presente invento.

La Figura 2 representa una curva estándar típica para un ensayo de digoxina LOCI^{TM}.

La Figura 3 representa el resultado de ensayos de digoxina LOCI^{TM} que usan el vehículo del presente invento comparado con un ensayo LOCI^{TM} que usa un vehículo con un solo revestimiento de polisacárido.

Las Figuras 4, 5 y 6 representan los resultados de un ensayo TSH LOCI^{TM} que usa los vehículos del presente invento.

Descripción detallada del invento

Antes de proceder además con la descripción de las realizaciones específicas del presente invento, se definirán varios términos.

"Analito", como se usa en este contexto, quiere decir un compuesto o composición a ser detectada. El analito puede ser un elemento de un par de unión específica y puede ser un analito monoepitópico (monovalente), normalmente hapténico y/o un analito polivalente y es un compuesto individual o varios compuestos que comparten al menos una organización polar y espacial particular común, por ejemplo, un sitio epitópico o determinante. Los posibles analitos se describen también en detalle en el documento de patente de EE.UU. 5.545.834, columnas 3-10.

Los analitos monoepitópicos tendrán generalmente un peso molecular de alrededor de 100 a 2.000, más normalmente de peso molecular de 125 a 1.000. Los analitos incluyen oligopéptidos, oligonucleótidos, fármacos, metabolitos, pesticidas, contaminantes y similares. Los analitos representativos, por medio de un ejemplo y sin limitación, incluyen (i) alcaloides tales como alcaloides de morfina, que incluyen morfina, codeína, heroína, dextrometorfano, sus derivados y metabolitos; alcaloides de cocaína, que incluyen cocaína y bencil ecgonina, sus derivados y metabolitos; alcaloides de ergot, que incluyen dietilamina de ácido lisérgico; alcaloides de esteroides; alcaloides de imidazoilo; alcaloides de quinazolina; alcaloides de isoquinolina; alcaloides de quinolina, que incluyen quinina y quinidina; alcaloides de diterpeno, sus derivados y metabolitos; (ii) esteroides, que incluyen estrógenos, andrógenos, esteroides andreocorticales, ácidos biliares, glicosidas cardiotónicas y agliconas, que incluyen digoxina y digoxigenina, saponinas y sapogeninas, sus derivados y metabolitos; sustancias miméticas esteroides, tal como dietilestilbestrol; (iii) lactamas que tienen de 5 a 6 elementos anulares, que incluyen barbitúricos, por ejemplo, fenobarbital y secobarbital, difenilhidantoína, primidona, etosuximida y sus metabolitos; (iv) aminoalquilbencenos, con alquilos de 2 a 3 átomos de carbono, que incluyen anfetaminas; catecolaminas, que incluyen efedrina, L-dopa, epinefrina; narceína; papaverina y metabolitos de los anteriores; (v) compuestos orgánicos heterocíclicos que incluyen oxazepan, clorpromacina, tegretol, sus derivados y metabolitos, anillos heterocíclicos que son azepinas, diazepinas y fenotiazinas; (vi) purinas, que incluyen teofilina, cafeína, sus metabolitos y derivados; (vii) fármacos obtenidos de la marihuana, que incluyen canabinol y tetrahidrocanabinol; (viii) hormonas tales como tiroxina, cortisol, triyodotironina, testosterona, estradiol, estrona, progesterona e inmunosupresores tales como ciclosporina, FK506, ácido micofenólico (MPA) y así sucesivamente; (ix) vitaminas tales como A, B, por ejemplo, B12, C, D, E y K, ácido fólico, tiamina; (x) prostaglandinas, que se diferencian en el grado y sitios de hidroxilación e insaturación; (xi) antidepresores tricíclicos que incluyen imipramina, dismetilimipramina, amitriptilina, nortriptilina, protriptilina, trimipramina, clomipramina, doxepina y desmetildoxepina; (xii) anti-neoplásticos, que incluyen metotrexato; (xiii) antibióticos, que incluyen penicilina, cloromicetina, actinomicetina, tetraciclina, terramicina, los metabolitos y sus derivados; (xiv) nucleósidos y nucleótidos, que incluyen ATP, NAD, FMN, adenosina, guanosina, timidina y citidina con su azúcar y sustituyentes de fosfato apropiados; (xv) fármacos individuales misceláneos que incluyen metadona, meprobamato, serotonina, meperidina, lidocaína, procainamida, acetilprocainamida, propanolol, griseofulvina, ácido valproico, butirofenonas, antihistaminas, cloramfenicol, fármacos anticolinérgicos, tales como atropina, sus metabolitos y derivados; (xvi) metabolitos relacionados con estados enfermos incluyen espermina, galactosa, ácido fenilpirúvico y porfirina Tipo 1; (xvii) aminoglicosidas, tales como gentamicina, canamicina, tobramicina y amicacina; y (xviii) pesticidas tales como bifenilos polihalogenados, ésteres de fosfato, tiofosfatos, carbamatos, sulfenamidas polihalogenadas, sus metabolitos y derivados.

Los analitos polivalentes son normalmente poli(amino ácidos), es decir, polipéptidos y proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos y combinaciones de los mismos. Tales combinaciones incluyen componentes de bacterias, virus, células animales, células de plantas y células humanas, tales como cromosomas, genes, mitocondria, núcleo, membranas de células y similares. Para la mayor parte, los analitos de ligandos poliepitópicos tendrán un peso molecular de al menos 5.000, más normalmente al menos alrededor de 10.000. En la categoría de los poli(amino ácidos), los poli(amino ácidos) de interés tendrán generalmente un peso molecular de alrededor de 5.000 a 5.000.000, más normalmente de alrededor de 20.000 a 1.000.000.

Puede considerarse una amplia variedad de proteínas como la familia de proteínas que tienen características estructurales similares, proteínas que tienen funciones biológicas particulares, proteínas relacionadas con microorganismos específicos, particularmente microorganismos que causan enfermedades, etc. Tales proteínas incluyen, por ejemplo, inmunoglobulinas, citoquinas, enzimas, hormonas, antígenos de cáncer, marcadores nutricionales, marcadores de metabolismo, antígenos específicos del tejido, etc. Tales proteínas incluyen, por medio de la ilustración y sin limitación, protaminas, histonas, albúminas, globulinas, escleroproteínas, fosfoproteínas, mucoproteínas, cromoproteínas, lipoproteínas, nucleoproteínas, glicoproteínas, receptores de células T, proteoglicanos, HLA; proteínas tales como somatotropina, prolactina, insulina, pepsina; proteínas encontradas en el plasma humano; factores coagulantes de la sangre; hormonas de proteínas, tales como por ejemplo, una hormona que estimula el tiroides, una hormona que estimula el folículo, una hormona luteinizante, luteotropina, prolactina, gonadotropina coriónica, hormonas del tejido, citoquinas, antígenos del cáncer tales como PSA, CEA, a-fetoproteína, fosfatasa ácida, citoqueratinas, enolasa neuroespecífica, CA19.9, CA 15-3 y CA125; antígenos específicos del tejido tales como, por ejemplo, fosfatasa alcalina, mioglobina, CPK-MB y calcitonina y hormonas peptídicas. Otros analitos polivalentes de interés son mucopolisacáridos, polisacáridos y receptores naturales que incluyen tales materiales como avidina, estreptavidina, globulina de unión a tiroxina, prealbúmina de unión a tiroxina, transcortina, etc.

El término analito incluye además analitos de oligonucleótidos y polinucleótidos tales como m-ARN, r-ARN, t-ARN ADN (cadena doble ("ds") o cadena simple ("ss")), ARN (ds o ss), dúplex de ADN-ARN, etc. Un "oligonucleótido", como se usa en este contexto, quiere decir normalmente un polinucleótido de simple hélice que incluye un polinucleótido sintético. El (los) oligonucleótido(s) está(n) comprendido(s) normalmente de una secuencia de 10 a 100 nucleótidos, preferentemente, 20 a 80 nucleótidos de longitud. "Polinucleótido", como se usa en este contexto, quiere decir normalmente un compuesto o composición que es un nucleótido polimérico que tiene en estado natural alrededor de 50 a 500.000 o más nucleótidos y que tiene en estado aislado alrededor de 15 a 50.000 o más nucleótidos, normalmente alrededor de 15 a 20.000 nucleótidos, más frecuentemente 15 a 10.000 nucleótidos. El polinucleótido incluye ácidos nucleicos de cualquier fuente en forma purificada o sin purificar, que suceden naturalmente o producidos sintéticamente, que incluyen ADN (dsADN y ssADN) y ARN (dsARN y ssARN), normalmente ADN, y puede ser t-ARN, m-ARN, r-ARN, ADN y ARN mitocondrial, ADN y ARN del cloroplasto, híbridos de ADN-ARN o mezclas de los mismos, genes, cromosomas, plásmidos; genomas de material biológico tal como microorganismos, por ejemplo, bacterias, levaduras, virus, viroides, mohos, hongos, plantas, animales,

\hbox{humanos y fragmentos de los mismos  y
similares.}

El analito puede ser una molécula encontrada directamente en una muestra tal como tejido biológico, que incluye tejido extirpado a partir de un órgano u otra parte del cuerpo de un huésped, tal como, por ejemplo, un humano o un animal y fluidos corporales, por ejemplo, orina, sangre entera, plasma, suero, saliva, semen, deposiciones, esputo, fluido espinal cerebral, lágrimas, mocos y similares. Preferentemente, la muestra es orina, plasma o suero. La muestra puede examinarse directamente o puede pretratarse para proporcionar el analito detectable más fácilmente retirando materiales no buscados. La muestra puede pretratarse para separar o lisar células; proteínas precipitadas, hidrolizadas o desnaturalizadas, lípidos hidrolizados; solubilizar el analito o similares. Tal pretratamiento puede incluir, sin limitación: centrifugación; tratamiento de la muestra con un disolvente orgánico, por ejemplo, un alcohol, tal como metanol y tratamiento con detergentes. La muestra puede prepararse en cualquier medio conveniente, que no interfiera con un ensayo. Se prefiere un medio acuoso.

El analito puede amplificarse. Una amplificación de ácidos nucleicos quiere decir cualquier método que da como resultado la formación de una o más copias de un ácido nucleico.

Se conocen muchos métodos que incluyen la reacción en cadena de polimerasa (PCR), reacción en cadena de ligasa (LCR), amplificación que usa Q beta replicasa, amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), amplificación en cebador único (ASPP) y otras.

El analito puede ser también una molécula encontrada en la comida, agua o en el medio ambiente, especialmente en presencia de dicho analito da evidencia de una polución o contaminación de dicha comida, agua o medio ambiente.

El analito de interés puede determinarse detectando un agente de prueba del analito de interés tal como un elemento del par de unión específica complementario al analito de interés, cuya presencia se detectará sólo cuando el analito de interés está presente en una muestra. Así, el agente de prueba del analito se vuelve el analito que se detecta en un ensayo.

"Analito equivalente", como se usa en este contexto, quiere decir un analito modificado, un sucedáneo de analito o un sucedáneo de analito modificado, refiriéndose los tres a un compuesto que tiene la capacidad de unir específicamente una pareja de unión específica complementaria al analito. El sucedáneo de analito es una molécula diferente al analito, pero que se une específicamente a la pareja de unión específica complementaria al analito. Un analito modificado y un sucedáneo de analito modificado se diferencian del analito o del sucedáneo de analito, por ejemplo, por unirse a un componente de un sistema que produce una señal y/o a un soporte sólido.

"Muestra", como se usa en este contexto, quiere decir el material sospechoso de contener el analito. Tales muestras, preferentemente de humanos o animales, incluyen fluidos biológicos tales como sangre, suero, plasma, esputo, fluido linfático, semen, moco vaginal, heces, orina, fluido espinal y similares; tejido biológico tal como pelo, piel, secciones o tejidos extirpados de órganos u otras partes del cuerpo y así sucesivamente. Otras muestras incluyen cultivos de células y similares, plantas, comida, muestras forenses, tales como papel, tejido y raspaduras, agua, aguas residuales, medicinales, etc. Cuando es necesario, la muestra puede pretratarse con reactivos para licuar la muestra y liberar el analito de sustancias de unión.

"Par de unión específica", como se usa en este contexto, quiere decir una pareja de unión específica.

"Pareja de unión específica" o, en otras palabras, "elemento de un par de unión específica", como se usa en este contexto, quiere decir una o dos moléculas, normalmente diferentes moléculas, que tienen un área en la superficie o en una cavidad a la que se une específicamente y se define así como complementario con una organización espacial y polar particular de la otra molécula. "Molécula", como se usa en este contexto, puede querer decir también una molécula compleja tal como una enzima constituida de una apoenzima y una coenzima, una enzima o un receptor celular constituido de varias subunidades o una lipoproteína constituida de proteínas y lípidos. Parejas de unión específica ilustrativas incluyen moléculas sintéticas y que suceden naturalmente, por ejemplo, globulina de unión a tiroxina, proteínas de unión a esteroides, anticuerpos, fragmentos Fab u otros fragmentos de unión a antígenos de anticuerpos, enzimas, lectinas, ácidos nucléicos, represores, oligonucleótidos, proteína A, proteína G, avidina, estreptavidina, biotina, componente complementario C1q o proteínas de unión a ADN, proteínas de unión a ARN y similares. Las parejas de unión específica pueden ser elementos de un par inmunológico tales como antígeno-anticuerpo o hapteno-anticuerpo, o puede ser operador-represor, nucleasa-nucleótido, biotina-avidina, lectina-polisacárido, esteroide-proteína de unión a esteroide, fármaco-receptor de fármaco, hormona-receptor de hormona, enzima-sustrato, IgG-proteína A, oligo- o polinucleótido- oligo complementario o polinucleótido y similares.

"Grupos funcionales cargados opuestamente" quiere decir que un grupo de grupos funcionales están cargados positivamente y los otros negativamente. La carga puede depender de las condiciones de reacción seleccionadas, por ejemplo, por el pH o el medio de reacción. El medio de reacción es una disolución, normalmente una solución tampón, en la que se realiza la reacción de acoplamiento entre los grupos funcionales.

"Anticuerpo", como se usa en este contexto, quiere decir una inmunoglobulina que se une específicamente y se define así como complementaria con una organización espacial y polar particular de otra molécula, llamada normalmente un antígeno o un hapteno. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede prepararse por técnicas que son bien conocidas en la técnica tal como inmunización de un huésped y recogida de sueros (policlonal) o preparando líneas de células híbridas continuas y recogiendo la proteína secretada (monoclonal) o clonando y expresando secuencias de nucleótidos o versiones mutadas de las mismas que se codifican al menos por las secuencias de amino ácidos necesarias para una unión específica de anticuerpos naturales. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de la misma, cuya inmunoglobulina incluye varias clases de isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Fragmentos de los mismos pueden incluir Fab, Fv y F(ab')_{2}, Fab' y similares. Además, pueden usarse agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos pueden usarse donde sea apropiado tan largos como la afinidad de unión para que se mantenga una molécula particular.

Un método para la determinación cuantitativa y/o cualitativa de un analito'', como se usa en este contexto, quiere decir un ensayo para determinar la presencia o cantidad de un analito. Métodos cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos, así como otros métodos para determinar un analito se consideran que son métodos para medir la cantidad de un analito. Por ejemplo, un método que detecta sólo la presencia o ausencia de un analito en una muestra sospechosa de contener el analito se considera que está incluido dentro del alcance del presente invento. Se contemplan los términos "detectar" y "determinar" así como otros sinónimos comunes para medir, dentro del alcance del presente invento.

En los ensayos más comunes para la determinación cuantitativa y/o cualitativa de un analito, el analito se une por una pareja de unión específica, preferentemente por una pareja de unión específica asociada con un soporte sólido y/o un componente de un sistema que produce una señal, tales como un marcador o una molécula indicadora. Dicha pareja de unión específica puede unirse directamente, por ejemplo, covalentemente o por adsorción, o indirectamente al soporte sólido y/o al componente de un sistema que produce una señal. Una unión indirecta se refiere a la asociación espacial de dos parejas de unión específica que no son elementos de un par de unión específica a través de una serie de enlaces entre diferentes pares de unión. Un ejemplo de uniones indirectas es la unión indirecta de un anticuerpo biotinilado a un marcador sobre la unión de dicho anticuerpo biotinilado a la avidina acoplada al marcador. Un ejemplo adicional es la unión indirecta de IgM a un soporte sólido sobre la unión de IgM a anticuerpos anti-IgM acoplados al soporte sólido.

"Vehículo", como se usa en este contexto, quiere decir una fase sólida, típicamente un soporte o superficie, normalmente de un material insoluble en agua, orgánico o inorgánico, hinchable o no hinchable, poroso o no poroso, magnético o no magnético que puede tener cualquier forma, tales como una tira, una lámina, placa, pocillo, tubo, partícula o gota. La superficie puede ser hidrófila o capaz de volverse hidrófila. El soporte sólido incluye polvos inorgánicos tales como sílice, sulfato de magnesio y alúmina; materiales poliméricos naturales, particularmente materiales celulósicos y materiales obtenidos a partir de la celulosa, tal como papeles que contienen fibra, por ejemplo, papel de filtro, papel cromatográfico, etc; polímeros que suceden naturalmente sintéticos o modificados, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), polacrilamida, dextrano reticulado, agarosa, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, polietilentereftalato, nylon, polivinilbutirato, etc; tanto usados por ellos mismos o junto con otros materiales; también pueden emplearse vidrio disponible como Biovidrio, cerámicos, materiales magnéticos, metales y similares. Pueden también emplearse cadenas naturales o sintéticas tales como liposomas, vesículas fosfolípidas y células.

Se selecciona un vehículo preferido según el presente invento a partir del grupo que consiste en tubos, placas de microvaloración, pocillos, esferas, partículas magnéticas y no magnéticas, papeles de filtro y papeles cromatográficos. Los vehículos más preferidos según el presente invento son partículas magnéticas o no magnéticas.

Un vehículo según el presente invento puede asociarse con moléculas indicadoras tales como tintes, radiomarcadores, sensibilizadores, fluorescentes y/o quimiluminiscentes. La asociación de tal(es) sustancia(s) con partículas utilizadas en el presente invento, particularmente con partículas de látex, puede implicar la incorporación durante la formación de las partículas por polimerización, pero implicará normalmente la incorporación en partículas preformadas, normalmente por disolución no covalente en las partículas. Normalmente se empleará una disolución de la(s) sustancia(s). Los disolventes que pueden utilizarse incluyen alcoholes, tales como, por ejemplo, etanol, etilen glicol y alcohol bencílico; amidas tales como, por ejemplo, dimetil formamida, formamida, acetamida y tetrametil urea y similares; y éteres tales como, por ejemplo, carbitol, etil carbitol, dimetoxi etano y similares y agua. El uso de disolventes que tienen altos puntos de ebullición en los que las partículas son insolubles, permite el uso de temperaturas elevadas para facilitar la disolución de la(s) sustancia(s) en las partículas y son particularmente adecuados. Los disolventes pueden usarse individualmente o en combinación. Los disolventes preferidos son los que no interfieren con las propiedades que generan la señal de la(s) sustancia(s). Las sustancias pueden unirse también covalentemente o no covalentemente (por ejemplo, por adsorción) al vehículo.

Por medio de la ilustración y sin limitación, la preparación de partículas asociadas con un sensibilizador (clorofila) o con una composición quimiluminiscente/fluorescente (dioxeno, Eu(TTA)_{3}/TOPO) se describe en el documento de patente de EE.UU. 5.578.498, columnas 31 y 32.

El vehículo revestido según el presente invento tiene grupos funcionales en cadenas laterales tales como, por ejemplo, grupos maleimido, grupos carboxilo, aldehidos, cetonas, grupos amino, grupos sulfhidrilo, grupos ciano, grupos etileno, grupos hidroxilo, tioles, carboxamidas, carbamatos, ésteres de ácido carboxílico, ácidos sulfónicos, ésteres de ácido sulfónico, ácidos fosfóricos, ésteres de ácido fosfórico, ureas, fosforamidas, sulfonamidas, éteres, sulfuros, tioéteres, olefinas, acetilenos, aminas, nitrilos, haluros y similares. Estos grupos funcionales en cadenas laterales pueden usarse para unir parejas de unión específica al revestimiento superficial del vehículo. Las parejas de unión específica pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, receptores, oligonuleótidos, proteínas de unión a nucleótidos, lectinas, haptenos, antígenos, proteínas de unión a inmunoglobulina, avidina, estreptavidina, biotina u otras moléculas biológicas.

"Partícula" como se usa en este contexto, quiere decir partículas de al menos 20 nm y no más de alrededor de 20 \mum, normalmente al menos alrededor de 40 nm y menor que 10 \mum, normalmente 0,1 a 10 \mum, preferentemente, 0,1 a 5 \mum, lo más preferentemente 0,15 a 3 \mum. "Partícula", como se usa en este contexto, abarca esferas, esferoides, gotas y también otras formas. La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable y no hinchable, porosa o no porosa, que tiene cualquier densidad, pero preferentemente de una densidad que se aproxima al agua, generalmente de alrededor de 0,7 a alrededor de 1,5 g/ml, preferentemente suspendible en agua, y compuesta de un material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partículas pueden ser partículas de núcleo y envolvente, tal como partículas con un núcleo magnético y un revestimiento envolvente duro de monómero(s) polimerizado(s). Las partículas están preferentemente cargadas negativamente. Las partículas son preferentemente sólidas, por ejemplo, partículas poliméricas, soles de metales (partículas constituidas de un metal pesado tales como, por ejemplo, oro o plata), partículas de vidrio, partículas de silicio, partículas magnéticas, cristales de tinte. Lo más preferido son las partículas de látex. "Látex", como se usa en este contexto, quiere decir un material polimérico insoluble en agua y suspendible en agua en forma de partículas. El látex es frecuentemente un polietileno sustituido tales como: poliestireno-butadieno, poliacrilamida-poliestireno, poliestireno con grupos amino, poli (ácido acrílico), poli (ácido metacrílico), acrilonitrilo-butadieno, copolímeros de estireno, poli (acetato de vinilo)-acrilato, poli (vinil pirridina), copolímeros de cloruro de vinilo - acrilato y similares. Se prefieren polímeros no reticulados de estireno y estireno carboxilado o estireno funcionalizado con otros grupos activos tales como amino, hidroxilo, halo y similares. Frecuentemente, se usarán copolímeros de estirenos sustituidos con dienos como butadieno.

"Sistemas que producen una señal", como se usa en este contexto, quiere decir uno o más componentes, siendo al menos un componente un marcador detectable, que genera una señal detectable que relaciona la cantidad de marcador unido y/o no unido, es decir, la cantidad de marcador unido o no unido al compuesto que se está detectando. El marcador es cualquier molécula que produce o puede inducir a producir un señal, y puede ser, por ejemplo, un compuesto fluorescente (fluorescente), un radiomarcador, una enzima, un compuesto quimiluminiscente (quimiluminiscente) o un sensibilizador. Esta molécula puede referirse como una "molécula indicadora". Así, la señal se detecta y/o se mide detectando la actividad de la enzima, luminiscencia, absorbancia de luz, dispersión de luz o radioactividad como puede ser el caso.

Los marcadores adecuados incluyen, por medio de la ilustración y sin limitación, enzimas tales como fosfatasa alcalina, de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y peroxidasa de rábano picante; tintes; fluorescentes; tales como fluoresceína, compuestos de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehido, quelatos de tierras raras fluorescentes y fluorescamina; quimiluminiscentes tales como isoluminol y compuestos de acridinio; sensibilizadores, tales como eosina, 9,10-dibromoantraceno, azul de metileno, hematoporfirina, ftalocianinas, clorofila, rosa bengal; coenzimas; sustratos de enzimas; radiomarcadores tales como ^{125}I, ^{131}I, ^{14}C, ^{3}H, ^{57}Co y ^{75}Se; partículas, tales como partículas de látex que pueden marcarse adicionalmente con una molécula indicadora o un grupo de moléculas tales como un tinte, un sensibilizador, fluorescente, quimiluminiscentes u otra molécula o grupo de moléculas detectables; sol de metal; cristales; liposomas y células, que pueden marcarse adicionalmente, etc.

Hay varios métodos por los que el marcador puede producir una señal detectable por medios externos, deseablemente por examen visual, por ejemplo, por radiación electromagnética, calor y reactivos químicos. El marcador u otros elementos del sistema que producen una señal pueden unirse también a una pareja de unión específica, a otra molécula o a un soporte sólido.

Los marcadores incluyen grupos detectables por medio de radiación electromagnética o por detección electroquímica que incluyen tintes, fluorescentes, quimiluminiscentes e isótopos radioactivos.

El marcador puede producir directamente una señal y, por lo tanto, no se requieren componentes adicionales para producir una señal. Varias moléculas orgánicas, por ejemplo, fluorescentes, son capaces de absorber luz ultravioleta y visible, en las que la absorción de luz transfiere energía a estas moléculas y las eleva a un estado de energía excitado. La energía absorbida se disipa después por emisión de luz a una segunda longitud de onda. Otros marcadores pueden producir directamente una señal que incluye isótopos radioactivos y tintes.

Alternativamente, el marcador puede necesitar otros componentes para producir una señal, y el sistema que produce una señal incluiría después todos los componentes necesarios para producir una señal medible, que puede incluir sustratos, coenzimas, quenchers, potenciadores, enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos enzimáticos, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, recuperadores, iones metálicos y una sustancia de unión específica necesaria para unir sustancias que generan una señal.

El marcador y/u otros elementos del sistema que produce una señal pueden unirse a una pareja de unión específica o a un vehículo según el presente invento. El marcador puede unirse covalentemente a una pareja de unión específica tales como, por ejemplo, un anticuerpo, biotina, avidina, un analito equivalente, un oligonucleótido o un hapteno. La unión del marcador a la pareja de unión específica puede realizarse por reacciones químicas que dan como resultado sustituir un átomo de hidrógeno del marcador con un enlace a la pareja de unión específica o puede incluir un grupo de unión entre el marcador y la pareja de unión específica. Otros elementos del sistema que produce una señal puede unirse covalentemente también a las parejas de unión específica. Por ejemplo, dos elementos del sistema que producen una señal tales como un fluorescente y un quencher pueden cada uno unirse a un anticuerpo diferente que forma un complejo específico con el analito. La formación del complejo lleva al fluorescente y al quencher a una proximidad cercana, permitiendo así interactuar al quencher con el fluorescente para producir una señal.

"Grupo de unión", como se usa en este contexto, quiere decir el enlace covalente entre moléculas. El grupo de unión variará dependiendo de la naturaleza de las moléculas a enlazarse. Se emplearán grupos funcionales, tales como grupos tiol, grupos amino, grupos carboxilo, grupos hidroxilo, grupos fosfato o grupos sulfo, que están presentes normalmente o se introducen en la molécula a enlazarse para la unión. Por ejemplo, dos moléculas funcionalizadas con un grupo tiol pueden conjugarse enlazando los tioles con un reactivo homobifuncional, tales como un compuesto de bis-maleimida o biyhalocetilo. Dos moléculas funcionalizadas con grupos amina pueden conjugarse usando reactivos homofuncionales tales como glutaraldehido o ésteres de disuccinimidilo. Puede conseguirse a menudo un control mejor del procedimiento de conjugación utilizando un reactivo heterobifuncional. Por ejemplo, una molécula funcionalizada con grupos tiol puede conjugarse a una molécula funcionalizada con grupos amina por medio de un reactivo heterobifuncional que posee tanto funciones maleimida como éster de succinimidilo. Ejemplos de enlazadores heterobifuncionales incluyen 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), 4-(yodoacetil)aminobenzoato de succinimidilo (SIAB) y 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo.

"Química de conjugación de la carbodiimida", como se usa en este contexto, quiere decir que pueden sintetizarse conjugados químicos a través de grupos -COOH y -NH_{2} disponibles para formar un enlace amida. Esto es ideal para preparar conjugados de anticuerpos o antígenos. Una primera etapa en esta síntesis es la conversión de grupos carboxilo en una de las moléculas a ser conjugadas para llamarlas así ésteres activos. Los ésteres activos pueden reaccionar después espontáneamente con otros grupos funcionales, típicamente aminas, en la otra molécula a ser conjugada. Las carboimidas más comunes, tales como 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]-carbodiimida (EDC o EDAC) o 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)-carbodiimida (CMC), se usan para convertir grupos carboxilo en ésteres activos.

"Ensayo" quiere decir determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra sospechosa de contener un analito, que se combina en un medio de ensayo con reactivos para realizar el ensayo. Tales reactivos pueden incluir parejas de unión específica para el analito, analitos equivalentes, superficies sólidas a las que se unen uno de los reactivos anteriores, parejas de unión específica para las parejas de unión específica para el analito. Pueden marcarse uno o más de los reactivos. Los reactivos se eligen tal que se obtiene una señal en relación a la presencia o cantidad de analito en la muestra. El ensayo puede realizarse tanto sin separación (homogénea) como sin separación (heterogénea) de cualquiera de los compuestos o productos de ensayo.

Los ensayos homogéneos se ejemplifican por los productos de ensayo EMIT® (Syva Company, San Jose, CA); ensayos nefelométricos y turbidimétricos, frecuentemente látex aumentado; ensayos de hibridación de ácido nucléico como se describe en el documento de patente EP-A2-0 070 685, ensayos como se resumen en Boguslaski & Li (1982), Applied Biochemistry and Biotechnology, 7:401-414 y ensayos como los que se describen en el documento de patente EP-A2-0 515 194, ejemplos 2 y 5.

En una aproximación de un ensayo heterogéneo, los componentes del ensayo comprenden normalmente (i) una muestra sospechosa de contener un analito que es una pareja de unión específica, (ii) una primera pareja de unión específica unida directamente o indirectamente, o a ser unida a un soporte sólido, que puede ser tanto un soporte sólido no dispersable como una partícula, (iii) y una segunda pareja de unión específica unida directamente o indirectamente, o a ser unida a un elemento de un sistema que produce una señal. La primera y/o la segunda pareja de unión específica puede ser un analito equivalente. Los componentes del ensayo y, si es necesario, otros reactivos tales como soluciones tampón, soluciones sustrato, etc., se combinan generalmente tanto simultáneamente como totalmente o parcialmente secuencialmente y se incuban bajo condiciones para permitir reacciones de unión entre los elementos del par de unión específica respectivos. El soporte sólido se separa después de la fase líquida y se lava a menudo para retirar reactivos no unidos. Después, el soporte sólido o la fase líquida se examinan por la presencia de dicho elemento de un sistema que produce una señal, que se relaciona con la presencia o cantidad de analito.

La separación puede conseguirse por cualquier medio, que incluye sin limitación, la separación de una fase líquida de un soporte sólido por filtración, microfiltración, doble precipitación de anticuerpos, centrifugación, cromatografía, electroforesis, separación magnética y separación de un soporte sólido (por ejemplo, una tira reactiva) de una muestra.

Se conocen diferentes formatos de ensayos homogéneos y heterogéneos. En un ensayo sandwich, el analito se encajona por al menos dos elementos del par de unión específica. En un ensayo competitivo, el analito compite normalmente con un analito equivalente a ser unido por una pareja de unión específica.

Por medio de la ilustración y sin limitación, tales formatos de ensayos en el campo de inmunoensayos pueden caracterizarse también por los complejos formados: (i) inmunoensayos sandwich por la formación de complejos "anticuerpo<>antígeno<>anticuerpo" o complejos "antígeno<>anticuerpo<>antígeno"; (ii) inmunoensayos indirectos por la formación de complejos "antígeno<>antígeno-anticuerpo específico (analito)<>anti-anticuerpo" y (iii) inmunoensayos competitivos por la formación de complejos "anticuerpo<>antígeno", complejos "anticuerpo<>hap- teno" o complejos "anticuerpo<>analito equivalente".

En un ensayo heterogéneo competitivo típico, un soporte sólido que tiene un antígeno-anticuerpo específico unido en el mismo, se pone en contacto con un medio que contiene la muestra y un analito equivalente conjugado a un marcador detectable tal como una enzima (el "conjugado"). El analito en la muestra compite con el conjugado para unirse al anticuerpo. Después de separar el soporte sólido y el medio, la actividad del marcador del soporte sólido o el medio, se determina por técnicas convencionales y se refiere a la cantidad de analito en la muestra. Alternativamente, el antígeno equivalente puede unirse al soporte sólido y se marca el antígeno-anticuerpo específico.

En un inmunoensayo sandwich homogéneo o heterogéneo típico, se forma un complejo sandwich en el medio de ensayo. El complejo comprende el analito, un primer anticuerpo (monoclonal o policlonal) que se une al analito y un segundo anticuerpo (monoclonal o policlonal) que se une al analito o a un complejo del analito y el primer anticuerpo. Posteriormente, se detecta el complejo sandwich y se relaciona con la cantidad de analito en la muestra. El complejo sandwich se detecta en virtud de la presencia en el complejo de un marcador en el se asocian con marcadores, tanto uno como ambos del primer anticuerpo y el segundo anticuerpo.

En un ensayo homogéneo sin ninguna etapa de separación, pero también en un ensayo heterogéneo, las partículas de látex pueden usarse como marcador(es) y se determinan los complejos de partículas, por ejemplo, por métodos nefelométricos o turbidimétricos. Los marcadores pueden ser también sustancias que se llevan a una distancia una de la otra, lo que permite o previene una interacción, en particular una transferencia de energía, entre las sustancias y se mide el alcance de la interacción. Tal transferencia de energía puede tener lugar por medio de moléculas de vida corta, por ejemplo, oxígeno singlete, radiación de onda corta, por ejemplo, radiación \beta radioactiva, y/o transferencia de energía según el mecanismo de Förster y no Förster. Además, la actividad de dichas sustancias puede aumentarse o inhibirse por otras sustancias que llevan a un cambio medible en la señal, por ejemplo, cambio en la intensidad o polarización de la luz emitida, inhibición o aumento de las actividades de las enzimas y/o cambio en el comportamiento fluorescente.

En caso de un ensayo sandwich heterogéneo, una primera pareja de unión específica se une a un soporte sólido y una segunda pareja de unión específica se une a un marcador. Después de una o más etapas de incubación, el soporte sólido se separa de la fase líquida y se determina cualquier complejo sandwich unido al soporte sólido. En una variación de dicho ensayo sandwich, la muestra en un medio adecuado se pone en contacto con la pareja de unión específica marcada y se incuba durante un periodo de tiempo. Después, se pone en contacto el medio con un soporte sólido al que se une la segunda pareja de unión específica. En otra variación de lo anterior, la muestra, la primera pareja de unión específica unida a un soporte sólido y la pareja de unión específica marcada se combinan en un medio y se incuban en una sola etapa de incubación.

Los ensayos sandwich encuentran uso para la mayor parte en la detección de analitos polivalentes; los ensayos preferidos para detectar analitos monovalentes son ensayos competitivos. El presente invento tiene aplicación para todos los ensayos anteriores.

"Total o parcialmente secuencialmente" quiere decir que si se combinan la muestra y los otros agentes utilizados en un ensayo distintos de concomitantemente (simultáneamente), o uno o más pueden combinarse con uno o más de los agentes restantes para formar una subcombinación. La subcombinación y los agentes restantes pueden combinarse después.

"Polisacárido" quiere decir un carbohidrato que contiene tres o más unidades monosacárido modificados o sin modificar, tales como, por ejemplo, dextrano, almidón, glicogeno, inulina, levan, mannan, agarosa, galactano, carboxidextrano o aminodextrano; los polisacáridos pueden hidrolizarse en unidades monosacárido más simples. Ejemplos de polisacáridos por medio de la ilustración y sin limitación son dextrano, almidón, glicogeno, poliribosa y similares.

"Dextrano" quiere decir un polisacárido que consiste en unidades de glucosa (98%) unidas a 1-carbono a 6-carbono lineales; una glucosa polimerizada.

La expresión "grupos funcionales" incluye ácidos carboxílicos, aldehídos, cetonas, grupos amino, grupos ciano, grupos etileno, grupos hidroxilo, tioles, carboxamidas, carbamatos, ésteres de ácido carboxílico, ácidos sulfónicos, ésteres de ácido sulfónico, ácidos fosfóricos, ésteres de ácido fosfórico, ureas, fosforamidas, sulfonamidas, éteres, sulfuros, tioéteres, olefinas, acetilenos, aminas, nitrilos, haluros y similares.

"Grupo funcional de amina reactiva" quiere decir una funcionalidad reactiva con una funcionalidad amina, normalmente en virtud de la nucleofilicidad o basicidad de la amina, tales como, por ejemplo, un aldehído, un ácido carboxílico \alpha-ceto, un grupo epoxilo y similares.

Normalmente, dos moléculas se "unen covalentemente" o "acoplan covalentemente", cuando los electrones se dividen por al menos un núcleo atómico de la primera molécula y un núcleo atómico de la segunda molécula.

Un "revestimiento" quiere decir al menos una capa de una envoltura sobre la superficie del vehículo. El revestimiento puede cubrir la superficie del vehículo completa o parcialmente; puede ser una capa monomolecular o multimolecular. Una capa sucesiva quiere decir que una capa se reviste en la parte superior de una capa precedente. Una capa sucesiva puede incluir la primera capa de revestimiento como el vehículo.

Se emplearán frecuentemente varios materiales auxiliares en el ensayo. Por ejemplo, estarán presentes normalmente soluciones tampón en el medio de ensayo, así como estabilizadores para el medio de ensayo y los componentes de ensayo Frecuentemente, además de estos aditivos, pueden incluirse proteínas, tal como albúminas; disolventes orgánicos tal como formamida; sales de amonio cuaternario; polianiones tal como sulfato de dextrano; tensioactivos, particularmente tensioactivos no iónicos; potenciadores de la unión, por ejemplo, polialquilen glicoles; o similares.

En las siguientes realizaciones específicas del invento se describen más detalles:

El presente invento se refiere a un vehículo que tiene un revestimiento superficial proporcionado con grupos funcionales en cadenas laterales. El revestimiento superficial comprende al menos dos capas de polisacárido. El polisacárido de la primera capa de revestimiento se acopla covalentemente al vehículo por reacción entre los grupos funcionales del vehículo y los grupos funcionales del polisacárido de la primera capa de revestimiento. Además, el polisacárido de la segunda capa de revestimiento se acopla covalentemente a la primera capa de revestimiento por reacción entre los grupos funcionales de la primera capa de revestimiento y los grupos funcionales del polisacárido de la segunda capa de revestimiento. Puede emplearse opcionalmente capas adicionales de polisacárido con grupos funcionales en cadenas laterales.

En el presente invento, el polisacárido de la primera capa de revestimiento se asocia espontáneamente con el polisacárido de la segunda capa de revestimiento y, opcionalmente, con el vehículo. La asociación espontánea entre las capas de polisacárido y entre el vehículo y la primera capa de polisacárido sucede cuando los grupos funcionales de una de las capas de polisacárido se atraen o reaccionan espontáneamente con los grupos funcionales del vehículo u otra capa. Ejemplos de asociación espontánea incluyen la atracción de una capa de polisacárido a otra capa de polisacárido (o al vehículo) porque los grupos funcionales de las capas (o la primera capa y el vehículo) están cargados opuestamente. Esto puede suceder cuando un polisacárido tiene grupos funcionales carboxilo y la otra capa es un aminodextrano. La asociación espontánea puede suceder también entre un vehículo carboxilado y un amino dextrano debido a la carga opuesta de los grupos funcionales.

Otro ejemplo de una asociación espontánea es la formación espontánea de una base Schiff, que sucede cuando los grupos aldehído en cadenas laterales de una capa de dextrano aldehído se asocia con los grupos amina de un aminodextrano. El enlace puede reducirse en el procedimiento de agente reductor suave tal como NaCNBH_{3} o similar. Incluso otro ejemplo es una asociación espontánea de un dextrano tiolado con un dextrano halogenado. La reacción de sustitución nucleofílica sucede espontánea y rápidamente bajo condiciones óptimas de pH (normalmente 8 o superior) a temperatura ambiente.

Otro ejemplo de una asociación espontánea es la sustitución nucleofílica que sucede entre grupos amino en cadenas laterales de una capa de amino dextrano y grupos carboxi de un carboxidextrano activado por carbodiimida. Para soportar esta reacción, la molécula que contiene -COOH formará un éster de acil amino con N-hidroxisuccinimida usando una carbodiimida. Esta molécula reaccionará con los grupos amino de un aminodextrano que produce una unión de amida estable.

La asociación espontánea de la primera capa con el vehículo o capas sucesivas de polisacárido una con la otra conduce a numerosas ventajas. Una ventaja es que el vehículo puede revestirse fácilmente con una primera capa de polisacárido. Como ejemplo, la reacción entre una partícula carboxilada y un amino dextrano requiere sólo el uso de la química de conjugación de la carbodiimida. No es necesario un grupo de unión, que reduzca las etapas de preparación así como que permita un control mayor de la reacción.

Del mismo modo, las ventajas de una asociación espontánea entre capas de polisacárido se ven cuando los polisacáridos tienen cargas opuestas, tales como un dextrano carboxilado y un amino dextrano, o cuando los grupos funcionales de las capas reaccionan espontáneamente. De nuevo, el acoplamiento de polisacáridos que se asocian espontáneamente permite una preparación sencilla sin la necesidad de un grupo de unión bifuncional tal como gluteraldehido. Esto permite un mejor control de la reacción mientras que se asegura un recubrimiento sustancialmente completo del polisacárido en un vehículo o en una capa de polisacárido precedente.

En una realización del presente invento, se proporciona un vehículo con grupos funcionales en cadenas laterales por un vehículo, tal como una partícula de poliestireno, con una superficie carboxilada (grupo funcional de amina reactiva). El revestimiento superficial comprende al menos dos capas de polisacárido. Un revestimiento tiene grupos funcionales de amina y el otro revestimiento tiene grupos funcionales de amina reactiva. El polisacárido de la primera capa de revestimiento se acopla covalentemente al vehículo por reacción entre los grupos funcionales de amina reactiva del vehículo (es decir, grupos carboxilo) y los grupos amina del polisacárido de la primera capa de revestimiento. El polisacárido de la segunda capa de revestimiento se acopla covalentemente a la primera capa de revestimiento por reacción entre los grupos funcionales de amina de la primera capa de revestimiento y los grupos funcionales de amina reactiva del polisacárido de la segunda capa de revestimiento. Igualmente preferido es un vehículo que tiene grupos funcionales amina y la primera capa de polisacárido tiene grupos funcionales de amina reactiva, la segunda capa de polisacáridos tiene grupos funcionales de amina reactiva y posteriores capas se alternan entre los dos polisacáridos.

Los grupos funcionales de amina reactiva en el vehículo serán accesibles para unir covalentemente los grupos amina del polisacárido de la primera capa de revestimiento al vehículo, o alternativamente, los grupos funcionales de amina en el vehículo serán accesibles para unir covalentemente los grupos de amina reactiva del polisacárido de la primera capa de revestimiento al vehículo.

Otra realización de este invento implica un vehículo en el que el polisacárido de la primera capa de revestimiento es un aminodextrano. Un aminodextrano es un polímero de glucosa obtenido con grupos amino que tienen un peso molecular de alrededor de 10.000 a alrededor de 2.000.000, preferentemente alrededor de 500.000. El aminodextrano puede prepararse a pequeña y gran escala según las instrucciones del documento de patente de EE.UU. 5.707.877, columnas 18-20 y del documento de patente de EE.UU. 5.639.620, columnas 21 y 22 o como se proporcionan en este contexto.

Incluso otra realización de este invento implica un vehículo en el que el polisacárido de la segunda capa de revestimiento es dextrano con grupos funcionales de amina reactiva seleccionado del grupo que consiste en aldehidos, grupos carboxilo o grupos epoxi que tienen un peso molecular similar al del amino dextrano.

Otra realización específica del presente invento es un vehículo en el que el polisacárido de la primera capa de revestimiento es un dextrano con grupos funcionales de amina reactiva y el polisacárido de la segunda capa de revestimiento es preferentemente un aminodextrano.

Se prefiere un método en el que se usa la química de conjugación de la carbodiimida para el acoplamiento del polisacárido de la primera capa de revestimiento a dicho vehículo. Se prefiere otro método en el que el acoplamiento del polisacárido de la segunda capa de revestimiento a la primera capa de revestimiento se hace en presencia de un agente reductor suave, tal como, por ejemplo, cianoborohidruro sódico. Alternativamente, puede usarse un método en el que se usa la química de conjugación de la carbodiimida para el acoplamiento del polisacárido de la segunda capa de revestimiento a la primera capa de revestimiento. Un método particularmente preferido para preparar un vehículo según el presente invento es un método en el que las parejas de unión específica se unen covalentemente al revestimiento superficial por reacción entre los grupos funcionales en cadenas laterales del revestimiento superficial por reacción entre los grupos funcionales en cadenas laterales del revestimiento superficial y los grupos funcionales de las parejas de unión específica.

El vehículo puede lavarse entre las etapas de reacción para retirar compuestos no unidos y/o para intercambiar el medio de reacción.

Para ilustrar este invento, y refiriéndose ahora a la Figura 1A, se describe el revestimiento de partículas de poliestireno carboxilado con un diámetro de alrededor de 2 nm. Brevemente, las partículas de carboxilato se revisten primero con moléculas de aminodextrano (AmDex) (que tienen múltiples grupos amino por molécula de AmDex) que usan la química de conjugación de la carbodiimida (EDAC). La presencia de cargas opuestas en la superficie de la esfera (-COO^{-}) y en el AmDex (-N^{+}H_{3}) se atraen la una a la otra y en la presencia de un relativamente gran exceso de AmDex, la superficie de la partícula se cubre rápida y eficazmente por moléculas de AmDex, incluso en ausencia de EDAC. De esta manera, el polisacárido se asocia espontáneamente con las partículas. Este fenómeno lleva a una concentración aumentada de grupos amino cerca de la superficie de las partículas de carboxilato y que a su vez mejora la eficacia del método de conjugación EDAC. También, la presencia de una capa de dextrano en la superficie de las partículas de carboxilato minimizará el problema de agregación de partículas, generalmente observado cuando se exponen las partículas de carboxilato al EDAC a un pH por debajo de 7,0. Añadiendo EDAC en este punto activa los grupos -COOH en la partícula, que se hacen reaccionar después con grupos -NH_{2} en el AmDex llevando a la formación de un enlace de amida químicamente estable. Sólo una fracción de los grupos amino de la molécula de AmDex se implican en la formación del enlace amida covalente y los grupos amino sobrantes están disponibles para reacciones con varios grupos reactivos (por ejemplo, grupos aldehído o grupos carboxilo). Tales partículas se refieren como esferas individuales de amino revestidas (C-esfera-AmDex). A diferencia de introducir grupos amino usando diaminas de pequeño peso molecular (etilen diamina, propilen diamina, etc) y EDAC, que usan AmDex elimina la necesidad de una monitorización cuidadosa del pH de la reacción, simplificando así el procedimiento significativamente.

La segunda capa de polisacárido puede introducirse haciendo reaccionar el reactivo de esfera-C-AmDex con un exceso relativamente grande de dextrano aldehído (DexAl) que tiene múltiples grupos aldehído por molécula de DexAl. Esta reacción espontánea es una forma de asociación espontánea de las capas de polisacárido. Una fracción de los grupos aldehído en una molécula de DexAl se hace reaccionar con grupos amino en el reactivo esfera-C-AmDex formando una base Shiff, que puede reducirse después con un agente reductor suave tal como cianoborohidruro (NaBH_{3}CN) para formar un enlace carbono químicamente estable-nitrógeno químicamente estable. Ya que la reducción de grupos aldehidos libres por NaBH_{3}CN es despreciable, las partículas revestidas resultantes tienen grupos aldehído reactivos en la superficie y pueden someterse a reacción con un grupo amino que contiene moléculas (tales como anticuerpos u otras proteínas o moléculas de AmDex adicionales). Deberá señalarse que hay múltiples grupos amino en la superficie del reactivo esferas-C-AmDex y múltiples grupos aldehido en la molécula de DexAl, que lo más probablemente, lleva a una reacción multipunto dentro de una molécula y a una reticulación al azar de estas dos capas de hidrogel, que da como resultado un "envolvente" y una estabilidad mejorada del revestimiento. Este reactivo se refiere en este contexto como partículas de aldehído doblemente revestidas (esfera-C-AmDex-DexAl).

La conjugación de una pareja de unión específica, tal como un anticuerpo (u otras moléculas que contienen grupos amino), al reactivo esfera-C-AmDex-DexAl puede realizarse por un método de aminación reductiva. El anticuerpo purificado en forma natural (no modificado) se incuba sólo con el reactivo esfera-C-AmDex-DexAl en presencia de NaBH_{3}CN durante un cierto periodo de tiempo, preferentemente a temperatura ambiente o a 37ºC. Los grupos aldehído libres sobrantes se tapan (pueden usarse varias moléculas para este objetivo, por ejemplo, carboximetil oxima o carboximetoxilamina, etc). Finalmente, las partículas se lavan varias veces con una solución tampón apropiada (por ejemplo, tampón Tris; pH 8,0). Después de resuspender los pelets por sonicación, las partículas se almacenan preferentemente en concentraciones de 1 mg/ml en una solución tampón apropiada.

El presente invento incluye vehículos con más de dos capas de revestimiento de hidrogeles (por ejemplo: esfera-ADx-DexAl-ADx; esfera-ADx-DexAl-ADx-DexAl; esfera-ADex-CEDex-ADx; esfera-ADex-CEDex-ADx-CEDex y así sucesivamente) en los que se crea una superficie con propiedades similares a la superficie doblemente revestida. Los preferidos son vehículos con 2 a 10 capas de revestimiento de polisacárido, particularmente preferidos son vehículos con 2 a 5 capas de revestimiento de polisacárido, los vehículos más preferidos son vehículos con 2 o 3 capas de revestimiento de polisacárido. Pueden prepararse por analogía con los métodos descritos anteriormente o los métodos descritos en detalle en los ejemplos.

Del mismo modo, en la Figura 1B, se muestra la síntesis de una partícula revestida con una capa de aminodextrano y una capa de carboxil etil dextrano.

Los vehículos según el presente invento pueden usarse para métodos in vitro y/o in vivo. Los vehículos son particularmente útiles en un método para la determinación cuantitativa y/o cualitativa de un analito. Los métodos preferidos para la determinación cuantitativa y/o cualitativa de un analito según el presente invento son ensayos homogéneos o heterogéneos, en los que una o más parejas de unión específica pueden unirse a un vehículo según el invento. Los ensayos pueden ser ensayos sandwich, ensayos competitivos o ensayos indirectos. El vehículo puede tener la función de un soporte sólido y/o un marcador. En los ensayos en los que se usan partículas, todas las partículas o sólo parte de las partículas pueden ser un vehículo según el presente invento.

Un método preferido para la determinación cuantitativa y/o cualitativa de un analito según el presente invento es un ensayo en el que las sustancias se llevan a una distancia la una de la otra que permita o prevenga una interacción, en particular una transferencia de energía, entre las sustancias y se mide el alcance de la interacción. Dichas sustancias y/o una o más parejas de unión específica pueden asociarse con un vehículo según el presente invento. El término "sustancias" se entiende como elementos de clases de sustancias químicas y/o biológicas que, cuando están en una proximidad espacial, pueden entrar en interacción con la otra, por ejemplo, en la forma de donantes de energía y receptores de energía, tales como, por ejemplo, fotosensibilizadores y quimiluminiscentes (documento de patente EP-A2-0 515 194; Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry 42: 1518-1526), fotosensibilizadores y fluoróforos (documento de patente WO 95/06877; Bystrak et al. (1995) Anal. Biochem. 225: 127-134) o yodo^{125} radioactivo y fluoróforos (Udenfriend et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672-8676), o fluoróforos y fluoróforos (Mathis, G. (1993) Clin. Chem. 39: 1953-1959) o fluoróforos y quenchers fluorescentes (documento de patente de EE.UU. 3.996.345).

Se entiende una interacción entre las sustancias, en particular, como una transferencia de energía - que es la transferencia directa de energía entre las sustancias, por ejemplo, por medio de luz o radiación de electrones así como por medio de moléculas químicas reactivas. Mientras que la transferencia de energía puede tener lugar de una sustancia a otra sustancia, también es posible para la transferencia de energía llevarla a cabo a través de una cascada de diferentes sustancias.

Además, la frase "interacción entre las sustancias" abarca también procedimientos en los que la actividad de una sustancia se inhibe o aumenta por una o más sustancias diferentes, por ejemplo inhibición o aumento en la actividad de la enzima, o la inhibición de, el aumento en o cambio de (por ejemplo, desplazamiento de la longitud de onda, polarización) la luz que se emite por la sustancia afectada.

La frase "interacción entre las sustancias" se entiende también como cascadas de enzimas. En este caso, las sustancias son enzimas, al menos una de las cuales suministra el sustrato para otra enzima, en la que, como consecuencia, por ejemplo, de la formación de complejos "analito-pareja de unión específica" o "analito equivalente-pareja de unión específica", las enzimas se llevan a unas distancia la una de la otra tal que la velocidad de reacción de la conversión del sustrato acoplado alcanza un máximo o un mínimo.

Una interacción eficaz entre las sustancias normalmente tiene lugar cuando estas sustancias están adyacentes espacialmente, es decir, por ejemplo, dentro de una distancia en el intervalo de pocos \mum, en particular dentro de una distancia en el intervalo menor que 600 nm, preferentemente menor que 400 nm y muy particularmente preferentemente menor que 200 nm.

En una realización preferida de un método según el presente invento, la interacción entre las sustancias se lleva a cabo como una transferencia de energía, por ejemplo por medio de (i) moléculas de vida corta, por ejemplo, oxígeno singlete (documento de patente EP-A2-0 515 194; Ullman et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 5426-5430; Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry 42: 1518-1526; documento de patente WO 95/06877; Bystrak et al. (1995) Anal. Biochem. 225: 127-134); (ii) radiación de onda corta, por ejemplo, radiación \beta radioactiva (Hart & Greenwald (1979) Molecular Immunology 16: 265-267; Udenfriend et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672-8676); (iii) y/o transferencia de energía según Förster (Mathis, G. (1993) Clin. Chem. 39: 1953-1959; documento de patente de EE.UU. 5.527.684).

En otra realización preferida de un método según el presente invento, se aumenta o inhibe la actividad de las sustancias por otras sustancias y esto lleva a un cambio medible en la señal, por ejemplo un cambio en la intensidad o polarización de la luz emitida, inhibición de o aumento en las actividades de la enzima y/o cambio en el comportamiento fluorescente.

Se distinguen realizaciones particularmente ventajosas de un método según el presente invento por el hecho que una o más de dichas sustancias pueden unirse covalentemente, por medio de una interacción específica a través de parejas de unión específica y/o adsortivamente a un vehículo según el presente invento, preferentemente partículas, y/o se incorporan en dicho vehículo o ellas mismas constituyen un vehículo o una parte del mismo. En el caso de un enlace covalente, las sustancias se unen por medio de un enlace químico al vehículo y/o a cualquier posible envolventes o capas que revisten al vehículo.

Un método particularmente preferido es el uso de los vehículos del presente invento en un Inmunoensayo de canalización de oxígeno luminiscente (LOCI^{TM}) como se ha descrito en el documento de patente EP-A2 0 515 194. En este método para la determinación cualitativa o cuantitativa de un analito, al menos una pareja de unión específica se une a un vehículo según el presente invento, comprendiendo las etapas de: tratar un medio sospechoso de contener un analito bajo condiciones tal que dicho analito afecta a la cantidad de un sensibilizador capaz en su estado excitado de generar oxígeno singlete y un compuesto quimiluminiscente que puede llegar a una proximidad cercana tal que el oxígeno singlete generado por dicho fotosensibilizador puede activar dicho compuesto quimiluminiscente, que posteriormente produce luz y midiendo dicha luz, la cantidad de la misma está relacionada con la cantidad de analito en dicho medio.

Otro ejemplo del método LOCI^{TM}, en el que se usa un vehículo según el presente invento, es un método para la determinación cualitativa o cuantitativa de un analito que comprende las etapas de: (A) combinar tanto simultáneamente como totalmente o parcialmente sucesivamente (i) un medio sospechoso de contener el analito; (ii) una primera pareja de unión específica asociada con un sensibilizador capaz en su estado excitado de generar oxígeno singlete y (iii) una segunda pareja de unión específica asociada con una composición que comprende un compuesto quimiluminiscente, que es una sustancia que sufre una reacción química con el oxígeno singlete para formar especies intermedias metaestables que pueden descomponerse con la simultánea o posterior emisión de luz; (B) permitir la formación de complejos que comprenden la primera y segunda pareja de unión específica, la formación de dicho complejo lleva a dicho sensibilizador a una proximidad cercana a dicho compuesto quimiluminiscente, (C) activar el sensibilizador para generar oxígeno singlete y medir la cantidad de luz emitida por el compuesto quimiluminiscente, dicha luz es directa o inversamente proporcional a la cantidad de analito en el medio. La composición que comprende el compuesto quimiluminiscente puede comprender también una o más moléculas fluorescentes que se excitan por el compuesto quimiluminiscente activado. La luz emitida por dichas moléculas fluorescentes puede medirse para determinar la cantidad de analito en el medio.

Se describen detalles adicionales relativos a ensayos preferidos que usan los vehículos según el presente invento en el documento de patente EP-A2-0 515 194, particularmente en los ejemplos 1-8.

Otro uso in vitro de los vehículos según el presente invento es capturar o seleccionar una especie de una muestra. Por ejemplo, pueden retirarse fácilmente células cancerosas de una muestra uniendo las células cancerosas a anticuerpos sujetos a partículas magnéticas preparadas según el presente invento y realizando después una etapa de separación magnética. Del mismo modo, las enzimas pueden unirse a un vehículo según el presente invento que les permite retirarlas fácilmente de la mezcla de reacción o usarse en un procedimiento de caudal continuo. Otra aplicación in vitro para vehículos según el presente invento es usar anticuerpos, lectinas, oligonucleótidos u otras parejas de unión específica unidos a tal vehículo para compuestos de afinidad-purificación que se unen específicamente por dicha pareja de unión específica.

Puede aplicarse también un vehículo según el presente invento in vivo a un animal o un humano, particularmente si se aplica en un medio farmacéuticamente aceptable. Está bien establecido (por ejemplo, en los documentos de patente WO 96/04017, WO 96/27394 y EP-A1-0 525 199) usar partículas magnéticas y no magnéticas para objetivos de imagen, por ejemplo, para detectar "sitios de enfermedades" in vivo tales como tumores, coágulos de sangre o sitios de inflamación o para medir el flujo sanguíneo en un órgano o la actividad del metabolismo de un órgano. Las partículas preparadas según el presente invento son ventajosas debido a su revestimiento hidrófilo que previene la agrupación no específica de las partículas aplicadas o formación de coágulos de sangre. Las mismas ventajas se aplican para vehículos según el presente invento que pueden usarse también para métodos terapéuticos, por ejemplo, como vehículos de fármacos tóxicos, por ejemplo, para destruir células tumorales; como sistemas de liberación de fármacos implantados, tal como una bomba de insulina; o como endoprótesis para prevenir la estenosis de un vaso sanguíneo.

Ejemplos Abreviaciones usadas

Ab

Anticuerpo

Acc

Esfera aceptora en un ensayo LOCI^{TM}

AmDex (AmDx)

Aminodextrano

Biotin-X-NHS

sulfosuccinimidil-6-(biotinamido)-hexanoato

BSA

albúmina de suero bovino

B-IgG

inmuglobulina G bovina

CEDex

Carboxiletildextrano

CHO

grupo aldehido

Esfera-C

esfera quimiluminiscente

DC

esferas doblemente revestidas

DexAl

Dextrano aldehído

Dig

Digoxina

DMSO

dimetil sulfóxido

EDC o EDAC

1-etil-3-(dimetilpropil) carbodiimida

EDTA

ácido tetraacético de etilendiamina

MES

ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico

NaCl

cloruro sódico

NHS

N-hidroxisuccinimida

PBS

solución salina fosfatada NaPi 0,02 M, NaCl 0,14 M/pH 7,2

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Pi

fosfato

PSA

antígeno específico de la próstata

S (esfera-S)

esfera sensibilizadora para un ensayo LOCI^{TM}

SC

revestido individual

Esferas Sens-Sav

esferas sensibilizadoras revestidas con estreptavidina

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Esferas-TAR

Esferas-(Tioxeno, antraceno, rubeno)

TRIS-HCL

tris-(hidroximetil)-aminometano-ácido clorhídrico

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Los siguientes ejemplos se dan para ilustrar la utilidad del invento reivindicado y no se toman como limitantes del invento. En particular, se describen la preparación de reactivos para el método LOCI^{TM} y ensayos que usan el método LOCI^{TM}.

A. Preparación de aminodextrano (AmDex)

Se conocen muchos métodos de preparación de amino dextrano en la técnica. Además, se proporcionan en este contexto dos métodos preferidos.

Método 1: Se preparó hidroxipropilaminodextrano (1NH_{2}/7 glucosa) disolviendo Dextrano T-500 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) (50 g) en 150 ml de H_{2}O en un matraz de fondo redondo de 3 bocas equipado con agitador mecánico y embudo de goteo. A la disolución anterior se añadieron 18,8 g de Zn(BF_{4})_{2} y se llevó la temperatura a 87ºC con un baño de agua caliente. Se añadió epiclorhidrina (350 ml) gota a gota con agitación durante alrededor de 30 min mientras que la temperatura se mantuvo a 87-88ºC. La mezcla se agitó durante 4 h mientras que la temperatura se mantuvo entre 80ºC y 95ºC, después se enfrió la mezcla a temperatura ambiente. El producto clorodextrano se precipitó vertiéndolo lentamente en 3 l de metanol con agitación enérgica, se recuperó por filtración y se secó durante la noche en una estufa de vacío.

El producto clorodextrano se disolvió en 200 ml de agua y se añadió a 2 l de amoniaco acuoso concentrado (36%). Esta disolución se agitó durante 4 días a temperatura ambiente, después se concentró a alrededor de 190 ml en un evaporador rotativo. El concentrado se dividió en dos composiciones iguales, y cada composición se precipitó vertiéndola lentamente en 2 l de metanol agitando rápidamente. El producto final se recuperó por filtración y se secó a vacío.

Método 2: Se preparó hidroxipropilaminodextrano disolviendo 100 g de Dextrano T-500 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) en 500 ml de agua en un matraz de fondo redondo de 3 bocas con agitador mecánico y embudo de goteo. A la disolución se añadieron 45 g de hidróxido sódico, 50 mg de EDTA, 50 mg de NaBH_{4}, 50 mg de hidroquinona y 200 g de N-(2,3-epoxipropil) ftalimida. La mezcla se calentó y agitó en un baño de agua a 90ºC durante dos horas. Una pequeña alicuota se precipitó tres veces a partir de metanol y se analizó por RMN - la aparición de un pico a 7,3-7,6 indicó la incorporación de ftalimida. La mezcla de la reacción principal se precipitó por adición a 3,5 l de metanol y se recogió el sólido. El grupo que protege la ftalimida se retiró disolviendo el producto anteriormente mencionado en 500 ml de tampón de acetato 0,1 M, añadiendo 50 ml de hidrazina al 35% y ajustando el pH a 3,5. La mezcla se calentó a 80ºC durante 1 hora, el pH se reajustó a 3,2 y la mezcla se calentó durante media hora adicional. Una alicuota se precipitó tres veces en metanol. La RMN mostró que el grupo ftalimida ya no estaba presente. La mezcla de reacción se neutralizó a pH 8 y se almacenó a temperatura ambiente.

El producto se purificó por filtración de flujo tangencial usando un filtro de corte de 50.000 de peso molecular, lavándolo con agua, HCl 0,01 M, NaOH 0,01 M y finalmente agua. La disolución del producto se concentró por filtración a 700 ml y después se liofilizó. La determinación de aminas reactivas usando trinitrobencenosulfonato dio alrededor de 1 resto de amina por 16 de glucosa.

B. Preparación de Dextrano Aldehído

Se disolvió dextrano (400 g, 500 kD) en 1,5 l de agua (Millipore), en una probeta de 4 l calentando a 70ºC con agitación de cabeza. El dextrano se añadió al agua a 70ºC en porciones de 30-50 g, añadiéndose cada porción después de que se había disuelto la primera porción. El agitador de cabeza se seleccionó a 300-400 rpm.

La disolución de dextrano caliente se filtró a través de un embudo filtrante (grueso) en un matraz erlenmeyer y la disolución filtrada se vertió en un matraz de 3 bocas preequilibrado a 70ºC. La probeta se aclaró con 50 ml de agua caliente, que se filtró a través del embudo filtrante en el erlenmeyer. Este filtrado se añadió a la mezcla de reacción.

El embudo se retiró de la boca lateral del matraz y se introdujo en su lugar un adaptador de destilación Claisen de doble entrada. El agitador de cabeza se puso en marcha y se seleccionó a 600-700 rpm y la temperatura de la disolución de dextrano se dejó llegar a 70ºC. Se seleccionó la temperatura del baño de aceite a 72-75ºC. La reacción se efectuó bajo argón. La disolución de Zn(BF_{4})_{2}, (400 ml, 25% en peso en H_{2}O, pH 1,8\pm0,2) se vertió en el matraz que contiene la disolución de dextrano usando un embudo en el adaptador Claisen. Se retiró el embudo del adaptador Claisen y se sustituyó por un embudo adicional (500 ml de capacidad) con un brazo lateral que iguala la presión.

Se añadió alil glicidil éter (500 ml de 1,5 l a ser añadido) en el embudo adicional (en 3 porciones de 500 ml) a 8-10 ml/min, mientras que la temperatura de reacción se mantuvo a 70 \pm 2ºC. La adición de alil glicidil continuó hasta que se añadió todo el 1,5 l. Después, la temperatura de la mezcla de reacción se aumentó a 80ºC. Se dejó proceder la reacción durante 12-13 h a 80ºC bajo argón, mientras se está agitando continuamente (600-700 rpm).

El recipiente de reacción se retiró del baño de aceite y la mezcla de reacción se dejó enfriar a 30ºC. La mezcla de reacción enfriada se vertió después en 6,0 l de agua (cubo Nalgene con espita) y se agitó manualmente. La mezcla de reacción diluida se purificó por ultrafiltración usando un sistema de diafiltración de flujo tangencial Microgon. El aliloxi dextrano se concentró a 1,0-1,5 l.

Se retiró una alicuota (50 ml) del filtrado y se liofilizó para objetivos analíticos. La disolución sobrante de aliloxi dextrano en agua se almacenó a 4ºC y se usó para la siguiente etapa. El espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) de ^{1}H y ^{13}C del aliloxi dextrano mencionado anteriormente era consecuente con el producto esperado.

El aliloxi dextrano se sometió a ozonólisis en una probeta de 4,0 l equipada con un agitador de cabeza. La mezcla se agitó a 300-350 rpm y se dejó llegar a temperatura ambiente. El ozono se generó por un ozonador y se añadió por medio de un borboteador de gas sumergido en la disolución de aliloxi dextrano a una presión de 0,06 MPa y un caudal de 2,0 LPM (litros por minuto). Se añadieron diez ml de heptanol como antiespumante. La reacción se registró por ^{13}C-RMN; la desaparición de las resonancias olefínicas a 118 y 134 ppm se usó como una indicación para la terminación de la reacción. La adición de ozono continuó durante 5-6 h. La mezcla de reacción se enfrió a alrededor de 10ºC. A esto, se añadieron 50 ml de sulfuro de dimetilo y agitando bajo atmósfera de argón, continuó durante 10 h. La mezcla de reacción se dejó llegar a temperatura ambiente mientras se agitaba (300-350 rpm) durante este tiempo. El dextrano aldehído resultante se purificó por ultrafiltración Microgon.

C. Preparación de carboxietildextrano (CEDex)

Se disolvieron diez gramos de dextrano T-500 sin secar en 40 ml de agua. Se añadieron veinte ml de hidróxido sódico 10 N seguido por 5,3 g de acrilamida en 40 ml de agua. La mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta que fue homogénea y después se colocó en un baño de agua a 45 grados con agitación magnética. Después de 24 horas a 45 grados, se precipitó el producto por adición lenta a 3 volúmenes de etanol fuerte vigorosamente. Los líquidos de etanol se decantaron, el producto precipitado se disolvió en 100 ml de agua y se precipitó una segunda vez a partir de 3 volúmenes de etanol. Después de decantar el líquido, se disolvió el producto en agua y se ajustó el pH a 7,3 con ácido clorhídrico concentrado. El volumen se completó hasta 100 ml con agua y la disolución de almacenó en la nevera.

D. Preparación de tioxeno C-28

A una disolución de 4-bromoanilina (30 g, 174 mmol) en DMF seco (200 ml) se añadieron 1-bromotetradecano (89,3 ml, 366 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (62,2 ml, 357 mmol). La disolución de reacción se calentó a 90ºC durante 16 h bajo argón antes de ser enfriada a temperatura ambiente. A esta disolución de reacción se añadió de nuevo 1-bromotetradecano (45 ml, 184 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (31 ml, 178 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 90ºC durante otras 15 h. Después del enfriamiento, se concentró la disolución de reacción in vacuo y se diluyó el resto con CH_{2}Cl_{2} (400 ml). La disolución de CH_{2}Cl_{2} se lavó con NaOH acuosa 1 N (2x), H_{2}O y salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró in vacuo para producir un aceite marrón oscuro (alrededor de 110 g). La cromatografía en columna preparativa de gel de sílice por un sistema LC Prep Waters 500 que se eluye con hexano proporcionó un aceite amarillo que contenía principalmente el producto (4-bromo-N,N-di-(C_{14}H_{29})-anilina) junto con un componente minoritario 1-bromotetradecano. Se retiró el último compuesto de la mezcla por destilación a vacío (bp 105-110ºC, 0,6 mm) para dejar 50,2 g (51%) del producto como un aceite marrón. A una mezcla de virutas de magnesio (9,60 g, 395 mmol) en THF seco (30 ml) bajo argón se añadió gota a gota una disolución del producto anilina sustituida mencionada anteriormente (44,7 g, 79 mmol) en THF (250 ml). Se añadieron unos pocos cristales de yodo para iniciar la formación del reactivo Grignard. Cuando la mezcla de reacción empezó a calentarse y empezó a refluir, se reguló la velocidad de adición para mantener un reflujo suave. Después de que se completó la adición, la mezcla se calentó a reflujo durante una hora adicional. La disolución sobrenadante enfriada se transfirió a través de una cánula a un embudo de adición y se añadió gota a gota (durante 2,5 h) a una disolución de fenilglioxal (11,7 g, 87 mmol) en THF (300 ml) a -30ºC bajo argón. La mezcla de reacción se calentó gradualmente a 0ºC durante 1 hora y se agitó durante otros 30 min. La mezcla resultante se vertió en una mezcla de agua helada (800 ml) y acetato de etilo (250 ml). La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3X). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con H_{2}O (2X), salmuera y se secaron sobre MgSO_{4}. La evaporación del disolvente dió 48,8 g de producto crudo como un líquido aceitoso verde oscuro. La cromatografía de columna flash de este líquido (gradiente de elución con hexano, 1,5:98,5, 3:97, 5:95 acetato de etilo:hexano) proporcionó 24,7 g (50%) del producto benzoína (LSIMS (C_{42}N_{69}NO_{2}): [M-H]^{+} 618,6, ^{1}H RMN (250 MHz, CDCl_{3}) era consecuente con el producto benzoína esperado. A una disolución del producto benzoína anterior (24,7 g, 40 mmol) en tolueno seco (500 ml) se añadieron sucesivamente 2-mercaptoetanol (25 g, 320 mmol) y TMSCI (100 ml, 788 mmol). La disolución de reacción se calentó a reflujo durante 23 h bajo argón antes de ser enfriada a temperatura ambiente. A esto, se añadió TMSCI adicional (50 ml, 394 mmol) y la disolución de reacción se calentó a reflujo durante otras 3 h. La disolución resultante se enfrió y se hizo básica con NaOH acuoso 2,5 N frío y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3X). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaHCO_{3} acuoso saturado (2X) y salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró in vacuo para dar un líquido aceitoso marrón. La cromatografía de columna preparativa de gel de sílice usando un sistema LC Prep Waters 500 (gradiente de elución con hexano, 1:99, 2:98 acetato de etilo:hexano) proporcionó 15,5 g (60%) de tioxeno C-28 como un aceite amarillo anaranjado (LSIMS (C_{44}H_{71}NOS): [M-H]^{+} 661,6, ^{1}H RMN (250 MHz, CDCl_{3}) era consecuente con el producto tioxeno C-28 esperado 2-(4-(N,N-di-(C_{14}H_{29})-anilino)-3-fenil tioxeno.

E. Preparación de esferas quimiluminiscentes (esferas TAR)

Una disolución al 10% de esferas de látex carboxilado (Seradyn) (120 ml) se calentó a 93ºC en un matraz de fondo redondo de tres bocas y después se mezcló con 166 ml de etoxietanol, 336 ml de etilen glicol y 12 ml de NaOH 0,1 M. Se añadieron un agitador mecánico y un termómetro y la mezcla se llevó a 95ºC con agitación y después se agitó durante 40 min adicionales. En un matraz distinto, se mezclaron 2,45 g de tioxeno C-28, 191,8 mg de 2-cloro-9,10-bis(feniletinil) antraceno y 323,9 mg de rubreno en 264 ml de etoxietanol y la mezcla se calentó a 95ºC con agitación hasta que se disolvió. La solución teñida se vertió en una disolución de esferas y se agitó durante 20 min a 95ºC y después se dejó enfriar lentamente a alrededor de 47ºC y se filtró a través de un filtro de poliéster de 43 micrómetros. Las esferas se lavaron por filtración de flujo tangencial usando un aparato Microgon con un filtro de 0,05 micrómetros. Después de la preparación del sistema con disolvente de lavado (1:2 v/v etoxietanol:etilen glicol), se añadió la mezcla de esferas teñidas. La mezcla se concentró a alrededor de 20 mg/ml y se lavó después con 6 l de disolvente de lavado y 4,8 l de etanol en agua 10% v/v ajustado a pH 10 con NaOH. Las esferas se concentraron a alrededor de 50 mg/ml durante el lavado y después se almacenaron finalmente a 4ºC protegidas de la luz. La concentración final se determinó por peso después de evaporar una alicuota a sequedad.

F. Preparación de tetra-t-butil ftalocianina de silicio

Se añadió sodio elemental, recientemente cortado (5,0 g, 208 mmol) a 300 ml de metanol anhidro en un matraz de 3 bocas, de dos litros, equipado con un agitador magnético, condensador de reflujo, un tubo desecador y un borboteador de gas. Después de que el sodio se disolvió completamente, se añadió 4-t-butil-1,2-dicianobenceno (38,64 g, 210 mmol, de TCI Chemicals, Portland OR) usando un embudo. La mezcla se volvió clara y la temperatura aumentó a alrededor de 50ºC. En este punto, se introdujo una corriente continua de gas amoniaco anhidro a través del borboteador de vidrio en la mezcla de reacción durante 1 h. La mezcla de reacción se calentó después a reflujo durante 4 h mientras que la corriente de gas amoniaco continuó durante el curso de la reacción, empezó a precipitar como sólido. La suspensión resultante se evaporó a sequedad (vacío de laboratorio) y el resto se suspendió en agua (400 ml) y se filtró. El sólido se secó (60ºC, vacío de laboratorio, P_{2}O_{5}). El rendimiento del producto (1,3-diiminoisoindolina, 42,2 g) era casi cuantitativa. Este material se usó para la siguiente etapa sin purificación adicional. A un matraz de tres bocas, de un litro, equipado con un condensador y un tubo de secado se añadió el producto mencionado anteriormente (18 g, 89 mmol) y quinolina (200 ml, Aldrich Chemical Company, St. Louis MO). Se añadió tetracloruro de silicio (11 ml, 95 mmol, Aldrich Chemical Company) con una jeringa a la disolución agitada durante un periodo de 10 minutos. Después de que se completó la adición, la mezcla de reacción se calentó a 180-185ºC en un baño de aceite durante 1 h. La reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y se añadió cuidadosamente HCl concentrado para acidificar la mezcla de reacción (pH 5-6). La mezcla de reacción marrón oscura se enfrió y se filtró. El sólido se lavó con 100 ml de agua y se secó (vacío de laboratorio, 60ºC, P_{2}O_{5}). El material sólido se colocó en un matraz de fondo redondo, de 1 l, y se añadió ácido sulfúrico concentrado (500 ml) con agitación. La mezcla se agitó durante 4 h a 60ºC y después se diluyó cuidadosamente con hielo picado (2.000 g). La mezcla resultante se filtró y se lavó el sólido con 100 ml de agua y se secó. El sólido azul oscuro se transfirió a un matraz de fondo redondo, de 1 l, se añadió amoniaco concentrado (500 ml) y la mezcla se calentó y agitó a reflujo durante 2 h, se enfrió a temperatura ambiente y se filtró. El sólido se lavó con 50 ml de agua y se secó a vacío (vacío de laboratorio, 60ºC, P_{2}O_{5}) para dar 12 g de producto tetra-t-butil ftalocianina de silicio como un sólido azul oscuro. Se añadieron 3-picolina (12 g, de Aldrich Chemical Co.), tri-n-butil amina (anhidro, 40 ml) y tri-n-hexil clorosilano (11,5 g) a 12 g del producto mencionado anteriormente en un matraz de tres bocas, de un litro, equipado con un agitador magnético y un condensador de reflujo. La mezcla se calentó a reflujo durante 1,5 h y después se enfrió a temperatura ambiente. La picolina se destiló a alto vacío (bomba de aceite a alrededor de 1 mm de Hg) a sequedad. El resto se disolvió en CH_{2}Cl_{2} y se purificó usando una columna de gel de sílice (hexano) para dar 10 g de producto puro di-(tri-n-hexilsilil)-silicio tetra t-butil ftalocianina como un sólido azul oscuro. (LSIMS: [M-H]^{+} 1.364,2, espectro de absorción: metanol: 674 nm (\varepsilon 180.000): tolueno 678 nm, ^{1}H RMN (250 MHz, CDCl_{3}): \delta: -2,4(m, 12H), -1,3(m, 12H), 0,2-0,9 (m, 54H), 1,8(s, 36H), 8,3(d, 4H) y 9,6 (m, 8H) era consecuente con el producto esperado anteriormente.

G. Preparación de esferas sensibilizadoras tintadas con tetra-t-butil ftalocianina de silicio (Esferas-S)

Las esferas sensibilizadoras se prepararon poniendo 600 ml de esferas modificadas de carboxilato (Seradyn) en un matraz de fondo redondo, de tres bocas, equipado con un agitador mecánico, un tapón de vidrio con un termómetro sujeto a una de las bocas y un embudo en la boca opuesta. El matraz se había sumergido en un baño de aceite mantenido a 94\pm1ºC. Las esferas se añadieron al matraz a través del embudo en la boca y el recipiente de las esferas se aclaró con 830 ml de etoxietanol, 1.700 ml de etilen glicol y 60 ml de NaOH 0,1 N y el aclarado se añadió al matraz a través del embudo. El embudo se sustituyó por un tapón de caucho 24-40. Las esferas se agitaron a 765 rpm a una temperatura de 94\pm1ºC durante 40 min.

Se disolvió tetra-t-butilftalocianina de silicio (10,0 g) en 300 ml de alcohol bencílico a 60\pm5ºC y se añadieron 85 ml al matraz de fondo redondo mencionado anteriormente a través del tapón por medio de una jeringa calentado a 120\pm10ºC a una velocidad de 3 ml por minuto. La disolución de ftalocianina sobrante se añadió después como se ha descrito anteriormente. La jeringa y el matraz que contienen originalmente la ftalocianina se aclaró con 40 ml de alcohol bencílico y el aclarado se transfirió al matraz de fondo redondo. Después de 15 min, se añadieron gota a gota 900 ml de agua desionizada y 75 ml de NaOH 0,1 N durante 40 min. La temperatura del baño de aceite se dejó disminuir lentamente a 40\pm10ºC y la agitación se interrumpió después. Las esferas se filtraron después a través de un filtro de poliéster de 43 micrómetros y se sometieron a un aparato de filtración de flujo tangencial Microgon (Microgon Inc., Laguna Hills, CA) usando etanol:agua, 100:0 a 10:90 y después se filtraron a través de un filtro de poliéster de 43 micrómetros.

H. Preparación de esferas sensibilizadoras revestidas de hidroxipropilaminodextrano (Esfera-S-AmDex)

Se preparó una disolución de hidroxipropilaminodextrano a 2 mg/ml en MES 50 mM (pH 6). Se añadieron gota a gota ciento cincuenta (150) mg de esferas sensibilizadoras de ftalocianina en 7,5 ml de agua a 7,5 ml de una disolución de hidroxipropilaminodextrano mientras se agitaba. Se añadieron ciento ochenta y ocho (188) \mul de una disolución de EDAC (80 mg/ml) en agua a la mezcla del revestimiento mientras se agitaba. La mezcla se incubó durante toda la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. La mezcla se diluyó con 12 ml de agua y se centrifugó. El sobrenadante se tiró y el pelet de esferas se suspendió en 40 ml de agua por sonicación. Las esferas se lavaron 3 veces con agua (40 ml por lavado) por centrifugación repetida y suspensión por sonicación. El pelet final se suspendió en 5 ml de agua.

I. Preparación de esferas quimiluminiscentes revestidas de aminodextrano (esfera-C-AmDex)

Se preparó el reactivo esfera-C-AmDex mezclando 1 ml (22 mg/ml) de esferas de carboxilato quimiluminiscente (esfera-C-COOH) (Seradyn) con 1 ml de hidroxipropilaminodextrano A 20 mg/ml (MW 500K) en MES 0,05 M/pH 6,0 en presencia de EDAC 3,8 mg/ml. Después de incubar esta mezcla durante 16 horas a temperatura ambiente, en la oscuridad, las esferas se lavaron una vez con 2 ml de MES 0,05 M/pH 6,0, después con 6 ml de MES 0,05 M, NaCl 1,0 M/pH 6,0. Finalmente, las esferas se resuspendieron en 1 ml de MES 0,05 M/pH 6,0 para conseguir esfera-C-AmDex 22 mg/ml. El lavado se realizó por el método de centrifugación (usando una centrífuga Sorval RC-5B Plus o una centrífuga Ependorf 5415 C) y se resuspendieron los pelets por sonicación (usando un Sonificador Branson 450).

J. Revestimiento de esfera-C-AmDex con dextrano aldehído para conseguir esferas doblemente revestidas que contienen grupos de aldehido reactivo (Esfera-C-AmDex-DexAl)

Se preparó esfera-C-AmDex-DexAl mezclando 1 ml de DexAl 20 mg/ml (MW 500K, preparado en el laboratorio) y 1 ml de esfera-C-AmDex 22 mg/ml en MES 0,05 M/pH 6,0 en presencia de NaBH_{3}CN 2 mg/ml. Después de incubarlo a 37ºC durante 20 horas (en la oscuridad), las esferas se lavaron una vez con 4 ml y después con otros 5 ml de solución tampón de MES. Finalmente, las esferas se resuspendieron en 0,5 ml de MES 0,05 M, Tween-20 0,4%/pH 6,0 para conseguir una concentración de alrededor de 40 mg/ml de esfera-C-AmDex-DexAl.

K. Marcado del reactivo de esfera-C-AmDex-DexAl con anti-Digoxina o anti-TSH Abs

Se prepararon esferas marcadas de anticuerpos (esfera-C-AmDex-DexAl) mezclando volúmenes iguales de disoluciones de Ab (anti-Dig 0,15 mg/ml o anti-TSH 20 mg/ml en MES 0,05 M/pH 6,0) y esfera-C-AmDex-DexAl 40 mg/ml en MES 0,05 M, Tween-20 0,4%/pH 6,0 en presencia de NABH_{3}CN 0,5 mg/ml. Después de incubarlas a 37ºC (3 horas para esferas anti-Dig y 36 horas para esferas anti-TSH) los grupos aldehido sobrantes, se taparon con CMO 0,08 M (carboximetil oxima o carboximetoxilamina) durante 90 minutos a 37ºC. Finalmente, las esferas se lavaron 3-4 veces con una disolución tampón apropiada (esferas anti-Dig con BSA que contienen solución tampón Tris/pH 8,0 y las esferas anti-TSH con BSA y detergente zwittergent 3-14 que contiene solución tampón Tris/pH 8,0). Después de resuspender los pelets por sonicación, las esferas se almacenaron a concentraciones de 1 mg/ml.

L. Preparación de esferas TAR de carboxietildextrano (CEDex)

Las esferas de hidroxipropil aminodextrano preparadas como se ha descrito anteriormente se revistieron con carboxietildextrano en presencia de los reactivos de reticulación EDC y NHS. Se incubaron 100 mg de esferas en una solución tampón MES 50 mM, pH 5,0 - 9,0 (10 mg esferas/ml) con EDC (1 - 4 mg de una disolución de stock: 20 mg/ml en solución tampón MES 50 mM, preparada recientemente) y NHS (1,2-4,8 mg de una disolución de stock: 20 mg/ml en solución tampón MES 50 mM, preparada recientemente). Las esferas de aminodextrano revestidas individualmente se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con diferentes cantidades de CEDex. La relación esfera/CEDex varía de 1:1 a 200:1. La relación estándar preferida es 5:1, por ejemplo, 10 mg de esferas y 2 mg de CEDex. La reacción se realiza a temperatura ambiente en un mezclador de rodillos. Después de la reacción, las esferas se lavaron y retamponaron en una solución tampón MES 50 mM, pH 5,0 por centrifugación.

M. Acoplamiento de esferas de CEDex al anticuerpo anti-PSA

Las esferas doblemente revestidas generadas pueden usarse para acoplar anticuerpos, antígenos, péptidos y/o proteínas recombinadas. Como ejemplo, las esferas se revisten con anticuerpos anti-PSA para la determinación del antígeno específico de la próstata.

Varias cantidades de anticuerpo (250, 500 y 100 \mug/10 mg de esferas, anticuerpo 92-283/029 de Dade Behring Marburg GmbH) se han acoplado a 10 mg de Esferas-CEDex. El dato (no mostrado) indica que 250 \mug de Ab es suficiente para un ensayo PSA potente. Básicamente, la cantidad óptima tiene que evaluarse para cada ensayo.

Se mezclaron 467 \mul de una disolución de esferas DC-CEDex-COOH (conc. 21,4 mg/ml), 40 \mul de EDC (EDC 10 mg/ml en una solución tampón MES), 48 \mul de NHS (NHS 10 mg/ml en una disolución tampón MES) y 20 \mul de Tween 20 (Tween 20 al 10%, 20 amps) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de un tiempo de incubación de 15 minutos, se añadieron 325 \mul de solución tampón MES y 100 \mul de disolución de anticuerpos (250 \mug de anticuerpo en una solución tampón MES) y la mezcla se incubó durante 3 - 16 horas a temperatura ambiente en un mezclador de rodillos. Las esferas revestidas se purificaron por centrifugación (30 minutos de centrifugado a 16.000 rpm a 10ºC [rotor Beckmann 80Ti/botellas de centrífuga de 10 ml], se tira el sobrenadante, se añade 1 ml de solución tampón MES, se agita y sonifica (Sonifier 250 en una boquilla enfriada por agua, pulso 2x5, salida: 4, CC 50%), se añaden 2 ml de solución tampón MES, se centrifuga (ver arriba), se tira el sobrenadante y se añaden 0,95 ml de solución tampón (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,3, EDTA 25 mM, BSA 1 mg/ml, pH 8,0).

N. Preparación de anticuerpo anti-PSA biotinilado

Se mezclaron 572 \mul de anticuerpo anti-PSA (anticuerpo 4 mg/ml (92-284/03, Dade Behring Marburg GmbH) en NaHCO_{3} 0,1 M) con 7,3 \mul de Biotin-X-NHS de Pierce Chemical Co. (5 mg/ml en DMSO). Después de un tiempo de incubación de 2 horas, se purificaron las mezclas de reacción en una columna PD 10 con PBS.

Estas esferas quimiluminiscentes marcadas con anticuerpos anti-Dig, anti TSH y anti-PSA (preparadas por química de marcado de doble revestimiento) se ensayaron por sus comportamientos en ensayos LOCI^{TM}.

Las variaciones suero a suero (o efecto matriz) para estas esferas se ensayaron por el siguiente procedimiento: quimiesferas marcadas con anticuerpos anti-Dig y esferas sensibilizadoras marcadas con digoxina (o digoxigenina) se hicieron reaccionar juntas para formar los complejos esfera-C-Ab_{Dig}*Dig-esfera-S, después se generó la señal LOCI^{TM} por iluminación repetitiva de estos complejos de esferas y se contaron los fotones emitidos. Los resultados se presentan en la Figura-1 y Figura-3.

La Figura 2 muestra el curso típico para un ensayo de digoxina LOCI^{TM}. La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo TSH LOCI^{TM} que comparan esferas quimiluminiscentes doblemente revestidas según el presente invento (Acc-AmDex-DexAl-Ab) y esferas revestidas con un revestimiento individual de Dextrano Aldehído (Acc-AmDex-DexAl-Ab). El ensayo se inició mezclando 20 \mul de reactivo esfera-C Ab_{Dig} 0,5 mg/ml y 360 \mul de solución tampón LOCI^{TM} estándar. Después de incubar esta mezcla durante 108,5 segundos a 37ºC, se añadieron 40 \mul de reactivo esfera-S-Dig 0,1 mg/ml y 580 \mul de solución tampón LOCI^{TM} y la mezcla de ensayo se incubó adicionalmente durante 170 segundos a 37ºC. Finalmente, estos tubos se iluminaron durante 1 segundo con una fuente de luz de 680 nm y se contaron los fotones emitidos durante 1 segundo (después de cortar la luz de iluminación). Estos procedimientos de iluminación y conteo se repitieron 10 veces (10 ciclos).

Como puede verse en la Figura 3, la variación suero a suero era mejor (CV = 1,54%) usando las esferas preparadas por la química de doble revestimiento. La esfera de referencia era una quimiesfera marcada con anticuerpo anti-Dig, pero tenía una capa individual de dextrano y la variación suero a suero era significativamente mayor (CV = 3,32%).

La Figura 4 muestra una curva estándar típica para el ensayo LOCI^{TM} TSH. Las esferas quimiluminiscentes se marcaron con un anticuerpo a la cadena-\beta de la molécula de TSH (Ab_{2}) y el segundo anticuerpo (específico para la cadena-\beta de la molécula de TSH, pero diferente y un epitopo no competitivo usado para Ab_{2}) era biotinilado (Ab_{1}-biotina). El ensayo se realizó mezclando 50 \mul de una muestra de calibradores TSH con 25 \mul de esfera-C-Ab_{2} 50 \mug/ml y 25 \mul de reactivos Ab_{1}-biotina 6,4 \mug/ml en una solución tampón LOCI^{TM}. Esta mezcla de ensayo se incubó durante 7,3 minutos a 37ºC, después se añadieron 50 \mul de esfera-S-estreptavidina 0,4 mg/ml y 750 \mul de solución tampón y se continuó la incubación a 37ºC durante 7,1 minutos extra. Finalmente, estos tubos de ensayo se iluminaron durante 1 segundo con una fuente de luz de 680 nm y se contaron los fotones emitidos durante 1 segundo (después de cortar la luz de iluminación). Estos procedimientos de iluminación y conteo se repitieron 6 veces (6 ciclos).

La Figura 5 muestra los resultados de un experimento para investigar el efecto de una unión no específica a partículas LOCI^{TM} que produce el efecto matriz. Las muestras de suero de 20 pacientes hipofisectomizados (se presentaron concentraciones de TSH en estas muestras de suero por ser iguales o casi iguales a 0,0 \mulU/ml) se ensayaron en un ensayo LOCI^{TM} TSH usando un reactivo de esfera-C-Ab_{2} preparado por química de doble revestimiento. El protocolo del ensayo era el mismo como se ha descrito para la Figura 4. Estos resultados indicaron que el efecto matriz se eliminó en gran parte debido al doble revestimiento de las quimiesferas de LOCI^{TM}.

Para la preparación de una quimiesfera marcada con anti-TSH (esfera-C-Ab_{2}) por el método de doble revestimiento, se investigó el efecto de la concentración de Ab en la mezcla de la reacción de marcado. Como se muestra en la Figura 6, los resultados mostraron que una concentración de Ab más alta durante el marcado dió como resultado un reactivo de quimiesfera-Ab con mejor comportamiento en el ensayo TSH LOCI^{TM}. Este ensayo TSH LOCI^{TM} se realizó por el siguiente procedimiento: se hicieron reaccionar 50 \mul de calibradores TSH (TSH 0,0 o 1,0 \mulU/ml) en suero de caballo con 25 \mul de R1 (quimiesfera marcada con concentraciones variables de anti-TSH Ab_{2}) y 25 \mul de R2 (anti-TSH Ab_{1} biotinilado) durante alrededor de 7,3 minutos a 37ºC, después por reacción con 800 \mul de R3 (esferas sensibilizadoras marcadas con estreptavidina) durante otros 7,1 minutos a 37ºC y finalmente se leyó la señal LOCI^{TM}.

Se realizó un ensayo PSA (Antígeno Específico de la Próstata) para ensayar las esferas revestidas con carboxi etil dextrano. Se incubaron 40 \mul de solución tampón (Tris/HCl 0,1 M pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 25 mM, BSA al 0,1%, Dextrano T-500 al 0,1%, Triton X-405 al 0,1%), 25 \mul de conjugado anti-PSA (anticuerpo 6,4 \mug/ml en Tris/HCl 0,1M pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 25 mM, BSA al 1,6%, Dextrano T-500 al 0,1%, Triton X-405 al 0,1%, B-IgG al 0,2%), 25 \mul de anti-PSA-esferas CEDex (50 \mug/ml en Tris/HCl 0,1 M pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 25 mM, BSA al 1,6%, Dextrano T-500 al 0,1%, Triton X-405 al 0,1%, B-IgG al 0,2%) y 10 \mul de una muestra de suero. Después de un tiempo de incubación de 4,5 minutos, se añadieron una solución tampón y 50 \mul de sensibilizador (400 \mug/ml en Tris/HCl 0,1 M pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 25 mM, BSA al 1,6%, Dextrano T-500 al 0,1% y Triton X-405 al 0,1%).

Resultados del ensayo PSA

1

Se habían ensayado 39 sueros de carcinomas de mama en el ensayo PSA con DC-esferas CEDex. Estas muestras de suero negativas PSA se usan como indicador para interferencias de la matriz que suceden potencialmente. Los resultados muestran que no hay interferencias de la matriz que perturben la determinación del PSA en las muestras de suero. El coeficiente de variación de estas 39 muestras de suero es un 5,1% con una desviación estándar de 142 conteos.

Claims (35)

1. Un vehículo revestido de polisacárido que comprende un vehículo que tiene un revestimiento de al menos dos capas sucesivas de polisacáridos, en el que una primera capa de polisacárido de asocia espontáneamente con una segunda capa de polisacárido por grupos funcionales que están cargados opuestamente o por grupos funcionales que se acoplan covalentemente y en el que la primera y segunda capa de polisacárido son diferentes polisacáridos, por sus propiedades físico-químicas.

2. El vehículo de la reivindicación 1, en el que cada una de dichas capas de polisacárido sucesivas se asocia espontáneamente con cada una de las capas de polisacárido anteriores por grupos funcionales que están cargados opuestamente o por grupos funcionales que se acoplan covalentemente.

3. El vehículo de la reivindicación 1, en el que dichos polisacáridos tienen grupos funcionales en cadenas laterales y dichos grupos funcionales de dichas capas de polisacárido sucesivas están cargadas opuestamente de dichos grupos funcionales de dichas capas de polisacárido anteriores.

4. El vehículo de la reivindicación 1, en el que dichos polisacáridos tienen grupos funcionales en cadenas laterales y dichas capas sucesivas de polisacárido se acoplan covalentemente a dichas capas de polisacárido anteriores por reacción entre dichos grupos funcionales de dichas capas sucesivas con dichos grupos funcionales de dichas capas anteriores.

5. El vehículo según la reivindicación 4, en el que dichos grupos funcionales de dichas capas de polisacárido sucesivas alternan entre grupos funcionales de amina y grupos funcionales de amina reactiva.

6. El vehículo según la reivindicación 5, en el que el grupo funcional de amina reactiva es un grupo aldehído o un grupo carboxilo.

7. El vehículo de la reivindicación 1, en el que dicha primera capa de polisacárido se asocia espontáneamente con dicho vehículo por grupos funcionales que están cargadas opuestamente o por grupos funcionales que se acoplan covalentemente.

8. El vehículo de la reivindicación 7, en el que dichos grupos funcionales de dicho vehículo y dichos grupos funcionales de dicha primera capa de polisacárido están cargados opuestamente.

9. El vehículo de la reivindicación 7, en el que dicho vehículo y dichos polisacáridos tienen grupos funcionales en cadenas laterales y dicha primera capa de polisacárido se acopla covalentemente a dicho vehículo por reacción entre dichos grupos funcionales de dicho vehículo y dichos grupos funcionales de dicha primera capa de polisacárido.

10. El vehículo según la reivindicación 9, en el que dichos grupos funcionales de dicho vehículo es un grupo funcional de amina reactiva y los grupos funcionales de dicha primera capa de polisacárido son grupos funcionales de amina.

11. El vehículo de la reivindicación 10, en el que dicho grupo funcional de amina reactiva es un grupo aldehído o un grupo carboxilo.

12. El vehículo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho material vehículo se selecciona del grupo que consiste en polímeros que suceden naturalmente sintéticos o modificados, naturales, tales como agarosa, celulosa, nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliestireno, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliacrilamida, polimetacrilato, polietilentereftalato, nylon, polivinilbutirato o poliacrilato; siliconas; vidrios; cerámicos; polvos inorgánicos tales como sílice, sulfato de magnesio y alúmina; materiales magnéticos; metales o una combinación de los mismos.

13. El vehículo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho vehículo se selecciona del grupos que consiste en tiras, láminas, barras, tubos, pocillos, placas de microvaloración, esferas y partículas.

14. El vehículo según la reivindicación 13, en el que dicho vehículo es una partícula magnética o no magnética.

15. El vehículo según la reivindicación 14, en el que dicho vehículo es una partícula de látex carboxilado.

16. El vehículo según la reivindicación 14, en el que dicha partícula está en el intervalo de tamaño de 0,1 a 10 \mum, preferentemente 0,1 a 5 \mum, lo más preferentemente 0,15 a 3 \mum.

17. El vehículo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho vehículo se asocia con al menos una molécula indicadora.

18. El vehículo según la reivindicación 17, en el que dicha molécula indicadora se selecciona del grupo que consiste en tintes, radiomarcadores, sensibilizadores, fluorescentes y/o quimiluminiscentes.

19. El vehículo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el polisacárido de la primera capa de revestimiento es aminodextrano.

20. El vehículo según la reivindicación 19, en el que dicho aminodextrano tiene un peso molecular de 10.000 a 2.000.000.

21. El vehículo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la capa más externa del polisacárido tiene al menos un grupo funcional en cadenas laterales.

22. El vehículo según la reivindicación 21, en el que dicho grupo funcional en cadenas laterales se selecciona del grupo que consiste en aminas, aldehidos, grupos carboxilo, grupos maleimido o grupos sulfhidrilo.

23. El vehículo según las reivindicaciones 21 o 22, en el que dicho grupo funcional en cadenas laterales se une a una pareja de unión específica.

24. El vehículo según la reivindicación 23, en el que dicha pareja de unión específica se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, receptores, ligandos, oligonucleótidos, proteínas de unión a oligonucleótidos, lectinas, haptenos, antígenos, proteínas de unión a inmunoglobulina, avidiva, estreptavidina o biotina.

25. Un método para preparar el vehículo revestido de polisacárido de la reivindicación 1, que comprende:

(a)

acoplar covalentemente la primera capa de polisacárido a dicho vehículo por reacción entre los grupos funcionales de amina reactiva del vehículo y los grupos funcionales de amina de los polisacáridos de la primera capa de revestimiento; y

(b)

acoplar covalentemente la segunda capa de polisacárido a la primera capa de polisacárido por reacción entre los grupos funcionales de amina de la primera capa de polisacárido y los grupos funcionales de amina reactiva de la segunda capa de polisacárido.

26. Un método para preparar el vehículo revestido de polisacárido de la reivindicación 1, que comprende:

(a)

acoplar covalentemente la primera capa de polisacárido a dicho vehículo por reacción entre los grupos funcionales de amina del vehículo y los grupos funcionales de amina reactiva de los polisacáridos de la primera capa de revestimiento; y

(b)

acoplar covalentemente la segunda capa de polisacárido a la primera capa de polisacárido por reacción entre los grupos funcionales de amina reactiva de la primera capa de polisacárido y los grupos funcionales de amina de la segunda capa de polisacárido.

27. El método según las reivindicaciones 25 o 26, en el que se usa la química de conjugación de la carbodiimida para el acoplamiento de los polisacáridos de la primera capa de revestimiento a dicho vehículo.

28. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en el que el acoplamiento de los polisacáridos de la segunda capa de revestimiento a la primera capa de revestimiento se hace en presencia de un agente reductor suave, tal como cianoborohidruro de sodio.

29. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en el que se usa la química de conjugación de la carbodiimida para el acoplamiento de los polisacáridos de la segunda capa de revestimiento a la primera capa de revestimiento.

30. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, en el que las parejas de unión específica se unen covalentemente a la capa de revestimiento por reacción entre los grupos funcionales en cadenas laterales de la capa de revestimiento y los grupos funcionales de las parejas de unión específica.

31. El vehículo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para uso en métodos diagnósticos in-vitro y/o in-vivo.

32. El vehículo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para uso en un método para la determinación cuantitativa y/o cualitativa de un analito.

33. Una composición que comprende el vehículo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 en un medio farmacéuticamente aceptable.

34. El vehículo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para uso en un método terapéutico.

35. Un método para la determinación cuantitativa o cualitativa de un analito en una muestra que usa el vehículo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.