CN116754757A - 一种用于均相化学发光分析的供体颗粒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于均相化学发光分析的供体颗粒及其应用,所述供体颗粒能够在激发状态下生成活性氧,其特征在于,所述供体颗粒包括第一载体,所述第一载体的内部填充有敏化剂,所述第一载体的表面没有包被或连接有多糖物质,其直接化学键合特异性结合配对成员中的一员;所述供体颗粒在供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值为5%~40%。该供体颗粒产生活性氧的效率高,且能够在供体试剂中稳定存在。当将包括上述供体试剂的试剂盒应用于均相化学发光分析检测时,既有超高的灵敏度,又具有很宽的检测量程。
Description
技术领域
本发明属于化学发光分析领域,具体涉及一种用于均相化学发光分析的供体颗粒及其应用。
背景技术
免疫分析经过半个多世纪的发展,已经发展出了很多种类。根据测定过程中是否要将待测物质与反应体系分离可以分为非均相(Heterogenous)免疫分析和均相(Homogeneous)免疫分析。非均相免疫分析,是指引入探针进行标记的操作过程中,各种相关试剂混合反应后需要进行分离,将待测物与反应体系分离后再进行检测,是现在免疫分析中的主流方法。如广为人们熟知的酶联免疫吸附法(ELISA法)和磁微粒化学发光法等。均相免疫分析则是指在测定过程中将待测物与反应体系中的相关试剂混合反应后直接测定,而没有多余的分离或清洗的步骤。截止目前,多种灵敏的检测方法被应用于均相免疫分析,比如光学检测方法、电化学检测方法等。
例如,光激化学发光检测(Light Initiated Chemiluminescent Assay,LiCA)就是一种典型的均相免疫分析方法。它是基于两种微球表面包被的抗原或抗体,在液相中形成免疫复合物而将两种微球拉近。在激光的激发下,发生微球之间的单线态氧的转移,进而产生高能级的红光,通过单光子计数器和数学拟合将光子数换算为靶分子浓度。而当样本不含靶分子时,两种微球间无法形成免疫复合物,两种微球的间距超出单线态氧传播范围,单线态氧在液相中迅速淬灭,检测时则无高能级红光信号产生。它具有快速、均相(免冲洗)、高灵敏和操作简单的特点。光激化学发光技术已经在很多检测项目上得到应用。
光激化学发光检测以“双球”为基本特征,“双球”指系统由“发光微球”和“感光微球”组成,且两种微球的在液相中有很好悬浮特性。微球在液相中和抗原或抗体相遇完全符合液态动力学特征。感光微球产生单线态氧的效率及时间、感光微球本身的稳定性、感光微球的生产成本、感光微球使用的便捷性均影响光激化学发光产品最终的检测结果。
随着检测行业的进步,对超敏试剂的需求越来越多,不但对灵敏度要求极高,而且检测量程又要求非常宽,现有的均相化学发光检测方法就很难满足上述检测条件。因此,亟需开发一种既能满足灵敏度要求、又能满足线性范围要求的用于均相化学发光分析的试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种用于均相化学发光分析的供体颗粒,该供体颗粒产生活性氧的效率高,且能够在供体试剂中稳定存在。当将包括上述供体试剂的试剂盒应用于均相化学发光分析检测时,既有超高的灵敏度,又具有很宽的检测量程。
为此,本发明第一方面提供了一种用于均相化学发光检测的供体颗粒,所述供体颗粒能够在激发状态下生成活性氧,其特征在于,所述供体颗粒包括第一载体,所述第一载体的内部填充有敏化剂,所述第一载体的表面化学键合特异性结合配对成员中的一员。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体的表面没有包被或连接有多糖物质,其直接化学键合特异性结合配对成员中的一员。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体的表面带有键合官能团,所述键合官能团用于将特异性结合配对成员中的一员化学键合在所述第一载体的表面。
在本发明的另一些实施方式中,所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、马来酰亚胺基和巯基;优选选自醛基和/或羧基。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体表面的键合官能团的含量为100~500nmol/mg,优选为200~400nmol/mg。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一载体的表面包被至少两个连续多糖层的涂层,其中第一多糖层与第二多糖层自发关联。
在本发明的一些实施方式中,所述连续多糖层中的每一层自发地与前一多糖层中的每一层相关联。
在本发明的另一些实施方式中,所述多糖具有侧基官能团,所述连续多糖层的所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团所带电荷相反。
在本发明的一些实施方式中,所述多糖具有侧基官能团,并且所述连续多糖层通过所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团之间的反应与所述前一多糖层共价连接。
在本发明的另一些实施方式中,所述连续多糖层的所述官能团在胺官能团和胺反应性官能团之间交替。
在本发明的一些实施方式中,所述胺反应性官能团是醛基或羧基。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一多糖层自发地与所述第一载体相关联。
在本发明的一些实施方式中,所述涂层的最外一层多糖层具有至少一个侧基官能团。
在本发明的另一些实施方式中,所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团选自醛基、羧基、巯基、氨基、羟基和马来胺基中的至少一种;优选选自醛基和/或羧基。
在本发明的一些实施方式中,所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团直接地或间接地化学键合特异性结合配对成员中的一员结合。
在本发明的一些具体实施方式中,所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物;优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖;更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体的粒径选自100~400nm,优选为150~350nm,更优选为180~220nm。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一载体为磁性或非磁性的,优选为非磁性的。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体的形状选自带、片、棒、管、孔、微滴定板、珠子、粒子和微球;优选为微球。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一载体的材质选自天然的、人工合成的或改性天然存在的聚合物;优选为人工合成的聚合物。
在本发明的一些具体实施方式中,所述第一载体的材质选自琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚丁酸乙烯或聚丙烯酸酯;优选选自聚苯乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚丙烯酸酯。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体为聚苯乙烯乳胶微球。
在本发明的另一些实施方式中,所述敏化剂是光活化的光敏剂和/或化学活化的引发剂,优选为光活化的光敏剂。
在本发明的一些实施方式中,所述敏化剂选自亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素。
在本发明的另一些实施方式中,所述特异性结合配对成员选自抗体、抗体片段、配体、寡核苷酸、寡核苷酸结合蛋白、凝集素、半抗原、抗原、免疫球蛋白结合蛋白、抗生物素蛋白、亲和素或生物素所组成的一对能够相互特异性结合的物质。
在本发明的一些实施方式中,所述特异性结合配对成员为亲和素-生物素。
在本发明的另一些实施方式中,所述亲和素选自卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素、中性亲和素和类亲和素,优选为中性亲和素和/或链霉亲和素。
在本发明的一些实施方式中,所述亲和素通过氨基与所述第一载体表面的醛基反应形成席夫碱的方式化学键合在所述第一载体的表面。
本发明第二方面提供了一种用于均相化学发光分析的供体试剂,其包括如本发明第一方面所述的供体颗粒。
在本发明的一些实施方式中,所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥5%。
在本发明的另一些实施方式中,所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥8%;优选地,所述供体颗粒在所述供试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥10%。
在本发明的一些实施方式中,所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤40%;更进一步优选地,所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤20%。
在本发明的另一些实施方式中,所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布呈现多分散性。
在本发明的一些实施方式中,所述供体颗粒在所述供体试剂中的浓度为10μg/ml~1mg/ml,优选为20μg/ml~500μg/ml,更优选为50μg/ml~200μg/ml。
在本发明的另一些实施方式中,所述供体试剂中还包括PH值为7.0~9.0的缓冲溶液,所述供体颗粒悬浮于所述缓冲溶液中。
在本发明的一些实施方式中,所述缓冲溶液中含有多糖,所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物,优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖;更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
在本发明的另一些实施方式中,所述葡聚糖的分子量分布Mw选自10000~1000000KDa,优选选自100000~800000KDa,更优选选自300000~700000KDa。
在本发明的一些实施方式中,所述缓冲溶液中葡聚糖的含量为0.01~1wt%,优选为0.05~0.5wt%。
本发明第三方面提供了一种用于均相化学发光分析的试剂盒,其包括如本发明第一方面所述的供体颗粒或第二方面所述的供体试剂。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂盒还包括受体试剂,所述受体试剂中包括能够与活性氧反应产生化学发光的受体颗粒。
在本发明的另一些实施方式中,所述受体颗粒包括第二载体,所述第二载体的内部填充有发光组合物,所述第二载体的表面包被有至少一层多糖层,所述多糖层的表面连接有报告分子,所述报告分子能够与待测目标分子特异性结合。
在本发明的一些实施方式中,所述发光组合物包含化学发光化合物和金属螯合物。
在本发明的另一些实施方式中,所述化学发光化合物选自烯烃化合物,优选选自二甲基噻吩、双丁二酮化合物、二氧杂环己烯、烯醇醚、烯胺、9-亚烷基苍耳烷、9-亚烷基-N-9,10二氢化吖啶、芳基乙醚烯、芳基咪唑和光泽精以及它们的衍生物,更优选选自二甲基噻吩及其衍生物。
在本发明的一些实施方式中,所述金属螯合物的金属是稀土金属或VIII族金属,优选选自铕、铽、镝、钐、锇和钌,更优选为铕。
在本发明的另一些实施方式中,所述金属螯合物包含选自下列的螯合剂:NHA、BHHT、BHHCT、DPP、TTA、NPPTA、NTA、TOPO、TPPO、BFTA、2,2-二甲基-4-全氟丁酰-3-丁酮、2,2’-联吡啶、联吡啶基羧酸、氮杂冠醚、氮杂穴状配体和三辛基氧化膦以及它们的衍生物。
本发明第四方面提供了一种如本发明第一方面所述的供体颗粒或第二方面所述的供体试剂或第三方面所述的试剂盒在体外诊断患者疾病中的临床应用。
本发明第五方面提供了一种均相化学发光分析仪,其利用本发明第一方面所述的供体颗粒或第二方面所述的供体试剂或第三方面所述的试剂盒分析待测样品中是否含有待测目标分子。
在本发明的一些实施方式中,所述均相化学发光分析仪包括如下组件:
加样机构,其用于向反应容器中添加待测样品;
加试剂机构,其用于向反应容器中添加含有受体颗粒的受体试剂和/或含有供体颗粒的供体试剂。
孵育模块,其用于为反应容器中的物质发生均相化学发光反应提供合适的温度;
检测模块,其用于检测均相化学发光反应产生的化学发光信号。
在本发明的另一些实施方式中,所述待测样品选自疑似含有待测目标分子的材料,其包括但不限于:血液、血清、血浆、痰液、淋巴液、精液、阴道粘液、粪便、尿液或脊髓液。
本发明的有益效果为:本发明所述用于均相化学发光分析的供体颗粒产生活性氧的效率高,活性氧在均相体系中更容易传递给受体颗粒,不易受其他物质的干扰,且所述供体颗粒本身的稳定性较高,在供体试剂中能够稳定存在,不容易失活。将含有上述供体颗粒的供体试剂用于均相化学发光分析时,不仅检测灵敏度较高,而且检测量程宽。另外,所述供体颗粒的生产成本较低,使用便捷,可以通用在各种检测项目中。
附图说明
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
图1为实施例1中制备的醛基聚苯乙烯乳胶微球的Gaussian分布图。
图2为实施例1中制备的醛基聚苯乙烯乳胶微球的Nicomp分布图。
图3为实施例1中制备的供体颗粒的Gaussian分布图。
图4为实施例2制备的包被葡聚糖的微球的Gaussian分布图
图5为实施例2制备的供体颗粒的Gaussian分布图。
图6为实施例3制备的醛基聚苯乙烯乳胶微球的Gaussian分布曲线图。
图7为实施例3制备的填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯乳胶微球的Gaussian分布曲线图。
图8为实施例3制备的包被葡聚糖的填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯乳胶微球的Gaussian分布图。
图9为实施例3制备的平均粒径在250nm左右的受体颗粒的Gaussian分布图。
图10为实施例7中血清和全血中不同浓度CRP检测的相关性系数图。
具体实施方式
为使本发明容易理解,下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前,应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解,本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式,而并不表示限制性的。本发明的实施并不局限于下面的实施例,对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在提供了数值范围的情况下,应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中,并且也涵盖在本发明内,服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下,排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义,本文使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可在本发明的实施或测试中使用,但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ.术语
本发明所述用语“活性氧”是指机体内或者自然环境中由氧组成,含氧并且性质活泼的物质的总称,主要为一种激发态的氧分子,包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2·-)、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮和单线态氧(1O2)等。
本发明所述用语“供体颗粒”是指含有通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体颗粒反应的诸如活性氧的活性中间体的敏化剂的颗粒。供体颗粒可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在本发明一些具体实施例中,所述供体颗粒为填充有光敏剂的高分子微球,所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂,优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物,其非限定性的例子包括例如美国专利US5709994(该专利文献在此全文引为参考)公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素等化合物,以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物,所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。本领域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用,例如美国专利US6406913中记载的内容,该专利文献并入本文以供参考。
本发明所述用语“受体颗粒”是指含有能够与活性氧反应可以产生可检测信号的化合物的颗粒。供体颗粒被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的活性氧,该高能态的活性氧被近距离的受体颗粒俘获,从而传递能量以激活所述受体颗粒。在本发明的一些具体实施方式中,所述受体颗粒包含发光组合物和载体,所述发光组合物填充于载体中和/或包被于载体表面。
本发明所述“载体”选自带、片、棒、管、孔、微滴定板、珠子、粒子和微球,其可以是本领域技术人员所公知的微球或微粒,其可以是任何尺寸的,其可以是有机的或是无机的,其可以是可膨胀或不可膨胀的,其可以是多孔的或非多孔的,其可以是磁性或非磁性的,其具有任何密度,但优选具有和水接近的密度,优选能漂浮于水中,且由透明、部分透明或不透明的材料构成。
本发明中,所述“化学发光化合物”即一种被称作为标记物的化合物,可进行化学反应以便引起发光,比如通过被转化为在电子激发态下形成的另一种化合物。激发态可以是单线态或是三重激发态。激发态可弛豫到基态直接发光,或者是通过将激发能量传递到发射能量受体,从而自身恢复到基态。在此过程中,能量受体颗粒将被跃迁为激发态而发光。
本发明所述“特异性结合配对成员”是指一对能够相互特异性结合的物质。
本发明所述“粒径分布变异系数C.V值”是指在纳米粒度仪的检测结果中,粒径在Gaussian分布中的变异系数。变异系数的计算公式为:C.V值=(标准偏差SD/平均值Mean)×100%。
本发明所述用语“Nicomp分布”是指美国PSS纳米粒度仪NICOMP中的一种算法分布。相对于Gaussian单峰算法,Nicomp多峰算法对于多组分、粒径分布不均匀液态分散体系的分析以及胶体体系的稳定性分析具有独特优势。
本发明所述用语“待测样品”是指待测的含有或疑似含有待测目标分子的一种混合物。可以被用在本发明的待测样品包括体液,如血液(可以是在收集的血液样品中通常看到的抗凝血)、血浆、血清、尿、精液、唾液、细胞培养物、组织提取物等。其他类型的待测样品包括溶剂、海水、工业水样、食品样品、环境样本诸如土或水、植物材料、真核细胞、细菌、质粒、病毒、真菌、及来自于原核的细胞。待测样品可以在使用前根据需要利用稀释液进行稀释。例如,为了避免HOOK效应,可以在上机检测前使用稀释液对待测样品进行稀释后再在检测仪器上进行检测。
本发明所述用语“待测目标分子”是指检测时待检测样本中的物质。与待测目标分子具有特异性结合亲合力的一种或多种物质会被用于检测该目标分子。待测目标分子可以是蛋白、肽、抗体或可以使其与抗体结合的半抗原。待测目标分子可以是与互补核酸或寡聚核苷酸结合的核酸或寡聚核苷酸。待测目标分子可以是可形成特异性结合配对成员的任何其他物质。其他典型的待测目标分子的例子包括:药物,诸如类固醇、激素、蛋白、糖蛋白、粘蛋白、核蛋白、磷蛋白、滥用的药物、维生素、抗细菌药、抗真菌药、抗病毒药、嘌呤、抗肿瘤试剂、安非他命、杂氮化合物、核酸和前列腺素,以及任何这些药物的代谢物;杀虫剂及其代谢物;以及受体。分析物也包括细胞、病毒、细菌和真菌。
本发明所述用语“抗体”以最广含义使用,包括任何同种型的抗体,保留对抗原的特异性结合的抗体片段,包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。在任何需要的情况下,抗体可以进一步与其它部分,诸如特异性结合配对成员中的一员,例如生物素或亲和素(生物素-亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。
本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答,并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合,发生免疫效应的物质。
本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用,包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。
本发明所述用语“特异性结合”,是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应,从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。在本发明公开的技术思想下,特异性结合反应的检测方法包括但不限于:双抗体夹心法、竞争法、中和竞争法、间接法或捕获法。
Ⅱ.具体实施方案
下面将结合实施例更详细地说明本发明。
本领域技术人员通常认为,微球的粒径尺寸越均一,利用该微球进行的均相化学发光检测的性能就越好。因此目前针对均相化学发光中采用的微球的研究趋于获得更均一粒径的微球。本申请的发明人通过研究后发现,采用粒径尺寸均一的微球进行均相化学发光检测时,检测结果的灵敏度和检测量程难以同时保障。但是通过采用粒径尺寸均一性合适的微球(如微球粒径分布的变异系数>5%),反而既能保障光激化学发光检测的灵敏度,又能拓宽检测量程。
因此,本发明所涉及的用于均相化学发光检测的供体颗粒,所述供体颗粒能够在激发状态下生成活性氧,其特征在于,所述供体颗粒包括第一载体,所述第一载体的内部填充有敏化剂,所述第一载体的表面化学键合特异性结合配对成员中的一员。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体的表面没有包被或连接有多糖物质,其直接化学键合特异性结合配对成员中的一员。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体的表面带有键合官能团,所述键合官能团用于将特异性结合配对成员中的一员化学键合在所述第一载体的表面。
在本发明的另一些实施方式中,所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、马来酰亚胺基和巯基;优选选自醛基和/或羧基。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体表面的键合官能团的含量为100~500nmol/mg,优选为200~400nmol/mg。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一载体的表面包被至少两个连续多糖层的涂层,其中第一多糖层与第二多糖层自发关联。
在本发明的一些实施方式中,所述连续多糖层中的每一层自发地与前一多糖层中的每一层相关联。
在本发明的另一些实施方式中,所述多糖具有侧基官能团,所述连续多糖层的所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团所带电荷相反。
在本发明的一些实施方式中,所述多糖具有侧基官能团,并且所述连续多糖层通过所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团之间的反应与所述前一多糖层共价连接。
在本发明的另一些实施方式中,所述连续多糖层的所述官能团在胺官能团和胺反应性官能团之间交替。
在本发明的一些实施方式中,所述胺反应性官能团是醛基或羧基。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一多糖层自发地与所述第一载体相关联。
在本发明的一些实施方式中,所述涂层的最外一层多糖层具有至少一个侧基官能团。
在本发明的另一些实施方式中,所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团选自醛基、羧基、巯基、氨基、羟基和马来胺基中的至少一种;优选选自醛基和/或羧基。
在本发明的一些实施方式中,所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团直接地或间接地化学键合特异性结合配对成员中的一员结合。
在本发明的一些具体实施方式中,所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物;优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖;更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一载体的粒径选自100~400nm,优选为150~350nm,更优选为180~220nm。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体为磁性或非磁性的,优选为非磁性的。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一载体的形状选自带、片、棒、管、孔、微滴定板、珠子、粒子和微球;优选为微球。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体的材质选自天然的、人工合成的或改性天然存在的聚合物;优选为人工合成的聚合物。
在本发明的另一些实施方式中,所述第一载体的材质选自琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚丁酸乙烯或聚丙烯酸酯;优选选自聚苯乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚丙烯酸酯。
在本发明的一些实施方式中,所述第一载体为聚苯乙烯乳胶微球。
在本发明的另一些实施方式中,所述敏化剂是光活化的光敏剂和/或化学活化的引发剂,优选为光活化的光敏剂,
在本发明的一些实施方式中,所述敏化剂选自亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素。
在本发明的另一些实施方式中,所述特异性结合配对成员选自抗体、抗体片段、配体、寡核苷酸、寡核苷酸结合蛋白、凝集素、半抗原、抗原、免疫球蛋白结合蛋白、抗生物素蛋白、亲和素或生物素所组成的一对能够相互特异性结合的物质。
在本发明的一些实施方式中,所述特异性结合配对成员为亲和素-生物素。
在本发明的另一些实施方式中,所述亲和素选自卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素、中性亲和素和类亲和素,优选为中性亲和素和/或链霉亲和素。
在本发明的另一些实施方式中,所述亲和素通过氨基与所述第一载体表面的醛基反应形成席夫碱的方式化学键合在所述第一载体的表面。
本发明第二方面涉及一种用于均相化学发光分析的供体试剂,其包括如本发明第一方面所述的供体颗粒。
在本发明的一些实施方式中,所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥5%。
在本发明的另一些实施方式中,所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥8%;优选地,所述供体颗粒在所述供试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥10%。
在本发明的一些实施方式中,所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤40%;更进一步优选地,所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤20%。
值得注意的是,本发明所述的供体颗粒粒径分布变异系数C.V值指的是供体颗粒包被上所需的物质后的粒径分布变异系数C.V值。
在本发明的一些具体实施方式中,所述供体颗粒在供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值可以为5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、20%、25%、30%、35%或40%等。
在本发明的另一些实施方式中,所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布呈现多分散性。
在本发明的一些具体实施方式中,所述粒径分布变异系数C.V值是通过Gaussian分布计算得到。
在本发明的另一些具体实施方式中,利用Gaussian分布分析法,所述受体颗粒在受体试剂中Gaussian分布曲线呈现两个或两个以上的峰。
在本发明的一些实施方式中,所述供体颗粒在所述供体试剂中的浓度为10μg/ml~1mg/ml,优选为20μg/ml~500μg/ml,更优选为50μg/ml~200μg/ml。
在本发明的另一些实施方式中,所述供体试剂中还包括PH值为7.0~9.0的缓冲溶液,所述供体颗粒悬浮于所述缓冲溶液中。
在本发明的一些实施方式中,所述缓冲溶液中含有多糖,所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物,优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖;更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
在本发明的另一些实施方式中,所述葡聚糖的分子量分布Mw选自10000~1000000KDa,优选选自100000~800000KDa,更优选选自300000~700000KDa。
在本发明的一些实施方式中,所述缓冲溶液中葡聚糖的含量为0.01~1wt%,优选为0.05~0.5wt%。
本发明第三方面涉及一种用于均相化学发光分析的试剂盒,其包括如本发明第一方面所述的供体颗粒或第二方面所述的供体试剂。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂盒还包括受体试剂,所述受体试剂中包括能够与活性氧反应产生化学发光的受体颗粒。
在本发明的一些实施方式中,所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥5%。
在本发明的一些实施方式中,所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥8%;优选地,所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥10%。
在本发明的另一些实施方式中,所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤40%;更进一步优选地,所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤20%。
值得注意的是,本发明所述的受体颗粒粒径分布变异系数C.V值指的是受体颗粒包被上所需的物质后的粒径分布变异系数C.V值。
在本发明的一些具体实施方式中,所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值可以为5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、20%、25%、30%、35%或40%等。
在本发明的一些实施方式中,所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布呈现多分散性。
在本发明的一些具体实施方式中,所述粒径分布变异系数C.V值是通过Gaussian分布计算得到。
在本发明的另一些具体实施方式中,利用Gaussian分布分析法,所述受体颗粒在受体试剂中Gaussian分布曲线呈现两个或两个以上的峰。
在本发明的一些实施方式中,所述受体试剂中包含至少两种平均粒径分布的受体颗粒。
在本发明的另一些实施方式中,所述受体颗粒包括第二载体,所述第二载体的内部填充有发光组合物,所述第二载体的表面包被有至少一层多糖层,所述多糖层的表面连接有报告分子,所述报告分子能够与待测目标分子特异性结合。
在本发明的一些实施方式中,所述载体的表面包被至少两个连续多糖层的涂层,其中第一多糖层与第二多糖层自发关联。
在本发明的另一些实施方式中,所述连续多糖层中的每一层自发地与前一多糖层中的每一层相关联。
在本发明的一些具体实施方式中,所述多糖具有侧基官能团,所述连续多糖层的所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团所带电荷相反。
在本发明的另一些具体实施方式中,所述多糖具有侧基官能团,并且所述连续多糖层通过所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团之间的反应与所述前一多糖层共价连接。
在本发明的一些实施方式中,所述连续多糖层的所述官能团在胺官能团和胺反应性官能团之间交替。
在本发明的另一些实施方式中,所述胺反应性官能团是醛基或羧基。
在本发明的一些实施方式中,所述第一多糖层自发地与所述载体相关联。
在本发明的另一些实施方式中,所述涂层的最外一层多糖层具有至少一个侧基官能团。
在本发明的一些实施方式中,所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团选自醛基、羧基、巯基、氨基、羟基和马来胺基中的至少一种;优选选自醛基和/或羧基。
在本发明的另一些实施方式中,所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团直接地或间接地与报告分子连接,所述报告分子能够与待测目标分子特异性结合。
在本发明的一些实施方式中,所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团直接地或间接地与特异性结合配对成员中的一员结合。
在本发明的一些实施方式中,所述发光组合物包含化学发光化合物和金属螯合物。
在本发明的另一些实施方式中,所述化学发光化合物选自烯烃化合物,优选选自二甲基噻吩、双丁二酮化合物、二氧杂环己烯、烯醇醚、烯胺、9-亚烷基苍耳烷、9-亚烷基-N-9,10二氢化吖啶、芳基乙醚烯、芳基咪唑和光泽精以及它们的衍生物,更优选选自二甲基噻吩及其衍生物。
在本发明的一些实施方式中,所述金属螯合物的金属是稀土金属或VIII族金属,优选选自铕、铽、镝、钐、锇和钌,更优选为铕。
在本发明的另一些实施方式中,所述金属螯合物包含选自下列的螯合剂:4’-(10-甲基-9-蒽基)-2,2’:6’2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺]四乙酸(MTTA)、2-(1’,1’,2’,2’,3’,3’-七氟-4’,6’-己二酮-6’-基)-萘(NHA)、4,4’-二(2”,3”,3”-七氟-4”,6”-己二酮-6”-基)-邻-三联苯(BHHT)、4,4’-二(1”,1”,1”,2”,2”,3”,3”-七氟-4”,6”-己二酮-6”-基)-氯代磺基-邻-三联苯(BHHCT)、4,7-联苯-1,10-菲咯啉(DPP)、1,1,1-三氟丙酮(TTA)、3-萘酰-1,1,1-三氟丙酮(NPPTA)、萘基三氟丁二酮(NTA)、三辛基氧化膦(TOPO)、三苯基氧化膦(TPPO)、3-苯甲酰-1,1,1-三氟丙酮(BFTA)、2,2-二甲基-4-全氟丁酰-3-丁酮(fod)、2,2’-联吡啶(bpy)、联吡啶基羧酸、氮杂冠醚、氮杂穴状配体和三辛基氧化膦以及它们的衍生物。
本发明第四方面涉及一种如本发明第一方面所述的供体颗粒或第二方面所述的供体试剂或第三方面所述的试剂盒在体外诊断患者疾病中的临床应用。
本发明第五方面涉及了一种均相化学发光分析仪,其利用本发明第一方面所述的供体颗粒或第二方面所述的供体试剂或第三方面所述的试剂盒分析待测样品中是否含有待测目标分子。
在本发明的一些实施方式中,所述均相化学发光分析仪包括如下组件:
加样机构,其用于向反应容器中添加待测样品;
加试剂机构,其用于向反应容器中添加含有受体颗粒的受体试剂和/或含有供体颗粒的供体试剂。
孵育模块,其用于为反应容器中的物质发生均相化学发光反应提供合适的温度;
检测模块,其用于检测均相化学发光反应产生的化学发光信号。
在本发明的另一些实施方式中,所述均相化学发光分析仪是POCT分析仪。这里的POCT分析仪是指在病人旁边进行的临床检测(床边检测bedsidetesting)的即时检验(point-of-care testing)仪器。所述均相免疫分析POCT分析仪的原理为:待测样品中的待测生物分子与供体颗粒和受体颗粒反应形成免疫复合物,这种相互作用会将供体颗粒和受体颗粒拉近,在激光(波长为680nm)的照射下,供体颗粒中的敏化剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体颗粒,与受体颗粒中的化学发光剂反应,进一步激活了同样在受体颗粒上的发光基团,使之发出光,波长为520-620nm。单体氧的半衰期为4μSec,在溶液中的扩散距离为200nm左右。如果生物分子不存在相互作用,单线态氧无法扩散到受体颗粒,则不会有光信号产生。故通过测量混合物发出的光强度,能够计算出待测样品中的待测目标分子的浓度。
所述POCT分析仪包括加样机构、加试剂机构、孵育模块、检测模块和电路控制模块;所述加样机构、加试剂机构、孵育模块、检测模块均与所述电路控制模块电连接。在电路控制模块的控制下,所述温育模块用于调整所述试剂卡及试剂卡内物质的温度,所述加试剂机构用于转移所述试剂卡内的物质,所述检测模块用于发射激光,并用于测量待测样品发出的光强度。在本发明的一个优选实施例中,所述加样机构和所述加试剂机构可以是同一个机构,通过Tip头的方式分别实现加样和加试剂功能。
在本发明的另一些实施方式中,所述待测样品选自疑似含有待测目标分子的材料,其包括但不限于:血液、血清、血浆、痰液、淋巴液、精液、阴道粘液、粪便、尿液或脊髓液。
Ⅲ.实施例
实施例1:表面不包被或连接有多糖的供体颗粒及供体试剂的制备(一)醛基聚苯乙烯乳胶微球的制备
准备100ml的三口烧瓶,加入40mmol苯乙烯、5mmol丙烯醛、10ml水,搅拌10min后通N2 30min。
称取0.11g过硫酸铵和0.2g氯化钠,溶于40ml水中配置成水溶液。将该水溶液加入到步骤a)的反应体系中,继续通N2 30min。
将反应体系升温至70℃,反应15小时。
将反应完成后的乳液冷却至室温,用合适的滤布过滤。得到的乳液用去离子水过次离心沉降清洗,直至离心初的上清液的电导率接近去离子水,然后用水稀释,以乳液形式保存。由纳米粒度仪测得该乳胶微球粒径的高斯分布平均粒径为201.3nm,变异系数(C.V.)=8.0%,Gaussian分布图如图1所示,Nicomp分布为多峰(如图2所示)。由电导滴定法测得该乳胶微球醛基含量为260nmol/mg。
(二)敏化剂的填充
准备25ml的圆底烧瓶,加入0.11g酞菁铜,10ml N,N-二甲基甲酰胺,磁力搅拌,水浴升温至75℃,获得光敏剂溶液。
准备100ml的三口烧瓶,加入10ml 95%乙醇、10ml水和10ml浓度为10%、(一)中获得的醛基聚苯乙烯乳胶微球,磁力搅拌,水浴升温至70℃。
将步骤a)中的溶液缓慢滴加至步骤b)中的三口烧瓶中,70℃反应2小时后停止搅拌,自然冷却,获得乳液。
将上述乳液离心1小时,30000G,离心后弃去上清液,用50%乙醇重新悬浮。重复离心清洗三次后用pH值=10的50mM CB缓冲液重新悬浮,使其终浓度为20mg/ml。
(三)微球表面修饰亲和素,制备供体试剂
微球混悬液处理:吸取一定量步骤(二)制备的微球于高速冷冻离心机中离心,弃去上清,加入一定量MES缓冲液,超声细胞破碎仪上超声至颗粒重新悬浮,加入MES缓冲液调节微球浓度至100mg/ml。
亲和素溶液配制:称量一定量链霉亲和素,加MES缓冲液溶解至8mg/ml。
混合:将处理好的微球混悬液、8mg/ml的亲和素以及MES缓冲液,以2:5:1的体积比进行混合,迅速混匀,得到反应液。
反应:MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液,按照与反应液1:25的体积比加入,迅速混匀。37℃旋转反应48小时。
封闭:MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液,按照与反应液2:1:10的体积比加入上述溶液中,混匀,37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液),其与反应液体积比为5:8,迅速混匀,37℃旋转反应16小时。
清洗:向反应好的溶液中加入MES缓冲液,高速冷冻离心机离心,弃上清,加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮,再次离心,如此清洗3次,最后用少量的供体颗粒缓冲液进行悬浮,测定固含量,并用供体颗粒缓冲液调节浓度至150μg/ml,获得包含供体颗粒的供体试剂。
由纳米粒度仪测得供体颗粒的高斯分布平均粒径为227.7nm,变异系数(C.V.)=6.5%,具体如图3所示。
实施例3:受体颗粒的制备
1.醛基聚苯乙烯乳胶微球的制备及表征过程
准备100ml的三口烧瓶,加入40mmol苯乙烯、5mmol丙烯醛、10ml水,搅拌10min后通N2 30min;
1)称取0.11g过硫酸铵和0.2g氯化钠,溶于40ml水中配置成水溶液。将该水溶液加入到步骤1的反应体系中,继续通N2 30min;
2)将反应体系升温至70℃,反应15小时;
3)将反应完成后的乳液冷却至室温,用合适的滤布过滤。得到的乳液用去离子水过次离心沉降清洗,直至离心初的上清液的电导率接近去离子水,然后用水稀释,以乳液形式保存;
4)由纳米粒度仪测得此时乳胶微球粒径的Gaussian分布平均粒径为202.2nm,变异系数(C.V.)=4.60%,Gaussian分布曲线如图6所示。由电导滴定法测得该乳胶微球醛基含量为280nmol/mg。
2.在微球内部填埋发光组合物的过程及表征
1)准备25ml的圆底烧瓶,加入0.1g二甲基噻吩衍生物和0.1g铕(Ⅲ)配合物(MTTA-EU3+),10ml 95%乙醇,磁力搅拌,水浴升温至70℃,获得配合物溶液;
2)准备100ml的三口烧瓶,加入10ml 95%乙醇、10ml水和10ml浓度为10%、步骤1中获得的醛基聚苯乙烯乳胶微球,磁力搅拌,水浴升温至70℃;
3)将步骤1)中的配合物溶液缓慢滴加至步骤2)中的三口烧瓶中,70℃反应2小时后停止搅拌,自然冷却;
4)将上述乳液离心1小时,30000G,离心后弃去上清液,得到填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯微球。
5)由纳米粒度仪测得此时微球粒径的Gaussian分布平均粒径为204.9nm,变异系数(C.V.)=5.00%(如图7所示)
3.在微球表面包被多糖涂层的过程及表征
1)取50mg氨基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中,加入5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液,30℃避光搅拌溶解;
2)取100mg步骤2中已制备好的填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯微球,加入到氨基葡聚糖溶液中搅拌2小时;
3)将10mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中,30℃避光反应过夜;
4)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液,加入50mM/pH=10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH=10碳酸盐缓冲液定容,使其终浓度为20mg/ml;
5)取100mg醛基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中,加入5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液,30℃避光搅拌溶解;
6)将上述微球加入到醛基葡聚糖溶液中搅拌2小时;
7)将15mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH=10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中,30℃避光反应过夜;
8)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液,加入50mM/pH=10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH=10碳酸盐缓冲液定容,使其终浓度为20mg/ml。
9)由纳米粒度仪测得此时微球粒径的Gaussian分布平均粒径为241.6nm,变异系数(C.V.)=12.90%(如图8所示)。
4.PCT抗体的偶联过程
1)将配对PCT抗体透析至PH值=10的50mM CB缓冲液,测得浓度为1mg/ml。
2)在2ml离心管中加入0.5ml步骤3中获得的微球以及0.5ml步骤1)获得的配对抗体Ⅰ,混匀后加入100μl 10mg/ml NaBH4溶液(50mM CB缓冲液),2-8℃反应4小时。
3)反应完毕后加入0.5ml 100mg/ml BSA溶液(50mM CB缓冲液),2-8℃反应2小时。
4)反应完毕后将离心45min,30000G,离心后弃去上清液,用50mM MES缓冲液重新悬浮。重复离心清洗四次,并用缓冲溶液稀释至终浓度为50μg/ml,获得偶联PCT抗体的受体颗粒溶液。
5)由纳米粒度仪测得此时受体颗粒的粒径的Gaussian分布平均粒径值为253.5nm,变异系数(C.V值)=9.60%(如图9所示)。
实施例4:利用实施例1中的方法制备包含如下一系列供体颗粒的供体试剂
供体试剂1:Gaussian分布曲线中供体颗粒的平均粒径为226.5nm,粒径分布变异系数C.V值=3.8%;Nicomp分布为单峰。
供体试剂2:Gaussian分布曲线中供体颗粒的平均粒径为225.3nm,粒径分布变异系数C.V值=4.6%;Nicomp分布为单峰。
供体试剂3:Gaussian分布曲线中供体颗粒的平均粒径为225.2nm,粒径分布变异系数C.V值=5.0%;Nicomp分布为单峰。
供体试剂4:Gaussian分布曲线中供体颗粒的平均粒径为226.7nm,粒径分布变异系数C.V值=8.1%;Nicomp分布为单峰。
供体试剂5:Gaussian分布曲线中供体颗粒的平均粒径为227.8nm,粒径分布变异系数C.V值=15.6%;Nicomp分布为单峰。
供体试剂6:Gaussian分布曲线中供体颗粒的平均粒径为225.9nm,粒径分布变异系数C.V值=26.1%;Nicomp分布为单峰。
供体试剂7:Gaussian分布曲线中供体颗粒的平均粒径为225.1nm,粒径分布变异系数C.V值=32.4%;Nicomp分布为单峰。
实施例5:一种光激化学发光免疫分析仪
本实施例所述光激化学发光免疫分析仪的原理为:待测样品中的待测目标分子与供体颗粒和受体颗粒反应形成免疫复合物,这种相互作用会将供体颗粒和受体颗粒拉近,在激光(波长为680nm)的照射下,供体颗粒中的敏化剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体颗粒,与受体颗粒中的化学发光剂反应,进一步激活了同样在受体颗粒上的发光基团,使之发出光,波长为520-620nm。单体氧的半衰期为4μSec,在溶液中的扩散距离为200nm左右。如果生物分子不存在相互作用,单线态氧无法扩散到受体颗粒,则不会有光信号产生。故通过测量混合物发出的光强度,能够计算出待测样品中的待测目标分子的浓度。其中,所述供体颗粒包括第一载体,所述第一载体的内部填充有敏化剂,所述第一载体的表面化学键合特异性结合配对成员中的一员。
本实施例所述光激化学发光免疫分析仪的一个优选结构包括如下组件:
试剂加样模块,其用于向反应容器中添加待测样品和/或受体试剂、供体试剂;其中所述供体试剂包括供体颗粒,所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥5%;
孵育模块,其用于为反应容器中均相化学发光反应提供合适的温度环境;所述孵育模块可以采用金属浴、水浴或油浴等方式;
检测模块,其包括激光激发器以及用于光信号检测的光子检测器(PMT),用于检测均相化学发光反应产生的化学发光信号。
其中,所述试剂加样模块、孵育模块、检测模块均与所述电路控制模块电连接。在电路控制模块的控制下,所述孵育模块用于调整免疫反应物质的温度,所述试剂加样模块用于转移所述反应容器内的物质,所述检测模块用于发射激光,并用于测量待测样品发出的光强度。
实施例6:上机检测结果及分析(检测物质:PCT抗原)
(1)利用实施例5中的分析仪将实施例1和实施例2中的供体试剂分别同时与实施例3中的受体试剂上机,检测PCT抗原,检测结果如表1所示。本实例所用的PCT定量测定检测试剂盒(光激化学发光法)由包含第一抗PCT抗体包被的受体颗粒的试剂1(R1’)、包含生物素标记的第二抗PCT抗体的试剂2(R2’)组成,另外包括含有供体颗粒的通用液(R3’)。其中,R1’是利用实施例3中受体颗粒(粒径分布变异系数C.V值=9.6%)制备得到的受体试剂;R3’是利用实施例1和实施例2中供体颗粒制备得到的供体试剂。
表1
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从表1的结果可知,利用本申请提供的供体试剂进行检测的灵敏度和检测上限均较为优异。且利用实施例1中的供体试剂进行检测的灵敏度和检测上限均优于实施例2中的供体试剂。可见,采用表面不包被多糖的供体颗粒的性能更加优异。
(2)实施例4中的供体试剂分别同时与实施例3中的受体试剂上机检测结果
本实施例所用的PCT定量测定检测试剂盒(光激化学发光法)由包含第一抗PCT抗体包被的受体颗粒的试剂1(R1’)、包含生物素标记的第二抗PCT抗体的试剂2(R2’)组成,另外包括含有供体颗粒的通用液(R3’)。其中,R1’是利用实施例3中受体颗粒(粒径分布变异系数C.V值=9.6%)制备得到的受体试剂;R3’是利用实施例4中制备得到的一系列供体试剂。
检测过程是在博阳生物科技(上海)有限公司开发的全自动光激化学发光分析系统(LiCA HT)上完成并输出检测结果,具体实验步骤如下:
1.在8×12的白板中分别加入混匀的样本、已配制的R1’和R2’;
2.将加好样的白板放入LiCA HT仪器中反应,采用的反应模式如下;
(1)将40ul样本、15ul R1’和15ul R2’混匀;
(2)37℃温育8min;
(3)加入160ul的R3’;
(4)37℃温育2min;
(5)激发读数,具体检测结果如下表2所示。
表2
从表2可知,当所述供体颗粒粒径分布的变异系数大于等于5%时,包含该供体颗粒的供体试剂上机检测,既有较合适的灵敏度,又有很宽的检测量程。
实施例7:CRP不同浓度的临床样本的检测
利用实施例5中的光激化学发光免疫分析仪,在反应杯中加入50μL CRP不同浓度临床样本(包含血清和全血),每孔平行管取均值,50μL生物素化抗CRP抗体,50μL包含偶联CRP受体颗粒的受体试剂,37℃反应7.5min,继续加入50μL实施例4中制备得到的供体试剂4,37℃反应5min,进行光激发检测,实验结果如表3和图10所示。从表3和图10中可以看出,利用血清和全血的相关性系数达到0.9988。从该实验结果表明,本发明的供体颗粒使得样品中非特异吸附大大降低,使得针对血清和全血的测量结果之间具有非常好的相关性,该供体试剂对于临床样品的适应性大大增强,可以直接用于临床全血样品的检测。
表3
血清检测结果(单位:mg/L) | 全血检测结果(单位:mg/L) |
4.037 | 4.035 |
4.785 | 4.559 |
5.499 | 5.233 |
5.513 | 5.160 |
6.449 | 6.035 |
7.111 | 7.008 |
7.179 | 7.062 |
8.435 | 8.215 |
10.290 | 10.443 |
12.899 | 12.465 |
12.929 | 12.336 |
17.455 | 16.980 |
16.900 | 17.378 |
17.500 | 18.645 |
18.989 | 20.918 |
20.651 | 20.555 |
21.677 | 21.440 |
23.401 | 24.450 |
27.998 | 27.334 |
32.865 | 32.590 |
43.870 | 44.239 |
65.111 | 65.211 |
72.962 | 74.728 |
75.883 | 75.882 |
81.595 | 81.829 |
85.240 | 85.375 |
109.991 | 109.860 |
111.332 | 112.640 |
115.230 | 105.985 |
132.241 | 133.660 |
145.030 | 144.459 |
200.325 | 199.768 |
应当注意的是,以上所述的实施例仅用于解释本发明,并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述,但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇,而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改,以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例,但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例,相反,本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种用于均相化学发光分析的供体颗粒,所述供体颗粒能够在激发状态下生成活性氧,其特征在于,所述供体颗粒包括第一载体,所述第一载体的内部填充有敏化剂,所述第一载体的表面没有包被或连接有多糖物质,其直接化学键合特异性结合配对成员中的一员;所述供体颗粒在供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值为5%~40%。
2.根据权利要求1所述的供体颗粒,其特征在于,所述第一载体的表面带有键合官能团,所述键合官能团用于将特异性结合配对成员中的一员化学键合在所述第一载体的表面,其中,所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、马来酰亚胺基和巯基;优选选自醛基和/或羧基。
3.根据权利要求1或2所述的供体颗粒,其特征在于,所述第一载体表面的键合官能团的含量为100~500nmol/mg,优选为200~400nmol/mg。
4.根据权利要求1~3中任意一项所述的供体颗粒,其特征在于,所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数C.V值为5%~20%;优选地,C.V值为8%~20%;和/或
所述第一载体的粒径选自100~400nm,优选为150~350nm,更优选为180~220nm。
5.根据权利要求1~4中任意一项所述的供体颗粒,其特征在于,所述第一载体的材质选自琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚丁酸乙烯或聚丙烯酸酯;优选选自聚苯乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚丙烯酸酯;优选第一载体为聚苯乙烯乳胶微球。
6.一种用于均相化学发光分析的供体试剂,其包括权利要求1~5中任意一项所述的供体颗粒。
7.根据权利要求6中任意一项所述的供体试剂,其特征在于,所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布呈现多分散性;和/或
所述供体颗粒在所述供体试剂中的浓度为10μg/ml~1mg/ml,优选为20μg/ml~500μg/ml,更优选为50μg/ml~200μg/ml。
8.根据权利要求6~7中任意一项所述的供体试剂,其特征在于,所述供体试剂中还包括pH值为7.0~9.0的缓冲溶液,所述供体颗粒悬浮于所述缓冲溶液中;和/或
所述缓冲溶液中含有多糖,所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物,优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖;更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖;和/或
所述缓冲溶液中葡聚糖的含量为0.01~1wt%,优选为0.05~0.5wt%。
9.一种用于均相化学发光分析的试剂盒,其包括权利要求1~5中任意一项所述的供体颗粒或权利要求6~8中任意一项所述的供体试剂和受体试剂,所述受体试剂中包括能够与活性氧反应产生化学发光的受体颗粒;
所述受体颗粒包括第二载体,所述第二载体的内部填充有发光组合物,所述第二载体的表面包被有至少一层多糖层,所述多糖层的表面连接有报告分子,所述报告分子能够与待测目标分子特异性结合。
10.一种均相化学发光分析仪,其利用如权利要求1~5中任意一项所述的供体颗粒或权利要求6~8中任意一项所述的供体试剂或权利要求9所述的试剂盒分析待测样品中是否含有待测目标分子;所述待测样品选自疑似含有待测目标分子的材料,其包括但不限于:血液、血清、血浆、痰液、淋巴液、精液、阴道粘液、粪便、尿液或脊髓液。
Priority Applications (1)
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