DE60035127T2

DE60035127T2 - Mit polysacchariden beschichtete träger, deren herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE60035127T2
Application number: DE60035127T
Authority: DE
Inventors: Hrair San Jose Kirakossian; John S. Los Altos Pease; Carsten Hockessin SCHELP; Marcel R. San Jose PIRIO; Uwe Stohr; Andreas Wiegand
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Priority date: 2000-03-06
Filing date: 2000-03-06
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2020-03-07
Also published as: JP4448642B2; US7179660B1; WO2001067105A1; EP1264181B1; EP1264181A1; JP2003526786A; CA2400993A1; DE60035127D1; CA2400993C; ES2287006T3

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Träger mit einer Oberflächenbeschichtung aus mindestens zwei Polysaccharidschichten zur Verwendung auf den Gebieten der Medizin und der klinischen Chemie. Diese Träger sind in diagnostischen und therapeutischen Verfahren besonders nützlich. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung der Träger.
Allgemeiner Stand der Technik
Auf dem Gebiet der Medizin und klinischen Chemie werden häufig Träger wie magnetische oder nicht-magnetische Teilchen, Perlen, Röhren, Mulden, Mikrotitrationsplatten, Streifen und Lagen in vitro, z.B. bei spezifischen Bindungsassays als fester Träger und/oder als Markierung zur Affinitätsreinigung von Substanzen, zur Abtrennung von Zellen oder als Enzymträger in enzymatischen Verfahren; oder in vivo, z.B. als Arzneistoffabgabesysteme, zur Lokalisierung von Erkrankungsstellen oder zum Messen des Blutflusses in einem Organ, verwendet. Gewöhnlich sind die Träger mit einem oder mehreren spezifischen Bindungspaarpartnern verbunden.
Einige der Schwierigkeiten, die mit der Verwendung der Träger verbunden sind, sind (1) das Anlagern von spezifischen Bindungspartnern am Träger und (2) das Verhindern der nicht-spezifischen Bindung von unerwünschten Substanzen am Träger für mit dem Träger in Kontakt gebrachten Proben. Die nicht-spezifische Bindung ist das Ergebnis einer nicht-kovalenten Bindung zwischen Molekülen, die von spezifischen Oberflächenstrukturen relativ unabhängig ist. Eine nicht-spezifische Bindung kann aus mehreren Faktoren, einschließlich hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Molekülen, resultieren.
Die Konsequenzen dieser Probleme schließen eine unakzeptabel niedrige Anzahl an den Träger gebundener spezifischer Bindungspartner, schlechte Leistungsfähigkeit von spezifischen Bindungsassays (hoher Hintergrund und niedrige Sensibilität) und geringe Reinheit bei Affinitätsreinigungen ein. Besondere Probleme bestehen für Träger in der Gestalt von Teilchen, die unspezifisch verkleben können und infolgedessen unerwünschte Niederschläge von aggregierten Teilchen bilden können.
Lösungen für diese Probleme wurden bisher durch die Verwendung von Trägern mit hydrophilen Polysaccharidbeschichtungen angegangen. In WO 90/04178 ist ein Immunreaktandträger beschrieben, in welchem eine Polysaccharidschicht auf der Oberfläche des Trägers durch kovalente Bindung aufgetragen ist. Der in WO 84/03358 beschriebene Träger ist durch eine Oberfläche gekennzeichnet, die nur teilweise mit einem Polysaccharid beschichtet und ansonsten nicht von einer solchen Beschichtung bedeckt ist, wobei jedoch stattdessen ein spezifischer Bindungspartner angelagert ist. Die Verwendung von magnetischen Teilchen als Arzneimittel ist in WO 96/27394 beschrieben, wobei diese Teilchen durch Alkali-behandelte Polysaccharide beschichtet sind. Eisenhaltige Nanoteilchen, die einen eisenhaltigen Kern und zwei Polymerbeschichtungen umfassen, sind aus WO 96/04017 bekannt. Squaratgefärbte, mit Carboxylat modifizierte Latexteilchen können durch maleimidiertes Aminodextran gemäß EP 0 275 139 beschichtet werden.
Teilchen mit einer Mehrfachbeschichtung aus Aminodextranen sind in US 5,639,620 und US 5,707,877 beschrieben. Hier ist es beschrieben, dass die mehrfachen Aminodextranschichten durch die Verwendung von bifunktionellen Vernetzungsmitteln, wie Gluteraldehyd vernetzt werden können. Die Anlagerung einer biologischen Substanz an freie Aminogruppen an der Außenschicht von Dextran beinhaltet auch die Verwendung des Vernetzungsmittels. Wenngleich dieses Verfahren Teilchen mit Mehrfachbeschichtungen aus einem Aminodextran erlaubt, was demnach eine nicht-spezifische Bindung vermindern sollte, beinhalten die Teilchenherstellung und -anlagerung an biologische Substanzen die Verwendung des Vernetzungsreagenzes. Dies fügt einen zusätzlichen Schritt während der Synthese des Trägers oder der Anlagerung von biologischen Substanzen hinzu. Ferner müssen die Reaktionen unter Beteiligung des Vernetzungsreagenzes sorgfältig gesteuert werden, um eine Vernetzung innerhalb der Schichten und zwischen den Teilchen zu vermeiden. Demzufolge ist es immer noch erwünscht, einen Träger vorzuweisen, bei welchem die gesamte Oberfläche mit einer hydrophilen Beschichtung bedeckt ist, die leicht herzustellen ist und an welcher spezifische Bindungspaarpartner leicht angelagert werden können.
WO 94/09368 A beschreibt einen beschichteten Träger mit einer ersten Schicht aus biologisch abbaubarer, vernetzter Gelatine und eine zweite Schicht aus einem Aminodextran. Gelatine ist ein Polypeptid.
WO 99/30160 A beschreibt Teilchen mit einer Dextranbeschichtung oder einer von Dextran abgeleiteten Beschichtung. Dextran wird mit ausgewählten Oxidationsmitteln, wie Perhalogenatverbindungen und ähnlichen Oxidationsmitteln, oxidiert.
US 5,466,609 beschreibt ein Teilchen mit einem festen Kern und beschichtet mit einer ersten Schicht aus einer wasserlöslichen Gelatine und einer zweiten Schicht aus einem Aminodextran. Gelatine ist ein Polypeptid.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen mit Polysaccharid beschichteten Träger bereit, umfassend einen Träger mit einer Beschichtung aus mindestens zwei aufeinander folgenden Polysaccharidschichten. Die erste Polysaccharidschicht verbindet sich spontan mit der zweiten Polysaccharidschicht. Jede aufeinander folgende Polysaccharidschicht verbindet sich spontan mit einer vorangehenden Polysaccharidschicht.
Die Polysaccharide weisen anhängige funktionelle Gruppen auf, und die funktionellen Gruppen der aufeinander folgenden Polysaccharidschichten sind vorzugsweise in Bezug auf die funktionellen Gruppen der vorangehenden Polysaccharidschichten entgegengesetzt geladen. Die Polysaccharidschichten können durch eine Reaktion zwischen den funktionellen Gruppen der aufeinander folgenden Schichten mit einer funktionellen Gruppe der vorangehenden Schicht kovalent aneinander gekuppelt werden. Diese Reaktion kann eine spontane Reaktion sein.
Vorzugsweise wechseln die funktionellen Gruppen der aufeinander folgenden Polysaccharidschichten zwischen aminfunktionellen Gruppen und aminreaktiven funktionellen Gruppen. Die aminreaktiven funktionellen Gruppen können eine Aldehyd- oder eine Carboxygruppe sein.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung liegt darin, dass sich die erste Polysaccharidschicht mit dem Träger spontan verbindet. Sowohl der Träger als auch das Polysaccharid können anhängige funktionelle Gruppen aufweisen, die vorzugsweise die spontane Verbindung bewirken. Die funktionellen Gruppen des Trägers und die funktionellen Gruppen der ersten Polysaccharidschicht können entgegengesetzt geladen sein, oder die funktionellen Gruppen des Trägers können mit den funktionellen Gruppen der ersten Polysaccharidschicht spontan reagieren. Der Träger kann durch Reaktion zwischen den funktionellen Gruppen des Trägers und den funktionellen Gruppen der ersten Polysaccharidschicht an die Polysaccharidschicht kovalent gekuppelt sein. Es ist bevorzugt, dass die funktionellen Gruppen des Trägers aminreaktive funktionelle Gruppen und die funktionellen Gruppen der ersten Polysaccharidschicht aminfunktionelle Gruppen sind. Die aminreaktive funktionelle Gruppe kann eine Aldehydgruppe oder eine Carboxygruppe sein.
In einem Aspekt der Erfindung ist das Polysaccharid der ersten Beschichtungsschicht durch Reaktion zwischen aminreaktiven funktionellen Gruppen des Trägers und Amingruppen des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht an den Träger kovalent gekuppelt. Das Polysaccharid der zweiten Beschichtungsschicht ist durch Reaktion zwischen den aminfunktionellen Gruppen der ersten Beschichtungsschicht und den aminreaktiven funktionellen Gruppen des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht kovalent gekuppelt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Polysaccharid der ersten Beschichtungsschicht durch Reaktion zwischen aminfunktionellen Gruppen des Trägers und aminreaktiven Gruppen des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht an den Träger kovalent gekuppelt. Das Polysaccharid der zweiten Beschichtungsschicht ist durch Reaktion zwischen den aminreaktiven funktionellen Gruppen der ersten Beschichtungsschicht und den aminfunktionellen Gruppen des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht kovalent gekuppelt.
Die Verwendung von mindestens zwei Polysaccharidschichten und insbesondere, wenn die beiden Polysaccharidmoleküle durch ihre physikalisch chemischen Eigenschaften unterschiedlich sind, führt zu einer besseren Bedeckung der Trägeroberfläche und minimiert eine unspezifische Bindung. Die entgegengesetzt geladenen funktionellen Gruppen an der Trägeroberfläche, z.B. COO^–-Gruppen, und am Polysaccharid der ersten Beschichtungsschicht, z.B. N⁺H₃-Gruppen, ziehen sich gegenseitig an (verbinden sich spontan), und in Gegenwart von überschüssigen Polysacchariden wird die Trägeroberfläche rasch und wirksam bedeckt. Alternativ dazu reagieren die Aldehydgruppen -CO-Gruppen eines mit Aldehyd derivatisierten Polysaccharidmoleküls spontan mit einer Aminogruppe einer mit Amin derivatisierten Trägeroberfläche oder eines ebensolchen Polysaccharids. Da überschüssige Mengen an Polysacchariden für die erste und die anderen Beschichtungsreaktionen verwendet werden können, besteht keine Notwendigkeit für ein genaues Überwachen der Polysaccharidkonzentration während den Reaktionen. Es wurde gefunden, dass die abwechselnde Beschichtung von Polysaccharid mit aminfunktionellen Gruppen und Polysaccharid mit aminreaktiven funktionellen Gruppen in Anbetracht einer besseren Bedeckung des Trägers und der Einfachheit des Beschichtungsvorgangs besonders vorteilhaft ist.
Die Reaktion zwischen den aminfunktionellen Gruppen der ersten Beschichtungsschicht und den aminreaktiven funktionellen Gruppen des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht oder alternativ die Reaktion zwischen den aminreaktiven funktionellen Gruppen der ersten Beschichtungsschicht und den aminfunktionellen Gruppen des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht führt auch zu einer wirksamen Vernetzung der Polysaccharide und infolgedessen zu einer stabilen, hydrophilen Trägerbeschichtung. Weiterhin können anhängige aminreaktive funktionelle Gruppen der zweiten bzw. äußersten Beschichtungsschicht leicht mit den Aminogruppen von Proteinen oder Peptiden reagieren. Beschichtete Teilchen, die erfindungsgemäß hergestellt sind, zeigen über mehrere Monate ohne sichtbaren Niederschlag im Aufbewahrungsröhrchen eine gute kolloidale Stabilität.
Eine spezifische Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Träger mit einer Oberflächenbeschichtung, die mit einer Mehrzahl an anhängigen funktionellen Gruppen versehen ist, wobei (i) die Oberflächenbeschichtung mindestens zwei abwechselnd aufgetragene Polysaccharidschichten mit funktionellen Gruppen umfasst; (ii) das Polysaccharid der ersten Beschichtungsschicht durch Reaktion zwischen den funktionellen Gruppen des Trägers und den funktionellen Gruppen des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht an den Träger kovalent gekuppelt ist; wobei die funktionellen Gruppen des Trägers und die funktionellen Gruppen des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht entgegengesetzt geladen sind; und (iii) das Polysaccharid der zweiten Beschichtungsschicht durch Reaktion zwischen den funktionellen Gruppen der ersten Beschichtungsschicht und den funktionellen Gruppen des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht kovalent gekuppelt ist, wobei die funktionellen Gruppen der ersten Beschichtungsschicht und die funktionellen Gruppen des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht entgegengesetzt geladen sind.
Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Träger ist ein Träger mit einer Oberflächenbeschichtung, die mit einer Mehrzahl an anhängigen funktionellen Gruppen versehen ist, wobei (i) die Oberflächenbeschichtung mindestens zwei abwechselnd aufgetragene Polysaccharidschichten mit aminfunktionellen Gruppen und aminreaktiven funktionellen Gruppen umfasst; (ii) das Polysaccharid der ersten Beschichtungsschicht durch Reaktion zwischen aminreaktiven funktionellen Gruppen des Trägers und Amingruppen des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht an den Träger kovalent gekuppelt ist; und (iii) das Polysaccharid der zweiten Beschichtungsschicht durch Reaktion zwischen den aminfunktionellen Gruppen der ersten Beschichtungsschicht und den aminreaktiven funktionellen Gruppen des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht kovalent gekuppelt ist.
Ein anderer bevorzugter erfindungsgemäßer Träger ist ein Träger mit einer Oberflächenschicht, die mit einer Mehrzahl an anhängigen funktionellen Gruppen versehen ist, wobei (i) die Oberflächenbeschichtung mindestens zwei abwechselnd aufgetragene Polysaccharidschichten mit aminreaktiven funktionellen Gruppen und aminfunktionellen Gruppen umfasst; (ii) das Polysaccharid der ersten Beschichtungsschicht durch Reaktion zwischen aminfunktionellen Gruppen des Trägers und aminreaktiven Gruppen des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht an den Träger kovalent gekuppelt ist; und (iii) das Polysaccharid der zweiten Beschichtungsschicht durch Reaktion zwischen den aminreaktiven funktionellen Gruppen der ersten Beschichtungsschicht und den aminfunktionellen Gruppen des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht kovalent gekuppelt ist.
Noch ein anderer bevorzugter erfindungsgemäßer Träger ist ein Träger, wobei das Trägermaterial ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus natürlichen, synthetischen oder modifizierten natürlich vorkommenden Polymeren, wie Agarose, Cellulose, Nitrocellulose, Celluloseacetat, Polyvinylchlorid, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polyacrylamid, Polymethacrylat, Polyethylenterephthalat, Nylon, Polyvinylbutyrat oder Polyacrylat; Siliconen; Glasmaterialien; keramischen Materialien; anorganischen Pulvern, wie Silica, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; magnetischen Materialien; Metallen oder einer Kombination davon.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Träger, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Röhrchen, Mikrotitrationsplatten, Perlen, Teilchen und vorzugsweise einem magnetischen oder nicht-magnetischen Teilchen, am meisten bevorzugt einem magnetischen oder nicht-magnetischen carboxylierten Latexteilchen. Ist der Träger ein Teilchen, liegt die bevorzugte Größe im Bereich von 0,1 bis 10 μm, vorzugsweise 0,1 bis 5 μm, am meisten bevorzugt 0,15 bis 3 um. Der Träger kann mit Substanzen, wie einem Reportermolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Farbstoffen, Radiomarkierungen, Sensibilisierungsmitteln, fluoreszierenden Mitteln und/oder chemilumineszierenden Mitteln, verbunden sein.
Ein anderer am meisten bevorzugter erfindungsgemäßer Träger ist ein Träger, in welchem es sich bei dem Polysaccharid der zweiten Beschichtungsschicht um Dextrane handelt, wobei die aminreaktiven funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aldehyden, Carboxygruppen. Die Dextrane weisen ein bevorzugtes Molekulargewicht von 10 000 bis 2 000 000, vorzugsweise etwa 500 000 auf.
Alternativ dazu kann der erfindungsgemäße Träger ein Träger sein, in welchem das Polysaccharid der ersten Beschichtungsschicht ein Dextran mit aminreaktiven funktionellen Gruppen und vorzugsweise das Polysaccharid der zweiten Beschichtungsschicht ein Aminodextran ist.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Träger, in welchem die anhängigen funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aminen, Aldehyden, Carboxygruppen, Maleimidogruppen, Sulfhydrylgruppen und dergleichen.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Träger, in welchem die anhängigen funktionellen Gruppen zum Binden von spezifischen Bindungspartnern an die Oberflächenbeschichtung des Trägers verwendet werden. Ein derartiger Träger ist bevorzugt, in welchem die spezifischen Bindungspartner ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antikörperfragmenten, Rezeptoren, Oligonukleotiden, Oligonukleotid-bindenden Proteinen, Lectinen, Haptenen, Antigenen, Immunglobulin-bindenden Proteinen, Avidin, Streptavidin und Biotin.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein erfindungsgemäßer Träger zur Verwendung in In-vitro- und/oder in diagnostischen in-vitro- und/oder in-vivo-Verfahren, insbesondere in einem Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung eines Analyts; und in therapeutischen Verfahren.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, umfassend einen erfindungsgemäßen Träger, vorzugsweise ein Teilchen, in einem pharmazeutisch verträglichen Medium.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines Analyts in einer Probe unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Trägers.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägers, wobei das Verfahren umfasst: (i) kovalentes Kuppeln des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht an den Träger durch Reaktion zwischen den aminreaktiven funktionellen Gruppen des Trägers und den Amingruppen des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht; und (ii) kovalentes Kuppeln des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht durch Reaktion zwischen den aminfunktionellen Gruppen der ersten Beschichtungsschicht und den aminreaktiven funktionellen Gruppen des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägers ist ein Verfahren, in welchem der chemische Vorgang der Carbodiimidkonjugation für die Kupplung des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht an den Träger verwendet wird.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägers, wobei das Verfahren umfasst: (i) kovalentes Kuppeln des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht an den Träger durch Reaktion zwischen den aminfunktionellen Gruppen des Trägers und den aminreaktiven Gruppen des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht; und (ii) kovalentes Kuppeln des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht durch Reaktion zwischen den aminreaktiven funktionellen Gruppen der ersten Beschichtungsschicht und den aminfunktionellen Gruppen des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägers ist ein Verfahren, in welchem der chemische Vorgang der Carbodiimidkonjugation zur Kupplung des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht an den Träger verwendet wird.
Ein anderes bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägers ist ein Verfahren, in welchem die Kupplung des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht in Gegenwart eines schwachen Reduktionsmittels, wie z.B. Natriumcyanoborhydrid, durchgeführt wird.
Noch ein anderes bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägers ist ein Verfahren, in welchem der chemische Vorgang der Carbodiimidkonjugation zur Kupplung des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht verwendet wird.
Eines der am meisten bevorzugten Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägers ist ein Verfahren, in welchem die spezifischen Bindungspartner durch Reaktion zwischen den anhängigen funktionellen Gruppen der Oberflächenbeschichtung und den funktionellen Gruppen der spezifischen Bindungspartner an die Oberflächenbeschichtung kovalent gekuppelt werden.
Die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind durch die Ansprüche 1 bis 39 beschrieben.
Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A und 1B sind schematische Darstellungen von zwei der bevorzugten Ausführungsformen zur Herstellung der erfindungsgemäßen Träger.
2 stellt eine typische Standardkurve für einen LOCI^TM-Digoxin-Assay dar.
3 stellt die Ergebnisse eines LOCI^TM-Digoxin-Assays unter Verwendung eines Trägers der vorliegenden Erfindung, verglichen mit einem LOCI^TM-Assay unter Verwendung eines Trägers mit einer einzigen Polysaccharidbeschichtung dar.
Die 4, 5 und 6 stellen die Ergebnisse eines LOCI^TM-TSH-Assays unter Verwendung der Träger der vorliegenden Erfindung dar.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Bevor mit der Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, wird eine Anzahl von Begriffen definiert.
„Analyt" bedeutet, wie hier verwendet, eine nachzuweisende Verbindung oder Zusammensetzung. Der Analyt kann ein Element eines spezifischen Bindungspaars und monoepitoper (einwertiger), gewöhnlich haptenischer Analyt und/oder ein mehrwertiger Analyt sein und ist eine einzelne Verbindung oder eine Mehrzahl von Verbindungen, die sich mindestens eine gemeinsame besondere räumliche und polare Organisation, z.B. eine Epitop- oder Bestimmungsstelle, teilen. Mögliche Analyte sind auch detailliert in US 5,545,834 , Spalten 3-10, beschrieben.
Die monoepitopen Analyte weisen im Allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 2000, gewöhnlicher ein Molekulargewicht von 125 bis 1000 auf. Die Analyte schließen Oligopeptide, Oligonukleotide, Arzneistoffe, Metabolite, Pestizide, Schadstoffe und dergleichen ein. Repräsentative Analyte schließen beispielsweise (i) Alkaloide, wie Morphinalkaloide, die Morphin, Codein, Heroin, Dextromethorphan, deren Derivate und Metabolite einschließen; Cocainalkaloide, die Cocain und Benzylecgonin, deren Derivate und Metabolite einschließen; Ergotalkaloide, die das Diethylamid von Lyserginsäure einschließen; Steroidalkaloide; Iminazoylalkaloide; Chinazolinalkaloide; Isochinolinalkaloide; Chinolinalkaloide, die Chinin und Chinidin einschließen; Diterpenalkaloide, deren Derivate und Metabolite; (ii) Steroide, die Östrogene, Androgene, Andreocorticalsteroide, Gallensäuren, cardiotonische Glycoside und Aglycone, die Digoxin und Digoxigenin, Saponine und Sapogenine, deren Derivate und Metabolite einschließen; Steroidmimetika, wie Diethylstilbestrol; (iii) Lactame mit 5 bis 6 Ringelementen, die die Barbiturate, z.B. Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantoin, Primidon, Ethosuximid und deren Metabolite einschließen; (iv) Aminoalkylbenzole mit Alkyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, die die Amphetamine einschließen; Catecholamine, die Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin einschließen; Narcein; Papaverin; und Metabolite des Vorstehenden; (v) benzheterocyclische Verbindungen, die Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, deren Derivate und Metabolite einschließen, wobei die heterocyclischen Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine sind; (vi) Purine, die Theophyllin, Coffein, deren Metabolite und Derivate einschließen; (vii) Arzneistoffe, die von Marihuana abgeleitet sind, di Cannabinol und Tetrahydrocannabinol einschließen; (viii) Hormone, wie Thyroxin, Cortisol, Triiodthyronin, Testosteron, Östradiol, Östron, Progesteron und Immunsuppressiva, wie Cyclosporin, FK506, Mycophenolsäure (MPA) und so weiter einschließen; (ix) Vitamine, wie A, B, z.B. B12, C, D, E und K, Folsäure, Thiamin; (x) Prostaglandine, die sich durch den Grad und die Stellen der Hydroxylierung und Unsättigung unterscheiden; (xi) tricyclische Antidepressiva, die Imipramin, Dismethylimipramin, Amitriptylin, Nortriptylin, Protriptylin, Trimipramin, Chlomipramin, Doxepin und Desmethyldoxepin einschließen; (xii) Anti-Neoplastika, die Methotrexat einschließen; (xiii) Antibiotika, die Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin, die Metabolite und Derivate einschließen; (xiv) Nukleoside und Nukleotide, die ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidin mit deren jeweiligen Zucker- und Phosphatsubstituenten einschließen; (xv) diverse, einzelne Arzneistoffe, die Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propranolol, Griseofulvin, Valpronsäure, Butyrophenone, Antihistamine, Chloramphenicol, anticholinerge Arzneistoffe, wie Atropin, deren Metabolite und Derivate einschließen; (xvi) Metabolite, die mit Krankheitszuständen verbunden sind, einschließlich Speramin, Galactose, Phenylbrenztraubensäure und Porphyrin Typ 1; (xvii) Aminoglycoside, wie Gentamicin, Kanamicin, Tobramycin und Amikacin; und (xviii) Pestizide, wie polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide, deren Metabolite und Derivate ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Mehrwertige Analyte sind normalerweise Poly(aminosäuren), d.h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren und Kombinationen davon. Derartige Kombinationen schließen Bestandteile von Bakterien, Viren, Tiernzellen, Pflanzenzellen und Menschenzellen, wie Chromosomen, Gene, Mitochondrien, Kerne, Zellmembranen und dergleichen, ein. Überwiegend weisen die polyepitopen Ligandanalyte ein Molekulargewicht von mindestens etwa 5000, gewöhnlicher mindestens etwa 10 000 auf. In der Poly(aminosäure)-Kategorie weisen die Poly(aminosäuren) von Interesse im Allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis 5 000 000, gewöhnlicher ein Molekulargewicht von etwa 20 000 bis 1 000 000 auf.
Eine breite Vielfalt an Proteinen kann als zu der Familie von Proteinen mit ähnlichen Strukturmerkmalen, Proteinen mit bestimmten biologischen Funktionen, Proteinen, die mit spezifischen Mikroorganismen verbunden sind, insbesondere Krankheiten verursachende Mikroorganismen usw., zugehörig betrachtet werden. Derartige Proteine schließen z.B. Immunglobuline, Cytokine, Enzyme, Hormone, Krebsantigene, Nährstoffmarker, Stoffwechselmarker, gewebespezifische Antigene usw. ein. Derartige Proteine schließen veranschaulichenderweise und ohne Beschränkung Protamine; Histone; Albumine; Globuline; Scleroproteine; Phosphoproteine; Mucoproteine; Chromoproteine; Lipoproteine; Nucleoproteine; Glycoproteine; T-Zellen-Rezeptoren; Proteoglycane; HLA; Proteine wie Somatotropin, Prolactin, Insulin, Pepsin; Proteine, die im menschlichen Plasma zu finden sind; Blutgerinnungsfaktoren; Proteinhormone, wie z.B. thyroidstimulierendes Hormon, follikelstimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon, Luteotropin, Prolactin, chorionisches Gonadotropin; Gewebehormone; Cytokine; Krebsantigene, wie z.B. PSA, CEA, a-Fetoprotein, Säurephosphatase, Cytokeratine, neuronenspezifische Enolase, Ca19.9, Ca 15-3 und CA125; gewebespezifische Antigene, wie z.B. alkalische Phosphatase, Myoglobin, CPK-MB und Calcitonin; und Peptidhormone ein. Andere mehrwertige Analyte von Interesse sind Mucopolysaccharide, Polysaccharide und natürliche Rezeptoren, einschließlich derartiger Materialien wie Avidin, Streptavidin, Thyroxin-bindendes Globulin, Thyroxin-bindendes Präalbumin, Transcortin usw. ein.
Der Begriff Analyt schließt ferner Oligonukleotid- und Polynukleotidanalyte, wie m-RNA, r-RNA, t-RNA, DNA (Doppelstrang („ds") oder Einzelstrang („ss")), RNA (ds oder ss), DNA-RNA-Duplexe usw., ein. Ein „Oligonukleotid" bedeutet, wie hier verwendet, gewöhnlich ein Einzelstrstrangpolynukleotid, einschließlich eines synthetischen Polynukleotids. Das (Die) Oligonukleotid(e) ist (sind) gewöhnlich aus einer Sequenz von 10 bis 100 Nukleotiden, vorzugsweise 20 bis 80 Nukleotiden in der Länge zusammengesetzt. „Polynukleotid” bedeutet, wie hier verwendet, gewöhnlich eine Verbindung oder Zusammensetzung, die ein polymeres Nukleotid mit im natürlichen Zustand etwa 50 bis 500 000 oder mehr Nukleotiden und im isolierten Zustand etwa 15 bis 50 000 oder mehr Nukleotiden, gewöhnlich etwa 15 bis 20 000 Nukleotiden, häufiger 15 bis 10 000 Nukleotiden, ist. „Polynukleotid" schließt Nukleinsäuren von aus einer beliebigen Quelle in gereinigter oder ungereinigter Form, natürlich vorkommend oder synthetisch hergestellt, einschließlich DNA (dsDNA und ssDNA) und RNA (dsRNA und ssRNA), gewöhnlich DNA ein, und kann t-RNA, m-RNA, r-RNA, Mitochondrien-DNA und -RNA, Chloroplast-DNA und -RNA, DNA-RNA-Hybride oder Gemische davon, Gene, Chromosomen, Plasmide, die Genome von biologischem Material, wie Mikroorganismen, z.B. Bakterien, Hefen, Viren, Viroiden, Schimmelpilzen, Pilzen, Pflanzen, Tieren, Menschen und Fragmenten davon und dergleichen sein.
Der Analyt kann ein Molekül sein, das direkt in einer Probe, wie einem biologischen Gewebe, einschließlich heraus seziertem Gewebe von einem Organ oder anderem Körperteil eines Wirts, wie z.B. eines Menschen oder eines Tiers, und Körperflüssigkeiten, z.B. Urin, Vollblut, Plasma, Serum, Speichel, Samenflüssigkeit, Stuhl, Auswurf, Rückenmarksflüssigkeit, Tranen, Mucus und dergleichen, zu finden ist. Vorzugsweise ist die Probe Urin, Plasma oder Serum. Die Probe kann direkt untersucht oder vorbehandelt werden, um den Analyten durch Entfernen von unerwünschten Materialien leichter nachweisbar zu machen. Die Probe kann vorbehandelt werden, um Zellen abzutrennen oder zu lysieren; Proteine auszufällen, zu hydrolysieren oder zu denaturieren; Lipide zu hydrolysieren; den Analyten anzulösen oder dergleichen. Eine derartige Vorbehandlung kann ohne Einschränkung einschließen: Zentrifugation; Behandlung der Probe mit einem organischen Lösungsmittel, z.B. einem Alkohol wie Methanol; und Behandlung mit Detergenzien. Die Probe kann in jedem beliebigen günstigen Medium hergestellt werden, das den Assay nicht stört. Ein wässriges Medium ist bevorzugt.
Der Analyt kann amplifiziert werden. Eine Amplifikation von Nukleinsäuren bedeutet jedes beliebige Verfahren, das zur Bildung von einer oder mehreren Kopien einer Nukleinsäure führt. Zahlreiche Verfahren sind bekannt, die Polymerasekettenreaktion (PCR), Ligasekettenreaktion (LCR), Amplifikation unter Verwendung von Q-Beta-Replicase, Amplifikation auf Nukleinsäurensequenzbasis (NASBA), Einzel-Primer-Amplifikation (ASPP) und andere einschließen.
Der Analyt kann auch ein in Nahrungsmitteln, Wasser oder in der Umwelt zu findendes Molekül sein, insbesondere, wenn die Gegenwart des Analyts einen Nachweis für eine Verunreinigung oder Kontamination des Nahrungsmittels, Wassers oder der Umwelt liefert.
Der Analyt von Interesse kann durch Nachweis eines für den Analyten von Interesse beweiskräftigen Mittels, wie ein zu dem Analyten von Interesse komplementäres spezifisches Bindungspaarelement, bestimmt werden, dessen Gegenwart nur dann nachgewiesen wird, wenn der Analyt von Interesse in einer Probe vorliegt. So wird das für den Analyten beweiskräftige Mittel zu dem Analyten, der in einem Assay nachgewiesen wird.
„Analytanalogon" bedeutet, wie hier verwendet, einen modifizierten Analyten, ein Analytsurrogat oder ein modifiziertes Analytsurrogat, wobei alle drei eine Verbindung bezeichnen, die die Fähigkeit besitzt, einen zu dem Analyten komplementären spezifischen Bindungspartner spezifisch zu binden. Das Analytsurrogat ist ein anderes Molekül als der Analyt, bindet sich jedoch spezifisch an den zu dem Analyten komplementären spezifischen Bindungspartner. Ein modifizierter Analyt und ein modifiziertes Analytsurrogat unterscheiden sich von dem Analyten oder dem Analytsurrogat z.B. dadurch, dass sie an eine Komponente eines signalerzeugenden Systems und/oder an ein festes Trägermaterial gebunden werden.
„Probe" bedeutet, wie hier verwendet, das Material, das im Verdacht steht, den Analyten zu enthalten. Derartige Proben, vorzugsweise von Menschen oder Tieren, schließen biologische Flüssigkeiten, wie Blut, Serum, Plasma, Auswurf, Lymphe, Samenflüssigkeit, Vaginalschleim, Fäkalien, Urin, Rückenmarksflüssigkeit und dergleichen; biologisches Gewebe, wie Haare, Haut, Abschnitte oder heraus sezierte Gewebe von Organen oder anderen Körperteilen und so weiter ein. Andere Beispiele schließen Zellkulturen und dergleichen, Pflanzen, Nahrungsmittel, forensische Proben, wie Papier, Stoffe und Schrottmaterialien, Wasser, Abwasser, Arzneimittel usw. ein. Falls nötig, kann die Probe mit Reagenzien zum Verflüssigen der Probe und Freisetzen des Analyts aus den Bindungssubstanzen vorbehandelt werden.
„Spezifisches Bindungspaar" bedeutet, wie hier verwendet, ein Paar von spezifischen Bindungspartnern.
„Spezifischer Bindungspartner" oder mit anderen Worten „Element eines spezifischen Bindungspaars" bedeutet, wie hier verwendet, ein oder zwei Moleküle, gewöhnlich unterschiedliche Moleküle, mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einem Hohlraum, der sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und dadurch als dazu komplementär definiert ist. „Molekül" kann, wie hier verwendet, auch einen Molekülkomplex wie ein Enzym, das aus Apoenzym und Coenzym zusammengesetzt ist, ein Enzym oder einen Zellrezeptor, das/der aus verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt ist, oder ein Lipoprotein, das aus Proteinen und Lipiden zusammengesetzt ist, bedeuten. Veranschaulichende spezifische Bindungspartner schließen natürlich vorkommende und synthetische Moleküle, z.B. Thyroxinbindendes Globulin, Steroid-bindende Proteine, Antikörper, Fab-Fragmente oder andere Antigen-bindende Fragmente von Antikörpern, Enzyme, Lectine, Nukleinsäuren, Repressoren, Oligonukleotide, Protein A, Protein G, Avidin, Streptavidin, Biotin, Komplementärkomponente C1q oder DNA-Bindungsproteine, RNA-Bindungsproteine und dergleichen ein. Die spezifischen Bindungspartner können Elemente eines immunologischen Paars, wie eines Antigen-Antikörpers oder Hapten-Antikörpers, oder ein Operator-Repressors, Nuklease-Nukleotid, Biotin-Avidin, Lectin-Polysaccharid, Steroid-Steroid-bindendes Protein, Arzneistoff-Arzneistoff-Rezeptor, Hormon-Hormon-Rezeptor, Enzym-Substrat, IgG-Protein-A, Oligo- oder Polynukleotid-Komplementär-Oligo- oder -Polynukleotid und dergleichen sein.
„Entgegengesetzt geladene funktionelle Gruppen" bedeutet, dass die eine Gruppe von funktionellen Gruppen positiv geladen und die andere negativ geladen ist. Die Ladung kann von den ausgewählten Reaktionsbedingungen, z.B. dem pH-Wert des Reaktionsmediums, abhängen. Das Reaktionsmedium ist eine Lösung, gewöhnlich ein Puffer, in welchem die Kupplungsreaktion zwischen den funktionellen Gruppen durchgeführt wird.
„Antikörper" bedeutet, wie hier verwendet, ein Immunglobulin, das sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Organisation von einem anderen Molekül bindet und dadurch als dazu komplementär definiert ist, gewöhnlich als Antigen oder Hapten bezeichnet. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und durch auf dem Fachgebiet bekannte Techniken, wie Immunisierung eines Wirts und Sammeln von Seren (polyklonal) oder durch Herstellen von kontinuierlichen Hybridzelllinien und Sammeln des sezernierten Proteins (monoklonal) oder durch Klonieren und Exprimieren von Nukleotidsequenzen oder mutagenisierten Versionen davon, die zumindest die für die spezifische Bindung von natürlichen Antikörpern erforderlichen Aminosäuresequenzen kodieren, hergestellt werden. Antikörper können ein vollständiges Immunglobulin oder ein Fragment davon einschließen, wobei Immunglobuline die verschiedenen Klassen und Isotypen, wie IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3, IgM usw., einschließen. Fragmente davon können Fab, Fv und F(ab')₂, Fab' und dergleichen einschließen. Zusätzlich können Aggregate, Polymere und Konjugate von Immunglobulinen oder deren Fragmente, wo geeignet, verwendet werden, sofern die Bindungsaffinität für ein bestimmtes Molekül aufrecht erhalten wird.
„Ein Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung eines Analyts" bedeutet, wie hier verwendet, einen Assay zum Bestimmen der Gegenwart oder Menge eines Analyts. Quantitative, halbquantitative und qualitative Verfahren sowie alle anderen Verfahren zum Bestimmen eines Analyts werden als Verfahren zum Messen der Menge eines Analyts betrachtet. Zum Beispiel wird ein Verfahren, das lediglich die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Analyts in einer Probe, die im Verdacht steht, den Analyten zu enthalten, nachweist, derart betrachtet, dass es im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist. Die Begriffe „Nachweisen" und „Bestimmen" sowie andere übliche Synonyme für das Messen werden als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet.
In den üblichsten Assays zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung eines Analyts wird der Analyt durch einen spezifischen Bindungspartner, vorzugsweise einen spezifischen Bindungspartner, der mit einem festen Trägermaterial und/oder einer Komponente eines signalerzeugenden Systems, wie einer Markierung oder einem Reportermolekül, verbunden ist, gebunden. Der spezifische Bindungspartner kann direkt, z.B. kovalent oder durch Adsorption, oder indirekt an das feste Trägermaterial und/oder die Komponente eines signalerzeugenden Systems gebunden werden. Eine indirekte Bindung bedeutet die räumliche Verbindung von zwei spezifischen Bindungspartnern, die keine Elemente eines spezifischen Bindungspaars sind, durch eine Reihe von Bindungen zwischen verschiedenen Bindungspaaren. Beispielhaft für eine indirekte Bindung ist die indirekte Bindung eines biotinylierten Antikörpers an eine Markierung durch die Bindung des biotinylierten Antikörpers an Avidin, das an die Markierung angelagert ist. Ein weiteres Beispiel ist die indirekte Bindung von IgM an ein festes Trägermaterial durch die Bindung von IgM an anti-IgM-Antikörper, die an das feste Trägermaterial angelagert sind.
„Träger" bedeutet, wie hier verwendet, eine feste Phase, typischerweise ein Trägermaterial oder eine Oberfläche, gewöhnlich aus einem organischen oder anorganischen, quellbaren oder nicht-quellbaren, porösen oder nicht-porösen, magnetischen oder nicht-magnetischen, wasserunlöslichen Material, das eine beliebige einer Anzahl von Gestalten, wie Streifen, Lage, Stab, Platte, Mulde, Röhrchen, Teilchen oder Perle, aufweisen kann. Die Oberfläche kann hydrophil sein oder in der Lage sein, hydrophil gemacht zu werden. Das feste Trägermaterial schließt anorganische Pulver, wie Silica, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche polymere Materialien, insbesondere Cellulosematerialien und von Cellulose abgeleitete Materialien, wie faserhaltiges Papier, z.B. Filterpapier, Chromatographiepapier usw.; synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere, wie Nitrocellulose, Celluloseacetat, Polyvinylchlorid, polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4- methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Polyethylenterephthalat, Nylon, Polyvinylbutyrat usw.; entweder allein oder in Verbindung mit anderen Materialien verwendet; Glas, das als Bioglas verfügbar ist, keramische Materialien, magnetische Materialien, Metalle und dergleichen, ein. Natürliche oder synthetische Anordnungen, wie Liposome, Phospholipidbläschen und Zellen, können ebenfalls eingesetzt werden.
Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Träger ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Röhrchen, Mikrotitrationsplatten, Mulden, Perlen, magnetischen und nicht-magnetischen Teilchen, Filterpapieren, Chromatographiepapieren. Die am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Träger sind magnetische oder nicht-magnetische Teilchen.
Ein erfindungsgemäßer Träger kann mit Reportermolekülen, wie Farbstoffen, Radiomarkierungen, Sensibilisierungsmitteln, fluoreszierenden Mitteln und/oder chemilumineszierenden Mitteln verbunden werden. Die Verbindung (einer) derartigen (derartiger) Substanz(en) mit Teilchen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, insbesondere mit Latexteilchen, kann die Einbringung während der Bildung der Teilchen durch Polymerisation beinhalten, beinhaltet jedoch gewöhnlich die Einbrigung in vorgeformte Teilchen, gewöhnlich durch nicht-kovalente Auflösung in den Teilchen. Gewöhnlich wird eine Lösung der Substanz(en) eingesetzt. Lösungsmittel, die eingesetzt werden können, schließen Alkohole, wie z.B. Ethanol, Ethylenglycol und Benzylalkohol; Amide, wie z.B. Dimethylformamid, Formamid, Acetamid und Tetramethylharnstoff und dergleichen; und Ether, wie z.B. Carbitol, Ethylcarbitol, Dimethoxyethan und dergleichen; und Wasser ein. Die Verwendung von Lösungsmitteln mit hohen Siedepunkten, in welchen die Teilchen unlöslich sind, erlaubt die Verwendung von erhöhten Temperaturen zum Erleichtern der Auflösung der Substanz(en) in den Teilchen und sind besonders geeignet. Die Lösungsmittel können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Die Lösungsmittel sind bevorzugt, die die signalerzeugenden Eigenschaften der Substanz(en) nicht stören. Die Substanzen können auch kovalent oder nicht-kovalent (z.B. durch Adsorption) an den Träger gebunden werden.
Veranschaulichenderweise und ohne Beschränkung ist die Herstellung von Teilchen, die mit einem Sensibilisierungsmittel (Chlorophyll) oder mit einer chemilumineszierenden/fluoreszierenden Zusammensetzung (Dioxen, Eu(TTA)₃/TOPO) verbunden sind, in US 5,578,498 , Spalte 31 und 32, beschrieben.
Der erfindungsgemäße beschichtete Träger weist anhängige funktionelle Gruppen, wie z.B. Maleimidgruppen, Carboxygruppen, Aldehyde, Ketone, Aminogruppen, Sulfhydrylgruppen, Cyanogruppen, Ethylengruppen, Hydroxygruppen, Thiole, Carboxamide, Carbamate, Carbonsäureester, Sulfonsäuren, Sulfonsäureester, Phosphorsäuren, Phosphorsäureester, Harnstoffe, Phosphoramide, Sulfonamide, Ether, Sulfide, Thioether, Olefine, Acetylene, Amine, Nitrile, Halogenide und dergleichen, auf. Diese anhängigen funktionellen Gruppen können zum Binden von spezifischen Bindungspartnern an die Oberflächenbeschichtung des Trägers verwendet werden. Spezifische Bindungspartner können z.B. Antikörper, Antikörperfragmente, Rezeptoren, Oligonukleotide, Nukleotid-bindende Proteine, Lectine, Haptene, Antigene, Immunglobulin-bindende Proteine, Avidin, Streptavidin, Biotin oder andere biologische Moleküle einschließen.
„Teilchen" bedeutet, wie hier verwendet, Teilchen an mindestens 20 nm und nicht mehr als etwa 20 μm, gewöhnlich mindestens etwa 40 nm und weniger als 10 μm, normalerweise 0,1 bis 10 μm, vorzugsweise 0,1 bis 5 μm, am meisten bevorzugt 0,15 bis 3 μm. „Teilchen" umfasst, wie hier verwendet, Kugeln, Halbkugeln, Perlen und auch andere Gestalten. Die Teilchen können organisch oder anorganisch, quellbar oder nicht-quellbar, porös oder nicht-porös, wobei sie eine beliebige Dichte, jedoch vorzugsweise eine Dichte, die ähnlich Wasser ist, im Allgemeinen von etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml, aufweisen vorzugsweise suspendierbar in Wasser, und zusammengesetzt aus einem Material, das transparent, teilweise transparent oder undurchsichtig sein kann, sein. Die Teilchen können Teilchen vom Kern-und-Schale-Typ, wie Teilchen mit einem magnetischen Kern und einer harten Schalenbeschichtung aus (einem) polymerisierten Monomer(en) sein. Die Teilchen sind vorzugsweise negativ geladen. Die Teilchen sind vorzugsweise fest, z.B. Polymerteilchen, Metallsole (Teilchen, die aus einem Schwermetall, wie z.B. Gold oder Silber, zusammengesetzt sind), Glasteilchen, Siliciumteilchen, magnetische Teilchen, Farbstoffkristallite. Besonders bevorzugt sind Latexteilchen. „Latex" bedeutet, wie hier verwendet, ein teilchenförmiges, wassersuspendierbares, wasserunlösliches polymeres Material. Der Latex ist häufig ein substituiertes Polyethylen, wie: Polystyrol-Butadien, Polyacrylamid-Polystyrol, Polystyrol mit Aminogruppen, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Acrylnitril-Butadien, Styrolcopolymere, Polyvinylacetat-Acrylat, Polyvinylpyridin, Vinyl-Chloridacrylat-Copolymere und dergleichen. Nicht vernetzte Polymere aus Styrol und carboxyliertem Styrol oder mit anderen aktiven Gruppen, wie Amino, Hydroxy, Halogen und dergleichen funktionalisiertem Styrol sind bevorzugt. Häufig werden Copolymere von substituierten Styrolen mit Dienen, wie Butadien, verwendet.
„Signalerzeugendes System” bedeutet, wie hier verwendet, eine oder mehrere Komponenten, wobei mindestens eine Komponente eine nachweisbare Markierung ist, die ein nachweisbares Signal erzeugt, das die Menge an gebundener und/oder ungebundener Markierung, d.h. die Menge an Markierung, die an die nachzuweisende Verbindung gebunden oder nicht-gebunden ist, betrifft. Die Markierung ist ein beliebiges Molekül, das ein Signal erzeugt oder zum Erzeugen eines Signals veranlasst werden kann, und kann z.B. eine fluoreszierende Verbindung (fluoreszierendes Mittel), eine Radiomarkierung, ein Enzym, eine chemilumineszierende Verbindung (chemilumineszierendes Mittel) oder ein Sensibilisierungsmittel sein. Dieses Molekül kann als „Reportermolekül" bezeichnet werden. Folglich wird das Signal durch Nachweis der Enzymaktivität, Lumineszenz, Lichtabsorption, Lichtstreuung oder Radioaktivität, wie es der Fall sein kann, nachgewiesen und/oder gemessen.
Geeignete Markierungen schliefen veranschaulichender Weise und ohne Beschränkung Enzyme, wie Alkaliphosphatase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase und Meerrettichperoxidase; Farbstoffe; fluoreszierende Mittel, wie Fluorescein, Rhodaminverbindungen, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd, fluoreszierende Chelate aus seltenen Erdmetallen und Fluorescamin; chemilumineszierende Mittel, wie Isoluminol und Acridiniumverbindungen; Sensibilisierungsmittel, wie Eosin, 9,10-Dibromanthracen, Methylenblau, Hämatoporphyrin, Phthalocyanine, Chlorophyll, bengalische Rose; Coenzyme; Enzymsubstrate; Radiomarkierungen, wie ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴C, ³H, ⁵⁷Co und ⁷⁵Se; Teilchen, wie Latexteilchen, die mit einem Reportermolekül oder einer Gruppe von Molekülen, wie einem Farbstoff, einem Sensibilisierungsmittel, fluoreszierenden Mittel, chemilumineszierenden Mittel oder einem anderen nachweisbaren Molekül oder einer anderen ebensolchen Gruppe von Molekülen markiert werden können; Metallsol; Kristallit; Liposome und Zellen, die weiter markiert werden können, usw., ein.
Es gibt zahlreiche Verfahren, durch welche die Markierung ein Signal erzeugen kann, das durch äußere Mittel, erwünschtermaßen durch visuelle Untersuchung, z.B. durch elektromagnetische Strahlung, Wärme und chemische Reagenzien nachweisbar ist. Die Markierung oder andere signalerzeugende Systemelemente können auch an einen spezifischen Bindungspartner, ein anderes Molekül oder ein festes Trägermaterial gebunden werden. Markierungen schließen Gruppen, die mithilfe von elektromagnetischer Strahlung oder elektrochemischen Nachweis nachweisbar sind, einschließlich Farbstoffe, fluoreszierende Mittel, chemilumineszierende Mittel und radioaktive Isotope ein.
Die Markierung kann direkt ein Signal erzeugen, und deshalb sind zusätzliche Komponenten zum Erzeugen eines Signals nicht erforderlich. Zahlreiche organische Moleküle, z.B. fluoreszierende Mittel, sind in der Lage, Ultraviolett- und sichtbares Licht zu absorbieren, wobei die Lichtabsorption Energie auf diese Moleküle überträgt und sie zu einem angeregten Energiezustand anhebt. Diese absorbierte Energie wird dann durch Emission von Licht mit einer zweiten Wellenlänge abgeführt. Andere Markierungen, die direkt ein Signal erzeugen, schließen radioaktive Isotope und Farbstoffe ein.
Alternativ dazu kann die Markierung zum Erzeugen eines Signals andere Komponenten benötigen, und das signalerzeugende System würde dann sämtliche zum Erzeugen eines messbaren Signals erforderlichen Komponenten einschließen, die Substrate, Coenzyme, Quenchmittel, Verstärker, zusätzliche Enzyme, Substanzen, die mit enzymatischen Produkten reagieren, Katalysatoren, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Radikalfänger, Metallionen und eine spezifische Bindungssubstanz, die zum Binden von signalerzeugenden Substanzen erforderlich ist, einschließen.
Die Markierung und/oder andere signalerzeugende Systemelemente können an einen spezifischen Bindungspartner oder an einen erfindungsgemäßen Träger gebunden werden. Die Markierung kann an einen spezifischen Bindungspartner, wie z.B. einen Antikörper, Biotin, Avidin, ein Analytanalogon, ein Oligonukleotid oder ein Hapten kovalent gebunden werden. Die Bindung der Markierung an den spezifischen Bindungspartner kann durch chemische Reaktionen erzielt werden, die zum Ersetzen eines Wasserstoffatoms der Markierung durch eine Bindung an den spezifischen Bindungspartner führen, oder kann eine Verbindungsgruppe zwischen der Markierung und dem spezifischen Bindungspartner einschließen. Andere signalerzeugende Systemelemente können auch an spezifische Bindungspartner kovalent gebunden werden. Zum Beispiel können zwei signalerzeugende Systemelemente, wie ein fluoreszierendes Mittel und ein Quenchmittel, jeweils an einen unterschiedlichen Antikörper gebunden werden, der einen spezifischen Komplex mit dem Analyten bildet. Die Bildung des Komplexes bringt das fluoreszierende Mittel und das Quenchmittel in enge Nachbarschaft, wodurch es ermöglicht wird, dass das Quenchmittel mit dem fluoreszierenden Mittel wechselwirkt, um ein Signal zu erzeugen.
„Verbindungsgruppe" bedeutet, wie hier verwendet, die kovalente Bindung zwischen Molekülen. Die Verbindungsgruppe variiert je nach der Beschaffenheit der zu verbindenden Moleküle. Funktionelle Gruppen, wie Thiolgruppen, Aminogruppen, Carboxygruppen, Hydroxygruppen, Phosphatgruppen oder Sulfogruppen, die normalerweise vorliegen oder am zu verbindenden Molekül eingebracht sind, werden zum Verbinden eingesetzt. Zum Beispiel können zwei mit Thiolgruppen funktionalisierte Moleküle durch Verbinden der Thiole mit einem homobifunktionellen Reagens, wie einem Bismaleimid oder einer Bishalogenacetylverbindung konjugiert werden. Zwei Moleküle, die mit Amingruppen funktionalisiert sind, können durch Verwendung von homofunktionellen Reagenzien, wie Glutaraldehyd oder Disuccinimidylester, konjugiert werden. Eine bessere Steuerung eines Konjugationsvorgangs kann häufig durch Einsatz eines heterobifunktionellen Reagenzes erzielt werden. Zum Beispiel kann ein mit Thiolgruppen funktionalisiertes Molekül mithilfe eines heterobifunktionellen Reagenzes, das sowohl Maleimid- als auch Succinimidylesterfunktionen besitzt, an ein mit Amingruppen funktionalisiertes Molekül konjugiert werden. Beispiele für heterobifunktionelle Verbindungsgruppen schließen Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), Succinimidyl-4-(iodacetyl)aminobenzoat (SIAB) und Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat ein.
„Chemischer Vorgang der Carbodiimidkonjugation" bedeutet, wie hier verwendet, dass chemische Konjugate über verfügbare -COOH- und -NH₂-Gruppen unter Bildung einer Amidbindung synthetisiert werden können. Dies ist ideal zum Herstellen von Antikörper- oder Antigenkonjugaten. Ein erster Schritt bei dieser Synthese ist die Umwandlung von Carboxygruppen an einem der zu konjugierenden Moleküle zu so genannten Aktivestern. Die Aktivester können dann mit anderen funktionellen Gruppen, typischerweise Aminen, an dem anderen zu konjugierenden Molekül spontan reagieren. Am üblichsten werden Carbodiimide, wie 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]-carbodiimid (EDC oder EDAC) oder 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid (CMC) zum Umwandeln von Carboxygruppen zu Aktivestern verwendet.
„Assay" bedeutet die Bestimmung der Gegenwart oder Menge eines Analyts in einer Probe, die in Verdacht steht, einen Analyten zu enthalten, die in einem Assaymedium mit Reagenzien zum Durchführen des Assays kombiniert wird. Derartige Reagenzien können spezifische Bindungspartner für den Analyten, die Analytanaloga, feste Oberflächen, an welche eines der vorstehenden Reagenzien gebunden ist, spezifische Bindungspartner für die spezifischen Bindungspartner für den Analyten einschließen. Ein oder mehrere der Reagenzien können markiert sein. Die Reagenzien werden derart ausgewählt, dass ein Signal von einer Markierung in Bezug auf die Gegenwart oder Menge an Analyt in der Probe erhalten wird. Der Assay kann entweder ohne Abtrennung (homogen) oder mit Abtrennung (heterogen) von beliebigen der Assayverbindungen oder Produkte durchgeführt werden.
Homogene Assays sind durch EMIT^® Assayprodukte (Syva Company, San Jose, CA); nephelometrische und turbidimetrische Assays, häufig latexverstärkt; Nukleinsäurehybridisierungsassays, wie beschrieben in EP-A2-0 070 685 , Assays wie in Boguslaski & Li (1982), Applied Biochemistry and Biotechnology, 7:401-414 zusammengefasst; und Assays wie diejenigen offenbart in EP-A2-0 515 194 , Beispiele 2 und 5, beispielhaft beschrieben.
In einer heterogenen Assay-Vorgehensweise umfassen die Assaykomponenten gewöhnlich (i) eine Probe, die im Verdacht steht, einen Analyten zu enthalten, der ein spezifischer Bindungspartner ist, (ii) einen ersten spezifischen Bindungspartner, der direkt oder indirekt an ein festes Trägermaterial gebunden oder zu binden ist, das entweder ein nicht-dispergierbares festes Trägermaterial oder ein Teilchen sein kann, (iii) und einen zweiten spezifischen Bindungspartner, der direkt oder indirekt an ein Element eines signalerzeugenden Systems gebunden oder zu binden ist. Der erste und/oder zweite spezifische Bindungspartner kann ein Analytanalogon sein. Die Assaykomponenten und gegebenenfalls andere Reagenzien, wie Puffer, Substratlösungen usw., werden im Allgemeinen entweder gleichzeitig oder vollständig oder teilweise aufeinander folgend kombiniert und unter Bedingungen zum Erlauben der Bindungsreaktionen zwischen den jeweiligen spezifischen Bindungspaarelementen inkubiert. Das feste Trägermaterial wird dann von der flüssigen Phase abgetrennt und häufig gewaschen, um ungebundene Reagenzien zu entfernen. Anschließend wird das feste Trägermaterial oder die flüssige Phase auf die Gegenwart des mit der Gegenwart oder Menge des Analyts verbundenen Elements eines signalerzeugenden Systems untersucht.
Die Abtrennung kann durch jedes beliebige Mittel, einschließlich, aber ohne Beschränkung, Abtrennung einer flüssigen Phase von einem festen Trägermaterial durch Filtration, Mikrofiltration, Doppelantikörperausfällung, Zentrifugation, Chromatographie, Elektrophorese, magnetischer Abtrennung und Entfernung eines festen Trägermaterials (z.B. eines Tauchstabs) von einer Probe, erzielt werden.
Unterschiedliche Formate von homogenen und heterogenen Assays sind bekannt. In einem Sandwich-Assay wird der Analyt durch mindestens zwei spezifische Bindungspaarelemente sandwichförmig angeordnet. In einem konkurrierenden Assay konkurriert der Analyt gewöhnlich mit einem Analytanalogon um die Bindung durch einen spezifischen Bindungspartner.
Veranschaulichenderweise und ohne Beschränkung können derartige Assayformate auf dem Gebiet der Immunassays auch durch die gebildeten Komplexe gekennzeichnet sein: (i) Sandwich-Immunassays durch die Bildung von „Antikörper<>Antigen<>Antikörper"-Komplexen oder „Antigen<>Antikörper<>Antigen"-Komplexen; (ii) indirekte Immunassays durch die Bildung von „Antigen<>Antigen-spezifischen Antikörper(Analyt) <>Antikörper"-Komplexen und (iii) konkurrierende Immunassays durch die Bildung von „Antikörper<>Antigen"-Komplexen, „Antikörper<>Hapten"-Komplexen oder „Antikörper<>Analytanalogon"-Komplexen.
In einem typischen konkurrierenden heterogenen Assay wird ein festes Trägermaterial mit einem daran gebundenen Antigen-spezifischen Antikörper mit einem Medium in Kontakt gebracht, das die Probe und ein an eine nachweisbare Markierung konjugiertes Analytanalogon, wie ein Enzym (das „Konjugat"), enthält. Der Analyt in der Probe konkurriert mit dem Konjugat um die Bindung an den Antikörper. Nach Abtrennung des festen Trägermaterials und des Mediums wird die Markierungsaktivität des festen Trägermaterials oder des Mediums durch herkömmliche Techniken bestimmt und mit der Analytmenge in der Probe in Beziehung gesetzt. Alternativ dazu kann das Antigenanalogon an das feste Trägermaterial gebunden werden und ist der Antigen-spezifische Antikörper markiert.
In einem typischen homogenen oder heterogenen Sandwich-Immunassay wird ein Sandwichkomplex in einem Assaymedium gebildet. Der Komplex umfasst den Analyten, einen ersten Antikörper (monoklonal oder polyklonal), der sich an den Analyten bindet, und einen zweiten Antikörper (monoklonal oder polyklonal), der sich an den Analyten oder einen Komplex des Analyts und den ersten Antikörper bindet. Anschließend wird der Sandwichkomplex nachgewiesen und mit der Menge an Analyt in der Probe in Beziehung gesetzt. Der Sandwichkomplex wird durch die Gegenwart einer Markierung in dem Komplex nachgewiesen, wobei entweder einer oder beide des ersten Antikörpers und des zweiten Antikörpers mit Markierungen verbunden sind.
In einem homogenen Assay ohne jeglichen Abtrennungsschritt, jedoch auch in einem heterogenen Assay können Latexteilchen als Markierung(en) verwendet werden und werden Teilchenkomplexe z.B. durch nephelometrische oder turbidimetrische Verfahren bestimmt. Die Markierungen können auch Substanzen sein, die mit einem Abstand voneinander versehen werden, der eine Wechselwirkung, insbesondere eine Energieübertragung, zwischen den Substanzen erlaubt oder verhindert, und der Wechselwirkungsgrad wird gemessen. Eine derartige Energieübertragung kann mithilfe von kurzlebigen Molekülen, z.B. einem atomaren Sauerstoff, Strahlung im kurzen Bereich, z.B. radioaktiver β-Strahlung, und/oder Energieübertragung gemäß dem Förster- oder Nicht-Förster-Mechanismus stattfinden. Ferner kann die Aktivität der Substanzen durch andere Substanzen erhöht oder gehemmt werden, was zu einer messbaren Änderung im Signal, z.B. einer Änderung in der Intensität oder Polarisation des emittierten Lichts, Hemmung oder Erhöhung der Enzymaktivitäten und/oder Änderung des Fluoreszenzverhaltens führt. Im Falle eines heterogenen Sandwich-Assays wird ein erster spezifischer Bindungspartner an ein festes Trägermaterial gebunden und wird ein zweiter spezifischer Bindungspartner an eine Markierung gebunden. Nach einem oder mehreren Inkubationsschritten wird das feste Trägermaterial von der flüssigen Phase abgetrennt und werden etwaige Sandwich-Komplexe, die an das feste Trägermaterial gebunden sind, bestimmt. In einer Variation des Sandwich-Assays wird die Probe in einem geeigneten Medium mit dem markierten spezifischen Bindungspartner in Kontakt gebracht und für eine Zeitdauer inkubiert. Dann wird das Medium mit einem festen Trägermaterial in Kontakt gebracht, an welchen der zweite spezifische Bindungspartner gebunden ist. In einer anderen Variation des Vorstehenden werden die Probe, der erste spezifische Bindungspartner, der an ein festes Trägermaterial gebunden ist, und der markierte spezifische Bindungspartner in einem Medium kombiniert und in einem einzigen Inkubationsschritt inkubiert.
Sandwich-Assays finden hauptsächlich beim Nachweis von mehrwertigen Analyten Verwendung; die bevorzugten Assays zum Nachweisen von einwertigen Analyten sind konkurrierende Assays. Die vorliegende Erfindung findet auf alle der vorstehenden Assays Anwendung.
„Vollständig oder teilweise aufeinander folgend" bedeutet, dass, wenn die Probe und die anderen Mittel, die in einem Assay verwendet werden, auf andere Weise als gemeinsam (gleichzeitig) kombiniert werden, eines oder mehrere mit einem oder mehreren der übrigen Mittel unter Bildung einer Unterkombination kombiniert werden können. Eine Unterkombination und die übrigen Mittel können dann kombiniert werden.
„Polysaccharid" bedeutet ein Kohlenhydrat, das drei oder mehr nicht-modifizierte oder modifizierte Monosaccharideinheiten enthält, wie z.B. Dextran, Stärke, Glycogen, Inulin, Levan, Mannan, Agarose, Galactan, Carboxydextran oder Aminodextran; das Polysaccharid kann zu den einfacheren Monosaccharideinheiten hydrolysiert werden. Beispiele für Polysaccharide sind veranschaulichenderweise und ohne Beschränkung Dextran, Stärke, Glycogen, Polyribose und dergleichen.
„Dextran” bedeutet ein Polysaccharid, das aus linearen Glucoseeinheiten mit 1 bis 6 verknüpften Kohlenstoffatomen (98 %) besteht; eine polymerisierte Glucose.
Der Begriff „funktionelle Gruppen" schließt Carbonsäuren, Aldehyde, Ketone, Aminogruppen, Cyanogruppen, Ethylengruppen, Hydroxygruppen, Thiole, Carboxamide, Carbamate, Carbonsäureester, Sulfonsäuren, Sulfonsäureester, Phosphorsäuren, Phosphorsäureester, Harnstoffe, Phosphoramide, Sulfonamide, Ether, Sulfide, Thioether, Olefine, Acetylene, Amine, Nitrile, Halogenide und dergleichen ein.
„Aminreaktive funktionelle Gruppe" bedeutet eine Funktionalität, die mit einer Aminfunktionalität, gewöhnlich durch eine Nukleophilie oder Basizität des Amins reaktiv ist, wie z.B. ein Aldehyd, eine α-Ketocarbonsäure, eine Epoxygruppe und dergleichen.
Gewöhnlich sind zwei Moleküle „kovalent gebunden" oder „kovalent gekuppelt", wenn sich mindestens ein Atomkern des ersten Moleküls und ein Atomkern des zweiten Moleküls Elektronen teilen.
Eine „Beschichtung" bedeutet mindestens eine Schicht einer Bedeckung auf der Oberfläche des Trägers. Die Beschichtung kann die Trägeroberfläche vollständig oder teilweise bedecken; sie kann eine monomolekulare oder multimolekulare Schicht sein. Eine darauffolgende Schicht bedeutet, eine Schicht wird auf einer vorhergehenden Schicht aufgetragen. Eine darauffolgende Schicht kann die erste Beschichtungsschicht als Träger einschließen.
Verschiedene Hilfsmaterialien werden häufig in dem Assay eingesetzt. Zum Beispiel liegen normalerweise Puffer im Assaymedium sowie Stabilisatoren für das Assaymedium und die Assaykomponenten vor. Häufig können zusätzlich zu diesen Additiven Proteine, wie Albumine; organische Lösungsmittel, wie Formamid; quartäre Ammoniumsalze; Polyanionen, wie Dextransulfat; oberflächenaktive Mittel, insbesondere nicht-ionische oberflächenaktive Mittel; Bindungsverstärker, z.B. Polyalkylenglycole; oder dergleichen eingeschlossen sein.
Im Folgenden werden spezifische Ausführungsformen der Erfindung detaillierter beschrieben:
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Träger mit einer Oberflächenbeschichtung, die mit anhängigen funktionellen Gruppen versehen ist. Die Oberflächenbeschichtung umfasst mindestens zwei Polysaccharidschichten. Das Polysaccharid der ersten Beschichtungsschicht ist durch Reaktion zwischen den funktionellen Gruppen des Trägers und den funktionellen Gruppen des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht an den Träger kovalent gekuppelt. Ferner ist das Polysaccharid der zweiten Beschichtungsschicht durch Reaktion zwischen den funktionellen Gruppen der ersten Beschichtungsschicht und den funktionellen Gruppen des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht kovalent gekuppelt. Zusätzliche Polysaccharidschichten mit anhängigen funktionellen Gruppen können wahlweise eingesetzt werden.
In der vorliegenden Erfindung verbindet sich das Polysaccharid der ersten Beschichtungsschicht spontan mit dem Polysaccharid der zweiten Beschichtungsschicht und wahlweise mit dem Träger. Eine spontane Verbindung zwischen den Polysaccharidschichten und zwischen dem Träger und der ersten Polysaccharidschicht findet statt, wenn die funktionellen Gruppen der einen der Polysaccharidschichten an die funktionellen Gruppen des Trägers oder einer anderen Schicht angelagert werden oder damit spontan reagieren. Beispiele für eine spontane Verbindung schließen die Anziehung der einen Polysaccharidschicht an eine andere Polysaccharidschicht (oder an den Träger), da die funktionellen Gruppen der Schichten (oder der ersten Schicht und des Trägers) entgegengesetzt geladen sind, ein. Dies kann stattfinden, wenn das eine Polysaccharid Carboxy-funktionelle Gruppen aufweist und die andere Schicht ein Aminodextran ist. Eine spontane Verbindung kann auch zwischen einem carboxylierten Träger und einem Aminodextran aufgrund der entgegengesetzten Ladung der funktionellen Gruppen stattfinden.
Ein anderes Beispiel für eine spontane Verbindung ist die spontane Bildung einer Schiffschen Base, die stattfindet, wenn die anhängigen Aldehydgruppen einer Dextranaldehydschicht sich mit den Amingruppen eines Aminodextrans verbinden. Die Bindung kann im Verfahren durch ein schwaches Reduktionsmittel, wie NaCNBH₃ oder dergleichen, reduziert werden. Noch ein anderes Beispiel ist die spontane Verbindung eines thiolierten Dextrans mit einem halogenierten Dextran. Diese nukleophile Substitutionsreaktion findet spontan und schnell unter optimalen pH-Bedingungen (gewöhnlich 8 oder höher) bei Raumtemperatur statt.
Ein anderes Beispiel für eine spontane Verbindung ist die nukleophile Substitution, die zwischen anhängigen Aminogruppen einer Dextranaminoschicht und Carboxygruppen eines Carboxydextrans, aktiviert durch Carbodiimid, stattfindet. Zum Unterstützen dieser Reaktion bildet das -COOH-haltige Molekül einen Acylaminoester mit N-Hydroxysuccinimid durch Verwendung eines Carbodiimids. Dieses Molekül reagiert mit den Aminogruppen eines Aminodextrans unter Erhalt einer stabilen Amidbindung.
Die spontane Verbindung der ersten Schicht mit dem Träger oder der aufeinander folgenden Polysaccharidschichten miteinander führt zu zahlreichen Vorteilen. Ein Vorteil liegt darin, dass der Träger leicht mit einer ersten Polysaccharidschicht beschichtet werden kann. Beispielsweise erfordert die Reaktion zwischen einem carboxylierten Teilchen und einem Aminodextran nur die Verwendung eines chemischen Vorgangs der Carbodiimidkonjugation. Keine Verbindungsgruppe ist nötig, was die Herstellungsschritte reduziert sowie eine größere Steuerung der Reaktion erlaubt.
Gleichermaßen sind die Vorteile der spontanen Verbindung zwischen Polysaccharidschichten ersichtlich, wenn die Polysaccharide entgegengesetzte Ladungen aufweisen, wie ein carboxyliertes Dextran und ein Aminodextran, oder wenn die funktionellen Gruppen der Schichten spontan reagieren. Wiederum erlaubt die Kupplung von Polysacchariden, die sich spontan verbinden, eine einfache Herstellung ohne die Notwendigkeit einer bifunktionellen Verbindungsgruppe, wie Glutaraldehyd. Dies erlaubt eine bessere Steuerung der Reaktion, während eine im Wesentlichen vollständige Bedeckung von Polysaccharid auf einem Träger oder auf einer vorangehenden Polysaccharidschicht gewährleistet wird.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Träger mit anhängigen funktionellen Gruppen durch einen Träger wie einem Polystyrolteilchen mit einer carboxylierten Oberfläche (aminreaktive funktionelle Gruppe) bereitgestellt. Die Oberflächenbeschichtung umfasst mindestens zwei Polysaccharidschichten. Ein Überzug weist aminfunktionelle Gruppen auf, und der andere Überzug weist aminreaktive funktionelle Gruppen auf. Das Polysaccharid der ersten Beschichtungsschicht ist durch Reaktion zwischen aminreaktiven funktionellen Gruppen des Trägers (d.h. Carboxygruppen) und Amingruppen des Polysaccharids der ersten Beschichtungschicht an den Träger kovalent gekuppelt. Das Polysaccharid der zweiten Beschichtungsschicht ist durch Reaktion zwischen den aminfunktionellen Gruppen der ersten Beschichtungsschicht und den aminreaktiven funktionellen Gruppen des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht kovalent gekuppelt. Gleichermaßen bevorzugt ist ein Träger, der aminfunktionelle Gruppen aufweist, und die erste Polysaccharidschicht weist aminreaktive funktionelle Gruppen auf, die zweite Polysaccharidschicht weist aminreaktive funktionelle Gruppen auf und die anschließenden Schichten wechseln zwischen den beiden Polysacchariden.
Aminreaktive funktionelle Gruppen an dem Träger sollen für eine kovalente Bindung der Amingruppen des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht an den Träger zugänglich sein, oder alternativ dazu sollen die aminfunktionellen Gruppen an dem Träger für eine kovalente Bindung der aminreaktiven Gruppen des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht an den Träger zugänglich sein.
Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung beinhaltet einen Träger, wobei das Polysaccharid der ersten Beschichtungsschicht ein Aminodextran ist. Ein Aminodextran ist ein derivatisiertes Glucosepolymer mit Aminogruppen mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 bis etwa 2 000 000, vorzugsweise etwa 500 000. Aminodextran kann gemäß den Anweisungen von US 5,707,877 , Spalten 18-20, und US 5,639,620 , Spalten 21 und 22, oder wie hierin bereitgestellt in kleinem und großem Maßstab hergestellt werden.
Noch eine andere Ausführungsform dieser Erfindung beinhaltet einen Träger, wobei das Polysaccharid der zweiten Beschichtungsschicht Dextran mit aminreaktiven funktionellen Gruppen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aldehyden, Carboxygruppen oder Epoxygruppen mit einem ähnlichen Molekulargewicht wie demjenigen von Aminodextran, ist.
Eine andere spezifische Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Träger, wobei das Polysaccharid der ersten Beschichtungsschicht ein Dextran mit aminreaktiven funktionellen Gruppen ist und das Polysaccharid der zweiten Beschichtungsschicht vorzugsweise ein Aminodextran ist.
Ein Verfahren ist bevorzugt, in welchem der chemische Vorgang der Carbodiimidkonjugation zur Kupplung des Polysaccharids der ersten Beschichtungsschicht an den Träger verwendet wird. Ein anderes Verfahren ist bevorzugt, in welchem die Kupplung des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht in Gegenwart eines schwachen Reduktionsmittels, wie z.B. Natriumcyanoborhydrid, durchgeführt wird. Alternativ dazu kann ein Verfahren verwendet werden, in welchem ein chemischer Vorgang der Carbodiimidkonjugation für das Kuppeln des Polysaccharids der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht verwendet wird. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägers ist ein Verfahren, in welchem die spezifischen Bindungspartner durch Reaktion zwischen den anhängigen funktionellen Gruppen der Oberflächenbeschichtung und den funktionellen Gruppen der spezifischen Bindungspartner an die Oberflächenbeschichtung kovalent gekuppelt werden.
Der Träger kann zwischen den Reaktionsschritten gewaschen werden, um ungebundene Verbindungen zu entfernen und/oder das Reaktionsmedium zu wechseln.
Zum Veranschaulichen dieser Erfindung und in Bezug nun auf 1A wird die Beschichtung von Carboxylatpolystyrolteilchen mit einem Durchmesser von etwa 200 nm beschrieben. Kurz gesagt, werden Carboxylatteilchen zuerst mit Aminodextran(AmDex)-Molekülen (mit mehrfachen Aminogruppen pro AmDex-Molekül) unter Verwendung eines chemischen Vorgangs der Carbodiimid(EDAC)-Konjugation beschichtet. Die Gegenwart von entgegengesetzten Ladungen auf der Perlenoberfläche (-COO^–) und am AmDex (-N⁺H₃) ziehen sich gegenseitig an, und in Gegenwart eines relativ großen Überschusses an AmDex wird die Teilchenoberfläche selbst in Abwesenheit von EDAC schnell und wirksam durch AmDex-Moleküle bedeckt. Auf diese Weise verbindet sich das Polysaccharid spontan mit den Teilchen. Dieses Phänomen führt zu einer erhöhten Konzentration an Aminogruppen in der Nähe der Oberfläche der Carboxylatteilchen, und dies verbessert wiederum die Effizienz des EDAC-Konjugationsverfahrens. Auch minimiert die Gegenwart einer Dextranschicht auf der Oberfläche der Carboxylatteilchen das Teilchenaggregationsproblem, das im Allgemeinen beobachtet wird, wenn die Carboxylatteilchen bei einem pH-Wert unter 7,0 EDAC ausgesetzt werden. Die Zugabe von EDAC an diesem Punkt aktiviert die -COOH-Gruppen an dem Teilchen, die dann mit -NH₂-Gruppen am AmDex reagieren, was zur Bildung einer chemisch stabilen Amidbindung führt. Nur ein Bruchteil der Aminogruppen von dem AmDex-Molekül ist beim Bilden der kovalenten Amidbindung beteiligt, und die übrigen Aminogruppen sind für Reaktionen mit verschiedenen reaktiven Gruppen (z.B. Aldehydgruppen oder Carboxygruppen) verfügbar. Derartige Teilchen werden als einzeln beschichtete Aminoperlen (C-Perlen-AmDex) bezeichnet. Anders als das Einbringen von Aminogruppen unter Verwendung von Diaminen mit kleinem Molekulargewicht (Ethylendiamin, Propylendiamin usw.) und EDAC, eliminiert die Verwendung von AmDex die Notwendigkeit für ein strenges Überwachen des pH-Werts der Reaktion, wodurch das Verfahren deutlich vereinfacht wird.
Die zweite Polysaccharidschicht kann durch Umsetzen des C-Perle-AmDex-Reagenzes mit einem relativ großen Überschuss an Dextranaldehyd (DexAl) mit mehrfachen Aldehydgruppen pro DexAl-Molekül eingebracht werden. Diese spontane Reaktion ist eine Form einer spontanen Verbindung der Polysaccharidschichten. Ein Bruchteil der Aldehydgruppen an einem DexAl-Molekül reagiert mit Aminogruppen am C-Perle-AmDex-Reagens unter Bildung einer Schiffschen Base, die dann mit einem schwachen Reduktionsmittel, wie Cyanoborhydrid (NaBH₃CN) unter Bildung einer chemisch stabilen Kohlenstoff-Stickstoffbindung reduziert werden kann. Da die Reduktion an freien Aldehydgruppen durch NaBH₃CN geringfügig ist, weisen die erhaltenen beschichteten Teilchen reaktive Aldehydgruppen an der Oberfläche auf und können mit aminogruppenhaltigen Molekülen (wie Antikörpern oder anderen Proteinen oder weiteren AmDex-Molekülen) umgesetzt werden. Es soll angemerkt werden, dass mehrfache Aminogruppen an der Oberfläche des C-Perle-AmDex-Reagenzes und mehrfache Aldehydgruppen am DexAl-Molekül vorliegen, was höchstwahrscheinlich zu einer Mehrpunktreaktion mit einem Molekül und einer statistischen Vernetzung dieser beiden Hydrogelschichten führt, was zu einer „Schale" und verbesserten Stabilität des Überzugs führt. Dieses Reagens wird hier als doppelt beschichtete Aldehydteilchen (C-Perle-AmDex-DexAl) bezeichnet.
Die Konjugation eines spezifischen Bindungspartners, wie eines Antikörpers (oder anderer aminogruppenhaltigen Moleküle), an das C-Perle-AmDex-DexAl-Reagens kann durch ein reduktives Aminierungsverfahren durchgeführt werden. Gereinigter Antikörper in nativer Form (nicht modifiziert) wird einfach mit C-Perle-AmDex-DexAl-Reagens in Gegenwart von NaBH₃CN für eine bestimmte Zeitdauer, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder bei 37°C inkubiert. Die übrigen freien Aldehydgruppen werden mit endständigen Gruppen versehen (verschiedene Moleküle, z.B. Carboxymethyloxim oder Carboxymethoxylamin usw., können für diesen Zweck verwendet werden). Schließlich werden die Teilchen mehrmals mit einem geeigneten Puffer (z.B. Tris-Puffer; pH 8,0) gewaschen. Nach dem erneuten Suspendieren der Pellets durch Ultraschall werden die Teilchen vorzugsweise mit Konzentrationen von 1 mg/ml in einem geeigneten Puffer aufbewahrt.
Die vorliegende Erfindung schließt Träger mit mehr als zwei Beschichtungsschichten von Hydrogelen (z.B.: Perle-ADx-DexAl-ADx; Perle-ADx-DexAl-ADx-DexAl; Perle-ADex-CEDex-ADx; Perle-ADex-CEDex-ADx-CEDex; usw.) ein, wobei eine Oberfläche mit ähnlichen Eigenschaften wie die doppelt beschichtete Oberfläche gebildet wird. Bevorzugt sind Träger mit 2 bis 10 Polysaccharidbeschichtungsschichten, besonders bevorzugt sind Träger mit 2 bis 5 Polysaccharidbeschichtungsschichten, wobei die am meisten bevorzugten Träger Träger mit 2 oder 3 Polysaccharidbeschichtungsschichten sind. Sie können analog zu den vorstehend offenbarten Verfahren oder den detailliert in den Beispielen beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Gleichermaßen ist in 1B die Synthese eines Teilchens dargestellt, das mit einer Schicht aus Aminodextran und einer Schicht aus Carboxylethyldextran beschichtet ist.
Die erfindungsgemäßen Träger können zu diagnositschen in-vitro- und/oder in-vivo-Verfahren verwendet werden. Die Träger sind in einem Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung eines Analyts besonders nützlich. Bevorzugte Verfahren zur quantitativen- und/oder qualitativen Bestimmung eines erfindungsgemäßen Analyts sind homogene oder heterogene Assays, in welchen ein oder mehrere spezifische Bindungspartner an einen erfindungsgemäßen Träger gebunden werden können. Die Assays können Sandwich-Assays, konkurrierende Assays oder indirekte Assays sein. Der Träger kann die Funktion eines festen Trägermaterials und/oder einer Markierung aufweisen. In Assays, in welchen Teilchen verwendet werden, können sämtliche Teilchen oder nur ein Teil der Teilchen ein erfindungsgemäßer Träger sein.
Ein bevorzugtes Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung eines erfindungsgemäßen Analyts ist ein Assay, in welchem Substanzen mit einem Abstand voneinander versehen werden, der eine Wechselwirkung, insbesondere eine Energieübertragung zwischen den Substanzen ermöglicht oder verhindert, und wobei der Wechselwirkungsgrad gemessen wird. Die Substanzen und/oder ein oder mehrere spezifische Bindungspartner können mit einem erfindungsgemäßen Träger verbunden werden. Der Begriff „Substanzen" ist so zu verstehen, dass er Vertreter von biologischen und/oder chemischen Substanzklassen bedeutet, die, wenn sie in räumlicher Nähe vorliegen, z.B. in Form von Energiespendern und Energieempfängern miteinander in Wechselwirkung treten können, wie z.B. Photosensibilisierungsmittel und chemisch lumineszierende Mitteln ( EP-A2-0 515 194 ; Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry 42:1518-1526), Photosensibilisierungsmittel und Fluorophore ( WO 95/06877 ; Bystrak et al. (1995) Anal. Biochem. 225:127-134) oder radioaktives Iod¹²⁵ und Fluorophoren (Udenfriend et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:8672-8676) oder Fluorophoren und Fluorophore (Mathis, G. (1993) Clin. Chem. 39:1953-1959) oder Fluorophoren und fluoreszierende Quenchmittel ( US 3,996,345 ).
Eine Wechselwirkung zwischen den Substanzen ist so zu verstehen, dass sie insbesondere eine Energieübertragung – d.h., die direkte Übertragung von Energie zwischen den Substanzen, z.B. mithilfe von Licht oder Elektronenstrahlung sowie durch reaktive chemische Moleküle – bedeutet. Während die Energieübertragung von einer Substanz zur anderen stattfinden kann, ist es auch möglich, dass die Energieübertragung durch eine Kaskade von unterschiedlichen Substanzen verläuft.
Zudem soll der Ausdruck „Wechselwirkung zwischen den Substanzen" auch Verfahren, in welchen die Aktivität einer Substanz durch eine oder mehrere unterschiedliche Substanzen gehemmt oder erhöht wird, z.B. eine Hemmung oder Erhöhung der Enzymaktivität, oder die Hemmung oder Erhöhung oder Veränderung (z.B. Wellenlängenverschiebung, Polarisation) des Lichts, das durch die betroffene Substanz emittiert werden kann, umfassen.
Der Ausdruck „Wechselwirkung zwischen den Substanzen" soll auch so zu verstehen sein, dass er Enzymkaskaden bedeutet. In diesem Fall sind die Substanzen Enzyme, wobei mindestens eines davon das Substrat für ein anderes Enzym liefert, wobei die Enzyme als Folge z.B. der Bildung von „Analyt-spezifischen Bindungspartner"- oder „Analytanalogon-spezifischen Bindungspartner"-Komplexen, mit eine derartigen Abstand voneinander versehen werden, dass die Reaktionsgeschwindigkeit der gekuppelten Substratumwandlung ein Maximum oder ein Minimum erreicht.
Eine wirksame Wechselwirkung zwischen den Substanzen findet gewöhnlich statt, wenn diese Substanzen räumlich benachbart, d.h. z.B. in einem Abstand im Bereich von wenigen μm, insbesondere einem Abstand im Bereich von weniger als 600 nm, vorzugsweise weniger als 400 nm und äußerst besonders bevorzugt weniger als 200 nm sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Wechselwirkung zwischen den Substanzen als Energieübertragung, z.B. mithilfe von (i) kurzlebigen Molekülen, z.B. atomarem Sauerstoff ( EP-A2-0 515 194 ; Ullman et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:5426-5430; Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry 42:1518-1526; WO 95/06877 ; Bystrak et al. (1995) Anal. Biochem. 225:127-134); (ii) kurzwelliger Strahlung, z.B. radioaktiver β-Strahlung (Hart & Greenwald (1979) Molecular Immunology 16:265-267; Udenfriend et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:8672-8676); (iii) und/oder Energieübertragung gemäß Förster (Mathis, G. (1993) Clin. Chem. 39:1953-1959; US 5,527,684 ) bewirkt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Aktivität von Substanzen durch andere Substanzen erhöht oder gehemmt, und dies führt zu einer messbaren Änderung des Signals, z.B. einer Änderung der Intensität oder Polarisation des emittierten Lichts, einer Hemmung oder Erhöhung der Enzymaktivitäten und/oder einer Änderung des Fluoreszenzverhaltens.
Besonders vorteilhafte Ausführungsformen eines erfindungsgemäßen Verfahrens zeichnen sich durch die Tatsache aus, dass eine oder mehrere der Substanzen mithilfe einer spezifischen Wechselwirkung über spezifische Bindungspartner und/oder adsorptiv an einen erfindungsgemäßen Träger, vorzugsweise Teilchen, kovalent gebunden und/oder in den Träger eingebracht werden oder selbst einen Träger oder einen Teil davon darstellen. Im Falle einer kovalenten Bindung werden die Substanzen mithilfe einer chemischen Bindung an den Träger und/oder an etwaige den Träger bedeckende Schalen oder Schichten gebunden.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist die Verwendung der Träger der vorliegenden Erfindung in einem Luminescent Oxygen Channelling Immunoassay (LOCI^TM), wie beschrieben in EP-A2-0 515 194 . In diesem Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Analyts wird mindestens ein spezifischer Bindungspartner an einen erfindungsgemäßen Träger gebunden, umfassend die Schritte: Behandeln eines Mediums, das im Verdacht steht, einen Analyten zu enthalten, unter Bedingungen, unter welchen der Analyt die Menge eines Sensibilisierungsmittels beeinflusst, das in der Lage ist, in seinem angeregten Zustand atomaren Sauerstoff und eine chemilumineszierende Verbindung zu bilden, die in enge Nachbarschaft treten können, so dass der durch das Photosensibilisierungsmittel gebildete atomare Sauerstoff die chemilumineszierende Verbindung aktivieren kann, was in der Folge Licht erzeugt, und Messen dieses Lichts, wobei dessen Menge mit der Analytmenge im Medium in Beziehung gesetzt wird.
Ein anderes Beispiel für das LOCI^TM-Verfahren, in welchem ein erfindungsgemäßer Träger verwendet wird, ist ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Analyts, umfassend die Schritte: (A) Kombinieren entweder gleichzeitig oder vollständig oder teilweise aufeinander folgend (i) eines Mediums, das im Verdacht steht, den Analyten zu enthalten; (ii) eines ersten spezifischen Bindungspartners, der mit einem Sensibilisierungsmittel verbunden ist, das in der Lage ist, in seinem angeregten Zustand atomaren Sauerstoff zu erzeugen; und (iii) eines zweiten spezifischen Bindungspartners, der mit einer Zusammensetzung verbunden ist, die eine chemilumineszierende Verbindung umfasst, die eine Substanz ist, die sich mit atomarem Sauerstoff unter Bildung einer metastabilen Zwischenspezies, die sich mit einer gleichzeitigen oder anschließenden Emission von Licht zersetzen kann, einer chemischen Reaktion unterzieht; (B) Bildenlassen von Komplexen, umfassend den ersten und den zweiten spezifischen Bindungspartner, wobei die Komplexbildung das Sensibilisierungsmittel in enge Nachbarschaft mit der chemilumineszierenden Verbindung bringt, (C) Aktivieren des Sensibilisierungsmittels zum Erzeugen von atomarem Sauerstoff; und Messen der Menge an von der chemilumineszierenden Verbindung emittiertem Licht, wobei das Licht direkt oder umgekehrt proportional zu der Analytmenge im Medium ist. Die Zusammensetzung, die die chemilumineszierende Verbindung umfasst, kann auch ein oder mehrere fluoreszierende Moleküle umfassen, die durch die aktivierte chemilumineszierende Verbindung angeregt werden. Das durch die fluoreszierenden Moleküle emittierte Licht kann zum Bestimmen der Analytmenge im Medium gemessen werden.
Weitere Details im Hinblick auf die bevorzugten Assays unter Verwendung der erfindungsgemäßen Träger sind in EP-A2-0 515 194 , insbesondere in den Beispielen 1-8, offenbart.
Eine andere in-vitro-Verwendung der erfindungsgemäßen Träger ist es, eine Spezies von einer Probe einzufangen oder auszuwählen. Zum Beispiel können Krebszellen durch Binden der Krebszellen an Antikörper, die an erfindungsgemäß hergestellte magnetische Teilchen angelagert sind und dann Durchführen eines magnetischen Abtrennungsschritts leicht von einer Probe entfernt werden. Gleichermaßen können Enzyme an einen erfindungsgemäßen Träger gebunden werden, wodurch es ermöglicht wird, dass sie aus dem Reaktionsgemisch leicht entfernt oder in einem kontinuierlichen Fließverfahren verwendet werden. Eine andere in-vitro-Anwendung für erfindungsgemäße Träger ist die Verwendung von Antikörpern, Lectinen, Oligonukleotiden oder anderen spezifischen Bindungspartnern, die an derartige Träger gebunden werden, um durch den spezifischen Bindungspartner spezifisch gebundene Verbindungen durch Affinität zu reinigen.
Ein erfindungsgemäßer Träger kann auch in vivo bei einem Tier oder einem Menschen angewandt werden, insbesondere, wenn er in einem pharmazeutisch verträglichen Medium angewandt wird. Es ist anerkannt (z.B. WO 96/04017 , WO 96/27394 , EP-A1-0 525 199 ), magnetische und nicht-magnetische Teilchen für Abbildungszwecke, z.B. zum Nachweisen von „Erkrankungsstellen" in vivo, wie Tumoren, Blutgerinnseln oder Entzündungsstellen oder zum Messen des Blutflusses in einem Organ oder der Stoffwechselaktivität in einem Organ zu verwenden. Erfindungsgemäß hergestellte Teilchen sind aufgrund ihrer hydrophilen Beschichtung, die eine unspezifische Aggregatbildung der angewandten Teilchen oder Blutgerinnselbildung verhindert, vorteilhaft. Dieselben Vorteile gelten für erfindungsgemäße Träger, die auch für therapeutische Verfahren, z.B. als Träger von toxischen Arzneistoffen, z.B. zum Zerstören von Tumorzellen; als implantierte Arzneistofffreisetzungssysteme, wie eine Insulinpumpe; oder als Stents zum Verhindern der Stenose eines Blutgefäßes verwendet werden können.
BEISPIELE
Verwendete Abkürzungen

Ab: Antikörper
Acc: Akzeptorperle in einem LOCI^TM-Assay
AmDex (AmDx): Aminodextran
Biotin-X-NHS: Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)-hexanoat
BSA: Rinderserumalbumin
B-IgG: Rinderimmunglobulin G
CEDex: Carboxyethyldextran
CHO: Aldehydgruppe
C-Perle: Chemilumineszierende Perle
DC: doppelt beschichtete Perlen
DexAl: Dextranaldehyd
Dig: Digoxin
DMS: O Dimethylsulfoxid
EDC oder EDAC: 1-Ethyl-3-(dimethylpropyl)carbodiimid
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
MES: 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
NaCl: Natriumchlorid
NHS: N-Hydroxysuccinimid
PBS: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 0,02 M NaPi, 0,14 M NaCl/pH 7,2
Pi: Phosphat
PSA: Prostatspezifisches Antigen
S (S-Perle): Sensibilisierungsperle für einen LOCI^TM-Assay
Sc: einfach beschichtet
Sens-Sav-Perlen: Streptavidin-beschichtete Sensibilisierungsperlen
TAR-Perlen: (Thioxen-, Anthracen-, Rubren-)-Perlen
TRIS-HC: Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydroclorid

Die folgenden Beispiele sind zum Veranschaulichen der Brauchbarkeit der beanspruchten Erfindung bereitgestellt und sollen nicht als Beschränkung der Erfindung verwendet werden. Insbesondere sind die Herstellung von Reagenzien für das LOCI^TM-Verfahren und Assays unter Verwendung des LOCI^TM-Verfahrens beschrieben.
A. Herstellung von Aminodextran (AmDex)
Zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Aminodextran sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zusätzlich sind hier zwei bevorzugte Verfahren bereitgestellt.
Verfahren 1: Hydroxypropylaminodextran (1NH₂/7 Glucose) wurde durch Lösen von Dextran T-500 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) (50 g) in 150 ml H2O in einem 3-Hals-Rundkolben, ausgestattet mit einem mechanischen Rührer und einem Tropftrichter, hergestellt. Zu der vorstehenden Lösung wurden 18,8 g Zn (BF₄)₂ zugesetzt, und die Temperatur wurde mit einem heißen Wasserbad auf 87°C gebracht. Epichlorhydrin (350 ml) wurde unter Rühren über eine Dauer von etwa 30 min zugetropft, während die Temperatur bei 87-88°C gehalten wurde. Das Gemisch wurde für eine Dauer von 4 h gerührt, während die Temperatur zwischen 80 und 95°C gehalten wurde, dann wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt. Chlordextranprodukt wurde ausgefällt, indem dies langsam in 3 l Methanol unter heftigem Rühren gegossen wurde, es wurde durch Filtration gewonnen und über Nacht in einem Vakuumofen getrocknet.
Das Chlordextranprodukt wurde in 200 ml Wasser gelöst und zu 2 l konzentriertem wässrigem Ammoniak (36 %ig) zugesetzt. Diese Lösung wurde für eine Dauer von 4 Tagen bei Raumtemperatur gerührt, dann auf etwa 190 ml an einem Rotationsverdampfer eingeengt. Das Konzentrat wurde in zwei gleiche Chargen aufgeteilt, und jede Charge durch langsames Gießen in 2 l schnell gerührtes Methanol ausgefällt. Das Endprodukt wurde durch Filtration gewonnen und unter Vakuum getrocknet.
Verfahren 2: Hydroxypropylaminodextran wurde durch Lösen von 100 g Dextran T-500 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) in 500 ml Wasser in einem 3-Halsrundkolben mit einem mechanischen Rührer und einem Tropftrichter hergestellt. Der Lösung wurden 45 g Natriumhydroxid, 50 mg EDTA, 50 mg NaBH4, 50 mg Hydrochinon und 200 g N-(2,3-Epoxypropyl)phthalimid zugesetzt. Das Gemisch wurde in einem Wasserbad bei 90°C für eine Dauer von zwei Stunden erwärmt und gerührt. Ein kleiner aliquoter Teil wurde dreimal aus Methanol ausgefällt und durch NMR analysiert – das Erscheinen eines Peaks bei 7,3-7,6 wies auf das Einbringen von Phthalimid hin. Das Hauptreaktionsgemisch wurde durch Zugabe zu 3,5 l Methanol ausgefällt, und der Feststoff wurde aufgefangen. Die Phthalimidschutzgruppe wurde durch Lösen des vorstehenden Produkts in 500 ml 0,1 M Acetatpuffer, Zugabe von 50 ml 35 %igem Hydrazin und Einstellen des pH-Werts auf 3,5 entfernt. Das Gemisch wurde bei 80°C für eine Dauer von 1 Stunde erwärmt, der pH-Wert wurde erneut auf 3,2 eingestellt, und das Gemisch wurde für eine Dauer von einer zusätzlichen halben Stunde erwärmt. Ein aliquoter Teil wurde dreimal in Methanol ausgefällt. Eine NMR zeigte, dass die Phthalimidgruppe nicht mehr vorlag. Das Reaktionsgemisch wurde auf pH 8 neutralisiert und bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Das Produkt wurde durch Tangentialflussfiltration unter Verwendung eines Filters für einen Molekulargewichtsabschnitt von 50 000 gereinigt, mit Wasser, 0,01 M HCl, 0,01 M NaOH und schließlich Wasser gewaschen. Die Produktlösung wurde durch Filtration auf 700 ml eingeengt und dann lyophilisiert. Eine Bestimmung der reaktiven Amine unter Verwendung von Trinitrobenzolsulfonat ergab etwa 1 Amin pro 16 Glucosereste.
B. Herstellung von Dextranaldehyd
Dextran (400 g, 500 kD) wurde in 1,5 l Wasser (Millipore) in einem Becherglas mit 4 l durch Erwärmen bei 70°C unter Overhead-Rühren gelöst. Das Dextran wurde bei 70°C in Portionen von 30-50 g zu Wasser hinzugefügt, wobei jede Portion nach dem Lösen der ersten Portion zugesetzt wurde. Der Overhead-Rührer wurde bei 300-400 UpM eingestellt.
Die heiße Dextranlösung wurde durch einen Frittentrichter (grob) in einen Erlenmeyer-Kolben filtriert, und die filtrierte Lösung wurde in einen 3-Halskolben, voräquilibriert bei 70°C, gegossen. Das Becherglas wurde mit 50 ml heißem Wasser ausgespült, das durch den Frittentrichter in den Erlenmeyer-Kolben filtriert wurde. Dieses Filtrat wurde dem Reaktionsgemisch zugesetzt.
Der Trichter wurde von dem Seitenhals des Kolbens entfernt und ein Doppelzugangs-Claisen-Destillationsaufsatz wurde an seiner Stelle eingesetzt. Der Overhead-Rührer wurde gestartet und bei 600-700 UpM eingestellt, und man ließ die Temperatur der Dextranlösung 70°C erreichen. Die Temperatur des Ölbads wurde bei 72-75°C eingestellt. Die Reaktion wurde unter Argon durchgeführt. Die Lösung von Zn(BF₄)₂, (400 ml, 25 Gew.-% in H₂O, pH 1,8±0,2) wurde in den die Dextranlösung enthaltenden Kolben unter Verwendung eines Trichters auf dem Claisen-Aufsatz gegossen. Der Trichter wurde von dem Claisen-Aufsatz entfernt und durch einen Zugabetrichter (500 ml Kapazität) mit einem druckausgleichenden Seitenarm ersetzt.
Allylglycidylether (500 ml der zuzusetzenden 1,5 1) wurde in den Zugabetrichter (in 3 × 500 ml Portionen) mit 8-10 ml/min zugesetzt, während die Reaktionstemperatur bei 70 ± 2°C gehalten wurde. Die Zugabe des Allylglycidyls wurde fortgesetzt, bis die gesamten 1,5 l zugesetzt waren. Dann wurde die Temperatur des Reaktionsgemischs auf 80°C erhöht. Man ließ die Reaktion unter ständigem Rühren (600-700 UpM) für eine Dauer von 12-13 h bei 80°C unter Argon verlaufen.
Das Reaktionsgefäß wurde aus dem Ölbad entfernt, und man ließ das Reaktionsgemisch auf 30°C abkühlen. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde dann in 6,0 l Wasser gegossen (Nalgene-Behälter mit Hahnventil) und manuell gerührt. Das verdünnte Reaktionsgemisch wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung eines Microgon-Tangentialflussdiafiltrationssystems gereinigt. Das Allyloxydextran wurde auf 1,0-1,5 l eingeengt.
Ein aliquoter Teil (50 ml) des Filtrats wurde entfernt und für analytische Zwecke gefriergetrocknet. Die restliche lösung von Allyloxydextranin Wasser wurde bei 4°C aufbewahrt und für den nächsten Schritt verwendet. Die ¹H- und ¹³C-Kernmagnetresonanz-(NMR-)Spektren des vorstehenden Allyloxydextrans stimmten mit dem erwarteten Produkt überein.
Das Allyloxydextran wurde einer Ozonolyse in einem 4,0 l Becherglas, ausgestattet mit einem Overhead-Rührer unterzogen. Das Gemisch wurde bei 300-350 UpM gerührt, und man ließ es Raumtemperatur erreichen. Ozon wurde durch einen Ozonator gebildet und mithilfe eines Gasspülers, der in die Allyloxydextranlösung eintauchte, bei einem Druck von 9,0 psi und einer Fließgeschwindigkeit von 2,0 lpm (Liter pro Minute) zugesetzt. Zehn ml Heptanol wurden als Schaumhemmer zugesetzt. Die Reaktion wurde durch ¹³C-NMR überwacht; das Verschwinden der olefinischen Resonanzen bei 118 und 134 ppm wurde als Hinweis für die Vollständigkeit der Reaktion verwendet. Die Ozonzugabe wurde für eine Dauer von 5-6 h fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf etwa 10°C abgekühlt. Diesem wurden 50 ml Dimethylsulfid zugesetzt, und das Rühren unter Argonatmosphäre wurde für eine Dauer von 10 h fortgesetzt. Man ließ das Reaktionsgemisch Raumtemperatur erreichen, während es über diese Zeitdauer gerührt wurde (300-350 UpM). Das erhaltene Dextranaldehyd wurde durch Microgon-Ultrafiltration gereinigt.
C. Herstellung von Carboxyethyldextran (CEDex)
Zehn Gramm ungetrocknetes Dextran T-500 wurden in 40 ml Wasser gelöst. Zwanzig ml 10 N Natriumhydroxid wurden zugesetzt, gefolgt von 5,3 g Acrylamid in 40 ml Wasser. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur bis zur Homogenität gerührt und dann in ein Wasserbad von 45°C unter Magnetrühren gegeben. Nach 24 Stunden bei 45°C wurde das Produkt durch langsame Zugabe zu 3 Volumina kräftig rührendem Ethanol ausgefällt. Die Ethanollaugen wurden abdekantiert, das ausgefällte Produkt in 100 ml Wasser gelöst und ein zweites Mal aus 3 Volumina Ethanol ausgefällt. Nach dem Dekantieren der Lauge wurde das Produkt in Wasser gelöst und der pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf 7,3 eingestellt. Das Volumen wurde mit Wasser auf 100 ml gebracht und die Lösung in einem Kühlschrank aufbewahrt.
D. Herstellung von C-28-Thioxen
Einer Lösung von 4-Bromanilin (30 g, 174 mmol) in trockenem DMF (200 ml) wurden 1-Bromtetradecan (89,3 ml, 366 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (62,2 ml, 357 mmol) zugesetzt. Die Reaktionslösung wurde bei 90°C für eine Dauer von 16 h unter Argon erwärmt, bevor sie auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Dieser Reaktionslösung wurden erneut 1-Bromtetradecan (45 ml, 184 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (31 ml, 178 mmol) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde bei 90°C für eine Dauer von weiteren 15 h erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit CH₂Cl₂ (400 ml) verdünnt. Die CH₂Cl₂-Lösung wurde mit 1 N wässriger NaOH (2×), H₂O und Kochsalzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum eingeengt, um ein dunkelbraunes Öl (etwa 110 g) zu erhalten. Eine präparative Säulenchromatographie über Silicagel durch ein System des Typs Waters 500 Prep LC, eluierend mit Hexan, ergab ein gelbes Öl, das hauptsächlich das Produkt (4-Brom-N,N-di(C₁₄H₂₉)-anilin), zusammen mit einem Nebenbestandteil 1-Bromtetradecan enthielt. Letztere Verbindung wurde aus dem Gemisch durch Vakuumdestillation (Siedepunkt 105-110°C, 0,6 mm) entfernt, um 50,2 g (51 %) des Produkts als braunes Öl zurückzulassen. Einem Gemisch aus Magnesiumringen (9,60 g, 395 mmol) in trockenem THF (30 ml) unter Argon wurde eine Lösung des vorstehenden substituierten Anilinprodukts (44,7 g, 79 mmol) in THF (250 ml) zugetropft. Ein paar Kristalle Iod wurden zugesetzt, um die Bildung des Grignard-Reagenzes zu initiieren. Als das Reaktionsgemisch warm wurde und unter Rückfluss zu kochen begann, wurde die Zugabegeschwindigkeit derart reguliert, dass ein sanften Rückfluss beibehalten wurde. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Gemisch unter Rückfluss für eine Dauer von einer zusätzlichen Stunde erwärmt. Die gekühlte Überstandlösung wurde über eine Kannüle in einen Zugabetrichter überführt und (über 2,5 h) einer Lösung von Phenylglycoxal (11,7 g, 87 mmol) in THF (300 ml) bei –30°C unter Argon zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde allmählich auf 0°C über eine Dauer von 1 h erwärmt und für eine weitere Dauer von 30 min gerührt. Das erhaltene Gemisch wurde in ein Gemisch aus Eiswasser (800 ml) und Ethylacetat (250 ml) gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase mit Ethylacetat (3×) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit H₂O (2×), Kochsalzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Abdampfen des Lösungsmittels ergab 48,8 g des Rohprodukts als dunkelgrüne ölige Flüssigkeit. Eine Flash-Säulenchromatographie dieser Flüssigkeit (Gradientelution mit Hexan, 1,5:98,5, 3:97, 5:95 Ethylacetat:Hexan) ergab 24,7 g (50 %) des Benzoinprodukts (LSIMS (C₄₂H₆₉NO₂): [M – H]⁺ 618, 6, ^1H NMR (250 MHz, CDCl₃), stimmte mit dem erwarteten Benzoinprodukt überein. Einer Lösung des Benzoinprodukts von Vorstehendem (24,7 g, 40 mmol) in trockenem Toluol (500 ml) wurden aufeinander folgend 2-Mercaptoethanol (25 g, 320 mmol) und TMSCI (100 ml, 788 mmol) zugesetzt. Die Rekationslösung wurde unter Rückfluss für eine Dauer von 23 h unter Argon erwärmt, bevor sie auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Diesem wurde zusätzliches TMSCI (50 ml, 394 mmol) zugesetzt; und die Reaktionslösung wurde unter Rückfluss für eine weitere Dauer von 3 h erwärmt. Die erhaltene Lösung wurde abgekühlt und mit kalter 2,5 N, wässriger NaOH basisch gestellt und mit CH₂Cl₂ (3×) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit gesättigter wässriger NaHCO₃ (2×) und Kochsalzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum eingeengt, um eine braune ölige Flüssigkeit zu erhalten. Eine präparative Säulenchromatographie über Silicagel unter Verwendung eines Systems des Typs Waters 500 Prep LC (Gradientelution mit Hexan, 1:99, 2:98 Ethylacetat:Hexan) stellte 15,5 g (60 %) des C-28-Thioxens als organgegelbes Öl bereit (LSIMS (C₄₄H₇₁NOS): [M – H]⁺ 661, 6, ¹H NMR (250 MHz, CDCl₃) stimmte mit dem erwarteten C-28-Thioxenprodukt 2-(4-(N,N-Di- (C₁₄H₂₉)-anilino)-3-phenylthioxen überein.
E. Herstellung von chemilumineszierenden Perlen (TAR-Perlen)
Eine 10 %ige Lösung von carboxylierten Latexperlen (Seradyn) (120 ml) wurde auf 93°C in einem Dreihalsrundkolben erwärmt und dann mit 166 ml Ethoxyethanol, 336 ml Ethylenglycol und 12 ml 0,1 M NaOH gemischt. Ein mechanischer Rührer und ein Thermometer wurden zugefügt und das Gemisch unter Rühren auf 95°C gebracht und dann für eine zusätzliche Dauer von 40 min gerührt. In einem getrennten Kolben wurden 2,45 g C-28-Thioxen, 191,8 mg 2-Chlor-9,10-bis(phenylethinyl)anthracen und 323,9 mg Rubren in 264 ml Ethoxyethanol gemischt, und das Gemisch wurde unter Rühren auf 95°C bis zum Lösen erwärmt. Die Farbstofflösung wurde in die Perlenlösung gegossen und für eine Dauer von 20 min bei 95°C gerührt und dann langsam auf etwa 47°C abkühlen gelassen und durch einen Polyesterfilter mit 43 Mikron filtriert. Die Perlen wurden durch Tangentialflussfiltration unter Verwendung einer Microgon-Apparatur mit einem Filter mit 0,05 Mikron gewaschen. Nach Auffüllen des Systems mit Waschlösungsmitteln (1:2 V/V Ethoxyethanol: Ethylenglycol) wurde das gefärbte Perlengemisch zugesetzt. Das Gemisch wurde auf etwa 20 mg/ml eingeengt und dann mit 6 l Waschlösungsmittel und 4,8 1 10 %igem V/V Ethanol in Wasser, eingestellt auf pH 10 mit NaOH, gewaschen. Die Perlen wurden auf etwa 50 mg/ml während des Waschens eingeengt und dann schließlich bei 4°C lichtgeschützt aufbewahrt. Die Endkonzentration wurde in Bezug auf das Gewicht nach Eindampfen eines Aliquots zur Trockne bestimmt.
F. Herstellung von Siliciumtetra-t-butylphthalocyanin
Natriummetall, frisch geschnitten (5,0 g, 208 mmol) wurde zu 300 ml wasserfreiem Methanol in einem 3-Halskolben mit einem Volumen von 2 1, ausgestattet mit einem Magnetrührer, einem Rückflusskühler, einem Trockenröhrchen und einem Gasspüler, zugesetzt. Nach dem vollständigen Lösen des Natriums wurde 4-t-Butyl-1,2-dicyanobenzol (38,64 g, 210 mmol, von TCI Chemicals, Portland, OR) unter Verwendung eines Trichters zugesetzt. Das Gemisch wurde klar, und die Temperatur erhöhte sich auf etwa 50°C. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein kontinuierlicher Strom aus wasserfreiem Ammoniakgas durch den Gasspüler in das Reaktionsgemisch für eine Dauer von 1 h eingebracht. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter Rückfluss für eine Dauer von 4 Stunden erwärmt, während der Ammoniakgasstrome weiter während des Reaktionsverlaufs fortgesetzt wurde, als der Feststoff auszufällen begann. Die erhaltene Suspension wurde zur Trockne eingedampft (Hausvakuum), und der Rückstand wurde in Wasser (400 ml) suspendiert und filtriert. Der Feststoff wurde getrocknet (60°C, Hausvakuum, P₂O₅). Die Ausbeute des Produkts (1,3-Diiminoisoindolin, 42,2 g) war nahezu quantitativ. Dieses Material wurde für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. Zu einem Dreihalskolben mit einem Volumen von 1 l, ausgestattet mit einem Kühler und einem Trockenröhrchen, wurden das vorstehende Produkt (18 g, 89 mmol) und Chinolin (200 ml, Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO) zugesetzt. Siliciumtetrachlorid (11 ml, 95 mmol, Aldrich Chemical Company) wurde mit einer Spritze der gerührten Lösung über eine Dauer von 10 Minuten zugesetzt. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch auf 180-185°C in einem Ölbad für eine Dauer von 1 h erwärmt. Man ließ die Reaktion auf Raumtemperatur abkühlen, und konzentrierte HCl wurde vorsichtig zugesetzt, um das Reaktionsgemisch anzusäuern (pH 5-6). Das dunkelbraune Reaktionsgemisch wurde gekühlt und filtriert. Der Feststoff wurde mit 100 ml Wasser gewaschen und getrocknet (Hausvakuum, 60°C, P₂O₅). Das feste Material wurde in einen Rundkolben mit einem Volumen von 1 l gegeben, und konzentrierte Schwefelsäure (500 ml) wurde unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch wurde für eine Dauer von 4 h bei 60°C gerührt und dann vorsichtig mit zerriebenem Eis (2000 g) verdünnt. Das erhaltene Gemisch wurde filtriert und der Feststoff mit 100 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Der dunkelblaue Feststoff wurde in einen Rundkolben mit einem Volumen von 1 l überführt, konzentrierter Ammoniak (500 ml) wurde zugesetzt, und das Gemisch unter Rückfluss für eine Dauer von 2 h erwärmt und gerührt, auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Der Feststoff wurde mit 50 ml Wasser gewaschen und unter Vakuum (Hausvakuum, 60°C, P₂O₅) getrocknet, um 12 g des Produkts Siliciumtetra-t-butylphthalocyanin als dunkelblauen Feststoff zu erhalten. 3-Picolin (12 g, von Aldrich Chemical Co.), Tri-n-butylamin (wasserfrei, 40 ml) und Tri-n-hexylchlorsilan (11,5 g) wurden zu 12 g des vorstehenden Produkts in einen Dreihalskolben mit einem Volumen von einem Liter, ausgestattet mit einem Magnetrührer und einem Rückflusskühler, zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Rückfluss für eine Dauer von 1,5 h erwärmt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Picolin wurde unter Hochvakuum (Ölpumpe bei etwa 1 mm Hg) zur Trockne abdestilliert. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ gelöst und unter Verwendung einer Silicagelsäule (Hexan) gereinigt, um 10 g reines Produkt Di-(tri-n-hexylsilyl)-siliciumtetra-t-butylphthalocyanin als dunkelblauen Feststoff zu erhalten. (LSIMS: [M – H]⁺ 1364,2, Absorptionsspektren: Methanol: 674 nm (ε 180 000): Toluol 678 nm, ¹H NMR (250 MHz, CDCl₃): δ: –2,4(m, 12H), –1,3(m, 12H), 0,2-0,9(m, 54H), 1,8(w, 36H), 8,3(d, 4H) und 9,6(m, 8H) stimmte mit dem vorstehend erwarteten Produkt überein.
G. Herstellung von Sensibilisierungsperlen, gefärbt mit Siliciumtetra-t-butylphthalocyanin (S-Perle)
Die Sensibilisierungsperlen wurden hergestellt, indem 600 ml Carboxylat-modifizierte Perlen (Seradyn) in einen Dreihalsrundkolben, ausgestattet mit einem mechanischen Rührer, einem Glasstopfen mit einem Thermometer, das an einem Hals angebracht war, und einem Trichter in dem gegenüber liegenden Hals, gegeben wurden. Der Kolben wurde in ein Ölbad, gehalten bei 94±1°C, getaucht. Die Perlen wurden dem Kolben durch den Trichter in dem Hals zugesetzt, und der Perlenbehälter wurde mit 830 ml Ethoxyethanol, 1700 ml Ethylenglycol und 60 ml 0,1 N NaOH gespült, und die Spülung dem Kolben durch den Trichter zugesetzt. Der Trichter wurde durch ein 24-40-Gummiseptum ersetzt. Die Perlen wurden bei 765 UpM bei einer Temperatur von 94±1°C für eine Dauer von 40 min gerührt.
Siliciumtetra-t-butylphthalocyanin (10,0 g) wurde in 300 ml Benzylalkohol bei 60±5°C gelöst, und 85 ml wurden dem vorstehenden Rundkolben durch das Septum mithilfe einer Spritze, erwärmt auf 120±10°C, mit einer Geschwindigkeit von 3 ml pro min zugesetzt. Die restliche Phthalocyaninlösung wurde dann, wie vorstehend beschrieben, zugesetzt. Die Spritze und der kolben, die ursprünglich das Phthalocyanin enthielten, wurden mit 40 ml Benzylalkohol gespült, und die Spülung wurde in den Rundkolben überführt. Nach 15 min wurden. 900 ml entionisiertes Wasser und 75 ml 0,1 N NaOH über eine Dauer von 40 min zugetropft. Man ließ die Temperatur des Ölbads langsam auf 40±10°C absinken und das Rühren wurde dann unterbrochen. Die Perlen wurden dann durch einen Polyesterfilter mit 43 Mikron filtriert und einer Microgon-Tangentiaiflussfiltrationsapparatur (Microgon Inc., Laguna Hills, CA) unter Verwendung von Ethanol:Wasser, 100:0 bis 10:90 unterzogen und dann durch einen Polyesterfilter mit 43 Mikron filtriert.
H. Herstellung von Hydroxypropylaminodextranbeschichteten Sensibilisierungsperlen (S-Perle-AmDex)
Eine Lösung von Hydroxypropylaminodextran wurde mit 2 mg/ml in 50 mM MES (pH 6) hergestellt. Einhundertfünfzig (150) mg Phthalocyanin-Sensibilisierungsperlen in 7,5 ml Wasser wurden zu 7,5 ml der Hydroxypropylaminodextranlösung unter Aufwirbeln zugesetzt. Einhundertachtundachtzig (188) μl EDAC-Lösung (80 mg/ml) in Wasser wurden dem Beschichtungsgemisch unter Aufwirbeln zugetropft. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Das Gemisch wurde mit 12 ml Wasser verdünnt und zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Perlenpellet wurde in 40 ml Wasser durch Ultraschall suspendiert. Die Perlen wurden 3-mal mit Wasser (40 ml pro Waschung) durch wiederholte Zentrifugation und Suspension durch Ultraschall gewaschen. Das endgültige Pellet wurde in 5 ml Wasser suspendiert.
I. Herstellung von Aminodextran-beschichteten chemilumineszierenden Perlen (C-Perle-AmDex)
Das C-Perle-AmDex-Reagens wurde durch Mischen von 1 ml (22 mg/ml) chemilumineszierender Carboxylatperlen (C-Perle-COOH) (Seradyn) mit 1 ml 20 mg/ml A Hydroxypropylaminodextran (MW 500 K) in 0,05 M MES/pH 6,0 in Gegenwart von 3,8 mg/ml EDAC hergestellt. Nach Inkubieren dieses Gemischs für eine Dauer von 16 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln wurden die Perlen einmal mit 2 ml 0,05 M MES/pH 6,0, dann mit 6 ml 0,05 M MES, 1,0 M NaCl/pH 6,0 gewaschen. Schließlich wurden die Perlen erneut in 1 ml 0,05 M MES/pH 6,0 suspendiert, um 22 mg/ml C-Perle-AmDex zu erhalten. Das Waschen wurde durch ein Zentrifugationsverfahren (unter Verwendung einer Zentrifuge des Typs Sorval RC-5B plus oder einer Zentrifuge des Typs Ependorf 5415 C) durchgeführt, und die Pellets wurden durch Ultraschall (unter Verwendung eines Branson-Ultraschallgeräts 450) erneut suspendiert.
J. Beschichtung des C-Perle-AmDex mit Dextranaldehyd zum Erhalt der aldehydreaktiven Gruppen, enthaltend doppelt beschichtete Perlen (C-Perle-AmDex-DexAl)
Das C-Perle-AmDex-DexAl wurde durch Mischen von 1 ml 20 mg/ml DexAl l (MG 600 K, hergestellt im Hause) und 1 ml 22 mg/ml C-Perle-AmDex in 0,05 M MES/pH 6,0 in Gegenwart von 2 mg/ml NaBH₃CN hergestellt. Nach Inkubieren bei 37°C für eine Dauer von 20 Stunden (im Dunkeln) wurden die Perlen einmal mit 4 ml und dann mit weiteren 5 ml MES-Puffer gewaschen. Schließlich wurden die Perlen in 0,5 ml 0,05 M MES, 0,4 % Tween-20/pH 6,0 erneut suspendiert, um eine Konzentration von 40 mg/ml C-Perle-AmDex-DexAl zu erhalten.
K. Markieren des C-Perle-AmDex-DexAl-Reagenzes mit Anti-Digoxin- oder Anti-TSH-Abs
Antikörper-markierte Perlen (C-Perle-AmDex-DexAl-Ab) wurden durch Mischen von gleichen Volumina an Ab-Lösungen (0,15 mg/ml Anti-Dig oder 20 mg/ml Anti-TSH in 0,05 M MES/pH 6,0) und 40 mg/ml C-Perle-AmDex-DexAl in 0,05 M MES, 0,4 % Tween-20/pH 6,0 in Gegenwart von 0,5 mg/ml NaBH₃CN hergestellt. Nach Inkubieren bei 37°C (3 Stunden für Anti-Dig-Perlen und 36 Stunden für Anti-TSH-Perlen) wurden die übrigen Aldehydgruppen mit 0,08 M CMO (Caraboxymethyloxim oder Carboxymethoxylamin) für eine Dauer von 90 Minuten bei 37°C mit endständigen Gruppen versehen. Schließlich wurden die Perlen 3-4 Mal mit geeignetem Puffer (Anti-Dig-Perlen mit BSA-haltigem Tris-Puffer/pH 8,0 und die Anti-TSH-Perlen mit BSA und Zwittergent-Detergens 3-14, enthaltendem Tris-Puffer/pH 8,0) gewasschen. Nach erneutem Suspendieren der Pellets durch Ultraschalll wurden die Perlen mit Konzentrationen von 1 mg/ml aufbewahrt.
L. Herstellung von Carboxyethyldextran-(CEDex-)TAR-Perlen
Hydroxypropylaminodextran-Perlen, die wie vorstehend hergestellt waren, werden mit Carboxyethyldextran in Gegenwart der Vernetzungsmittel EDC und NHS beschichtet. 100 mg Perlen in 50 mM MES-Puffer, pH 5,0-9,0 (10 mg/Perlen/ml) werden mit EDC (1-4 mg von einer Stammlösung: 20 mg/ml in 50 mM MES-Puffer, frisch hergestellt) und NHS (1,2-4,8 mg von einer Stammlösung: 20 mg/ml in 50 mM MES-Puffer, frisch hergestellt) inkubiert. Einfach beschichtete Aminodextran-Perlen werden über Nacht bei Raumtemperatur mit unterschiedlichen Mengen an CEDex inkubiert. Das Perle/CEDex-Verhältnis wird von 1:1 bis 200:1 variiert. Das bevorzugte Standardverhältnis beträgt 5:1, z.B. 10 mg Perlen und 2 mg CEDex. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur auf einem Rollmischer durchgeführt. Nach der Reaktion werden die Perlen gewaschen und erneut in 50 mM MES-Puffer, pH 5,0, durch Zentrifugation gepuffert.
M. Kupplung von CEDex-Perlen an Anti-PSA-Antikörper
Die erzeugten doppelt beschichteten Perlen können zum Kuppeln von Antikörper, Antigen, Peptiden und/oder rekombinanten Proteinen verwendet werden. Beispielsweise werden die Perlen mit Anti-PSA-Antikörpern zur Bestimmung von Prostata-spezifischem Antigen beschichtet.
Verschiedene Mengen an Antikörper (250, 500 und 100 μg/10 mg Perlen, Antikörper 92-283/029 von Dade Behring Marburg GmbH) wurden an 10 mg CEDex-Perlen gekuppelt. Die Daten (nicht dargestellt) weisen darauf hin, dass 250 μg Ab für einen leistungskräftigen PSA-Assay ausreichend sind. Grundsätzlich muss die optimale Menge für jeden Assay bewertet werden.
467 μl DC-CEDex-COOH-Perlen-Lösung (konz. 21,4 mg/ml), 40 μl EDC (10 mg/ml EDC in MES-Puffer), 48 μl NHS (10 mg/ml NHS in MES-Puffer) und 20 μl Tween-20 (10 % Tween-20, surfact amps 20) werden gemischt und für eine Dauer von 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nafch 15-minütiger Inkubationszeit werden 325 μl MES-Puffer und 100 μl Antikörperlösung (250 μg Antikörper in MES-Puffer) zugesetzt, und die Mischung wird für eine Dauer von 3-16 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Rollmischer inkubiert. Die beschichteten Perlen werden durch Zentrifugation gereinigt (Zentrifugat 30 Minuten bei 16 000 UpM bei 10°C [Beckmann Rotor 80 Ti/10 ml Zentrifugenfläschchen], der Überstand wird verworfen, 1 ml MES-Puffer wird zugesetzt, aufgewirbelt und mit Ultraschall behandelt (Ultraschallgerät 250 in wassergekühltem CUPHORN, 2×5 Puls, Ausgabe: 4, Gleichstrom 50 %), 2 ml MES-Puffer werden zugesetzt, es wird zentrifugiert (siehe vorstehend), der Überstand wird verworfen, und es werden 0,95 ml Puffer (0,1 M Tris-HCl, 0,3 NaCl, 25 mM EDTA, 1 mg/ml BSA, pH 8,0) zugesetzt.
N. Herstellung von biotinyliertem Anti-PSA-Antikörper
572 μl Anti-PSA-Antikörper (4 mg/ml Antikörper (92-284/03, Dade Behring Marburg GmbH) in 0,1 M NaHCO₃) werden mit 7,3 μl Biotin-X-NHS von Pierce Chemical Co. (5 mg/ml in DMSO) gemischt. Nacht einer Inkubationszeit von 2 Stunden werden die Reaktionsgemische auf einer PD-10-Säule mit PBS gereinigt.
Diese mit Anti-Dig-, Anti-TSH- und Anti-PSA-Antikörper markierten chemilumineszierenden Perlen (hergestellt durch Doppelbeschichtungsmarkierungschemie) wurden auf deren Leistungsfähigkeit in LOCI^TM-Assays getestet.
Die Serum-zu-Serum-Variationen (oder Matrixwirkung) dieser Perlen wurden durch das folgende Verfahren getestet: Anti-Dig-Antikörper-markierte Chemiperlen und Digoxin- (oder Digoxigenin-)-markierte Sensibilisierungsperlen wurden miteinander umgesetzt, um die C-Perlen-Ab_Dig·Dig-S-Perlen-Komplexe zu bilden, dann wurde das LOCI^TM-Signal durch wiederholte Beleuchtung dieser Perlenkomplexe und Zählen der emittierten Photonen erzeugt. Die Ergebnisse sind in 2 und 3 dargelegt.
2 zeigt einen typischen Verlauf für einen LOCI^TM-Digoxin-Assay. 3 zeigt die Ergebnisse eines LOCi^TM-TSH-Assays durch Vergleichen von chemilumineszierenden Perlen, die erfindungsgemäß doppelt beschichtet sind (Acc-AmDex-DexAl-Ab), und Perlen, die mit einer einzelnen Beschichtung aus Dextranaldehyd beschichtet sind (Acc-AmDex-DexAl-Ab).
Der Assay wurde durch Mischen von 20 μl 0,5 mg/ml C-Perle-Ab_Dig-Reagens und 360 μl Standard-LOCI^TM-Puffer eingeleitet. Nach Inkubieren dieses Gemischs für eine Dauer von 108,5 Sekunden bei 37°C wurden 40 μl 0,1 mg/ml S-Perle-Dig-Reagens und 580 μl Standard-LOCI^TM-Puffer zugesetzt, und das Testgemisch wurde für eine Dauer von 170 Sekunden bei 37°C weiter inkubiert. Schließlich wurden diese Röhren für eine Dauer von 1 Sekunde mit einer Lichtquelle mit 680 nm beleuchtet, und die emittierten Photonen wurden für eine Dauer von 1 Sekunde (nach dem Abschalten des Beleuchtungslichts) gezählt. Diese Beleuchtungs- und Zählvorgehensweisen wurden 10-mal wiederholt (10 Zyklen).
Wie aus 3 ersichtlich, war die Serum-zu-Serum-Variation unter Verwendung der durch den chemischen Vorgang der Doppelbeschichtung hergestellten Perlen besser (CV = 1,54 %). Die Bezugsperle war Anti-Dig-Antikörper-markierte Chemieerle, wies jedoch eine einzelne Beschichtung aus Dextran auf, und die Serum-zu-Serum-Variation war deutlich höher (CV = 3,32 %).
4 zeigt eine typische Standardkurve für einen TSH-LOCI^TM-Assay. Chemilumineszierende Perlen wurden mit Antikörper an der β-Kette des TSH-Moleküls (Ab₂) markiert und der zweite Antikörper (spezifisch für die β-Kette des TSH-Moleküls, jedoch unterschiedlich und kein konkurrierendes Epitop, das für Ab₂ verwendet wurde) wurde biotinyliert (Ab₁-Biotin). Der Assay wurde durch Mischen einer 50 μl Probe oder von TSH-Kalibratoren mit 25 μl 50 μg/ml C-Perle-Ab₂ und 25 μl 6,4 μg/ml Ab₁-Biotin-Reagenzien in LOCi^TM-Puffer durchgeführt. Dieses Assaygemisch wurde für eine Dauer von 7,3 Minuten bei 37°C inkubiert, dann wurden 50 μl 0,4 mg/ml S-Perle-Streptavidin und 750 μl Puffer zugesetzt und die Inkubation bei 37°C für eine zusätzliche Dauer von 7,1 Minuten fortgesetzt. Schließlich wurden die Teströhrchen für eine Dauer von 1 Sekunde mit einer Lichtquelle von 680 nm beleuchtet und die emittierten Photonen für eine Dauer von 1 Sekunde (nach Abschalten des Beleuchtungslichts) gezählt. Diese Beleuchtungs- und Zählvorgehensweisen wurden 6 Mal wiederholt (6 Zyklen).
5 zeigt die Ergebnisse eines Versuchs zum Untersuchen der Wirkung der nicht-spezifischen Bindung an LOCI^TM-Teilchen, die die Matrixwirkung hervorbringt. Serumproben von 20 hypophysektomierten Patienten (TSH-Konzentrationen in diesen Serumproben wurden als gleich oder nahezu gleich 0,0 μl U/ml berichtet) wurden in einem TSH-LOCI^TM-Assay unter Verwendung eines C-Perle-Ab₂-Reagenzes, hergestellt durch den chemischen Vorgang der Doppelbeschichtung, getestet. Das Assayprotokoll war das gleiche wie für 4 beschrieben. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die Matrixwirkung größtenteils aufgrund der Doppelbeschichtung der LOCI^TM-Chemiperlen erliminiert wurde.
Zur Herstellung einer Anti-TSH-markierten Chemieerle (C-Perle-Ab₂) durch ein Doppelbeschichtungsverfahren wurde die Wirkung der Ab-Konzentration im Markierungsreaktionsgemisch untersucht. Wie in 6 dargestellt, zeigten die Ergebnisse, dass eine höhere Ab-Konzentration während der Markierung zu einem Chemiperlen-Ab-Reagens mit besserer Leistungsfähigkeit im TSH-LOCI^TM-Assay führte. Dieser TSH-LOCI^TM-Assay wurde nach der folgenden Vorgehensweise durchgeführt: 50 μl TSH-Kalibratoren (0,0 oder 1,0 μl U/ml TSH) in Pferdeserum wurden mit 25 μl R1 (Chemieerle, markiert mit variierenden Konzentrationen von Anti-TSH-Ab₂) und 25 μl R2 (biotinyliertes Anti-TSH-Ab₁) für eine Dauer von etwa 7,3 Minuten bei 37°C umgesetzt, dann durch Reaktion mit 800 μl R3 (Streptavidin-markierte Sensibilisierungsperlen) für eine weitere Dauer von 7,1 Minuten bei 37°C, und schließlich wurde das LOCI^TM-Signal gelesen.

Ein PSA-(Prostata-spezifisches Antigen)-Assay wurde durchgeführt, um die Carboxyethyldextran-beschichteten Perlen zu testen. 40 μl Puffer (0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 0,3 M NaCl, 25 mM EDTA, 0,1 % BSA, 0,1 % Dextran T-500, 0,1 % Triton X-405), 25 μl Anti-PSA-Konjugat (6,4 μg/ml Antikörper in 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 0,3 M NaCl, 25 mM EDTA, 1,6 % BSA, 0,1 % Dextran T-500, 0,1 % Triton X-405, 0,2 % B-IgG), 25 μl Anti-PSA-CEDex-Perlen (50 μg/ml in 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 0,3 M NaCl, 25 mM EDTA, 1,6 % BSA, 0,1 % Dextran T-500, 0,1 % Triton X-405, 0,2 % B-IgG) und 10 μl Serumprobe werden inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 4,5 Minuten werden der Puffer und 50 μl Sensibilisationsmitel (400 μg/ml in 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 0,3 M NaCl, 25 mM EDTA, 0,1 % BSA, 0,1 % Dextran T-500, 0,1 % Triton X-405) zugesetzt. PSA-Assay-Ergebnisse

Konzentration			Signal
PSA [ng/ml]	Standardabweichung	Variationskoeffizient	Zählungen (n = 3)	Standard-abweichung	Variationskoeffizient
0,0		11,8 %	3117,3	128	4,1 %
0,1	0,0	0,9 %	4782,3	9,5	0,2 %
1,3	0,01	0,7 %	18218	105	0,6 %
6,1	0,11	1,8 %	76778	1487	1,9 %
11,6	0,27	2,4 %	164711	3964	2,4 %
54,8	1,08	2,0 %	797016	15554	2,0 %
102,6	1,7	1,6 %	1436440	21361	1,5 %

39 Mammakarzinomseren wurden im PSA-Assay mit DC-CEDex-Perlen getestet. Diese PSA-negativen Serumproben werden als Indikator für das potenzielle Vorkommen von Matrixstörungen verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass keine Matrixstörungen vorliegen, die die Bestimmung von PSA in den Serumproben stören. Der Variationskoeffizient dieser 39 Serumproben beträgt 5,1 % mit einer Standardabweichung von 142 Zählungen.

Claims

Mit Polysaccharid beschichteter Träger umfassend einen Träger mit einer Beschichtung aus mindestens zwei aufeinander folgenden Polysaccharidschichten, wobei sich eine erste Polysaccharidschicht durch funktionelle Gruppen, die entgegengesetzt geladen sind, oder durch funktionelle Gruppen, die kovalent kuppeln, mit einer zweiten Polysaccharidschicht spontan verbindet, und wobei es sich bei der ersten und der zweiten Polysaccharidschicht durch ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften um unterschiedliche Polysaccharide handelt.
Träger nach Anspruch 1, wobei sich jede der nachfolgenden Polysaccharidschichten durch funktionelle Gruppen, die entgegengesetzt geladen sind, oder durch funktionelle Gruppen, die kovalent kuppeln, mit jeder einer vorangehenden Polysaccharidschicht spontan verbindet.
Träger nach Anspruch 1, wobei die Polysaccharide anhängige funktionelle Gruppen aufweisen und die funktionellen Gruppen der nachfolgenden Polysaccharidschichten in Bezug auf die funktionellen Gruppen der vorangehenden Polysaccharidschichten entgegengesetzt geladen sind.
Träger nach Anspruch 1, wobei die Polysaccharide anhängige funktionelle Gruppen aufweisen und die nachfolgenden Polysaccharidschichten durch Reaktion zwischen den funktionellen Gruppen der nachfolgenden Schichten mit den funktionellen Gruppen der vorangehenden Schichten an die vorangehenden Polysaccharidschichten kovalent gekuppelt sind.
Träger nach Anspruch 4, wobei die funktionellen Gruppen der aufeinander folgenden Polysaccharidschichten zwischen aminfunktionellen Gruppen und aminreaktiven Gruppen wechseln.
Träger nach Anspruch 5, wobei die aminreaktive funktionelle Gruppe eine Aldehydgruppe oder eine Carboxygruppe ist.
Träger nach Anspruch 1, wobei sich die erste Polysaccharidschicht durch funktionelle Gruppen, die entgegengesetzt geladen sind, oder durch funktionelle Gruppen, die kovalent kuppeln, mit dem Träger spontan verbindet.
Träger nach Anspruch 7, wobei die funktionellen Gruppen des Trägers und die funktionellen Gruppen der ersten Polysaccharidschicht entgegengesetzt geladen sind.
Träger nach Anspruch 7, wobei der Träger und die Polysaccharide anhängige funktionelle Gruppen aufweisen und die erste Polysaccharidschicht durch Reaktion zwischen den funktionellen Gruppen des Trägers und den funktionellen Gruppen der ersten Polysaccharidschicht an den Träger kovalent gekuppelt sind.
Träger nach Anspruch 9, wobei es sich bei den funktionellen Gruppen des Trägers um eine aminreaktive funktionelle Gruppe handelt und bei den funktionellen Gruppen der ersten Polysaccharidschicht um aminfunktionelle Gruppen handelt.
Träger nach Anspruch 10, wobei die aminreaktive funktionelle Gruppe eine Aldehydrgruppe oder eine Carboxygruppe ist.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Trägermaterial ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus natürlichen, synthetischen oder modifizierten natürlich vorkommenden Polymeren wie Agarose, Cellulose, Nitrocellulose, Celluloseacetat, Polyvinylchlorid, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polyacrylamid, Polymethacrylat, Polyethylenterephthalat, Nylon, Polyvinylbutyrat oder Polyacrylat; Siliconen; Gläsern; Keramiken; anorganischen Pulvern wie Siliciumdioxid, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; magnetischen Materialien; Metallen; oder einer Kombination davon.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Streifen, Lagen, Stäben, Röhren, Mulden, Mikrotitrationsplatten, Perlen und Teilchen.
Träger nach Anspruch 13, wobei der Träger ein magnetisches oder nicht-magnetisches Teilchen ist.
Träger nach Anspruch 14, wobei der Träger ein carboxyliertes Latexteilchen ist.
Träger nach Anspruch 14, wobei das Teilchen eine Größe im bereich von 0,1 bis 10 μm, vorzugsweise 0,1 bis 5 μm, am meisten bevorzugt 0,15 bis 3 μm aufweist.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Träger mit mindestens einem Reportermolekül verbunden ist.
Träger nach Anspruch 17, wobei das Reportermolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Farbstoffen, Radiomarkierungen, Sensibilisierungsmitteln, fluoreszierenden Mitteln und/oder chemilumineszierenden Mitteln.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das Polysaccharid der ersten Beschichtungsschicht ein Aminodextran ist.
Träger nach Anspruch 19, wobei das Aminodextran ein Molekulargewicht von 10.000 bis 2.000.000 aufweist.
Träger nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die äußerste Polysaccharidschicht mindestens eine anhängige funktionelle Gruppe aufweist.
Träger nach Anspruch 21, wobei die anhängige funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminen, Aldehyden, Carboxygruppen, Maleimidogruppen oder Sulfhydrylgruppen.
Träger nach den Ansprüchen 21 oder 22, wobei die anhängige funktionelle Gruppe an einen spezifischen Bindungspartner gebunden ist.
Träger nach Anspruch 23, wobei der spezifische Bindungspartner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antikörperfragmenten, Rezeptoren, Liganden, Oligonukleotiden, Oligonukleotid-bindenden Proteinen, Lectinen, Haptenen, Antigenen, Immunglobulin-bindenden Proteinen, Avidin, Streptavidin oder Biotin.
Verfahren zur Herstellung des mit Polysaccharid beschichteten Trägers nach Anspruch 1, umfassend: (a) kovalentes Kuppeln der ersten Polysaccharidschicht an den Träger durch Reaktion zwischen den aminreaktiven funktionellen Gruppen des Trägers und den aminfunktionellen Gruppen der Polysaccharide der ersten Beschichtungsschicht; und (b) kovalentes Kuppeln der zweiten Polysaccharidschicht an die erste Polysaccharidschicht durch Reaktion zwischen den aminfunktionellen Gruppen der ersten Polysaccharidschicht und den aminreaktiven funktionellen Gruppen der zweiten Polysaccharidschicht.
Verfahren zur Herstellung des mit Polysaccharid beschichteten Trägers nach Anspruch 1, umfassend: (a) kovalentes Kuppeln der ersten Polysaccharidschicht an den Träger durch Reaktion zwischen den aminfunktionellen Gruppen des Trägers und den aminreaktiven funktionellen Gruppen der Polysaccharide der ersten Beschichtungsschicht; und (b) kovalentes Kuppeln der zweiten Polysaccharidschicht an die erste Polysaccharidschicht durch Reaktion zwischen den aminreaktiven funktionellen Gruppen der ersten Polysaccharidschicht und den aminfunktionellen Gruppen der zweiten Polysaccharidschicht.
Verfahren nach den Ansprüchen 25 oder 26, wobei der chemische Vorgang der Carbodiimidkonjugation zum Kuppeln der Polysaccharide der ersten Beschichtungsschicht an den Träger verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei das Kuppeln der Polysaccharide der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht in Gegenwart eines schwachen Reduktionsmittels wie Natriumcyanoborhydrid durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei der chemische Vorgang der Carbodiimidkonjugation zum Kuppeln der Polysacharide der zweiten Beschichtungsschicht an die erste Beschichtungsschicht verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 29, wobei die spezifischen Bindungspartner durch Reaktion zwischen den anhängigen funktionellen Gruppen der Beschichtungsschicht und den funktionellen Gruppen der spezifischen Bindungspartner kovalent an die Beschichtungsschicht gekuppelt werden.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Verwendung in diagnostischen in-vitro- und/oder in-vivo-Verfahren.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Verwendung in einem Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung eines Analyts.
Zusammensetzung umfassend den Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 24 in einem pharmazeutisch verträglichen Medium.
Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren.
Verfahren zur quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines Analyts in einer Probe unter Verwendung des Trägers nach einem der Ansprüche 1 bis 24.