EP1695083A1 - Homogenes nachweisverfahren - Google Patents

Homogenes nachweisverfahren

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EP1695083A1
EP1695083A1 EP04820583A EP04820583A EP1695083A1 EP 1695083 A1 EP1695083 A1 EP 1695083A1 EP 04820583 A EP04820583 A EP 04820583A EP 04820583 A EP04820583 A EP 04820583A EP 1695083 A1 EP1695083 A1 EP 1695083A1
Authority
EP
European Patent Office
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specific binding
analyte
binding partner
antibody
signal
Prior art date
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Ceased
Application number
EP04820583A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Trier
Carsten Schelp
Hrair Kirakossian
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Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Original Assignee
Dade Behring Marburg GmbH
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Filing date
Publication date
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Application filed by Dade Behring Marburg GmbH filed Critical Dade Behring Marburg GmbH
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Ceased legal-status Critical Current

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    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Definitions

  • the invention relates to methods for the quantitative or qualitative detection of an analyte in a sample and suitable reagents therefor.
  • Binding tests are frequently used to detect analytes, in which the presence, absence or amount of the analyte in a sample can be inferred from a specific binding of the analyte to be detected to analyte-specific binding partners.
  • Immunoassays or methods in which oligo- or polynucleotides are hybridized are examples of binding tests.
  • the so-called “heterogeneous binding tests” are characterized by one or more separation steps and / or washing steps.
  • the separation can be carried out, for example, by immunoprecipitation, precipitation with substances such as polyethylene glycol or ammonium sulfate, filtration, magnetic separation, and binding to a solid phase.
  • a solid phase exists made of porous and / or non-porous, usually water-insoluble material. It can have a wide variety of shapes such as: Vessel, tube, microtitration plate, sphere, microparticles, rods, strips, filter or chromatography paper, etc.
  • one of the analyte-specific binding partners is usually bound to a solid phase and is used for Separation of the binding complex "analyte / analyte-specific binding partner" from the liquid phase, while the other analyte-specific binding partner bears a detectable label (eg an enzyme, a fluorescence or chemiluminescence label, etc.) for the detection of the binding complex.
  • a detectable label eg an enzyme, a fluorescence or chemiluminescence label, etc.
  • test methods are further divided into so-called one-step Sandwich tests in which the two specific binding partners are incubated simultaneously with the sample and in two-step sandwich tests in which the sample is first incubated with the solid phase reagent and after a separation and washing step the solid phase-bound binding complex of analyte and analyte-specific binding partner is incubated with the detection reagent.
  • test batch which contains the analyte-specific binding partners, the signal-forming components and the sample, is measured after or even during the binding reaction without a further separation and / or washing step and the corresponding measurement signal is determined.
  • homogeneous immunoassays see also Boguslaski & Li.
  • the antibody reagents are incubated together with the sample and the measurement of the signal is carried out during and / or after the incubation without separation In other words, there is no separation of the antibody-bound analyte from the free analyte or from antibodies which have not bound any analyte.
  • Homogeneous and heterogeneous binding tests can also be carried out in the form of a so-called "sandwich assay".
  • the analyte is bound by a solid-phase-associated analyte-specific binding partner and an analyte-specific binding partner which is associated with a component of a signal-forming system
  • Sandwich immunoassays can form antibodies or antigens or haptens as the analyte-specific binding partners.
  • analyte is an antibody.
  • petitive binding assay competes "sample analyte and reagent analyte (for example, a” modified analyte ", such as a labeled or labeled analyte, analyte fragment or analyte) for binding to a limited amount of analyte-specific binding partners.
  • reagent analyte for example, a” modified analyte ", such as a labeled or labeled analyte, analyte fragment or analyte
  • analyte-specific binding partners In many binding tests, however, great difficulties arise in the preparation of the reagents, since the binding of the analyte-specific binding partners to solid phases or particulate components of a signal-forming system (e.g. microparticles) often results in activity losses and / or changes in properties (e.g. with regard to conformation) in the analyte-specific binding partners bound in this way or stability). This is especially true if the bound analyte-specific binding partners are proteins, such as Antibodies or enzymes.
  • the detection of an analyte can be carried out by using an avidin-coated solid phase as the universal solid-phase reagent, to which the biotinylated analyte-specific binding partner is bound.
  • an avidin-coated solid phase as the universal solid-phase reagent, to which the biotinylated analyte-specific binding partner is bound.
  • a biotinylated analyte-specific binding partner is used which, for example, can bind to a streptavidin / enzyme complex used as a universal detection reagent. In these tests, however, separation steps, such as washing steps, are a necessary part of the test procedure.
  • EP-0 356 964, EP-0 349 988 and EP-0 444 561 it is therefore considered essential for the feasibility of such a homogeneous test that the analyte-specific binding partner is monovalent with respect to the universal reagent, ie the latter is only one Binding site for the universal reagent (eg streptavidin latex particles) has.
  • the inventors point out that the measurement signal formation is dependent on the formation of particle pairs, which each consist of a sensitizer and a chemiluminescer particle (Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry, 42: 1518-1526).
  • a disadvantage of such methods is that the number of binding sites on the corresponding analyte-specific binding partner must be precisely controlled.
  • the method according to the invention solves this problem by providing universal reagents (specific binding partners X or Y, each associated with a component of a signal-forming system), which are independent of the analyte-specific reagents (analyte-specific binding partners R1 and R2) to the specific ones Requirements can be set, and the detection of analytes with high sensitivity and accuracy.
  • this invention also solves the following general problem of homogeneous binding tests, namely the opposite one Requirements for optimal differentiation and optimal sensitivity:
  • concentration of the reagents should be limited so that the background signals are as low as possible, and on the other hand the reagents should be highly concentrated and highly marked in order to achieve a sufficient signal change per unit of time.
  • the analyte-specific binding partners R1 and / or R2 according to the invention are characterized in that they have more than one binding site for the specific binding partner X or Y associated with components of a signal-forming system.
  • Universal reagents, the components are preferably used in the process according to the invention of a signal-forming system, which can interact with one another over very short distances, for example in the form of an energy transfer.
  • the binding sites of the analyte-specific binding partners for the respective universal reagents preferably consist of small molecules, e.g. B. haptens such as digoxigenin, biotin, DNP or FITC exist, which were preferably covalently bound to the analyte-specific binding partner, the analyte-specific activity or binding capacity of R1 or R2 is generally not or hardly affected.
  • the binding sites can also be part of the unchanged analyte-specific binding partner.
  • the analyte-specific binding partner could e.g. be a human IgG antibody that has multiple binding sites that are specifically recognized by anti-human IgG antibodies of another species.
  • a preferred object of the invention is a homogeneous method for the quantitative or qualitative detection of an analyte in a sample, the analyte-specific binding partner R1 having specific binding sites for the specific binding partner X, which is associated with a component of a signal-forming system, and the analyte-specific binding partner R2 specific Binding sites for the specific binding partner Y, which. is associated with a component of a signal-forming system, characterized in that R1 and / or R2 has more than one binding site for the respective specific binding partner associated with components of a signal-forming system.
  • a particular advantage of the invention is that the specific binding partners X and / or Y (for example avidin, streptavidin, etc.) do not have to be saturated as described in EP-0 138 297 by adding free “specific binding sites” (for example biotin) ,
  • This method according to the invention is particularly preferably a homogeneous binding test, in particular a homogeneous immunoassay.
  • this homogeneous binding test can be carried out, inter alia, in the form of a sandwich assay, an indirect immunoassay or a competitive binding test.
  • a “quantitative detection” the amount, concentration or activity of the analyte in the sample is measured.
  • Quantitative detection also encompasses semi-quantitative methods which only record the approximate amount, concentration or activity of the analyte in the sample or can only serve to provide a relative indication of the amount, concentration or activity.
  • qualifying detection is the detection of the presence or absence of the analyte or its activity in the sample at all or the indication that the amount, concentration or activity of the analyte in the sample is below or above a certain or more certain threshold values.
  • analyte is to be understood as the substance to be detected in the method according to the invention. Examples of an analyte are listed in EP-A2-0 515 194 on pages 8-15.
  • the analyte can be a member of a specific binding pair.
  • the analyte may have one binding site (monovalent, usually a hapten) or several binding sites (polyvalent). In immunochemical tests, such a binding site is often also referred to as an epitope.
  • the analyte can be a single substance or a group of substances that have at least one common binding site exhibit.
  • a monovalent analyte usually has a molecular weight of approximately 100 to 2000, in particular 125 to 1000. Many oligopeptides, oligonucleotides, oligosaccharides, drugs, drugs, metaobolites, pesticides etc. are included in the term monovalent analyte.
  • a polyvalent analyte has usually a molecular weight of over 2000, mostly over 10,000. Examples of polyvalent analytes are polypeptides, polysaccharides, nucleic acids, cells, cell components including chromosomes, genes, mitochondria and other cell organelles, cell membranes, etc. Often proteins are the substances to be detected.
  • Such proteins may be members of a family of proteins whose members are characterized by similar structural features and / or by a similar biological function.
  • analytically interesting protein families are proteins from pathogens, immunoglobulins, cytokines, enzymes, hormones, tumor markers, metabolic markers, tissue-specific antigens, histones, albumins,. Globulins, skieroproteins, phosphoproteins, mucins, chromoproteins, lipoproteins, nucleoproteins, glycoproteins, proteoglycans, receptors, HLA, coagulation factors, heart attack markers (e.g. myoglobin, troponin, pro-BNP, etc.), etc.
  • Other analytically interesting substances are, for example, single or double-stranded oligo and polynucleotides
  • sample is to be understood as the material that presumably contains the substance to be detected (“analyte”).
  • sample includes, for example, biological fluids or tissues, in particular of humans and animals, such as blood, plasma, serum, sputum, exudate, bronchoalveolar lavage, lymph fluid, synovial fluid, seminal fluid, vaginal mucus, feces, urine, cerebrospinal fluid, hair, skin, tissue samples or sections , Also included are cell culture samples, vegetable fluids or tissues, forensic samples, water and. Sewage samples, food, pharmaceuticals.
  • sample also encompasses a pretreated sample which presumably contains the substance to be detected (“analyte”) in a form possibly released or amplified by carrier substances:
  • analyte a substance to be detected
  • Some samples have to be pretreated in order to make the analyte accessible for the detection method or to remove interfering sample components.
  • Such pretreatment of samples may include the separation and / or lysis of cells, the precipitation, the hydrolysis or the denaturation of sample components such as proteins, the centrifugation of samples, the treatment of the sample with organic solvents such as alcohols, especially methanol; treating the sample with detergents.
  • the sample is placed in another, usually aqueous, medium - y - transferred, which should not interfere with the detection method if possible.
  • the analyte can also be amplified. Amplification of nucleic acids leads, for example, to the generation of one or more copies of the nucleic acid chain to be detected. Such amplification methods are well known to the person skilled in the art, for example “polymerase chain reaction” (PCR), “ligase chain reaction” (LCR), “amplification using Q beta replicase”, “nucleic acid sequence based amplification” (NASBA), “single primer amplification” "(ASPP) and others.
  • an “analyte-specific binding partner” is either to be understood as a specific binding partner that is able to bind specifically to the analyte,
  • a “modified analyte” is generally a substance which is capable of binding at least one analyte-specific binding partner, but which differs from the sample analyte in that there are no or additional binding sites, for example a biotinylated analyte or an analyte which is associated with a component of a signal-forming system.
  • a modified analyte is used, for example, in competitive tests.
  • a “specific binding partner” is understood to mean a member of a specific binding pair.
  • the members of a specific binding pair are two molecules, each of which has at least one structure complementary to a structure of the other molecule, the two molecules being linked via a bond
  • the term molecule also includes molecular complexes such as, for example, enzymes that consist of apo and coenzyme, proteins that consist of several subunits, lipoproteins consisting of protein and lipids, etc.
  • Specific binding partners can occur naturally but also, for example, substances produced by means of chemical synthesis, microbiological techniques and / or genetic engineering processes.
  • specific bin can now be used using phage display libraries, synthetic peptide databases or using "recombinatorial antibody libraries" selection partner (Larrick & Fry (1991) Human Antibodies and Hybridomas, 2: 172-189).
  • binding partner examples include: thyroxine-binding globulin, steroid-binding proteins, antibodies, antigens, haptens, enzymes, lectins, nucleic acids, repressors, oligo- and polynucleotides, protein A, protein G, avidin, streptavidin, biotin, complement component C1q, nucleic acid-binding proteins, etc.
  • Specific binding pairs are, for example: antibody-antigen, antibody-hap ' ten, digoxigen / anti-digoxigen-antibody, • fluorescin / anti-fluorescein antibody,
  • nuclease nucleotide is usually nucleic acid chains which are at least partially complementary to sections of the nucleic acid chain to be detected.
  • antibody is an immunoglobulin, eg, IgD, IgE, IgG i, IgG 2a, IgG 2b, IgG 3, IgG 4, IgM, to understand an immunoglobulin of the class or subclass of IgA in the sense of this invention.
  • An antibody has at least one binding site (often called a paratope) for an epitope (often also called an antigenic determinant) on an antigen or hapten, such as its spatial structure and / or the presence of polar and / or apolar groups
  • the binding site of the antibody is complementary to the epitope.
  • the antigen-antibody reaction or the hapten-antibody reaction works according to the so-called "key-keyhole principle", and is usually to a high degree specific, ie the Antibodies are able to distinguish small deviations in the primary structure, in the charge, in the spatial configuration and in the steric arrangement of the antigen or hapten.
  • the so-called “complementarity determining regions” of the antibody contribute to the binding of the antibody to the antigen or hapten.
  • the term "antigens” includes monovalent and polyvalent antigens.
  • a polyvalent antigen is a molecule or a complex of molecules to which more than one immunoglobulin can bind at the same time, while with a monovalent antigen only one antibody can bind at a time.
  • a hapten is usually a molecule that is not immunogenic by itself, but that is usually bound to a carrier for immunization purposes.
  • antibody is not only to be understood to mean complete antibodies but also expressly antibody fragments, such as
  • Antibody fragments can be broken down, for example, by enzymatic cleavage of
  • Antibody aggregates, polymers and conjugates can be generated by a variety of methods, e.g. by heat treatment, reaction with substances such as glutaraldehyde, reaction with immunoglobulin-binding molecules, biotinylation of antibodies and subsequent reaction with streptavidin or avidin, etc.
  • An antibody in the sense of this invention can be a monoclonal or a polyclonal antibody.
  • the antibody can be prepared by the usual methods, e.g. by immunization of humans or animals, e.g. Mouse, rat, meerschleich, rabbit, camel, horse, sheep, goat, chicken (see also Messerschmid (1996) BlOforum, 11: 500-502), and then collecting the antiserum; or by establishing hybridoma cells and then purifying the secreted antibodies; or by cloning and expression of the nucleotide sequences or modified versions thereof, which encode the amino acid sequences which are responsible for the binding of the natural antibody to the antigen and / or hapten.
  • Antibodies can also be produced, if necessary with the help of genetic engineering methods in plants - such as Yeast cells - (Fischer et al. (1999) Biol. Chem., 380: 825-839; Hiatt et al. (1992) Genetic Engineering, 14: 49-64)), animal and prokaryotic cells (see for example WO 95/25172) as well as isolated human cells.
  • plants - such as Yeast cells - (Fischer et al. (1999) Biol. Chem., 380: 825-839; Hiatt et al. (1992) Genetic Engineering, 14: 49-64)
  • animal and prokaryotic cells see for example WO 95/25172 as well as isolated human cells.
  • a “signal-forming system” can be one or more components, at least one component being one verifiable label.
  • a label is any molecule that can itself produce a signal or can induce the production of a signal, such as a fluorescent substance, a radioactive substance, an enzyme, or a chemiluminescent substance.
  • the signal can be detected or measured, for example, on the basis of the enzyme activity, the luminescence, the light absorption, the light scattering, the emitted electromagnetic or radioactive radiation, or a chemical reaction.
  • a “label” is capable of generating a detectable signal itself, so that no further components are necessary. Many organic molecules absorb ultraviolet and visible light, whereby the energy transmitted by the light absorption can bring these molecules into an excited energy state, and the absorbed energy in the form emit light of a different wavelength than that of the incident light, and yet other labels can directly generate a detectable signal, such as radioactive isotopes, dyes or magnetic and non-magnetic microparticles.
  • the signal-producing system includes all the components required for signal generation, such as Substrates, coenzymes, quenchers ,. Accelerators, additional enzymes, substances that react with enzyme products, catalysts, activators, cofactors, inhibitors, ions etc.
  • Suitable labels are, for example, enzymes including horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose-6 Phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, glucose oxidase, ⁇ -galactosidase, luciferase, urease and acetylcholinesterase; dyes; fluorescent substances including fluorescein isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, ethidium bromide, 5-dimethylaminonapthalene-1-sulfonyl chloride and fluorescent rare earth chelates; chemiluminescent substances including luminol, isoluminol, acridinium compounds, olefin, enol ether
  • a signal-generating system can also comprise components which can interact with one another in the vicinity of one another, for example in the form of energy donors and energy receivers such as photosensitizers and chemiluminescent substances (EP-A2-0 515 194), photosensitizers and fluorophores (WO 95 / 06877), radioactive iodine 125 and fluorophores (Udenfriend et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672-8676), fluorophores and fluorophores (Mathis (1993) Clin. Chem. 39: 1953-1959) or Fluorophores and fluorescence quencher (US 3,996,345).
  • photosensitizers and chemiluminescent substances EP-A2-0 515 194
  • photosensitizers and fluorophores WO 95 / 06877
  • radioactive iodine 125 and fluorophores Udenfriend et al. (1985) Proc. Natl. Acad
  • Interaction between the components is the direct transfer of energy between the components, e.g. through light or electron radiation as well as via short-lived reactive chemical molecules.
  • This also includes processes in which the activity of a component is inhibited or enhanced by one or more others, for example the inhibition or increase in the enzyme activity or the inhibition, increase or change (for example wavelength shift, polarization) of the electromagnetic component emitted by the affected component Radiation.
  • the interaction between the components also includes enzyme cascades.
  • the components are enzymes, at least one of which supplies the substrate for another, so that a maximum or minimum reaction rate of the coupled substrate conversion results.
  • An effective interaction between the components usually takes place if they are spatially adjacent, for example within a distance range of a few ⁇ m, in particular within a distance range of less than 600 nm, preferably less than 400 nm, very particularly preferably less than 200 nm.
  • this comprises.
  • Microparticles are often used as a solid phase and / or as a label.
  • the term “microparticles” is understood to mean particles which have an approximate diameter of at least 20 nm and not more than 20 ⁇ m, usually between 40 nm and 10 ⁇ m, preferably between 0.1 and 10 ⁇ m, particularly preferably between 0.1 and 5 ⁇ m, very particularly preferably between 0.15 and 2 ⁇ m.
  • the microparticles can have a regular or irregular shape. They can be spheres, spheroids, spheres with more or less large cavities or pores organic, inorganic material or a mixture or combination of the two.
  • microparticles can consist of a porous or non-porous, a swellable or non-swellable material.
  • the microparticles can have any density, but particles with a density that are preferred are preferred Density of the water approximates as about 0.7 to about 1.5 g / ml.
  • the preferred microparticles are in w ssrigen solutions suspendable and maximally stable in suspension. They may be translucent, partially translucent, or opaque.
  • the microparticles can consist of several layers, such as the so-called “core-and-shell” particles with a core and one or more enveloping layers.
  • microparticles includes, for example, dye crystals, metal sols, silica particles, glass particles, magnetic particles, polymer particles, oil drops , Lipid particles, dextran, and protein aggregates.
  • Preferred microparticles are particles which can be suspended in aqueous solutions and consist of water-insoluble polymer material, in particular of substituted polyethylenes.
  • Latex particles for example made of polystyrene, acrylic acid polymers, methacrylic acid polymers, acrylonitrile polymers, acrylonitrile butadiene styrene, are very particularly preferred.
  • Latex particles with reactive groups on their surface such as carboxyl, amino or Aldehyde groups that allow covalent binding, for example, of specific binding partners to the latex particles.
  • reactive groups on their surface such as carboxyl, amino or Aldehyde groups that allow covalent binding, for example, of specific binding partners to the latex particles.
  • the production of latex particles is described for example in EP 0 080 614, EP 0 227 054 and EP 0 246 446.
  • association is to be understood broadly and includes, for example, a covalent and a non-covalent bond, a direct and an indirect bond, the adsorption to a surface and the inclusion in a depression or a cavity, etc.
  • a covalent bond For example, the specific binding partner is bound to a label by means of a chemical bond.
  • a covalent bond between two molecules if at least one atomic nucleus of one molecule shares electrons with at least one atomic nucleus of the second molecule.
  • non-covalent bond examples include surface adsorption, inclusion in cavities or the binding of two specific binding partners
  • specific binding partners can also be indirectly bound to the label via specific interaction with other specific binding partners illustrated:
  • a biotinylated anti-fluorescein antibody can be bound to the label via label-bound avidin.
  • a microparticle can have a coating of one or more layers, e.g. from proteins, carbohydrates, biopolymers, organic polymers or mixtures thereof, for example to suppress or prevent the non-specific binding of sample components to the particle surface, or to achieve improvements in terms of suspension stability, storage stability, shaping stability or resistance to UV radiation, for example Light, microbes or other destructive agents. So this coating can in particular from protein layers or polymer layers, such as. B. cyclodextrins, dextrans, hydrogels, albumin or polyalbumin exist, which have been applied covalently or adsorptively on the microparticles.
  • R1 and / or R2 can be bound to components of the signal-forming system before, during or after the binding reaction with the analyte via X and / or Y.
  • the sample can first be incubated with the analyte-specific binding partners R1 and R2 and then the specific binding partners X and Y are added.
  • a different order of reagent addition can also take place.
  • the sample is first mixed with the analyte-specific binding partners R1 and R2 in a sequential or simultaneous sequence and then the components of the signal-forming system with the binding partners X and Y are added to the mixture in a sequential or simultaneous sequence ,
  • the number of binding sites of the analyte-specific binding partner R1 according to the invention for the specific binding partner X should be at least 2, preferably at least 5, particularly preferably at least 10 and very particularly preferably at least 15 and the number of binding sites of the analyte-specific binding partner R2 according to the invention for the specific binding partner Y should be at least 2, preferably at least 5, particularly preferably at least 10 and very particularly preferably at least 15.
  • the analyte-specific binding partners R1 and R2 according to the invention can also be the same or different analyte-specific binding partners.
  • a monoclonal antibody can be used both as analyte-specific binding partner R1 and as analyte-specific binding partner R2 if the analyte has more than one epitope for this antibody.
  • the analyte-specific binding partners R1 and R2 can both bind the analyte specifically.
  • the analyte-specific binding partners can, for example, be analyte-specific antibodies in the case of a sandwich immunoassay or, if the analyte itself is an antibody, its antigen or a "modified antigen" or an antigen analogue. It should be a competitive test setup one of the analyte-specific binding partners R1 and R2 according to the invention is a modified analyte.
  • binding sites of the analyte-specific binding partner R1 according to the invention for the specific binding partner X are preferably haptens.
  • Particularly preferred as binding sites of the analyte-specific binding partner R1 according to the invention are biotin, digoxigenin, fluorescein, single-stranded nucleic acid chains, dinitrophenol.
  • other molecules that are a member of a specific binding pair can also be used.
  • binding sites of the analyte-specific binding partner R2 according to the invention for the specific binding partner Y are preferably haptens.
  • Particularly preferred as binding sites of the analyte-specific binding partner R2 according to the invention are biotin, digoxigenin, fluorescein, single-stranded nucleic acid chains, dinitrophenol.
  • other molecules that are a member of a specific binding pair can also be used.
  • the specific binding partners X and Y according to the invention can be the same or different specific binding partners.
  • the specific binding partner X according to the invention is preferably avidin, streptavidin, anti-digoxigenin antibodies, anti-dinitrophenol antibodies, single-stranded nucleic acid chains or anti-hapten antibodies. However, it can also be an enzyme, an enzyme substrate or an antibody that is able to bind specific polypeptides, oligopeptides or enzymes.
  • the specific binding partner Y according to the invention can also be avidin, streptavidin, anti-digoxigenin antibodies, anti-dinitrophenol antibodies, single-stranded nucleic acid chains or anti-hapten antibodies. However, it can also be an enzyme, an enzyme substrate or an antibody that is able to bind specific polypeptides, oligopeptides or enzymes.
  • components of the signal-forming system are brought into a distance from one another which creates an interaction, in particular an energy transfer, between them Components allowed. The extent of this interaction is then measured for quantitative or qualitative detection of the analyte in the sample.
  • the method is particularly suitable for sandwich assays and indirect immunoassays.
  • components of the signal-forming system are placed at a distance from one another which have no or only a very slight interaction, in particular no or only very little energy transfer, between these components allowed. The remaining extent of this interaction is then measured for quantitative or qualitative detection of the analyte in the sample.
  • This method is particularly suitable for competitive binding tests.
  • Carrier molecules are introduced to which both the analyte-specific
  • Binding partner as well as the binding sites can be bound. It is therefore advantageous in the method according to the invention if R1 is one or more analyte-specific binding partners which are associated with a carrier molecule, the carrier molecule being binding sites for the specific one
  • Binding partner X can have. It is also advantageous if it is also
  • R2 is one or more analyte-specific binding partners that deal with a
  • Carrier molecule are associated, wherein the carrier molecule can have binding sites for the specific binding partner Y.
  • R1 and / or R2 are each associated with such a carrier molecule.
  • Suitable carrier molecules are, for example, proteins, for example antibodies, enzymes, albumins such as bovine serum albumin or human serum albumin, or protein polymers, dextrans, cyclodextrins, dendrimers or similar structures.
  • Particularly preferred protein polymers or aggregates can consist of antibodies, albumin molecules, enzymes or mixtures thereof which are associated with one another, preferably covalently bound.
  • a carrier molecule > biotinylated dextran and biotinylated protein polymers (eg biotinylated antibody polymers).
  • a particularly preferred carrier molecule can be prepared as described in Example 7.
  • murine antibodies preferably murine IgG antibodies
  • carrier molecules according to the invention can also be produced from enzymes, antibodies (e.g. antibodies, in particular IgG antibodies, from the mouse or the goat), albumins or mixtures thereof.
  • the binding sites for the specific binding partner X or Y e.g. Biotin, digoxigenin, fluorescein, single-stranded nucleic acid chains, dinitrophenol, etc., can be bound to these protein polymers using methods known to those skilled in the art, covalent binding being preferred.
  • An analyte-specific binding partner associated with a carrier molecule can be produced, for example, as follows:
  • the analyte-specific binding partner preferably an antibody, particularly preferably an antibody fragment, is obtained by methods known to those skilled in the art, e.g. by means of coupling reagents, bound to the carrier molecule. This bond should be as covalent as possible.
  • Suitable carrier molecules are, for example, biotinylated dextran (see Example 5) or the other carrier molecules described above, in particular those such as the antibody polymer described in Example 7.
  • the binding sites for the specific binding partner X or Y can be introduced before or as described in Example 7 after the binding reaction between analyte-specific binding partner and carrier molecule.
  • analyte-specific binding partner can be bound to a carrier molecule.
  • several carrier molecules can also be bound to one analyte-specific binding partner.
  • Another object of this invention is a carrier molecule which is associated with one or more analyte-specific binding partners, preferably covalently linked.
  • the carrier molecule is a protein polymer, for example covalently linked to one another Antibodies ' (see Example 7), albumin molecules, enzymes or mixtures thereof, which may additionally have binding sites, for example biotin, digoxigenin, fluorescein, single-stranded nucleic acid chains, dinitrophenol, etc., for a specific binding partner X or Y.
  • the number of binding sites should be at least 2, better more than 5, preferably more than 10, particularly preferably more than 15, very particularly preferably more than 18 per carrier molecule which is associated with one or more analyte-specific binding partners.
  • the analyte-specific binding partner in this embodiment according to the invention is preferably an antibody or an antibody fragment, an antigen, a hapten or a nucleic acid chain.
  • Analyte-specific binding partners which are associated with the carrier molecules according to the invention are also called conjugate below. These can of course not only be used in homogeneous binding tests but also advantageously in heterogeneous binding tests.
  • a conjugate according to the invention consists of a carrier molecule which is associated with one or more analyte-specific binding partners, this conjugate having additional binding sites for a specific binding partner X or Y.
  • the carrier molecule consists of dextran, cyclodextrin, dendrimers or of linked antibodies, linked albumin molecules, linked enzymes or linked mixtures thereof. Their binding should preferably be covalent.
  • the additional binding sites of the conjugate according to the invention can be biotin, digoxigenin, fluorescein, dinitrophenol or single-stranded nucleic acid chains.
  • the carrier molecule is covalent to one or more analyte-specific Binding partner bound.
  • the conjugate according to the invention should have at least 2, preferably more than 5, particularly preferably more than 10, very particularly preferably more than 15 and optimally more than 18 additional binding sites for the specific binding partner X or Y.
  • a conjugate in which the carrier molecule consists of antibodies covalently linked to one another, preferably IgG antibodies from the mouse or the goat, is very particularly preferred.
  • Another embodiment of the invention is a reagent which contains one or more of these conjugates and a test kit which contains such a reagent.
  • the conjugates according to the invention can be used in a homogeneous or heterogeneous binding test (for example an immunoassay) for the quantitative or qualitative detection of an analyte in a sample.
  • a binding test according to the invention in particular a homogeneous binding test, a conjugate according to the invention which has specific binding sites for the specific binding partner X associated with a component of a signal-forming system is used for the quantitative or qualitative detection of an analyte in a sample.
  • a further conjugate according to the invention which has specific binding sites for the specific binding partner Y associated with a component of a signal-forming system, is additionally used for the quantitative or qualitative detection of an analyte in a sample.
  • the number of binding sites for the specific binding partner X or Y should be at least 2, preferably at least 5, particularly preferably at least 10 and very particularly preferably at least 15.
  • X and Y can be the same or a different specific binding partner.
  • Preferred binding partners X and Y are avidin, streptavidin, anti-digoxigenin antibodies, anti-dinitrophenol antibodies, single-stranded nucleic acid chains, anti-hapten antibodies, enzymes, enzyme substrates or antibodies, which contain specific polypeptides, oligopeptides or enzymes bind, used.
  • a binding test preferably a homogeneous binding test, using one or more of the conjugates according to the invention is very particularly preferred within the meaning of this invention, components of the signal-forming system being brought into a distance from one another as a result of the binding of the analyte-specific binding partners, which interaction, in particular one Energy transfer between these components is permitted and the extent of this interaction is measured or, as a result of the binding of the analyte-specific binding partners, components of the signal-forming system are brought into a distance from one another which has no or only very little interaction, in particular no or only very little energy transfer, between them Components allowed and the remaining extent of this interaction is measured.
  • microparticles in particular latex particles, are preferably used as components of the signal-forming system.
  • photosensitizers associated with microparticles and chemiluminescent substances associated with microparticles are very particularly preferably used as components of the signal-forming system.
  • microparticles in particular latex particles
  • Sensitizers associated with microparticles are very particularly preferred as components of the signal-forming system. in particular photosensitizers, and chemiluminescent substances associated with microparticles.
  • a microparticle is a further subject of this invention, in particular a latex particle, to which a conjugate according to the invention is bound via a specific binding partner X or Y bound to the microparticle and its use in a method according to the invention.
  • a microparticle which is associated as a component of a signal-forming system with photosensitizers or with chemiluminescent substances, is preferred.
  • a particularly preferred embodiment of the method according to the invention is a test based on the LOCI method, which is described in detail in EP-0 515 194. This is based on the use of photosensitizers and so-called acceptors as signal-generating components.
  • the photosensitizers generate singlet oxygen on exposure, which reacts with the acceptors, which are chemiluminescent components.
  • the activated chemiluminescent component produces light, which is measured.
  • the analyte is bound, for example, to an analyte-specific binding partner R1, which may be associated with a carrier molecule, which is bound to so-called sensitizer particles by means of the specific binding partner X.
  • the sensitizer molecules associated with the sensitizer particle can generate singlet oxygen in the excited state. This singlet oxygen can react with the chemiluminescent compounds, which are associated with so-called chemiluminescent particles, the metastable compound formed again disintegrating to produce a flash of light.
  • the analyte-specific binding partner R2 which can be associated with a carrier molecule, is bound to the chemiluminescer particles by means of the specific binding partner Y. Since singlet oxygen is ⁇ stable in aqueous solutions only a short time, are associated with analyte-specific binding partner chemiluminescer particles energized by the formation of a sandwich complex in close proximity to, for example, by light sensitizer particles have fallen, excited to emit light. The wavelength of the emitted light to be measured can be changed by appropriate fluorescent dyes in the chemiluminescer particles.
  • the sample is preferably first incubated with the analyte-specific binding partners R1 and R2 and then the specific binding partners X and Y, which are associated with the sensitizer or chemiluminescer particles, are added.
  • the analyte-specific binding partner R1 is associated with a component of a signal-forming system and the analyte-specific binding partner R2 has specific binding sites for the specific binding partner Y, which is associated with a component of a signal-forming system, R2 being more than one Binding site for the respective specific binding partner Y associated with components of a signal-forming system.
  • a reagent in liquid or lyophilized form is an object of this invention which contains one or more of the carrier molecules according to the invention described above, each of which is associated with one or more analyte-specific binding partners, or which contains the microparticles according to the invention.
  • a test kit containing such a reagent is also encompassed by this invention. This also applies to the use of this reagent and / or the test kit for carrying out a homogeneous or heterogeneous binding test for the quantitative or qualitative detection of an analyte in a sample, preferably for carrying out one of the homogeneous methods described in the patent claims.
  • test kit for performing the homogeneous binding test according to the invention.
  • This test kit is characterized in that it contains an analyte-specific binding partner R1, which has more than one specific binding site for the specific binding partner X, which is associated with a component of a signal-forming system, and in that it contains an analyte-specific binding partner R2, which has more than one has specific binding site for the specific binding partner Y, which is associated with a component of a signal-forming system.
  • test kit according to the invention can also additionally contain the specific binding partners X and / or Y associated with components of a signal-forming system. Furthermore, the test kits according to the invention can also contain a package insert, dilution buffer, standards, controls, system reagents and / or further reagents and materials (e.g. cuvettes, sampling devices) required for carrying out the test.
  • a package insert e.g. dilution buffer, standards, controls, system reagents and / or further reagents and materials (e.g. cuvettes, sampling devices) required for carrying out the test.
  • test kits according to the invention preferably contain an analyte-specific binding partner R1, which consists of one or more analyte-specific binding partners, which contain biotinylated dextran, biotinylated protein polymers, biotinylated antibody polymers or a are associated with another carrier molecule and / or an analyte-specific binding partner R2, which consists of one or more analyte-specific binding partners which are associated with biotinylated dextran, biotinylated protein polymers, biotinylated antibody polymers or another carrier molecule.
  • R1 an analyte-specific binding partner
  • R2 which consists of one or more analyte-specific binding partners which contain biotinylated dextran, biotinylated protein polymers, biotinylated antibody polymers or another carrier molecule.
  • sensitizer and chemiluminescer particles are described in detail in EP 0 515 194, Clin. Chem. (1996) 42: 1518-1526 and Proc. Natl. Acad. Be. (1994) 91: 5426-5430.
  • the particles can e.g. Wear dextran coatings and additionally have bound streptavidin (see also Proc. Natl. Acad. Sei. (1994) 91: 5426-5430).
  • the production of a variant of sensitizer and chemiluminescer particles is described by way of example below (see also EP 0 515 194, example 8, for further details):
  • a solution of chlorophyll-a in benzyl alcohol (1.0 ml; 0.6 mM) is added to 8.0 ml of benzyl alcohol which has been heated to 105 ° C.
  • a suspension of latex beads (175 nm, carboxyl-modified latex, Bangs Laboratories, Carmel, IN) in water (10%; 1.0 ml) is added to the benzyl alcohol solution.
  • the mixture is stirred at 105 ° C for 5 minutes and then cooled to room temperature.
  • 10 ml of ethanol are added and the mixture is centrifuged.
  • the pellet is resuspended in a 1: 1 water-ethanol mixture (10 ml) and then centrifuged again. The same procedure is repeated with water and the pellet is then taken up in physiological saline solution.
  • chemiluminescent particles 20 ml of the carboxyl-modified latex particle suspension (10% suspension in water) are mixed with 20 ml of 2-ethoxyethanol. The mixture is heated to 90 ° C. 20 ml of a solution of 10 mM dioxen, 20 mM europium chelate with the agent 3- (2-thienoyl) -1, 1,1 trifluoroacetone (Kodak, CAS # 14054-87-6) (EuTTA) and 60 mM trioctylphosphine oxide (TOPO) in 2-ethoxyethanol are added to the particle suspension. The mixture is further heated at 97 ° C for 7 minutes.
  • the coupling conditions during the incubation 50 mg particles / ml coupling, 0.5 mg sodium cyanoborohydride / ml coupling, 2 mg streptavidin / 20 mg particles.
  • the supernatant was separated by centrifugation and the particles were resuspended in coupling buffer (with 0.6 M NaCl, Merck). The supernatant was then separated off again by centrifugation and the particles in storage buffer (0.1 M Tris HCl, 0.3 M NaCl, 25 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.1% Dextran T-500, 0.1% Zwittergent 3-14, 0.01% gentamycin, 15 ppm ProClin-300, pH 8.0) and resuspended.
  • sensitizer particles with 3 mg of anti-digoxigenin antibody (Mab DIG 2H6, Dade Behring Inc.) and 0.15 mg of sodium cyanoborohydride (Sigma, S 8628) in a coupling buffer (0.05 M ⁇ -morpholino) -ethanesulfonic acid; Serva, Art. 29834) combined and incubated for 24 hours at + 37 ° C.
  • the coupling conditions during the incubation 32.8 mg particles / ml coupling, 6.6 mg antibody / ml coupling, 0.33 mg sodium cyanoborohydride / ml coupling, 3 mg antibody / 15 mg particles.
  • the supernatant was separated by centrifugation and the particles were resuspended in coupling buffer (with 0.6 M NaCl, Merck). The supernatant was then separated off again by centrifugation and the particles in storage buffer (0.1 M Tris HCl, 0.3 M NaCl, 25 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.1% Dextran T-500, 0.1% Zwittergent 3-14, 0.01% gentamycin, 15ppm ProClin-300, pH 8.0) and resuspended.
  • coupling buffer with 0.6 M NaCl, Merck.
  • storage buffer 0.1 M Tris HCl, 0.3 M NaCl, 25 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.1% Dextran T-500, 0.1% Zwittergent 3-14, 0.01% gentamycin, 15ppm ProClin-300, pH 8.0
  • Chemiluminescencer particles acceptor ParticleP with anti-digoxigenin or anti-troponin: Acceptor particles were coupled analogously to the coupling "Sensitizer particles with anti-digoxigenin” with antibodies directed against digoxigenin or troponin.
  • Universal reagent A (acceptor particles with streptavidin) is used in combination with universal reagent B (sensitizer particles with anti-digoxigenin) or universal reagent A (acceptor particles with anti-digoxigenin) is used in combination with universal reagent B (sensitizer particles with streptavidin) used the following examples.
  • Conjugate K1 biotinated anti-PSA antibody
  • Conjugate K2 (anti-PSA antibody labeled with digoxigenin): The anti-PSA antibody (MAK ⁇ PSA> 92-283 / 029 Dade Behring Marburg GmbH) was treated with digoxigenin according to the instructions / instructions for use DIG-Antibody Labeling Kit (Boehringer Mannheim Biochemica, order no. 1367200, implementation: protein labeling with DIG-NHS LMonoclonal antibodies).
  • the anti-PSA antibody (MAK ⁇ PSA> 92-284 / 03, Dade Behring Marburg GmbH) was used different amounts of biotin molecules and the anti-PSA antibody (MAK ⁇ PSA> 92-283 / 029, Dade Behring Marburg GmbH) conjugated with different amounts of digoxigenin molecules.
  • the results of the antibody pairs are shown in the following table.
  • Table 3 PSA assay based on antibodies, with a different number of binding sites for the specific binding partners X and Y. Measurement signal given in "Counts”.
  • the conjugate is then desalted over a PD-10 column with phosphate buffer 0.1 M pH 6.0.
  • phosphate buffer 0.1 M pH 6.0 Manufacture of activated biotin dextran
  • 1.7 mL of the antibody-SATA solution (1 mg / mL) are mixed with 509 ⁇ L of the FlukaBioDex-GMBS solution (1.32 mg / mL). This mixture is incubated for 2 hours at 37 ° C. and then stopped with 220 ⁇ L 0.1 M n-ethylmaleimide solution.
  • the purification / desalination is carried out using Sephacryl S300 (diameter 1.6 cm, gel bed height 90 cm, application quantity approx. 2 mL) with 0.1 M TRIS / HCl, 150 mM NaCI pH 7.4.
  • the fractions containing the conjugate were pooled and concentrated to 1.7 mL ( «0.65 mg / mL).
  • 1.7 mL of the antibody SATA solution (1 mg / mL) are mixed with 102 ⁇ L of the FlukaBioDex-GMBS solution (1.32 mg / mL). This mixture is incubated for 2 hours at 37 ° C. and then stopped with 180 ⁇ L 0.1 M n-ethylmaleimide solution.
  • the purification / desalination is carried out using Sephacryl S300 from Fluka (diameter 1.6 cm, gel bed height 90 cm, application amount approx. 2 mL) with 0.1 M TRIS / HCl, 150 mM NaCI pH 7.4.
  • the fractions containing the conjugate were pooled and concentrated to 1.7 mL ( «0.64 mg / mL).
  • Table 4 PSA assay using dextran-antibody-biotin conjugates. Measurement signal specified in "Counts”.
  • Conjugate K2 (anti-Rubella antibody labeled with digoxigenin):.
  • the anti-rubella antibody (MAK ⁇ Rubella> 93-9 / 08, Dade Behring Marburg GmbH) was digoxigenin according to the instructions / instructions for use DIG-Antibody Labeling Kit (from Boehringer Mannheim Biochemica, order no. 1367200, implementation: protein -Marking with DIG-NHS 1.Monoclonal antibodies).
  • the components were mixed and incubated as follows: 10 ⁇ l sample, 1 + 9 parts diluted in RF absorbent 40 ⁇ l assay buffer 25 ⁇ l conjugate K1 (biotinylated anti-human IgM antibody, 8 ⁇ g / ml) and conjugate K2 (digoxigenized Anti-Rubella antibody, 2 ⁇ g / ml) 25 ⁇ l Rubella antigen, 4 ⁇ g / ml) 453.5 seconds incubation time at + 37 ° C 75 ⁇ l assay buffer 25 ⁇ l acceptor particles with anti-digoxigenin (0.05 mg / ml) 50 ⁇ l sensitizer particles with streptavidin (0, 4 mg / ml) 432.5 seconds incubation time at + 37 ° C measurement
  • Example 7 Comparison of a standard biotin conjugate with a biotinylated carrier molecule Fab 'conjugate using a troponin assay
  • M-IgG murine IgG antibodies
  • 0.1 M phosphate buffer 5 mM EDTA, pH 7.0
  • an aqueous sulfosuccinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate solution (0.66 mL, 2.0 mg / mL).
  • the mixture is concentrated and purified using a gel filtration column (AcA22, Ciphergen, Fremont, CA). The fractions with the monomeric, activated M-IgG (tested with HPLC) are pooled.
  • a solution (3.0 mL, 10 mg / mL) of an F (ab ') 2 fragment of an anti-troponin antibody in a 0.1 M phosphate buffer (5 mM EDTA, pH 6.0) is mixed with 0.091 mL of a mixture of dithiothreitol ( 15.4 mg / mL) and 2-mercaptoethanol (15.6 uL / mL) mixed.
  • the mixture is concentrated and purified using a gel filtration column (AcA22, Ciphergen, Fremont, CA). The fractions with the Fab 'antibody fragment are pooled.
  • a mixture of the activated M-IgG (20.5 mg; 0.14 mmol) and the Fab 'fragment (20.5 mg; 0.41 mmol) is re-buffered in an phosphate buffer pH 7.0 via an Amicon ultrafiltration cell (5 mM EDTA).
  • the mixture is concentrated to 5.0 mg / mL protein and incubated for 24-70 hours at 2-8 ° C. Then an aqueous solution of N-ethylmaleimide (20 mg / mL; 50 ⁇ L per mL protein solution) is added.
  • the solution is concentrated and purified with a gel filtration column (AcA22, Ciphergen, Fremont, CA) in 10 mM phosphate buffer (300 mM NaCl, pH 7.0). The protein fractions are pooled.
  • the Fab '-M-IgG conjugate in the phosphate buffer pH 7.0 (6 mL; 0.8 mg / mL; 16 ⁇ mol) is mixed with an aqueous solution of NHS-PEO4-Biotin (Pierce Chemical , Company, Rockford, ILL; 0.095 mL, 0.5 mg / mL). After a reaction time of 4 hours at room temperature, the mixture is diafiltered against the pH 7.0 phosphate buffer. Production of a Fab'-Biotin conjugate ("Standard-Biotin Anti-Troponin-KonjugaO

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe und geeignete Reagenzien hierfür, insbesondere einen homogenen Bindungstest, wobei ein analytspezifischer Bindungspartner R1 mehr als eine spezifische Bindungsstellen für einen spezifischen Bindungspartner X aufweist, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, und ein zweiter analytspezifischer Bindungspartner R2 mehr als eine spezifische Bindungsstellen für einen spezifischen Bindungspartner Y aufweist, der ebenfalls mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist.

Description

Homogenes Nachweisverfahren
Die Erfindung betrifft Verfahren zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe und geeignete Reagenzien hierfür.
Zum Nachweis von Analyten werden häufig Bindungsteste eingesetzt, bei denen durch eine spezifische Bindung von nachzuweisenden Analyt an analytspezifische Bindungspartner auf die Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge des Analyten in einer Probe geschlossen werden kann. Immunoassays oder auch Verfahren, bei denen Oligo- oder Polynukieotide hybridisiert werden, sind Beispiele für Bindungsteste.
Die sogenannten „heterogenen Bindungsteste" sind durch einen oder mehrere Trennungsschritte und/oder Waschschritte gekennzeichnet. Die Trennung kann beispielsweise durch Immunfällung, Fällung mit Substanzen wie Polyethylenglykol oder Ammoniumsulfat, Filtration, magnetische Abtrennung, Anbindung an eine Festphase erfolgen. Ein solche „Festphase" besteht aus porösem und/oder nicht porösem, in der Regel wasserunlöslichem Material. Sie kann die unterschiedlichsten Formen aufweisen wie z.B.: Gefäß, Röhrchen, Mikrotitrationsplatte, Kugel, Mikropartikel, Stäbchen, Streifen, Filter- oder Chromatographiepapier, etc. Bei heterogenen Bindungstesten im Sandwichformat ist in der Regel einer der analytspezifischen Bindungspartner an eine Festphase gebunden und dient zur Abtrennung des Bindungskomplexes „Analyt/analytspezifischer Bindungspartner" von der flüssigen Phase, während der andere analytspezifische Bindungspartner zum Nachweis des Bindungskomplexes ein nachweisbares Label (z.B. ein Enzym, ein Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzlabel, etc.) trägt. Man unterteilt diese Testverfahren weiter in sogenannte Einschritt-Sandwich-Teste, bei denen die beiden spezifischen Bindungspartner simultan mit der Probe inkubiert werden und in Zweischritt-Sandwich-Teste, bei denen die Probe zunächst mit dem Festphasenreagenz inkubiert wird und nach einem Trenn- und Waschschritt der festphasengebundene Bindungskomplex aus Analyt und analytspezifischer Bindungspartner mit dem Nachweisreagenz inkubiert wird.
Bei „homogenen Bindungstesten" erfolgt keine Trennung zwischen freien und an den „Analyt analytspezifischer Bindungspartner"-Komplex gebundenen Komponenten des signalbildenden Systems. Der Testansatz, welcher die analytspezifischen Bindungspartner, die signalbildenden Komponenten und die Probe enthält, wird nach oder sogar während der Bindungsreaktion ohne einen weiteren Trenn- und/oder Waschschritt gemessen und das entsprechende Messsignal bestimmt. Beispiele für homogene Immunoassays (s.a. Boguslaski & Li. (1982) Applied Biochemistry and Biotechnology, 7:401-414) sind viele turbidimetrische oder nephelometrische Methoden, wobei die zum Nachweis verwendeten analytspezifischen Bindungspartner mit Latexpartikel assoziiert sein können; EMIT®-Teste; CEDIA®- Teste; Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays; Luminescent Oxygen Channeling Immunoassays („LOCI", s. EP-A2-0 515 194; Ullman et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei., 91:5426-5430; Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry ,42:1518 - 1526); etc.. Bei einem homogenen Sandwich-Immunoassay, wie z.B. einem nephelometrischen Latextest, werden die Antikörperreagenzien mit der Probe zusammen inkubiert und die Messung des Signals während und/oder nach der Inkubation durchgeführt, ohne dass ein Trenn- oder Waschschritt vor der Messung durchgeführt wird. Mit anderen Worten ausgedrückt: Es folgt keine Trennung des Antikörper-gebundenen Analyten vom freien Analyten oder von Antikörpern, die keinen Analyten gebunden haben.
Homogene und heterogene Bindungsteste können auch in Form eines sogenannten „Sandwichassays" durchgeführt werden. Hierbei wird der Analyt z.B. bei einem heterogenen Bindungstest von einem Festphasen-assoziierten analytspezifischen Bindungspartner und einem analytspezifischen Bindungspartner, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, gebunden. Bei Sandwichimmunoassays können Antikörper oder Antigene oder Haptene die analytspezischen Bindungspartner bilden.
Eine weitere spezielle Ausführungsform eines heterogenen oder homogenen Bindungstestes ist der „indirekte Immunoassay". Der Analyt ist in diesem Fall ein Antikörper. Einer der analytspezifischen Bindungspartner ist das Antigen oder ein modifiziertes Antigen des nachzuweisenden Antikörpers (= Analyt) und der andere analytspezifische Bindungspartner ist in der Regel ein Immunglobulin-bindendes Protein wie z.B. ein Antikörper, der den nachzuweisenden Antikörper (= Analyt) spezifisch zu binden vermag.
Bei einem homogenen oder heterogenen „kompetitiven Bindungstest" konkurriert " Proben-Analyt und Reagenz-Analyt (beispielsweise ein „modifizierter Analyt" wie z.B. ein gelabelter oder markierter Analyt, Analytteilstück oder Analytanalogon), um die Bindung an eine limitierte Anzahl von analytspezifischen Bindungspartnern. Beispiele zur Illustration des Prinzips: (i) Proben-Analyt konkurriert mit Reagenz-Analyt, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, um die Bindung an Festphasen-assoziierte analytspezifische Bindungspartner oder (ii) Proben-Analyt konkurriert mit Festphasen-assoziiertem Analyt (= Reagenz-Analyt) um die Bindung an analytspezifische Bindungspartner, die mit einer Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert sind.
Bei vielen Bindungstesten treten jedoch große Schwierigkeiten bei der Herstellung der Reagenzien auf, da die Bindung der analytspezifischen Bindungspartner an Festphasen oder partikuläre Komponenten eines signalbildenden Systems (z.B. Mikropartikel) häufig bei den so gebundenen analytspezifischen Bindungspartnern Aktivitätsverluste und/oder Änderung der Eigenschaften (z.B. bezüglich Konformation oder Stabilität) verursacht. Dies gilt besonders, wenn es sich bei den gebundenen analytspezifischen Bindungspartnern um Proteine, wie z.B. Antikörper oder Enzyme, handelt.
Man hat daher versucht, dieses Problem durch die Einführung von sogenannten "Universalreagenzien" zu beheben (s. z.B. EP-0 105 714). So kann gemäß EP-0 245 926 der Nachweis eines Analyten dadurch geführt werden, dass als universelles Festphasenreagenz eine Avidin-beschichtete Festphase eingesetzt wird, an die der biotinylierte analytspezifische Bindungspartner gebunden wird. In anderen Verfahren wird ein biotinylierter analytspezifischen Bindungspartner eingesetzt, der z.B. an ein als universelles Nachweisreagenz eingesetzten Streptavidin/Enzym-Komplex zu binden vermag. Bei diesen Testen sind jedoch Trennungsschritte, wie z.B. Waschschritte, ein notwendiger Bestandteil der Testdurchführung. Bei homogenen Bindungstesten treten in Bezug auf die Verwendung von universellen Reagenzien besondere Schwierigkeiten auf, insbesondere bei solchen, die auf der Verwendung von partikulären Universalreagenzien (z.B. Streptavidin- beschichtete Mikropartikel) beruhen. Wenn der analytspezifische Bindungspartner di- oder polyvalent ist, d.h. zwei und mehr Bindungstellen für das partikuläre Universalreagenz besitzt, (z.B. ein Antikörper, an den zwei und mehr Biotinmoleküle gebunden sind) würde dies zu einer Agglutination der Mikropartikel führen, auch ohne dass ein Analyt in der Probe vorhanden ist. Dies hätte Fehlbestimmungen zur Folge. Gemäß EP-0 356 964, EP-0 349 988 und EP-0 444 561 wird daher als wesentlich für die Durchführbarkeit eines solchen homogenen Testes angesehen, dass der analytspezifische Bindungspartner in Bezug auf das universelle Reagenz monovalent ist, d.h., dass letzterer nur eine Bindungstelle für das universelle Reagenz (z.B. Streptavidin-Latexpartikel) besitzt. Auch bei homogenen LOCI-Testen (s. EP-0 515 194) wird von den Erfindern darauf hingewiesen, dass die Messsignalbildung abhängig ist von der Ausbildung von Partikelpaaren, die aus je einem Sensitizer- und einem Chemiluminescer-Partikel bestehen (Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry, 42:1518 - 1526). Nachteilig ist bei solchen Verfahren, dass die Anzahl der Bindungsstellen auf dem entsprechenden analytspezifischen Bindungspartner genau kontrolliert werden muss.
Einen anderen Lösungssatz verfolgt EP-0 138 297. Hier wird die Zahl der biotinylierten Antikörper, die an Avidin-beschichtete Latexpartikel binden sollen, dadurch kontrolliert, dass freies Biotin hinzugefügt werden r uss. Eine solche Maßnahme wirkt sich jedoch negativ sowohl auf die Reagenzstabilität als auch auf die analytische Sensitivität des Testes aus. Ferner wird hier das universelle Reagenz bereits vor dem eigentlichen Testverfahren mit dem entsprechenden analytspezifischen Bindungspartner umgesetzt, d.h. die über Biotin/Avidin-Brücke an die Latexpartikel gebundenen Antikörper stellen das im Test einzusetzende Reagenz dar. Dies hat den Nachteil, dass das universelle Reagenz nicht auf dem Analysegerät je nach durchzuführenden Test mit unterschiedlichen analytspezifischen Bindungspartnern eingesetzt werden kann. v Aufgabe war es daher, eine verbesserte Methode zum Nachweis eines Analyten, insbesondere mittels homogener Testverfahren, zu entwickeln, die die oben beschriebenen Nachteile nicht aufweist. Eine solche Methode läßt sich besonders vorteilhaft in automatisierten Analysegeräten nutzen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren und Gegenstände.
Das erfindungsgemäße Verfahren löst diese Aufgabe, in dem es Universalreagenzien (spezifische Bindungspartner X oder Y, der jeweils mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist) zur Verfügung stellt-, die unabhängig von den analytspezifischen Reagenzien (analytspezifische Bindungspartner R1 und R2) auf die speziellen Belange hin eingestellt werden können, und den Nachweis von Analyten mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit ermöglicht.
Da die analytspezifischen Bindungspartner von den signalerzeugenden Komponenten unabhängig voneinander eingesetzt werden können und da die analytspezifischen Bindungspartner und die signalerzeugenden Komponenten unabhängig voneinander optimal auf die jeweiligen Anforderungen eingestellt werden können, wird durch diese Erfindung auch folgendes generelles Problem von homogenen Bindungstesten gelöst, nämlich die einander entgegengesetzte Anforderungen für eine optimale Differenzierung und eine optimale Empfindlichkeit: Die Konzentration der Reagenzien soll einerseits limitiert sein, damit die Hinter- grundsignale möglichst gering sind und andererseits sollen die Reagenzien hochkonzentriert und hochmarkiert sein, um eine genügende Signaländerung pro Zeiteinheit zu erzielen.
Die analytspezifischen erfindungsgemäßen Bindungspartner R1 und/oder R2 sind dadurch gekennzeichnet, dass diese mehr als eine Bindungsstelle für den jeweiligen, mit Komponenten eines signalbildenden System assoziierten spezifischen Bindungspartner X bzw. Y aufweisen. Bevorzugt werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Universalreagenzien eingesetzt, die Komponenten eines signalbildenden Systems umfassen, welche über sehr kurze Entfernungen miteinander in Wechselwirkung treten können, z.B. in Form eines Energietransfers.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass der erfindungsgemäße Einsatz von analytspezifischen Bindungspartnern, die mehr als eine Bindungsstelle für das jeweilige Universalreagenz haben, in homogenen Testverfahren nicht zu Fehlmessungen führt sondern sogar zu einem verbessserten Verhältnis von Hintergrundsignal zu analytspezifischen Messsignal (s. z.B. Tabellen 3 und 4).
Da die Bindungstellen der analytspezifischen Bindungspartner für die jeweiligen Universalreagenzien bevorzugt aus kleinen Molekülen, z. B. Haptene wie Digoxigenin, Biotin, DNP oder FITC, bestehen, die an die analytspezifischen Bindungspartner bevorzugterweise kovalent gebunden wurden, wird die analytspezifische Aktivität bzw. Bindungskapazität von R1 bzw. R2 in der Regel nicht oder kaum beeinträchtigt. Die Bindungsstellen können auch Teil des unveränderten analytspezifischen Bindungspartners sein. So könnte der analytspezifische Bindungspartner z.B. ein menschlicher IgG-Antikörper sein, welcher mehrere Bindungstellen aufweist, die von Anti-Human IgG-Antikörpern einer anderen Spezies spezifisch erkannt werden.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein homogenes Verfahren zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe, wobei der analytspezifische Bindungspartner R1 spezifische Bindungsstellen für den spezifische Bindungspartner X aufweist, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, und der analytspezifische Bindungspartner R2 spezifische Bindungsstellen für den spezifischen Bindungspartner Y aufweist, der. mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass R1 und/oder R2 mehr als eine Bindungsstelle für den jeweiligen, mit Komponenten eines signalbildenden System assoziierten spezifischen Bindungspartner aufweist. Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist, dass die spezifischen Bindungspartner X und/oder Y (z.B. Avidin, Streptavidin, etc.) nicht wie in EP-0 138 297 beschrieben durch die Zugabe von freien „spezifischen Bindungsstellen" (z.B. Biotin) abgesättigt werden müssen. Besonders bevorzugt handelt es sich bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren um einen homogenen Bindungstest, insbesondere um einen homogenen Immunoassay. Dieser homogene Bindungstest kann wie bereits weiter oben erläutert u.a. in Form eines Sandwichassays, eines indirekten Immunoassays oder eines kompetitiven Bindungstestes durchgeführt werden.
Im folgenden werden einige Begriffe, die zur Beschreibung der Erfindung herangezogen wurden, näher erläutert:
Bei einem "quantitativen Nachweis" wird die Menge, Konzentration oder Aktivität des Analyten in der Probe gemessen. Von dem Begriff des „quantitativen Nachweises" sind auch semiquantitative Methoden umfaßt, die nur die ungefähre Menge, Konzentration oder Aktivität des Analyten in der Probe erfassen oder nur zu einer relativen Mengen-, Konzentrations- oder Aktivitätsangabe dienen können. Unter einem "qualitativen Nachweis" ist der Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens des Analyten oder dessen Aktivität in der Probe überhaupt oder das Anzeigen, dass die Menge, Konzentration oder Aktivität des Analyten in der Probe unterhalb oder oberhalb eines bestimmten oder mehrerer bestimmter Schwellenwerte liegt, zu verstehen.
Unter dem Begriff „Analyt" ist die im erfindungsgemäßen Verfahren nachzuweisende Substanz zu verstehen. Beispiele für einen Analyten sind in EP-A2-0 515 194 auf den Seiten 8-15 aufgeführt. Der Analyt kann ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars sein. Der Analyt mag eine Bindungsstelle (monovalent, üblicherweise ein Hapten) oder mehrere Bindungsstellen (polyvalent) aufweisen. Bei immunchemischen Testen wird eine solche Bindungsstelle häufig auch als Epitop bezeichnet. Ferner kann der Analyt eine einzelne Substanz sein oder eine Gruppe von Substanzen, die wenigstens eine einzige gemeinsame Bindungsstelle aufweisen.
Ein monovalenter Analyt hat üblicherweise ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 2000, insbesondere von 125 bis 1000. Viele Oligopeptide, Oligonukleotide, Oligosaccharide, Arzneimittel, Drogen, Metaobolite, Pestizide etc. werden vom Begriff eines monovalenten Analyten umfaßt. Ein poylvalenter Analyt hat üblicherweise ein Molekulargewicht von über 2000, meistens über 10 000. Beispiele für polyvalente Analyte sind Polypeptide, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Zellen, Zellbestandteile inklusive Chromosomen, Gene, Mitochondrien und andere Zellorganelle, Zellmembranen, etc. Häufig sind Proteine die nachzuweisenden Substanzen. Solche Proteine mögen Mitglieder einer Proteinfamilie sein, deren Mitglieder durch ähnliche strukturelle Merkmale und/oder durch eine ähnliche biologische Funktion gekennzeichnet sind. Beispiele für analytisch interessante Proteinfamilien sind Proteine von Krankheitserregern, Immunoglobuline, Cytokine, Enzyme, Hormone, Tumormarker, Stoffwechselmarker, gewebespezifische Antigene, Histone, Albumine, . Globuline, Skieroproteine, Phosphoproteine, Mucine, Chromoproteine, Lipoproteine, Nukleoproteine, Glykoproteine, Proteoglykane, Rezeptoren, HLA, Gerinnungsfaktoren, Herzinfarktmarker (z.B. Myoglobin, Troponin, pro-BNP, etc.), etc. Andere analytisch interessante Substanzen sind beispielsweise einzel- oder doppelsträngige Oligo- und Polynukieotide
Unter einer „Probe" ist im Sinne der Erfindung das Material zu verstehen, das die nachzuweisende Substanz („Analyt") vermutlich enthält. Der Begriff Probe umfaßt beispielsweise biologische Flüssigkeiten oder Gewebe insbesondere von Menschen und Tieren wie Blut, Plasma, Serum, Sputum, Exudat, bronchoalveoläre Lavage, Lymphflüsigkeit, Synovialflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Vaginalschleim, Feces, Urin, Liquor, Haare, Haut, Gewebeproben oder -schnitte. Ferner werden umfaßt Zellkulturproben, pflanzliche Flüssigkeiten oder Gewebe, forensische Proben, Wasser- und. Abwasserproben, Nahrungsmittel, Arzneimittel.
Ferner unfasst der Begriff „Probe" auch eine vorbehandelte Probe, die die nachzuweisende Substanz („Analyt") ggf. in einer von Trägerstoffeη freigesetzten oder amplifizierten Form vermutlich enthält: Manche Proben müssen vorbehandelt werden, um den Analyten für das Nachweisverfahren zugänglich zu machen oder um störende Probenbestandteile zu entfernen. Solche Vorbehandlung von Proben mag die Abtrennung und/oder Lyse von Zellen beinhalten, das Präzipitieren, die Hydrolyse oder die Denaturierung von Probenbestandteilen wie z.B. Proteinen, die Zentrifugation von Proben, das Behandeln der Probe mit organischen Lösungsmitteln wie z.B. Alkohole, insbesondere Methanol; das Behandeln der Probe mit Detergenzien. Häufig wird die Probe in ein anderes, meistens wässriges, Medium - y - überführt, welches mit dem Nachweisverfahren möglichst nicht interferieren soll. Der Analyt kann auch amplifiziert werden. Eine Amplifizierung von Nukleinsäuren führt beispielsweise zur Generierung von einer oder mehreren Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäurekette. Solche Amplifizierungsmethoden sind dem Fachmann gut bekannt, z.B. „polymerase chain reaction" (PCR), „ligase chain reaction" (LCR), „amplification using Q beta replicase", „nucleic acid sequence based amplification" (NASBA), „Single primer amplification" (ASPP) und andere.
Unter einem „analytspezifischen Bindungspartner" ist entweder ein spezifischer Bindungspartner zu verstehen, der spezifisch an den Analyten zu binden vermag,
- oder ein spezifischer Bindungspartner (z.B. ein modifizierter Analyt), der an einen anderen analytspezifischen Bindungspartner zu binden vermag. Bei einem "modifizierten Analyt" handelt es sich in der Regel um einen Stoff der zumindest an einen analytspezifischen Bindungspartner zu binden vermag, der sich jedoch von dem Proben-Analyt durch fehlende oder zusätzliche Bindungsstellen unterscheidet, z.B. ein biotinylierter Analyt oder ein Analyt, der mit einer Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert ist. Ein modifizierter Analyt wird beispielsweise bei kompetitiven Testen eingesetzt. Unter einem „spezifischen Bindungspartner" ist ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars zu verstehen. Bei den Mitgliedern eines spezifischen Bindungspaars handelt es sich um zwei Moleküle, die jeweils mindestens eine zu einer Struktur des anderen Moleküls komplementäre Struktur aufweisen, wobei die beiden Moleküle sich über eine Bindung der komplementären Strukturen spezifisch zu binden vermögen. Der Begriff Molekül umfaßt hierbei auch Molekülkomplexe wie z.B. Enzyme, die aus Apo- und Coenzym bestehen, Proteine, die aus mehreren Untereinheiten bestehen, Lipoproteine bestehend aus Protein und Lipiden, etc.. Spezifische Bindungspartner können natürlich vorkommende aber auch z.B. mittels chemischer Synthese, mikrobiologischer Techniken und/oder gentechnologischer Verfahren hergestellte Substanzen sein. So lassen sich mittlerweile mit Hilfe von Phage Display Bibliotheken, über synthetische Peptiddatenbanken oder mittels „Recombinatorial Antibody Libraries" spezifische Bindungspartner selektieren (Larrick & Fry (1991) Human Antibodies and Hybridomas, 2:172-189). Zur Illustration des Begriffs spezifischer Bindungspartner, aber nicht als Einschränkung zu verstehend, sind z.B. zu nennen: Thyroxinbindendes Globulin, steroidbindende Proteine, Antikörper, Antigene, Haptene, Enzyme, Lektine, Nukleinsäuren, Repressoren, Oligo- und Polynukieotide, Protein A, Protein G, Avidin, Streptavidin, Biotin, Komplementkomponente C1q, nukleinsäurebindende Proteine, etc.. Spezifische Bindungspaare sind beispielsweise: Antikörper-Antigen, Antikörper-Hap'ten, Digoxigen/Anti-Digoxigen-Antikörper, • Fluorescin/Anti-Fluorescein-Antikörper,
Operator-Repressor, Nuclease-Nukleotid, Biotin-Avidin, Biotin/Streptavidin, Lektin- Polysaccharid, Steroid-steroidbindendes Protein, Wirkstoff-Wirkstoffrezeptor, Hormon-Hormonrezeptor, Enzym-Substrat, IgG-Protein A, komplementäre Oligo- oder Polynukieotide, etc.. Bei den sogenannten homogenen Gensondentesten sind die spezifischen Bindungspartner in der Regel Nukleinsäureketten, die zumindest teilweise komplementär sind zu Abschnitten der nachzuweisenden Nukleinsäurekette.
Unter dem Begriff „Antikörper" ist im Sinne dieser Erfindung ein Immunglobulin, z.B. ein Immunglobulin der Klasse bzw. Subklasse IgA, IgD, IgE, IgG-i, lgG2a, lgG2b, lgG3, lgG4, IgM, zu verstehen. Ein Antikörper weist mindestens eine Bindungsstelle (häufig Paratop genannt) für ein Epitop (häufig auch antigene Determinante genannt) auf einem Antigen oder Hapten auf. Ein solches Epitop ist z.B. durch seine räumliche Struktur und/oder durch das Vorhandensein von polaren und/oder apolaren Gruppen gekennzeichnet. Die Bindungsstelle des Antikörpers ist komplementär zum Epitop. Die Antigen-Antikörper-Reaktion bzw. die Hapten-Antikörper-Reaktion funktioniert nach dem sogenannten „Schlüssel-Schlüsselloch-Prinzip", und ist in der Regel in einem hohen Grad spezifisch, d.h. die Antikörper vermögen kleine Abweichungen in der Primärstruktur, in der Ladung, in der räumlichen Konfiguration und der sterischen Anordnung des Antigens oder Haptens zu unterscheiden. Insbesondere die sogenannten „complementarity determining regions" des Antikörpers tragen zur Bindung des Antikörpers an das Antigen oder Hapten bei. Der Begriff „Antigene" umfaßt monovalente und polyvalente Antigene. Ein polyvalentes Antigen ist ein Molekül oder ein Molekülkomplex, an das/den mehr als ein Immunglobulin gleichzeitig binden kann, während bei einem monovalenten Antigen jeweils nur ein einziger Antikörper zur selben Zeit binden kann. Als Hapten wird üblicherweise ein Molekül bezeichnet, das nicht für sich allein immunogen ist, sondern das zu Immunisierungszwecken üblicherweise an einen Träger gebunden wird.
Unter dem Begriff Antikörper sind im Sinne dieser Erfindung nicht nur komplette Antikörper zu verstehen sondern ausdrücklich auch Antikörperfragmente, wie z.B.
Fab, Fv, F(ab')2, Fab'; sowie auch Chimäre, humanisierte, bi- oder oligospezifische, oder „Single chain" Antikörper; des weiteren auch Aggregate, Polymere und
Konjugate von Immunglobulinen und/oder deren Fragmenten, sofern die
Bindungseigenschaften an das Antigen oder Hapten erhalten sind. Antikörperfragmente lassen sich beispielsweise durch enzymatische Spaltung von
Antikörpern mit Enzymen wie Pepsin oder Papain herstellen. Antikörperaggregate, - polymere und -konjugate können durch vielfältige Methoden generiert werden, z.B. durch Hitzebehandlung, Umsetzung mit Substanzen wie Glutaraldehyd, Reaktion mit immunglobulin-bindenden Molekülen, Biotinylierung von Antikörpern und anschließende Reaktion mit Streptavidin oder Avidin, etc..
Bei einem Antikörper im Sinne dieser Erfindung kann es sich um einen monoklonalen oder um einen polyklonalen Antikörper handeln. Der Antikörper kann nach den üblichen Verfahren hergestellt worden sein, z.B. durch Immunisierung des Menschen oder eines Tieres, wie z.B. Maus, Ratte, Meerschweichen, Kaninchen, Kamel, Pferd, Schaf, Ziege, Huhn (s.a. Messerschmid (1996) BlOforum, 11:500-502), und anschließender Gewinnung des Antiserums; oder durch die Etablierung von Hybridomazellen und der anschließenden Reinigung der sekretierten Antikörper; oder durch Klonierung und Expression der Nukleotidsequenzen bzw. modifizierter Versionen davon, die die Aminosäuresequenzen kodieren, die für die Bindung des natürlichen Antikörpers an das Antigen und/oder Hapten verantwortlich sind. Antikörper sind auch herstellbar ggf. unter Zuhilfenahme gentechnologischer Methoden in pflanzlichen - wie z.B. Hefezellen - (Fischer et al. (1999) Biol. Chem., 380:825-839; Hiatt et al. (1992) Genetic Engineering, 14:49-64)), tierischen und prokaryontischen Zellen (s. z.B. WO 95/25172) sowie isolierten menschlichen Zellen.
Bei einem „signalbildenden System" kann es sich um eine oder mehrere Komponenten handeln, wobei es sich wenigstens bei einer Komponente um ein nachweisbares Label handelt. Als Label ist jedes Molekül zu verstehen, das selbst ein Signal produziert oder die Produktion eines Signals induzieren kann wie z.B. eine fluoreszierende Substanz, eine radioaktive Substanz, ein Enzym, oder eine chemilumineszierende Substanz. Das Signal kann beispielsweise anhand der Enzymaktivität, der Lumineszenz, der Lichtabsorption, der Lichtstreuung, der ausgestrahlten elektromagnetischen oder radioaktiven Strahlung, oder einer chemischen Reaktion nachgewiesen oder gemessen werden.
Ein „Label" vermag selbst ein nachweisbares Signal zu erzeugen, so daß keine weiteren Komponenten notwendig sind. Viele organische Moleküle absorbieren ultraviolettes und sichtbares Licht, wobei durch die Lichtabsorption übertragene Energie diese Moleküle in einen angeregten Energiezustand kommen können, und die absorbierte Energie in Form von Licht einer anderen Wellenlänge als der des eingestrahlten Lichts abgeben. Wieder andere Label können direkt ein nachweisbares Signal erzeugen wie z.B. radioaktive Isotope, Farbstoffe oder magnetische und nicht-magnetische Mikropartikel.
Wieder andere Label benötigen zur Signalerzeugung weitere Komponenten, d.h. das signalproduzierende System schließt in einem solchen Fall all die für die Signalbildung benötigten Komponenten mit ein wie z.B. Substrate, Coenzyme, Quencher,. Beschleuniger, zusätzliche Enzyme, Substanzen die mit Enzymprodukten reagieren, Katalysatoren, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Ionen etc..
Geeignete Label (s.a. EP-A2-0 515 194; US 5,340,716; US 5,545,834; Bailey et al. (1987) J. Pharmaceutical & Biomedical Analysis 5:649-658) sind beispielsweise Enzyme einschließlich Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Glukose-6- Phosphatdehydrogenase, Alkoholdehydrogenase, Glucoseoxidase, ß-Galactosidase, Luciferase, Urease und Acetylcholinesterase; Farbstoffe; fluoreszierende Substanzen einschließlich Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Ethidiumbromid, 5-Dimethylaminonapthalen-1-sulfonylchlorid und fluoreszierende Chelate von seltenen Erden; chemilumineszierende Substanzen einschließlich Luminol, Isoluminol, Acridiniumverbindungen, Olefin, Enolether, Enamin, Arylvinylether, Dioxen, Arylimidazol, Lucigenin, Luciferin und Aequorin; Sensitizer einschließlich Eosin, 9,10-Dibromoanthracen, Methylen Blau, Porphyrin, Phthalocyanin, Chlorophyll, Rose Bengal; Coenzyme; Enzymsubstrate; radioaktive Isotope einschließlich 125l, 131l, 4C, 3H, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 59Fe, 57Co und 75Se; Partikel einschließlich magnetische Partikel oder Partikel, bevorzugt Latexpartikel, die selbst beispielsweise mit Farbstoffen, Sensitizem, fluoreszierenden Substanzen, chemilumineszierenden Substanzen, Isotopen oder anderen nachweisbaren Labein markiert sein können; Solpartikel einschließlich Gold- oder Silbersolen; Liposomen oder Zellen, die selbst mit nachweisbaren Labein markiert sein können; etc.
Ein signalbildendes System kann auch Komponenten umfassen, die bei räumlicher Nähe miteinander in eine nachweisbare Wechselwirkung treten können, z.B. in Form von Energiespendern und Energieempfängern wie beispielsweise Photosensitizer und chemolumineszierende Substanzen (EP-A2-0 515 194), Photosensitizer und Fluorophore (WO 95/06877), radioaktives lod125 und Fluorophore (Udenfriend et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82:8672-8676), Fluorophore und Fluorophore (Mathis (1993) Clin. Chem. 39:1953-1959) oder Fluorophore und Fluoreszenz-Quencher (US 3,996,345).
Unter einer Wechselwirkung zwischen den Komponenten ist die direkte Übertragung von Energie zwischen den Komponenten, z.B. durch Licht- oder Elektronenstrahlung sowie über kurzlebige reaktive chemische Moleküle, miteingeschlossen. Ferner umfaßt sind hiervon auch Vorgänge, bei denen die Aktivität einer Komponente durch eine oder mehrere andere inhibiert oder verstärkt wird, beispielsweise die Hemmung oder Steigerung der Enzymaktivität oder die Hemmung, Steigerung oder Veränderung (z.B. Wellenlängenverschiebung, Polarisation) der von der beeinflußten Komponente ausgesendeten elektromagnetischen Strahlung. Die Wechselwirkung zwischen den Komponenten umfaßt auch Enzymkaskaden. In diesem Fall sind die Komponenten Enzyme, von denen mindestens eines das Substrat für ein anderes liefert, so daß eine maximale oder minimale Reakionsgeschwindigkeit der gekoppelten Substratumsetzung resultiert.
Eine effektive Wechselwirkung zwischen den Komponenten findet in der Regel statt, wenn diese räumlich benachbart vorliegen, also z.B. innerhalb eines Abstandbereiches von wenigen μm, insbesondere innerhalb eines Abstandbereiches von unter 600 nm, bevorzugt unter 400 nm, ganz besonders bevorzugt von unter 200 nm.
Bei einem ganz besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt das . signalbildende System an Mikropartikel assoziierte Photosensitizer und an Mikropartikel assoziierte chemolumineszierende Substanzen.
Mikropartikel werden häufig als Festphase und/oder als Label genutzt. Unter dem Begriff „Mikropartikel" sind im Sinne dieser Erfindung Teilchen zu verstehen, die einen ungefähren Durchmesser von wenigstens 20 nm und nicht mehr als 20 μm. aufweisen, üblicherweise zwischen 40 nm und 10 μm, bevorzugt zwischen 0,1 und 10 μm, besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 5 μm, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,15 und 2 μm. Die Mikropartikel können regelmäßig oder unregelmäßig geformt sein. Sie können Kugeln, Spheroide, Kugeln mit mehr oder weniger großen Kavitäten oder Poren darstellen. Die Mikropartikel können aus organischem, aus anorganischem Material oder aus einer Mischung oder Kombination von beiden bestehen. Sie können aus einem porösen oder nicht porösen, einem schwellfähigen oder nicht schwellfähigen Material bestehen. Prinzipiell können die Mikropartikel jegliche Dichte haben, bevorzugt sind jedoch Partikel mit einer Dichte, die der Dichte des Wassers nahekommt wie etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml. Die bevorzugten Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbar und möglichst lange suspensionsstabil. Sie mögen durchsichtig, teilweise durchsichtig oder undurchsichtig sein. Die Mikropartikel können aus mehreren Schichten bestehen wie beispielsweise die sogenannten „core-and-shell" Partikel mit einem Kern und einer oder mehreren umhüllenden Schichten. Der Begriff Mikropartikel umfaßt beispielsweise Farbstoffkristalle, Metallsolen, Silica-Partikel,. Glaspartikel, Magnetpartikel, Polymerteilchen, Öltropfen, Lipidpartikel, Dextran, und Proteinaggregate. Bevorzugte Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbare und aus wasserunlöslichem Polymermaterial bestehende Partikel, insbesondere aus substituierten Polyethylenen. Ganz besonders bevorzugt sind Latexpartikel z.B. aus Polystyrol, Acrylsäurepolymeren, Methacrylsäurepolymeren, Acrylnitril-Polymeren, Acrylnitril-Butadien-Styrol, Polyvinylacetat-Acrylat, Polyvinylpyridin, Vinylchlorid-Acrylat. Von besonderem Interesse sind Latexpartikel mit reaktiven Gruppen an ihrer Oberfläche wie beispielsweise Carboxyl-, Amino- oder Aldehydgruppen, die eine kovalente Bindung z.B. von spezifischen Bindungspartnern an die Latexpartikel erlauben. Die Herstellung von Latexpartikeln ist beispielsweise in EP 0 080 614, EP 0 227 054 und EP 0 246 446 beschrieben.
Der Begriff „assoziiert" ist breit zu verstehen und umfaßt beispielsweise eine kovalente und eine nicht-kovalente Bindung, eine direkte und eine indirekte Bindung, die Adsorption an eine Oberfläche und den Einschluß in eine Vertiefung oder einen Hohlraum, etc.. Bei einer kovalenten Bindung ist beispielsweise der spezifische Bindungspartner über eine chemische Bindung an ein Label gebunden. Üblicherweise spricht man von einer kovalenten Bindung zwischen zwei Molekülen, wenn wenigstens ein Atomkern des einen Moleküls Elektronen mit wenigstens einem Atomkern des zweiten Moleküls teilt. Beispiele für eine nicht-kovalente Bindung sind die Oberflächenadsorption, der Einschluß in Hohlräume oder die Bindung von zwei spezifischen Bindungspartnern. Neben einer direkten Bindung an ein Label können die spezifischen Bindungspartner auch indirekt über spezifische Wechselwirkung mit weiteren spezifischen Bindungspartnern an das Label gebunden sein. Dies soll anhand eines Beispiels näher illustriert werden: Ein biotinylierte Anti-Fluorescein- Antikörper kann über labelgebundenes Avidin an das Label gebunden werden.
Ein Mikropartikel kann einen Überzug aus einer oder mehreren Schichten aufweisen, z.B. aus Proteinen, Kohlehydraten, Biopolymeren, organischen Polymeren oder Mischungen hiervon, um beispielsweise die unspezifische Bindung von Probenbestandteilen an die Partikeloberfläche zu unterdrücken oder zu verhindern, oder um beispielsweise Verbesserungen zu erreichen hinsichtlich der Suspensionsstabilität der Lagerstabilität, der formgebenden Stabilität oder der Resistenz gegen UV-Licht, Mikroben oder sonstige zerstörend wirkender Agenzien. So kann dieser Überzug insbesondere aus Proteinschichten oder Polymerschichten, wie z. B. Cyclodextrine, Dextrane, Hydrogele, Albumin oder Polyalbumine bestehen, die kovalent oder adsorptiv auf die Mikropartikel aufgebracht wurden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können R1 und/oder R2 vorher, während oder nach der Bindungsreaktion mit dem Analyten über X und/oder Y an Komponenten des signalbildenden System gebunden werden. Die Probe kann zunächst mit den analytspezifischen Bindungspartnern R1 und R2 inkubiert werden und dann werden die spezifischen Bindungspartner X und Y hinzugegeben. Es kann jedoch auch eine andere Reihenfolge der Reagenzzugabe erfolgen.
Bei der Durchführung einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen homogenen Bindungstests wird die Probe zuerst mit den analytspezifischen Bindungspartnern R1 und R2 in sequentieller oder simultaner Abfolge gemischt und danach die Komponenten des signalbildenden Systems mit den Bindungspartnern X und Y in sequentieller oder simultaner Abfolge zum Gemisch dazu gegeben.
Die Anzahl der Bindungstellen des erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartners R1 für den spezifischen Bindungspartner X sollte mindestens 2, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 10 und ganz besonders bevorzugt mindestens 15 betragen und die Anzahl der Bindungstellen des erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartners R2 für den spezifischen Bindungspartner Y sollte mindestens 2, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 10 und ganz besonders bevorzugt mindestens 15 betragen.
Bei den erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartnern R1 und R2 kann es sich auch um den gleichen oder um verschiedene analytspezifischen Bindungspartner handeln. So kann z.B. bei einem Sandwich-Immunoassay ein monoklonaler Antikörper sowohl als analytspezifischer Bindungspartner R1 als auch als analytspezifischer Bindungspartner R2 eingesetzt werden, wenn der Analyt mehr als ein Epitop für diesen Antikörper aufweist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vermögen im Falle eines Sandwichassays oder eines indirekten Immunoassays die analytspezifischen Bindungspartnern R1 und R2 beide den Analyten spezifisch zu binden. Bei den analytspezifischen Bindungspartnern kann es sich z.B. im Fall eines Sandwich-lmmunassays um analytspezifische Antikörper handeln oder, wenn der Analyt selbst ein Antikörper ist, um dessen Antigen oder um ein „modifiziertes Antigen" oder um ein Antigenanalogon. Bei einem kompetitiven Testaufbau sollte es sich bei einem der erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartner R1 und R2 um einen modifizierten Analyten handeln. Bei den Bindungsstellen des erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartners R1 für den spezifische Bindungspartner X handelt es sich bevorzugt um Haptene. Besonders bevorzugt als Bindungsstellen des erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartners R1 sind Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, einzelsträngige Nukleinsäureketten, Dinitrophenol. Es können aber auch ander Moleküle verwendet werden, die ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars sind.
Bei den Bindungsstellen des erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartners R2 für den spezifische Bindungspartner Y handelt es sich bevorzugt um Haptene. Besonders bevorzugt als Bindungsstellen des erfindungsgemäßen analytspezifischen Bindungspartners R2 sind Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, einzelsträngige Nukleinsäureketten, Dinitrophenol. Es können aber auch ander Moleküle verwendet werden, die ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars sind.
Bei den erfindungsgemäßen spezifischen Bindungspartnern X und Y kann es sich um den gleichen oder um verschiedene spezifische Bindungspartner handeln. Bei dem erfindungsgemäßen spezifischen Bindungspartner X handelt es sich bevorzugt um Avidin, Streptavidin, Anti-Digoxigenin-Antikörper, Anti-Dinitrophenol-Antikörper, einzelsträngige Nukleinsäurekette oder Anti-Hapten-Antikörper. Es kann sich aber auch um ein Enzym, ein Enzym-Substrat oder um einen Antikörper, der spezifisch bestimmte Polypeptide, Oligopeptide oder Enzyme zu binden vermag, handeln. Bei dem erfindungsgemäßen spezifischen Bindungspartner Y kann es sich auch um Avidin, Streptavidin, Anti-Digoxigenin-Antikörper, Anti-Dinitrophenol-Antikörper, einzelsträngige Nukleinsäurekette oder Anti-Hapten-Antikörper. Es kann sich aber auch um ein Enzym, ein Enzym-Substrat oder um einen Antikörper, der spezifisch bestimmte Polypeptide, Oligopeptide oder Enzyme zu binden vermag, handeln.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird infolge der Bindung des Analyten an R1 und/oder R2 Komponenten des signalbildenden Systems in einen Abstand zueinander gebracht werden, der eine Wechselwirkung, insbesondere einen Energietransfer, zwischen diesen Komponenten erlaubt. Das Ausmaß dieser Wechselwirkung wird dann zum quantitativen oder qualitativen Nachweis des Analyten in der Probe gemessen. Das Verfahren ist besonders für Sandwichassays und indirekte Immunoassays geeignet.
Bei einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird infolge der Bindung des Analyten an R1 oder R2 Komponenten des signalbildenden Systems in einen Abstand zueinander gebracht werden, der keine oder nur eine sehr geringe Wechselwirkung, insbesondere keinen oder nur sehr geringen Energietransfer, zwischen diesen Komponenten erlaubt. Das verbleibende Ausmaß dieser Wechselwirkung wird dann zum quantitativen oder qualitativen Nachweis des Analyten in der Probe gemessen. Dieses Verfahren ist besonders für kompetitive Bindungsteste geeignet.
Um die Anzahl der Bindungsstellen der analytspezifischen Bindungspartner für die spezifischen Bindungspartner X oder Y erhöhen zu können, ohne die Spezifität oder
Sensitivität der analytspezifischen Bindungspartner zu verringern, können
Trägermolekuele eingeführt werden, an die sowohl die analytspezifischen
Bindungspartner als auch die Bindungsstellen gebunden werden können. Vorteilhaft ist es daher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, wenn es sich bei R1 um einen oder mehre analytspezifische Bindungspartner handelt, die mit einem Trägermolekül assoziiert sind, wobei das Trägermolekül Bindungsstellen für den spezifischen
Bindungspartner X aufweisen kann. Ferner ist es von Vorteil, wenn es sich auch bei
R2 um einen oder mehre analytspezifische Bindungspartner handelt, die mit einem
Trägermolekül assoziiert sind, wobei das Trägermolekül Bindungsstellen für den spezifischen Bindungspartner Y aufweisen kann.
Bei einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist R1 und/oder R2 jeweils mit einem solchen Trägermolekül assoziiert. Geeignete Trägermolekül sind z.B. Proteine, beispielsweise Antikörper, Enzyme, Albumine wie z.B. Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, oder Proteinpolymere, Dextrane, Cylclodextrine, Dendrimere oder ähnliche Strukturen. Besonders bevorzugte Proteinpolymere oder -aggregate können aus mit einander assoziierten, bevorzugt kovalent gebundenen, Antikörpern, Albuminmolekülen, Enzymen oder Mischungen derselben bestehen. Ganz besonders bevorzugt sind als Trägermolekül > biotinyliertes Dextran und biotinylierte Proteinpolymere (z.B. biotinylierte Antikörperpolymere).
Ein besonders bevorzugtes Trägermolekül läßt sich wie in Beispiel 7 beschrieben herstellen. Hierbei werden murine Antikörper, bevorzugt murine IgG Antikörper, mit Hilfe eines Kopplungsreagenzes kovalent miteinander verbunden. Analog lassen sich auch erfindungsgemäße Trägermoleküle aus Enzymen, Antikörpern (z.B. Antikörper, insbesondere IgG Antikörper, von der Maus oder der Ziege), Albuminen oder Gemischen derselben herstellen. Die Bindungsstellen für den spezifischen Bindungspartner X oder Y, z.B. Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, einzelsträngige Nukleinsäureketten, Dinitrophenol, etc., können mit dem Fachmann bekannten Methoden an diese Proteinpoymere gebunden werden, wobei eine kovalente Bindung bevorzugt ist. Ein mit einem Trägermolekül assoziierter, analytspezifischer Bindungspartner läßt sich beispielsweise wie folgt herstellen: Der analytspezifische Bindungspartner, bevorzugt ein Antikörper, besonders bevorzugt ein Antikörperfragment, wird nach dem Fachmann bekannten Methoden, z.B. mittels Kopplungsreagenzien, an das Trägermolekül gebunden. Diese Bindung sollte möglichst kovalent sein. Als Trägermolekül kommt zum Beispiel biotinyliertes Dextran (s. Beispiel 5) in Frage oder die weiter oben beschriebenen anderen Trägermoleküle, insbesondere solche wie das im Beispiel 7 beschriebenen Antikörperpolymere. Die Bindungsstellen für den spezifischen Bindungspartner X oder Y können wie im Fall des biotinyliertes Dextrans vor oder wie im Beispiel 7 beschrieben nach der Bindungsreaktion zwischen analytspezifischer Bindungspartner und Trägermolekül eingeführt werden. An ein Trägermolekül kann nicht nur einer sondern auch mehrere analytspezifische Bindungspartner gebunden werden. Neben dieser bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform können aber auch mehrere Trägermoleküle an einen analytspezifischer Bindungspartner gebunden werden.
Eine weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Trägermolekül, das mit einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartner assoziiert ist, bevorzugt kovalent verbunden ist. Bei einer Ausführungsform dieses Gegenstandes handelt es sich bei dem Trägermolekül um ein Proteinpolymer, z.B. kovalent miteinander verbundene Antikörper' (s. Beispiel 7), Albuminmoleküle, Enzyme oder Mischungen derselben, welches zusätzlich Bindungsstellen, z.B. Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, einzelsträngige Nukleinsäureketten, Dinitrophenol, etc., für einen spezifischen Bindungspartner X oder Y aufweisen kann. Die Zahl der Bindungsstellen sollte mindestens 2, besser mehr als 5, bevorzugt mehr als 10, besonders bevorzugt mehr als 15, ganz besonders bevorzugt mehr als 18 pro Trägermolekül, das mit einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartner assoziiert ist, betragen. Bei dem analytspezifischen Bindungspartner handelt es sich bei dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform bevorzugt um einen Antikörper oder um ein Antikörperfragment, ein Antigen, ein Hapten oder eine Nukleinsäurekette.
Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung des oben beschriebenen Trägermoleküls, das mit einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartnern assoziiert ist, in einem homogenen oder heterogenen Bindungstest zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe, insbesondere in einem homogenen oder heterogenen Immunassay.
Analytspezifische Bindungspartner, die mit den erfindungsgemäßen Trägermolekülen assoziiert sind, werden im folgenden auch Konjugat genannt. Diese können natürlich nicht nur in homogenen Bindungstesten sondern auch vorteilhaft bei heterogenen Bindungstesten eingesetzt werden.
Ein erfindungsgemäßes Konjugat besteht aus einem Trägermolekül, das mit einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartnern assoziiert ist, wobei dieses Konjugat zusätzliche Bindungsstellen für einen spezifischen Bindungspartner X oder Y aufweist. Bei einer speziellen Ausführungsform eines Konjugats besteht das Trägermolekül aus Dextran, Cylclodextrin, Dendrimeren oder aus miteinander verbundenen Antikörpern, miteinander verbundenen Albuminmolekülen, miteinander verbundenen Enzymen oder miteinander verbundenen Mischungen derselben. Deren Bindung sollte bevorzugt kovalent sein. Bei den zusätzlichen Bindungsstellen des erfindungsgemäßen Konjugates kann es sich um Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, Dinitrophenol oder einzelsträngige Nukleinsäureketten handeln. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Konjugates ist das Trägermolekül kovalent an ein oder mehrere analytspezifische Bindungspartner gebunden. Das erfindungsgemäße Konjugat sollte mindestens 2, bevorzugt mehr als 5, besonders bevorzugt mehr als 10, ganz besonders bevorzugt mehr als 15 und optimal mehr als 18 zusätzliche Bindungsstellen für den spezifischen Bindungspartner X oder Y aufweisen. Ganz besonders bevorzugt ist ein Konjugat, bei dem das Trägermolekül aus kovalent miteinander verbundenen Antikörpern, bevorzugt IgG-Antikörpem von der Maus oder der Ziege, besteht. Ein andere Ausgestaltung der Erfindung ist ein Reagenz, welches ein oder mehrere dieser Konjugate enthält, sowie ein Testkit, welcher ein solches Reagenz enthält.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können in einem homogenen oder heterogenen Bindungstests (z.B. einem Immunoassay) zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe verwendet werden. Bei einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Bindungstests, insbesondere eines homogenen Bindungstestes, wird ein erfindungsgemäßes Konjugat, das spezifische Bindungsstellen für den spezifischen, mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziierten Bindungspartner X aufweist, zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe verwendet. Bei einer anderen Ausführungsform wird zusätzlich ein weiteres erfindungsgemäßes Konjugat, das spezifische Bindungsstellen für den spezifischen, mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziierten Bindungspartner Y aufweist, zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe verwendet. Die Anzahl der Bindungstellen für den spezifischen Bindungspartner X bzw. Y sollte mindestens 2, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 10 und ganz besonders bevorzugt mindestens 15 betragen. Bei X und Y kann es sich um den den gleichen oder um einen verschiedenen spezifischen Bindungspartner handeln. Bevorzugt werden als Bindungspartner X bzw. Y Avidin, Streptavidin, Anti-Digoxigenin- Antikörper, Anti-Dinitrophenol-Antikörper, einzelsträngige Nukleinsäurekette, Anti- Hapten-Antikörper, Enzym, Enzym-Substrat oder Antikörper, der spezifisch bestimmte Polypeptide, Oligopeptide oder Enzyme zu binden vermag, eingesetzt. Ganz besonders bevorzugt im Sinne dieser Erfindung ist ein Bindungstest, bevorzugt ein homogener Bindungstest, unter Verwendung eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Konjugate, wobei infolge der Bindung der analytspezifischen Bindungspartner Komponenten des signalbildenenden Systems in einen Abstand zueinander gebracht werden, der eine Wechselwirkung, insbesondere einen Energietransfer, zwischen diesen Komponenten erlaubt und das Ausmaß dieser Wechselwirkung gemessen wird oder wobei infolge der Bindung der analytspezifischen Bindungspartner Komponenten des signalbildenden Systems in einen Abstand zueinander gebracht werden, der keine oder nur sehr geringe Wechselwirkung, insbesondere keinen oder nur sehr geringen Energietransfer, zwischen diesen Komponenten erlaubt und das verbleibende Ausmaß dieser Wechselwirkung gemessen wird. Als Komponenten des signalbildenden Systems werden bei einem solchen Test bevorzugt Mikropartikel, insbesondere Latexpartikel, eingesetzt. Ganz besonders bevorzugt werden bei einem solchen Testverfahren an Mikropartikel assoziierte Photosensitizer und an Mikropartikel assoziierte chemolumineszierende Substanzen als Komponenten des signalbildenden Systems eingesetzt.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren können Mikropartikel, insbesondere Latexpartikel, als Komponenten des signalbildenden Systems eingesetzt werden. Ganz besonders bevorzugt sind als Komponenten des signalbildenden Systems an Mikropartikel assoziierte Sensitizer,. insbesondere Photosensitizer, und an Mikropartikel assoziierte chemolumineszierende Substanzen.
Folglich ist ein Mikropartikel ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung, insbesondere ein Latexpartikel, an den über einen an den Mikropartikel gebundenen spezifischen Bindungspartner X oder Y ein erfindungsgemäßes Konjugat gebunden ist und dessen Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren. Bevorzugt wird hierbei ein Mikropartikel, der als Komponente eines signalbildenden Systems mit Photosensitizern oder mit chemolumineszierende Substanzen assoziiert ist.
Eine besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Test auf Basis des LOCI-Verfahrens, welches im Detail in EP-0 515 194 beschrieben ist. Dieses beruht auf der Verwendung von Photosensitizern und sogenannten Akzeptoren als signalerzeugende Komponenten. Die Photosensitizer generieren bei Belichtung Singulett-Sauerstoff, der mit den Akzeptoren, die chemilumineszierende Komponenten sind, reagiert. Die aktivierte chemilumineszierende Komponente produziert Licht, welches gemessen wird. Anhand eines erfindungsgemäßen Sandwichassays soll dieses bevorzugte Verfahren näher erläutert werden: Der Analyt wird bespielsweise an einen analytspezifischen Bindungspartner R1, der mit einem Trägermolekül assoziiert sein kann, gebunden, der mittels des spezifischen Bindungspartner X an sogenannte Sensitizer-Partikel gebunden wird. Die mit dem Sensitizer-Partikel assoziierten Sensitizer-Moleküle können im angeregten Zustand Singlet-Sauerstoff erzeugen. Dieser Singlet-Sauerstoff kann mit den Chemilumineszenzverbindungen, die mit sogenannten Chemiluminescer-Partikeln assoziiert sind, reagieren, wobei die gebildete metastabile Verbindung unter Erzeugung eines Lichtblitzes wieder zerfällt. Der analytspezifische Bindungspartner R2, der mit einem Trägermolekül assoziiert sein kann, wird mittels des spezifischen Bindungspartner Y an die Chemiluminescer- Partikel gebunden. Da Singlet-Sauerstoff in wässrigen Lösungen nur kurze Zeit stabil¬ ist, werden die mit analytspezifischen Bindungspartner assoziierten Chemiluminescer-Partikel, die durch die Ausbildung eines Sandwichkomplexes in unmittelbarer Nähe zu den z.B. per Licht angeregten Sensitizer-Partikel gelangt sind, angeregt, Licht abzustrahlen. Durch entsprechende Fluoreszenzfarbstoffe in den Chemiluminescer-Partikeln kann die Wellenlänge des zu messenden abgestrahlten Lichts verändert werden. Bevorzugt wird bei diesem Verfahren die Probe zunächst mit den analytspezifischen Bindungspartnern R1 und R2 inkubiert und dann die spezifischen Bindungspartner X und Y, die mit den Sensitizer- bzw. Chemiluminescer-Partikeln assoziiert sind, hinzugegeben.
Andere Energie-Transfer-Verfahren die ebenfalls bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden könnten, beruhen auf dem Energie-Transfer nach Förster (Mathis, G. (1993) Clin. Chem. 39: 1953 - 1959; US 5,527,684) oder auf der Verwendung von Photosensitizern und Fluorophoren (WO 95/06877) oder auf der Kombination radioaktiver Strahlung und Fluorophoren (S.Udenfriend et al. (1985) Proc. Math. Acad. Sei 82: 8672 - 8676) oder der Verwendung von geeigneten Enzymkaskaden (US 4,663,278). Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der analytspezifische Bindungspartner R1 mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert und der analytspezifische Bindungspartner R2 weist spezifische Bindungsstellen für den spezifischen Bindungspartner Y auf, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, wobei R2 mehr als eine Bindungsstelle für den jeweiligen, mit Komponenten eines signalbildenden System assoziierten spezifischen Bindungspartner Y aufweist.
Ferner ist ein Reagenz in flüssiger oder lyophilisierter Form ein Gegenstand dieser Erfindung, welches eines oder mehrere der weiter oben beschriebenen erfindungsgemäßen Trägermoleküle, die jeweils mit einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartnern assoziiert sind, enthält oder die erfindungsgemäßen Mikropartikel enthält. Ebenso ist ein Testkit, der ein solches Reagenz enthält, von dieser Erfindung umfasst. Dies gilt ebenso für die Verwendung dieses Reagenzes und/oder des Testkits zur Durchführung eines homogenen oder heterogenen Bindungstests zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe, bevorzugt zur Durchführung eines der in den Patentansprüchen beschriebenen homogenen Verfahrens.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen homogenen Bindungstestes. Dieser Testkit ist dadurch gekennzeichnet, dass er einen analytspezifischen Bindungspartner R1 enthält, der mehr als eine spezifische Bindungsstelle für den spezifischen Bindungspartner X aufweist, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, und dass dieser einen analytspezifischen Bindungspartner R2 enthält, der mehr als eine spezifische Bindungsstelle für den spezifischen Bindungspartner Y aufweist, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist.
Der erfindungsgemäße Testkit kann auch zusätzlich die mit Komponenten eines signalbildenden System assoziierten spezifischen Bindungspartner X und/oder Y enthalten. Ferner können die erfindungsgemäßen Testkits auch eine Packungsbeilage, Verdünnungspuffer, Standards, Kontrollen, Systemreagenzien und/oder weitere für die Testdurchführung benötigte Reagenzien und Materialien (z.B. Küvetten, Probenabnahmebestecke) enthalten.
Bevorzugterweise enthalten die erfindungsgemäßen Testkits einen analytspezifischen Bindungspartner R1 , der aus einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartner besteht, die mit biotinylierten Dextran, biotinylierten Proteinpolymeren, biotinylierten Antikörperpolymeren oder einem anderen Trägermolekül assoziiert sind und/oder einen analytspezifischen Bindungspartner R2, der aus einem oder mehreren analytspezifischen Bindungspartner besteht, die mit biotinylierten Dextran, biotinylierten Proteinpolymeren, biotinylierten Antikörperpolymeren oder einem anderen Trägermolekül assoziiert sind.
Die im folgenden beschriebenen Beispiele dienen zur exemplarischen Beleuchtung einzelner Aspekte dieser Erfindung und sind nicht als Einschränkung zu verstehen.
Beispiele:
Beispiel 1: Herstellung von Sensitizer- bzw. Chemiluminescer-Partikel
Die Herstellung von Sensitizer- und Chemiluminescer-Partikeln ist im Detail in EP 0 515 194, Clin. Chem. (1996) 42:1518-1526 und Proc. Natl. Acad. Sei. (1994) 91:5426-5430 beschriebenen. Die Partikel können z.B. Dextranumhüllungen tragen und zusätzlich gebundes Streptavidin aufweisen (s.a. Proc. Natl. Acad. Sei. (1994) 91:5426-5430). Exemplarisch ist im folgenden die Herstellung einer Variante von Sensitizer- und Chemiluminescer-Partikeln beschrieben (s.a. EP 0 515 194, Beispiel 8, für weitere Details):
Herstellung von Sensitizer-Partikeln:
Eine Lösung von Chlorophyll-a in Benzylalkohol (1 ,0 ml; 0,6 mM) wird zu 8,0 ml Benzylalkohol gegeben, der auf 105°C erhitzt worden ist. Eine Suspension von Latex-Beads (175 nm, carboxyl-modifiziertes Latex, Bangs Laboratories, Carmel, IN) in Wasser (10%; 1,0 ml) wird zu der Benzylalkohol-Lösung gegeben. Das Gemisch wird für 5 Minuten bei 105°C gerührt und dann auf Raumtemperatur gekühlt. 10 ml Ethanol werden hinzugegeben und das Gemisch zentrifugiert. Das Pellet wird in einem 1 :1 Wasser-Ethanol Gemisch (10 ml) resuspendiert und anschließend wieder zentrifugiert. Das gleiche Verfahren wird mit Wasser wiederholt und anschließend das Pellet in physiologischer Kochsalz-Lösung aufgenommen.
Herstellung der Chemiluminescer-Partikel (= Acceptor-Partikel): 20 ml der carboxyl-modifizierten Latex-Partikel-Suspension (10% Suspension in Wasser) werden mit 20 ml 2-Ethoxyethanol gemischt. Die Mischung wird auf 90°C erhitzt. 20 ml einer Lösung aus 10 mM Dioxen, 20 mM Europiumchelat mit dem Agenz 3-(2-thienoyl)-1 ,1,1trifluoroaceton (Kodak, CAS # 14054-87-6) (EuTTA) und 60 mM Trioctylphosphinoxid (TOPO) in 2-Ethoxyethanol werden der Partikel- Suspension zugegeben. Das Gemisch wird weiter bei 97CC für 7 Minuten erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden 40 ml Ethanol zugegeben und das Gemisch zentrifugiert. Das Pellet wird dann in 80% Ethanol resuspendiert und zentrifugiert. Dieser Waschprozess wird mit 10% Ethanol wiederholt. Zum Abschluß werden die Partikel in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Beispiel 2: Herstellung von Universalreagenzien
Chemiluminescencer-Partikel (=Acceptor- Partikel) mit Streptavidin: Es wurden 20 mg Acceptor-Partikel mit 2,0 mg Streptavidin (Fa. Gerbu, High purity, #3058) und 0,2 mg Natriumcyanoborhydrid (Fa. Sigma, S 8628) in einem Kopplungspuffer (0,05 M ß-Morpholino-ethansulfonsäure; Fa. Serva, Art. 29834) zusammengegeben und 24 Stunden bei +37°C inkubiert. Die Kopplungsbedingungen während der Inkubation: 50mg Partikel/ml Kopplung, 0,5 mg Natriumcyanoborhydrid/ml Kopplung, 2 mg Streptavidin/20 mg Partikel.
Nach der Inkubation wurde 65,6 μl einer 0,48 M Carboxymethoxylamin Hemihydrochlorid (Fa. Aldrich, 98%-ig, Cat.Nr. C1 ,340-8) Lösung zugegeben, gemischt und für weitere 2 Stunden bei +37° inkubiert.
Der Überstand wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und die Partikel in Kopplungspuffer (mit 0,6 M NaCI, Fa. Merck), resupendiert. Danach wurde der Überstand nochmals durch Zentrifugieren abgetrennt und die Partikel in Lagerpuffer (0,1 M Tris HCI, 0,3 M NaCI, 25 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,1% Dextran T-500, 0,1% Zwittergent 3-14, 0,01 % Gentamycin, 15 ppm ProClin-300, pH 8,0) aufgenommen und resupendiert.
Sensitizer-Partikel mit Streptavidin:
Es wurden Sensitizer-Partikel analog der Kopplung "Chemiluminescencer-Partikel (=Acceptor-Partikel) mit Streptavidin" gekoppelt.
Sensitizer-Partikel mit Anti-Digoxigenin:
Es wurden 15mg Sensitizer-Partikel mit 3 mg Anti-Digoxigenin Antikörper (Mab DIG 2H6, Fa. Dade Behring Inc.) und 0,15 mg Natriumcyanoborhydrid (Fa. Sigma, S 8628) in einem Kopplungspuffer (0,05 M ß-Morpholino-ethansulfonsäure; Fa. Serva, Art. 29834) zusammengegeben und 24 Stunden bei +37°C inkubiert. Die Kopplungsbedingungen während der Inkubation: 32,8 mg Partikel/ml Kopplung, 6,6 mg Antikörper/ml Kopplung, 0,33 mg Natriumcyanoborhydrid/ml Kopplung, 3mg Antikörper/15 mg Partikel. Nach der Inkubation wurde 49,2 μl einer 0,48 M Carboxymethylamin Hemihydrochlorid Lösung (Fa. Aldrich, 98%-ig, Cat.Nr. C1, 340-8) zugegeben, gemischt und für weitere 2 Stunden bei +37° inkubiert.
Der Überstand wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und die Partikel in Kopplungspuffer (mit 0,6 M NaCI, Fa. Merck), resupendiert. Danach wurde der Überstand nochmals durch Zentrifugieren abgetrennt und die Partikel in Lagerpuffer (0,1 M Tris HCI, 0,3 M NaCI, 25 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,1% Dextran T-500, 0,1% Zwittergent 3-14, 0,01 % Gentamycin, 15ppm ProClin-300, pH 8,0) aufgenommen und resupendiert.
Chemiluminescencer-Partikel (=Acceptor-PartikeP mit Anti-Digoxigenin oder Anti- Troponin: Es wurden Acceptor-Partikel analog der Kopplung "Sensitizer-Partikel mit Anti- Digoxigenin" mit gegen Digoxigenin bzw. Troponin gerichtete Antikörper gekoppelt.
Universalreagenz A (Acceptor-Partikel mit Streptavidin) wird in Kombination mit Universalreagenz B (Sensitizer-Partikel mit Anti-Digoxigenin) oder Universalreagenz A (Acceptor-Partikel mit Anti-Digoxigenin) wird in Kombination mit Universalreagenz B (Sensitizer-Partikel mit Streptavidin) in den folgenden Beispielen eingesetzt.
Beispiel 3: PSA-Assay
Herstellung von PSA spezifischen Reagenzien
Konjugat K1 (Biotinvlierter Anti-PSA-Antikörper):
Zu 2,3 mg Anti-PSA-Antikörper (MAK <PSA> 92-284/03, Dade Behring Marburg GmbH, in 0,1 M Natriumcarbonat (Fa. RdH, 31432) wurden 0,23 mg Biotin-LC-NHS (Fa. Pierce, Art. 21336, Immuno Pure), gelöst in DMSO (Fa. RdH, 34943), zugegeben, gemischt und 16 Stunden bei +4°C inkubiert. Molares Einsatzverhältnis [AK] : [Biotin-LC-NHS] = 1:35. Das Konjugat wurde über eine PD-10 Column Sephadex G-25M. ( Fa. Pharmacia Biotech, Code 17-0851-01) mit Phosphatpuffer (0,05 M Natriumdihydrogenphosphat mit 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,5) aufgereinigt.
Konjugat K2 (mit Digoxigenin markierter Anti-PSA-Antikörper): Der Anti-PSA-Antikörper (MAK <PSA> 92-283/029 Dade Behring Marburg GmbH) wurde mit Digoxigenin laut Vorschrift / Gebrauchsanweisung DIG-Antibody Labeling Kit (Fa. Boehringer Mannheim Biochemica, Best. Nr. 1367200, Durchführung: Protein-Markierung mit DIG-NHS LMonoklonale Antikörper) markiert.
Assav-Puffer
0, 1 mol/l Tris plus 0,3 mol/l NaCI plus 25 mmol/l EDTA plus 0,1 % RSA plus 0, 1 % Dextran T-500 plus 0,1 % Zwittergent 3-14 plus 0,01 % Gentamycin plus 15 ppm ProClin-300, pH-Wert 8,00.
Durchführung eines PSA-Assav
Zur Testdurchführung wurden die Komponenten wie folgt gemischt und inkubiert: 10 μl Probe 75 μl Assay Puffer 25 μl Konjugat K1 (biotinylierter Anti-PSA-Antikörper) und Konjugat K2 (digoxigenierter Anti-PSA-Antikörper), je 0,96 μg /ml 371 Sekunden Inkubationszeit bei +37°C 100 μl Assay-Puffer 20 μl Sensitizer-Partikel mit Anti-Digoxigenin (0,2 mg/ml ) 20 μl Acceptor-Partikel mit Streptavidin (0,2mg/ml) 762,5 Sekunden Inkubationszeit bei +37°C Messung Die Durchführung und Messung erfolgte an einem modifizierten Sample Processor der Firma Tecan, siehe Ullman et al. (Clinical Chemistry 42:1518-1526. 1996, EP 0515194 A2), die Signale wurden aufgezeichnet. Ergebnisse
Tabelle 1 : Standardkurve im PSA Assay:
Tabelle 2: Proben, die mit dem erfindungsgemäßen PSA Assay gemessen wurden:
Die obige Tabelle zeigt, daß die im erfindungsgemäßen Verfahren bestimmten Werte mit dem im Vergleichsverfahren (Abbott IMx Total PSA, List-Nr.1 D85), innerhalb üblicher Abweichungen, übereinstimmt. Dies belegt, daß das erfindungsgemäße Verfahren funktioniert. Beispiel 4: Variation der Anzahl der Biotin-Label pro Antikörper
Gemäß dem im Beispiel 3 beschriebenen Biotinylierungs-Verfahren wurde der anti- PSA Antikörper (MAK<PSA>92-284/03, Dade Behring Marburg GmbH) mit verschieden Mengen an Biotinmolekülen und der anti-PSA Antikörper (MAK<PSA>92-283/029, Dade Behring Marburg GmbH) mit verschiedenen Mengen an Digoxigenin-Molekülen konjugiert. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse der Antikörperpaare dargestellt.
Tabelle 3: PSA Assay auf Basis von Antikörpern, mit einer unterschiedlichen Anzahl an Bindungsstellen für die spezifischen Bindungspartner X und Y. Messsignal angegeben in „Counts".
Beispiel 5: Herstellung von Dextran-Antikörper-Biotin Konjugaten
Aktivieren von Antikörpern mit N-Succinimidyl S-Acetylthioacetat (SATA)
10,4 mg Anti-PSA Antikörper (MAK<PSA>92-284/03, Dade Behring Marburg GmbH) in 0,1 M Natriumcarbonat Puffer (Fa. Riedel de Haen, 31432) werden in Mischpuffer (LiBO3/20% Dioxan), pH 8,5, umgepuffert und mit 104 μL SATA (Fa. Pierce) in DMF (2 mg/mL) gemischt. Nach einer Inkubation von 1,5 Stunden bei 37 °C wird 45 Minuten mit 200 μL NH2OH inkubiert.
Anschließend wird das Konjugat über eine PD-10 Säule mit Phosphatpuffer 0,1 M pH 6,0 entsalzt. Herstellen von aktiviertem Biotin-Dextran
3,9 mg (1,95 mL) FlukaBioDex (70000 kDa, Product Nummer 14402, Biotin Substitution 20 mol/mol) werden in Mischpuffer (2 mg/mL) aufgenommen und mit 26 μL GMBS-Lösung (N- maleimidobutyryloxysuccinimide ester, Fa. Pierce) in Dioxan (6 mg/mL) gemischt. Dieses Gemisch wird eine Stunde bei 18 °C inkubiert. Anschliessend wird das Konjugat über eine PD-10 Säule mit Phosphatpuffer 0,1 M, pH 6,0 entsalzt.
Kopplung des aktivierten Antikörpers mit dem aktivierten Biotin-Dextran
Konjugat 1 :
1 ,7 mL der Antikörper-SATA Lösung (1 mg/mL) werden mit 509 μL der FlukaBioDex- GMBS Lösung (1,32 mg/mL) gemischt. Dieses Gemisch wird 2 Stunden bei 37 °C inkubiert und anschliessend mit 220 μL 0,1 M n-Ethylmaleimid-Lösung abgestoppt. Die Aufreinigung/Entsalzung erfolgt über Sephacryl S300 (Durchmesser 1,6 cm, Gelbetthöhe 90 cm, Auftragungsmenge ca. 2 mL) mit 0,1 M TRIS/HCI, 150 mM NaCI pH 7,4. Die das Konjugat enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und auf 1,7 mL ankonzentriert (« 0,65 mg/mL).
Konjugat 2:
1,7 mL der Antikörper-SATA Lösung (1 mg/mL) werden mit 102 μL der FlukaBioDex- GMBS Lösung (1,32 mg/mL) gemischt. Dieses Gemisch wird 2 Stunden bei 37 °C inkubiert und anschliessend mit 180 μL 0,1 M n-Ethylmaleimid-Lösung abgestoppt. Die Aufreinigung/Entsalzung erfolgt über Sephacryl S300 der Fa. Fluka (Durchmesser 1,6 cm, Gelbetthöhe 90 cm, Auftragungsmenge ca. 2 mL) mit 0,1 M TRIS/HCI, 150 mM NaCI pH 7,4. Die das Konjugat enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und auf 1,7 mL ankonzentriert (« 0,64 mg/mL).
Auf Grund der unterschiedlichen Ansätze ergibt sich für Konjugat 1 ein Verhältnis von ca. 18 Biotin-Molekülen pro Antikörper und für Konjugat 2 ein Verhältnis von ca. 3 Biotin-Molekülen pro Antikörper. Diese Konjugate wurden im weiter oben beschriebenen PSA Assay in Kombination mit den oben beschriebenen digoxigenierten Anti-PSA-Antikörpern mit ansteigenden Antikörper/Dioxigenin Verhältnissen eingesetzt. Die Konzentration der Dextran- Konjugate lag bei 9,75 μg/mL und die digoxigenierten Anti-PSA-Antikörper wurden mit einer Konzentration von 8,8 μg/mL eingesetzt. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse dargestellt.
Tabelle 4: PSA Assay unter Verwendung von Dextran-Antikörper-Biotin Konjugaten. Messsignal angegeben in „Counts".
Beispiel 6: Rubella IgM Assay
Herstellung von Rubella IgM spezifischen Reagenzien
Konjugat KKBiotinylierter Anti-Human IgM-Antikörper):
Die biotinylierung von Anti-Humah IgM-Antikörper von der Ziege (PAK <h-lgM> 62FX022, Dade Behring Marburg GmbH) erfolgte analog der Biotinylierung der Anti- PSA-Antikörper (s. Beispiel 3).
Konjugat K2 (mit Digoxigenin markierter Anti-Rubella-Antikörper): .
Der Anti-Rubella-Antikörper (MAK <Rubella> 93-9/08, Dade Behring Marburg GmbH) wurde mit Digoxigenin laut Vorschrift / Gebrauchsanweisung DIG-Antibody Labeling Kit (Fa. Boehringer Mannheim Biochemica, Best. Nr. 1367200, Durchführung: Protein-Markierung mit DIG-NHS 1.Monoklonale Antikörper) markiert.
Assav-Puffer:
0,1 mol/l Tris plus 0,3 mol/l NaCI plus 25 mmol/l EDTA plus 0,1% RSA plus 0,1 % Dextran T-500 plus 0,1% Zwittergent 3-14 plus 0,01% Gentamycin plus 15ppm ProClin-300, pH-Wert 7,3.
Rheuma Faktor (RF) Absorbens:
Rheuma Faktor (RF) Absorbens der Firma Dade Behring Marburg GmbH, Produkt
Nummer OUCG.
Rubella Antigen:
Firma Intergen, CDP (Lot.8320)
Durchführung eines Rubella IgM Assav
Zur Testdurchführung wurden die Komponenten wie folgt gemischt und inkubiert: 10 μl Probe, 1+9 Teile in RF Absorbens verdünnt 40 μl Assay Puffer 25 μl Konjugat K1 (biotinylierter Anti-Human IgM-Antikörper, 8 μg/ml) und Konjugat K2 (digoxigenierter Anti-Rubella-Antikörper, 2 μg/ml) 25 μl Rubella Antigen, 4 μg/ml) 453,5 Sekunden Inkubationszeit bei +37°C 75 μl Assay Puffer 25 μl Acceptor-Partikel mit Anti-Digoxigenin (0,05 mg/ml ) 50μl Sensitizer-Partikel mit Streptavidin (0,4 mg/ml) 432,5 Sekunden Inkubationszeit bei +37°C Messung
Die Durchführung und Messung erfolgte an einem modifizierten Sample Processor der Firma Tecan, siehe Ullman et al. (Clinical Chemistry 42:1518-1526. 1996, EP 0515 194 A2), die Signale wurden aufgezeichnet.
Ergebnis eines Rubella IgM Assavs Tabelle 5: Messung von Proben im Rubella IgM Assay. Messsignal angegeben in „Counts" bzw. in „mE" (Messung der Extinktion).
Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, stimmen die mittels des erfindungsgemäßen Verfahren erzielten Ergebnisse mit dem im Vergleichsverfahren (DiaSorin, ETI-RUBEK-M reverse, P2471) gewonnenen, innerhalb üblicher Abweichungen, überein. Dies belegt, dass auch bei einem indirekten Testverfahren das erfindungsgemäßen Verfahren funktioniert. Beispiel 7: Vergleich eines Biotin-Standard-Konjugates mit einem biotinylierten Trägermolekül-Fab' Konjugat anhand eines Troponin Assays
Herstellung eines biotinylierten Trägermolekül-Fab' Konjugates ("M-lgG-Biotin Anti- Troponin-KoniuoaH:
Eine Lösung von murinen IgG-Antikörpem ("M-IgG") (15,0 mL, 2,6 mg/mL M-IgG, 0,26 mmol) in 0,1 M Phosphatpuffer (5 mM EDTA, pH 7.0) wird mit einer wässerigen Sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoat Lösung (0,66 mL, 2,0 mg/mL) gemischt. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei 25 °C wird das Gemisch mit einer Gelfiltrationssäule (AcA22, Ciphergen, Fremont, CA) ankonzentriert und aufgereinigt. Die Fraktionen mit dem monomeren, aktivierten M-IgG (mit HPLC getested) werden gepoolt.
Eine Lösung (3,0 mL, 10 mg/mL) eines F(ab')2 Fragments eines Anti-Troponin Antikörpers in einem 0,1 M Phosphatpuffer (5 mM EDTA, pH 6.0) werden mit 0,091 mL eines Gemisches von Dithiothreitol (15,4 mg/mL) und 2-Mercaptoethanol (15,6 uL/mL) gemischt. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei 37 °C wird das Gemisch mit einer Gelfiltrationssäule (AcA22, Ciphergen, Fremont, CA) ankonzentriert und aufgereinigt. Die Fraktionen mit dem Fab' Antikörperfragment werden gepoolt.
Eine Mischung des aktivierten M-IgG (20,5 mg; 0,14 mmol) und des Fab' Fragments (20,5 mg; 0,41 mmol) werden über eine Amicon Ultrafiltrationszelle in einen Phosphatpuffer pH 7,0 umgepuffert (5 mM EDTA). Die Mischung wird auf 5.0 mg/mL Protein ankonzentriert und für 24 - 70 Stunden bei 2 - 8 °C inkubiert. Danach wird eine wässrige Lösung von N-Ethylmaleimid (20 mg/mL; 50 μL per mL Proteinlösung) hinzugegeben. Nach einer Stunde Raumtemperatur wird die Lösung mit einer Gelfiltrationssäule (AcA22, Ciphergen, Fremont, CA) in 10 mM Phosphatpuffer (300 mM NaCI, pH 7.0) ankonzentriert und aufgereinigt. Die Proteinfraktionen werden gepoolt.
Das Fab' -M-lgG-Konjugat in dem Phosphatpuffer pH 7.0 (6 mL; 0.8 mg/mL; 16 umol) wird mit einer wässrigen Lösung des NHS-PEO4-Biotin (Pierce Chemical , Company, Rockford, ILL; 0,095 mL, 0,5 mg/mL) versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 4 Stunden bei Raumtemperatur wird das Gemisch gegen den pH 7.0 Phosphatpuffer diafiltriert. Herstellung eines Fab'-Biotin Konjugates ("Standard-Biotin Anti-Troponin-KonjugaO
Eine Lösung des Fab'-Fragmentes des Anti-Troponin Antikörpers (2 mL einer 5 mg/mL Proteinlösung) in 10 mM Phosphatpuffer (300 mM NaCI, pH 7.0) wird mit 0,22 mL einer PEO-iodoacetylbiotin-Lösung (10 mg/mL; 4 mmol in DMF) der Fa. Pierce Chemical Company, Rockford, III. gemischt. Nach einer Reaktionszeit von 4 Stunden bei Raumtemperatur wird das Gemisch gegen den pH 7.0 Phosphatpuffer diafiltriert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA Protein Assay der FA. Pierce Chemical Company bestimmt. Troponin-lmmunoassavs
A) Testdurchführung
Zur Testdurchführung wurden die Komponenten wie folgt gemischt und inkubiert: 20 μl Probe . 10 μl Wasser 15 μl Konjugat (Standard-Biotin Anti-Troponin-Konjugat: 12,5 μg /ml oder M- IgG-Biotin Anti-Troponin-Konjugat: 8 μg/mL) 13 μl Acceptor-Partikel mit Anti-Troponin-Antikörper (210 μg/mL) 435 Sekunden Inkubationszeit bei +37°C 13 μl Sensitizer-Partikel mit Streptavidin (1 ,5 mg/ml ) 10 μl Wasser 87 Sekunden Inkubationszeit bei +37CC 169 μl Wasser Messung
Die Durchführung und Messung erfolgte an einem modifizierten Sample Processor der Firma Tecan, siehe Ullman et al. (Clinical Chemistry 42:1518-1526. 1996, EP 0515194 A2), die Signale wurden aufgezeichnet. B) Ergebnisse
Tabelle 6: Troponin-Immunoassay unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Anti-Troponin-Konjugaten. Messsignal angegeben in „Counts".
Das mit biotinylierte Trägermolekül-Fab' Konjugat (= M-lgG-Biotin Anti-Troponin- Konjugat) zeigt eine deutlich steilere Kalibrationskurve, was ein verbesserte Präzion des Testes zur Folge hat.

Claims

Patentansprüche
1. Homogenes Verfahren zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe, wobei der analytspezifische Bindungspartner R1 spezifische Bindungsstellen für den spezifische Bindungspartner X aufweist, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, und der analytspezifische Bindungspartner R2 spezifische Bindungsstellen für den spezifischen Bindungspartner Y aufweist, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass R1 und/oder R2 mehr als eine Bindungsstelle für den jeweiligen, mit Komponenten eines signalbildenden System assoziierten spezifischen Bindungspartner aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1 bei dem R1 und/oder R2 vorher, während oder nach der Bindungsreaktion mit dem Analyten über X und/oder Y an Komponenten des signalbildenden System gebunden werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Bindungstellen von R1 für den spezifischen Bindungspartner X mindestens 2, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 10 und ganz besonders bevorzugt mindestens 15 beträgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Bindungstellen von R2 für den spezifische Bindungspartner Y mindestens 2, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 10 und ganz besonders bevorzugt mindestens 15 beträgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei es sich bei R1 und R2 um die gleichen oder um verschiedene analytspezifischen Bindungspartner handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei R1 und R2 den Analyten spezifisch zu binden vermögen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei es sich bei R1 oder R2 um einen modifizierten Analyten handelt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, wobei es sich bei den Bindungsstellen von R1 für den spezifische Bindungspartner X um Haptene oder andere Mitglieder eines spezifischen Bindungspaars handelt, besonders bevorzugt um Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, einzelsträngige Nukleinsäureketten und Dinitrophenol.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, wobei es sich bei den Bindungsstellen von R2 für den spezifische Bindungspartner Y um Haptene oder andere Mitglieder eines spezifischen Bindungspaars handelt, besonders bevorzugt um Biotin, Digoxigenin, Fluorescein, einzelsträngige Nukleinsäureketten und Dinitrophenol.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, wobei es sich bei X und Y um den den gleichen- oder um einen verschiedenen spezifischen Bindungspartner handelt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, wobei es sich bei X um Avidin, Streptavidin, Anti-Digoxigenin-Antikörper, Anti-Dinitrophenol-Antikörper, einzelsträngige Nukleinsäurekette, Anti-Hapten-Antikörper, Enzym, Enzym- Substrat oder um einen Antikörper, der spezifisch bestimmte Polypeptide, Oligopeptide oder Enzyme zu binden vermag, handelt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, wobei es sich bei Y um Avidin, Streptavidin, Anti-Digoxigenin-Antikörper, Anti-Dinitrophenol-Antikörper, einzelsträngige Nukleinsäurekette, Anti-Hapten-Antikörper, Enzym, Enzym- Substrat oder um einen Antikörper, der spezifisch bestimmte Polypeptide, Oligopeptide oder Enzyme zu binden vermag, handelt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, wobei infolge der Bindung des Analyten an R1 und/oder R2 Komponenten des signalbildenenden Systems in einen Abstand zueinander gebracht werden, der eine Wechselwirkung, insbesondere einen Energietransfer, zwischen diesen Komponenten erlaubt und das Ausmaß dieser Wechselwirkung gemessen wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, wobei infolge der Bindung des Analyten an R1 oder R2 Komponenten des signalbildenden Systems in einen Abstand zueinander gebracht werden, der keine oder nur sehr geringe Wechselwirkung, insbesondere keinen oder nur sehr geringen Energietransfer, zwischen diesen Komponenten erlaubt und das verbleibende Ausmaß dieser Wechselwirkung gemessen wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14, wobei es sich bei Komponenten des signalbildenden Systems um Mikropartikel, bevorzugt Latexpartikel, handelt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei es sich bei Komponenten des signalbildenden Systems um an Mikropartikel assoziierte Photosensitizer und an Mikropartikel assoziierte chemolumineszierende Substanzen handelt.
17. Testkit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, dass dieser einen analytspezifischen Bindungspartner R1 enthält, der mehr als eine spezifische Bindungsstelle für den spezifischen Bindungspartner X aufweist, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist, und dass dieser einen analytspezifischen Bindungspartner R2 enthält, der mehr als eine spezifische Bindungsstelle für den spezifischen Bindungspartner Y aufweist, der mit einer Komponente eines signalbildenden System assoziiert ist.
18. Testkit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass dieser zusätzlich auch die mit Komponenten eines signalbildenden Systems assoziierten spezifischen Bindungspartner X und/oder Y enthält.
19. Testkit nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass dieser den analytspezifischen Bindungspartner R1 gemäß Anspruch 3 und/oder den analytspezifischen Bindungspartner R2 gemäß Anspruch 4 enthält.
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