JPS62103572A - スクアレ−ト染料を用いる新規リガンド・レセプタ−・アツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） 蛍光化合物は、一定エネルギー値範囲のエネルギーで励
起されたとき光を発する能力を有することにより、広範
な用途を有する。この能力により、蛍光剤は化学的方法
または生物学的方法、例えばアッセイにおいて、標識と
して用いられる。すなわち、種々の化合物を蛍光化合物
にコンジュゲートすることができ、生成したコンジュゲ
ートをある種の分配に付し、コンジュゲートの行方を、
試料に光を照射しコンジュゲートが存在する帯域を検出
することにより測定できろ。

この技術は、リガンドとレセプター、例えば抗原と抗体
のような特異的結合対が関係するイムノアッセイに用い
ることができる。蛍光剤を特異的結合対構成員の１つに
コンジュゲートさけ、種々のプロトコルを用いることに
より、未知検体中の抗原量に関連して蛍光剤フンシュゲ
ートを固相と液相の間で分配することができる。何れか
一方の相の蛍光を測定することにより、観測された蛍光
レベルを試料中の抗原濃度に関連づけることができる。

別の方法として、液体媒質中の標識環境に応じて標識蛍
光を変化させる機構を用いることにより、蛍光標識の分
配を避けることができる。例えば、特異的結合対構成員
の１つに蛍光剤で標識することに加えて、他方の構成員
を消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）すなわち蛍光剤分子の励
起エネルギーを吸収して光子の放出を防ぎ得る分子で標
識することができる。

消光は、特異的結合対を構成する２成分が会合し、それ
により蛍光剤と消光剤が消光に必要な空間的近接を達成
した七きにのみ起る。

（先行技術） 米国特許第３９９８９４３号は、リガンドの抗体および
蛍光剤の抗体の同時結合の立体的阻止を用いるリガンド
・蛍光剤コンジュゲートが関与したイムノアッセイを記
載しているが、ここでは蛍光剤の抗体が蛍光を実質的に
消光する。米国特許第３９９６３４５号は、特異的結合
対の１つの構成員に結合した蛍光剤のコンジュゲートと
、同一または異なる特異的結合対構成員に結合した消光
剤のコンジュゲートを用いる蛍光剤・消光剤の対が関与
したイムノアッセイを記載している。このアッセイは、
媒質中のアナライト量に基づいて消光剤と蛍光剤が消光
距離内に近接する度合に依存している。ポリ（アミノ）
酸を用いる蛍光剤と消光剤の新規コンジュゲートが米国
特許第４３５１７６０号および第４３１８８４６号に記
載されている。染料でタッグした試薬が米国特許第４１
６６１０５弓にスー請六れている一ジゴキシゲニ゛ノ冬
佛原、抗体、標識コンジュゲートおよび関連誘導体は、
米国特許第４４６９７９７号中で検討されている。

種々のスクアレート染料が、スプレンガー等、アンゲバ
ンテ・ヘミ−（Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、　）８．０巻
５４１頁（１９６８年）、スプレンガー等、アンゲバン
テ・ヘミ−（Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、）７９巻５Ｂ＋
頁（１９６７年）、スプレンガー等、アンゲバンテ・ヘ
ミ−・インターナショナル・エディンヨン（Ａｎｇｅｗ
、　Ｃｈｅｍ、　Ｉｎｔｅｒｎａｔ、　Ｅｄｉｔ、　）
５巻８９４頁（１９６６年）、およびマークス等、同誌
５巻８８８頁（１９６６年）中で検討されている。

比較的大きな試料容積中の蛍光フラクチュエーンヨンの
相関により相対寸法に基づいて粒子を差別するためにレ
ーザービームとスリットを用いる方法が、ブリックス等
、サイエンス（Ｓ　ｃ　１ｅｎｃｅ）　２１２巻＋２６
６−１２６７頁（１９８１年）およびニコリ等、ブロシ
ーデインダス・オン・ザ・ナンヨナル・アカデミ−・オ
ン・サイエンス・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ
ｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　、ｔＪｓＡ）７７
巻４９０４−４９０８頁（１９８０年）に記載されてい
る。

細胞にとり込まれたスクアレート染料を蛍光剤としてイ
ムノアッセイに用いることは、ヨーロッパ特許出願第８
５３０６０５４．９号に記載されている。

［発明の概要］ この発明は、通常６００ナノメートルより大きな値の極
大吸収を有するスクアレート染料と特異的結合対の構成
員類のコンジュゲートである、新規化合物に関するもの
である。特異的結合対は、リガンドとその相補的レセプ
ターからなる群から選ばれる。この新規化合物は、アナ
ライトを含有する試料中におけるアナライトの存否また
は量の測定用アッセイに使用される。上記コンジュゲー
トまたは水相容性スクアレート染料を用いる新規アッセ
イ法も、この発明に含まれる。また、新規化合物を含む
キットが提供される。

［具体的実施態様の記載］ この発明は、試料中のアナライト（分析質、ａｎａｌｙ
ｔｅ）の測定用アッセイに用いろ化合物の改良を提供す
るものであり、ここにいう化合物は染料と特異的結合対
構成員のコンジュゲートである。改良点は、コンジュゲ
ート中の染料としてスクアレート染料を用いる点にある
。この発明はまた、スクアレート染料コンジュゲートま
たは水相容性ス・クアレート染料をヘリウム／ネオンレ
ーザ−と組合わせる新規アッセイ法を含む。

この発明の具体的実施態様をさらに詳細に述べる前に、
用語の説明を行なう。

アナライト・・・測定すべき化合物または組成物であり
、また関心の対象となる物質である。これは通常特異的
結合対の一員であり、−価または多価のリガンドである
ことができ、通常抗原性またはハブテン性であり、単一
化合物であるかまたは少なくとも１つの共通エピトープ
部または決定基をもつ複数の化合物である。

多価リガンド・アナライトは、通常ポリ（アミノ酸）す
なわちポリペプチドおよび蛋白質、多糖類、核酸、およ
びこれらの組合わせである。このような組合わせには、
細菌、ウィルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核
、細胞膜等が含まれる。

アナライトの詳細な性質は、数多くの例と共に米国特許
第４２９９９１６号（リドマン等）特に１６〜２３ａｌ
に記載されており、これを引用して説明の一部とする。

多くの場合、この発明で用いるポリエピトープ性リガン
ド・アナライトは、分子量少なくとも約５０００、通常
少なくとも約１００００である。

ポリ（アミノ酸）類の中では、関心のあるポリ（アミノ
酸は一般に分子量約５００（１−５００００００であり
、通常的２００００〜＋００００００である。関心のあ
るホルモン類では、分子量は約５０００〜６００００の
分子量範囲内にある。

広範囲の蛋白質が、同様な構造的特徴を有する蛋白質、
特定の生物学的機能を有する蛋白質、特定の微生物特に
病原性微生物に関連する蛋白質等として含まれる。

モノエピトープ性リガンド・アナライトは、一般に分子
量約１００−２０００、通常＋２５−１０００である。

関心のあるアナライトには、医薬、中間代謝物、殺虫剤
、汚染物等が含まれる。関心のある医薬としては、アル
カロイド性のものが含まれる。アルカロイドの中には、
モルヒネ、コディン、ヘロイン、デキストロメトルファ
ン、それらの誘導体および代謝物を含むモルヒネアルカ
ロイド、コカイン、ペンゾイルエルゴニン、それらの誘
導体および代謝物を含むコカインアルカロイド、リセル
グ酸ジエヂルアミドを含む麦角アルカロイド、ステロイ
ドアルカロイド、イミナゾイルアルカロイド、キナプリ
ンアルカロイド、イソキノリンアルカロイド、キニンお
よびキニジンを含むキノリンアルカロイド、ジテルペン
アルカロイド、それらの誘導体および代謝物がある。

医薬の別の群には、エストロゲン、ゲストロゲン、アン
ドロゲン、アドレノコルチコステロイド、胆汁酸、強心
配糖体およびアグリコン（ジゴキシンおよびジゴキシゲ
ニンを含む）、サポニンおよびサボゲニン、それらの誘
導体および代謝物を含むステロイド類がある。また、ノ
エチルスチルベストロールのようなステロイド様物質も
含まれる。

医薬の別の群には、パルピッレート、例えばフエノバル
ビタールおよびセコバルビクール、ジフェニルヒダント
ニン、ブリミドン、エトスクシミド、およびそれらの代
謝物を含む５−６員ラクタムがある。

医薬の別の群には、アンフェタミン、カテコールアミン
（エフェドリンを含む）、Ｌ−ドーパ、エピネフリン、
ナルセイン、バパベリン、およびそれらの代謝物を含む
アミノアルキルベンゼン類がある。

医薬の別の群には、オキサゼパム、クロルプロマジン、
テグレトール、イミプラミン、それらの誘導体および代
謝物を含むベンズヘテロ環（ヘテロ漂はアゼピン、ジア
ゼピン、フェノチアジンであり得る）がある。

医薬の別の群には、テオフィリン、カフェイン、それら
の代謝物および誘導体を含むプリン類がある。

医薬の別の群には、カナピノールおよびテトラビドロカ
ナビノールを含むマリファナ由来物質がある。

医薬の別の群には、Ａ、Ｂ（例えばＢ１２）、Ｃ１Ｄ、
Ｅ、に、葉酸、チアミンを含むビタミンがある。

医薬の別の群には、ヒドロキシ化および不飽和の度合い
と位置でことなるプロスタグランジン類がある。

医薬の別の群には、ペニシリン、クロロマイセチン、ア
クチノマイセチン、テトラサイクリン、テラマイシン、
それらの代謝物および誘導体を含む抗生物質がある。

医薬の別の群には、ＡＴＰ、ＮＡＤ、ＦＭＮ１アデノン
ン、グアノシン、チミジンおよびシチジン（それらは適
当な糖および燐置換基を有し得る）を含むヌクレオシド
およびヌクレオチドがある。

医薬の別の群には、メサトン、メブロバメート、セロト
ニン、メペリジン、アミトリブチリン、ノルトリブチリ
ン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプロカイ
ンアミド、プロプラノロール、グリセオフルビン、パル
プロ酸、ブチロフェノン類、抗ヒスタミン剤、抗コリン
作用薬（例えばアトロピン）、それらの代謝物および誘
導体を含む種々の個別医薬がある。

疾病状態に関連する代謝物には、スペルミン、ガラクト
ース、フェニルピルビン酸、およびポルフィリンＩ型が
含まれる。

医薬の別の群には、ゲンタマイシン、カナマイシン、ト
ブラマイシンおよびアミカシンのようなアミノグリコシ
ド類がある。

関心のある殺虫剤には、ポリハロゲン化ビフェニル、燐
酸エステル、チオホスフェート、カルバメート、ポリハ
ロゲン化スルフェンアミド、それらの代謝物および誘導
体がある。

レセプター・アナライトの場合、分子量は一般に１００
００−２ｘｌＯ”の範囲、通常１００００−１０６であ
る。免疫グロブリン類、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよび
ｒｇＭの場合、分子量は一般１、Ｊ／ｑｌ　Ｒｎｆｌｎ
〇−腔１　（１”　のｎ信テ恋住オる一酵素は通常分子
重範囲約１００００−６００００００である。天然レセ
プターは広範囲で変化し、一般に少なくとも分子量約２
５０００であり、１００またはそれ以上の分子量でもあ
り得、アビジン、チロキシン結合グロブリン、ヂロキシ
ン結合プレアルブミン、トランスコルチン等のような物
質を含む。

リガンド類似体またはアナライト類似体・・・レセプタ
ーに体して類似のリガンドまたはアナライトと競合し得
る修飾リガンドま）２はリガンド代用物または修飾アナ
ライトまたはアナライト代用物であり、修飾はリガンド
類似体またはアナライト類似体を他の分子に結合する手
段を供給するものである。リガンド類似体またはアナラ
イト類似体は、通常、リガンド類似体またはアナライト
類似体をハブ（ｈｕｂ）または標識に結びつける結合で
１個の水素を置換すること以外の点でリガンドまたはア
ナライトと異なっているが、これは必らずしも必要では
ない。リガンド代用物またはアナライト代用物の語は、
リガンドまたはアナライトに対して相補的なレセプター
に特異的に結合する能力を有する化合物を意味する。す
なわち、リガンド代用物およびアナライト代用物は、リ
ガンドまたはアナライトと類似の仕方でレセプターと結
合することができる。代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）は
、例えば、リガンドまたはアナライトに対する抗体のイ
ディオタイプを指向する抗体である。

ポリ（リガンド類似体）・・・通常ハブ（ｈｕｂ）核に
対して、互いに共有結合した複数個のリガンド類似体で
ある。ハブ核は、多官能性物質で、普通ポリマー性であ
り、通常複数個の官能基、例えばヒドロキシ、アミノ、
メルカプト、エチレン基等を結合部位として有する。ハ
ブ核は水溶性でも非水溶性でもよいが、水溶性が好まし
く、通常分子看少なくとも約ａｏｏｏｏであり、分子量
１０００万またはそれ以上であり得る。ハブ核の例には
、多糖類。ポリペプチド（蛋白質を含む）、核酸、アニ
オン交換樹脂等が含まれる。非水溶性ハブ核はまた、容
器壁（例えばガラスまたはプラスチック）、ガラスピー
ズ、付加および縮合重合体、セファデックスおよびアガ
ロースビーズ等を含むことができる。

特異的結合対の構成員（ｒｓｂｐ構成員」）・・・他方
の分子と特異的に結杏し、それ故に該分子に固有の空間
的および極性的構成と相補的であると規定される表面上
の区域またはくぼみを有する異なった二つの分子のうち
一つ。特異的結合対の要素はリガンドと受容体（アンチ
リガンド）として表すことができる。これらは通常、抗
原−抗体のような免疫学的対の要素である。なお、ビオ
ヂンーアビジン、ホルモン−ホルモン受容体、核酸２本
鎖分子、ＩｇＧ−蛋白質Ａ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−
ＲＮＡ等のような他の特異的結合対の要素は免疫学的対
ではないけれども発明に含まれる。

リガンド・・・レセプターが天然に存在し、らしくはこ
れを作成することができる任意の有機化合物。

レセプター（「アンチリガンド」）・・・ある分子に固
有の空間的および極性的構成、例えばエビトビツク部位
または決定部位を認識し得る任意の化合物または組成物
。具体的なレセプターの例を挙げれば、例えばチロキシ
ン結合グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂ断片、レクチン
類、核酸類、プロティンＡ、補体成分Ｃ１ｑ等の天然の
レセプター等を挙げることができる。

表面／支持体・・・水溶性でない多孔性または非多孔性
の物質。表面は親水性であり、または親水性にすること
ができるものであって、シリカ、硫酸マグネシウムおよ
びアルミナのような無機粉末類、天然の高分子材料、と
くに繊維含有紙のようなセルロース材料およびセルロー
スから誘導された物質（例えば、１紙、クロマトグラフ
ィー紙等）、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ
塩化ビニル、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、
アガロース、ポリアクリル酸、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポ
リメタアクリル酸、ポリ（エチレンテレフタル酸）、ナ
イロン、ポリ（酪酸ビニル）等のような合成ポリマーま
たは天然の高分子化合物を加工した重合体等から形成さ
れることができ、これらをそのまま、または他の材料（
例、ガラス、セラミックス、金属等）と組合わせて使用
することができる。表面にｓｂｐ構成員を結合させるの
は、ひろく文献によって知られる公知の手技によって達
成することができる〔例えば、［インモヒライズド・エ
ンザイムズ（Ｉ　ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅ　ｎｚａｙ
ｍｅｓ）Ｊイチロウ・チバタ、ハルステッド・プレス、
ニューヨーク（＋９７８）、クアトレカサス、ジャーナ
ル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、２４５巻、３０５９頁（
１９７０年）および「：／ヤーナル・オン・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、
　）、２４５巻、３０５９頁（１９７０年）」、参照〕
。

粒子・・・粒子直径が少なくとも約５０ｎｍで５０ミク
ロンを越えない粒子で、通常、少なくとも約１１００ｎ
で約２５ミクロンより小さくなく、好ましくは約０２〜
５ミクロンである。この粒子は有機物でも無機物でもよ
く、膨潤性らしくは非膨潤性であって、多孔性もしくは
非多孔性であって、好ましくは水に近い畜度を有しく一
般に約０゜７〜約０　、５　ｇ／ｍ（１＞、透明または
半透明、または不透明な物質から成る。

有機性粒子は、通常重合体であり、測定媒質に容易に分
散し得るものであれば、付加重合体でも縮合重合体でも
よい。有機性粒子もまた、ｓｂｐ構成員と直接的または
間接的に結合できるように、吸着性または官能化できる
ものである。

粒子は天然物質、合成により修飾した天然物質および合
成物質から誘導することができる。有機重合体のなかで
とくに興味深いものは、多糖類、とくにアガロース（セ
ファロース）、デキストラン（セファデックスおよびセ
ファクリル）、セルロース、およびてんふん等のような
架橋多糖類、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ア
クリル酸およびメタアクリル酸誘導体、とくに遊離のヒ
ドロキシル官能性基を有するそのエステル類およびアミ
ド類のホモポリマーおよびコポリマーのような付加重合
体等である。無機重合体にはシリコーン、ガラス類（バ
イオガラス）等がある。また、リポソーム、りん脂質、
細胞のような天然または合成の集合物を使用することが
できる。

これらの粒子が商業的に人手可能である場合、粒子サイ
ズの大きいものを、粉細、音波処理、撹拌等の機械的手
段により粉砕して小さい粒子にすることができる。

粒子は、通常多官能基であり、あるいは多官能性とする
ことができ、特異的または非特異的な共有結合または非
共有結合の相互作用を介して支持体または発明の化合物
をこれに結合させることができる。広範な官能基を利用
することが可能であり、または挿入することができる。

官能基としては、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、
シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基
等を挙げることができる。多くの化合物を粒子に連結さ
せる方法は周知のものであり、文献上で充分説明されて
いるし例えば、コートレカサス、ジャーナル・オン・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｍ、　）、２４５巻、３０５９頁（１９７０年）、参
照］。発明の化合物と連結する基の鎖長は、連結された
化合物の性質、連結された化合物と粒子との間の距離が
ｓｂｐ構成員およびアナライトとの結合におよぼす効果
等によって大きく変化する。

スクアレート染料・・・シクロブテノル−トを構造成分
として有する染料であり、一般にスクアリン酸（ｓｑｕ
ａｒｉｃ　　ａｃｉｄ、ジヒドロキシシクロブテンジオ
ン）とピロールまたはアニリンのような活性化合物との
縮合生成物である。スクアレート染料は一般に６００ナ
ノメートル以上、好ましくは６２０−６５０ｎｍに吸収
極大を有する。

励起光波長におけるスクアレート染料の分子消衰係数は
実用可能な高さであることを要し、１００００以上、好
ましくはｔｏｏｏｏｏ以上（ａｍ２１モル）であること
を要する。スクアレート染料は高い量子収量、通常０．
０５以上、好ましくは０１３以上を有すべきである。

標識・・・ｓｂｐの一員にコンツユゲートしたシグナル
発生系の一員。標識は任きのスクアレート染料（上記）
であり得る。

シグナル発生系・・・シグナル発生系は１つまたはそれ
以上の成分を有することができ、少なくとも一成分はス
クアレート染料またはスクアレート染料前駆体である。

シグナル発生系は、測定可能なシグナルの発生に必要な
すべての試薬を含み、その中にはスクアレート染料の電
子励起を起こさせる手段も含まれる。好ましい手段は、
例えば６３３ｎｍの波長で発光するＨｅ／Ｎｅレーザー
であり得る。しかし、他の６００ｎｍ以上の励起波長を
有する他の光源も用い得る。シグナル発生系の他の成分
としては、酵素、化学発光性化合物、消光剤、基質等を
含み得る。

消光剤・・・６００ｎｍまたはそれ以上に吸収極大を有
する化合物。この化合物は、蛍光をほとんど有しないか
、または観測できる程有しないのが好ましく、またこの
発明１ごよるスクアレート染料・ｓｂｐ構成員コンジュ
ゲートの蛍光を効果的に消光するのか好まししい。この
ような化合物の例は、ガロシアニン（Ｇ　ａｌｌｏｃｙ
ａｎｉｎｅ）、セレスチンブルー（Ｃｅｌｅｓｔｉｎｅ
　　Ｂ　１ｕｅ）、メヂレングリーン（ＭｅｔｈｙＩｅ
ｎｅ　　Ｇ　ｒｅｅｎ）等である。

水溶性授与基または官能基・・・化合物に水溶性を授与
する、すなわち化合物を少なくとも１ナノモルの度合い
で水が溶かす官能基であって、この発明の化合物に含ま
れる基。このような官能基または官能基としては、スル
ホネート、ホスフェート、ホスホネート、カルボキシレ
ート、ヒドロキシ、アミン、エーテル、アミド等が含ま
れ得る。水溶性を授与する基は、一般に水素以外に１−
３０個、好ましくは１−１２個の原子を含み、これら原
子は炭素、酸素、窒素、硫黄、りん、および原子番号９
−５３のハロゲンから選ばれ得る。このような基は、ス
クアレート染料とｓｂｐ構成員のコンジュゲートを生成
する前のスクアレート染料の部分であり得る。したがっ
て、スクアレート染料は、ポリ（アミノ）酸を含めて広
範囲のｓｂｐ構成員と、ｓｂｐ構成員の水溶性を大きく
変えることなく、またはスクアレート染料の分光測定上
の性質に悪影響を及ぼすことなく、コンジュゲートする
ことができる。

補助物質・・・種々の補助物質が、この発明のアッセイ
法でしばしば用いられる。例えば、通常緩衝剤がアッセ
イ媒質中に存在し、またアッセイ媒質およびアッセイ成
分の安定剤が存在し得る。多くの場合、この添加剤に加
えて、アルブミンのような別の、蛋白質、または界面活
性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤、例えばポリア
ルキレンゲリコール類のような結合増強剤等を含ませる
ことができる。

この発明の化合物はｓｂｐの一員にコンジュゲートした
スクアレート染料からなる新規な蛍光化合物である。該
スクアレート染料は６００ｎｍ以−ヒの最大吸収を有す
る。

この発明の化合物は一般に式（Ｉ）。

［式中、ＤおよびＹは、同一または異なって、それぞれ
−ＣＨ＝および−Ｎ＝からなる群から選ばれた部分１〜
６個の鎖を含み、上記鎖は交互の単結合および２型詰合
を含むとともに０、Ｓおよび窒素からなる群から選ばれ
た官能基で終結し、ＤおよびＹの両者における上記部分
の数および上記末端官能基の合計は偶数（好ましくは６
−１０の範囲内）であり、北記鎖、またはその末端官能
基を含む部分は脂肪族または１個またはそれ以上の脂環
式もしくは芳香環の部分、またはそれらの組合わせであ
り、上記鎖または環、または官能基は水素以外に１−３
０個、通常１−１２個、さらにはｌ−４ｐＩの原子を含
む置換基０個、１個またはそれ以上を有し、上記原子は
炭素、酸素、窒素、硫黄、原子番号９−５３のハロゲン
、ひ素、けい素、セレンおよびりんからなる群から選ば
れたものであって、上記置換基は一緒になって脂環式も
しくは芳香環であり得る環を１個またはそれ以上形成し
ていてもよく、ＤまたはＹの少なくとも一方はＡに結合
し、Ａは、リガンドおよびその相補的レセプターからな
る特異的結合対（ｓｂｐ）の一員少なくとも１個を含む
基であり、ｓｂｐ構成員はポリマー主鎖に結合すること
ができる。好ましいｓｂｐ構成員は抗原、抗体およびハ
プテンである。ｓｂｐ構成員がポリマーと結合していな
い場合、ｎは平均して約１〜２０、通常は２〜１５、好
ましくは４〜１０である。ｓｂｐ構成員がポリマーと結
合している場合、ｎは平均して約２〜１０４、通常はｔ
ｏ−１０３、好ましくは２０〜１００である。

この明細書に用いる「平均して」なる語はいくつかのｓ
ｂｐ構成員分子はｎよりも多いかまたは少ない数の染料
分子を有しうるが、コンジュゲート分子の混合物は平均
してコンジュゲート１つ当りｎ個の染料分子を有するこ
とを意味する。ｑは１または２である。］ で示される。

スクアレート染料とｓｂｐ構成員は共有結合または非共
有結合のいずれかにより相互に結合することができる。

共有結合は結合手または連結基によって得ることができ
る。種々の連結基をスクアレート染料とｓｂｐ構成員の
結合に使用することができる。連結基は、既存の官能基
または存在できるかもしくは染料若しくはｓｂｐ構成員
中に容易に導入しうる官能基、所望の結合手長さ、特定
の環境に適合する結合手を有することの有用性、化学的
性質または物理適性質、例えば正または負荷電、溶解性
の向上、双極子効果等に基づき広範に選択することかで
きる。連結基には、好ましくは非オキソ−カルボニル、
カルバモイル、チオカルバモイル、スルホニル、アミノ
、チオ等、とくに非オキソ−カルボニルおよびその硫黄
同族体を有する官能基が包含される。

この明細書におＣ）で、非オキソ−カルボニルには式・ Ｃ−ＯＨ で示されるカルボン酸のカルボニル基、式で示されるア
ミド酸の窒素含有イミノカルボニル基および式： ％式％ で示されるヂオ酸の硫黄含何ヂオカル°ボニル基が包含
される。

この明細書で用いられる非共有結合なる語は電子の共有
以外によって形成される結合を意味する。

かかる結合は、主として静ＩＩ用互作用、例えば水素結
合、双極子・双極子相互作用またはファンデルワールス
相互作用によって形成される。

この発明に包含される化合物は式（■）：［式中、 ｍは１〜・１、好ましくは３〜４、 ｋは１〜４、好ましくは３〜４、 ｍ＋には偶数、 Ｘは０、ＳまたはＮ　（Ｒ１）ｔ、 ｐは、Ｘが０またはＳである場合（−）で、ＸがＮ　（
Ｒ、）、である場合（１）を意味する。

ＲＩは水素を意味するか、または水素でない場合各々独
立して１〜３０、通常は１〜１２、好ましくは１〜４の
水素原子以外の原子であって炭素、酸素、窒素、硫黄、
原子番号９〜５３のハロゲン、ひ素、けい素、セレンお
よびりんからなる群から選ばれる原子を有する置換基か
らなる群から選ばれる基を意味し、あるいはＲ３は１つ
以上の他のＲ１と一緒になって１個以上の環、通常は５
または６員環を形成し、かつ少なくとも１つのＲ１上の
水素がＡ１への結合手または連結基で置換されている。

例えば、ｍおよびｋが各々４である場合、１位の炭素上
のＲ１と４位の炭素上のＲ４が一緒になってベンゼン環
の一部であるエチレン基を形成でき、またｍおよびｋが
各々２である場合、ＸがＮ（Ｒ６）２で、該Ｎ（Ｒυ２
のＲ３がＮ　（Ｒ、）、をらつ炭素上のＲ１と一諸にな
って５員環を形成でき、加えて、ベンゼン環が該５員環
に縮合できる。

、７十４ Ａ１はＡ１および ｑｌはｑを意味する。］ で示される。

この発明に包含される化合物は式（■）＝［式中、 Ａ、はＡ１ Ｒ２はｎｌ ｑ２はｑｌ、 Ｄｌは各々独立して式。

て示される基からなる１１から遭ばれる基、Ｙｌは独立
して式。

て示される基からなろ１ｉＴから選ばれる基、Ｄ、およ
びＹ、におけるＺは各々独立して炭素、窒素、酸米、硫
黄、およびセレンからなる群から選ばれる基、 １Ｎ、は！λ１、および Ｓは、Ｚか炭素の場合２で、Ｚが窒素の場合ｌて、Ｚか
酸素、硫黄またはセレンの場合０を意味才る。コ て示される。

」二足式中、Ｄｌは例えば式： （Ｒ２）４ １式中、窒素に結合したＲ７は各々独立してメチルおよ
び水溶性付与基からなる群から選ばれる基、炭素に結合
したＲ１は水素を意味する。ただし、水素原子または少
なくとも１つのＲ１はＡ！への結合手または連結基で置
換されている。］で示されろ。

別のり、の例は式： ［式中、Ｚ’（Ｒ＊）ｐはイソプロピリデンを色味する
。］で示される。

好ましい化合物は下式（ＩＶ）および（Ｖ）の化合物お
よび、 ［式中、Ａ、は特異的結合対の一〇、好ましくは抗原、
ハプテンまたは抗体、 ｎ、は平均して１からＡ、の分子ｍを５０００で割った
値までの改、通常２−１５、好ましくは４−１０、 ｔは１またけ２． ９３けｑ、 Ｒ１は、炭素原子１−１Ｏ側、好ましくは１−６個、酸
素原子０−６ｇ、好ましくは１−２個および窒素原子０
−３ｐｌ、好ましくは０−１ｇを有する置換Ｉ＆群から
独立に選ばれた基であり、また−緒になって脂環式もし
くは芳香環を形成することができ、このような置換基の
例はカルボキシメチル、アミノエチル、ジヒドロキシ、
プロピル、エチル、メチル等であり、 Ｒ４は、ヒドロキシ、水素、ホスフェート、ホスホネー
ト、スルホネート、ニトロ、ハロゲン、アミノおよびＲ
３からなる群から選ばれた基、ＬはＲ３の任色の水素を
置換するものであり、結合手またはＡ、に対する連結基
である］からなる群から選ばれたものである。

好ましいものは、窒素上のＲ１の少なくとも１個がして
置換された水素を有するものであり、特に窒素上のＲ１
の残り全部が炭素数１−５の低級アルキルであるか、ま
たは（がＩ、Ｒ，がヒドロキシであるかまたはＬが非オ
キソ・カルボニル、カルバモイル、チオカルバモイル、
チオおよびアミ　）か【：斗、讐巽ζｆｉ１．１−１．
の″７″−凧１シ―、一般に、該スクアレート染料は水
溶性付与基を有すべきである。しかし、該スクアレート
染料のｓｂｐ構成員へのコンジュゲーションを行なう媒
体がスクアレート染料を可溶化する物質を含む場合、水
不溶性スクアレート染料を使用することができろ。かか
る物質は、例えば洗剤またはシクロデキストリンのよう
な錯体生成剤であることができる。

水不溶性スクアレート染月は、またｓｂｐ構成員が該染
料へのコンジュゲーション用の水媒体を必要としない場
合にも使用することができる。さらに加えて、スクアレ
ート染料とｓｂｐ構成員が相互に非共有結合されている
場合、水溶性は必要でなく、加えて、疎水性を付与する
物質、例えば炭素数４〜３０、好ましくは６〜２０の炭
化水素基、またはレセプターに対する染料の親和力を向
上させる置換基をスクアレート染料に導入することが望
ましい。例えば、ビオチンをスクアレート染料に付着さ
せて、アビジンに付着されたりガントへの結合を提供す
ることができる。

この発明の化合物の具体例は式化学（■）：［式中、 Ｗはジゴキシンの抗体およびかかる抗体に結合可能なジ
ゴキシン類似体からなる群から選択され、例えばジゴキ
シン類似体は３−チオギン−３−ノゴキノゲニンとする
ことができろ］ で示される。

この発明の化合物は、個々の工程が別々にその分野で知
られている反応方式に従い製造することができる。スク
アレート染料およびその製法は当業界で公知である。こ
の発明のスクアレート染料のいくつかはスプレングーら
［アンゲバント・ヘミ−（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ　ｅｔ　ａ
ｌ、　　、Ａｎｇｅｗ、　　Ｃｈｅｍ、　）８０巻５／
１１頁１９６８年］、スビリンカーら［アノゲバント・
ヘミ−・インターナショナル・エディノヨン（Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　　、Ａｎｇｅｗ、　　Ｃｈｅ
ｍ、　　１ｎｔｅｒｎａｌＥｄｉｔ、）５巻８９４頁１
９６６年］、およびマークスら［アンゲバント・ヘミ−
・インターナショナル・エディジョン（Ｍａａｋｓ　　
ｅｔ　　ａｌ、　、Ａｎｕｇｅｗ。

Ｃｈｅｍ、　１ｎｔｅｒｎａｔ、　Ｅｄｉｔ、　）５巻
８８８頁１９６６年］による記載方法に従い製造するこ
とができる。一般的に、スクアリン酸（ジヒドロキシシ
クロブテンジオン）を活性化合物、例えばピロールまた
はアニリンと縮合する。該縮合は反応混合物から脱水す
る条件で行なわれる。例えば、該縮合は還流下、アルカ
ノール／ベンゼン溶媒混合物中で行なうことができる。

得られた生成物は、例えば再結晶、蒸留、クロマトグラ
フィー等で採取精製することができる。この発明の化合
物に水溶液を付与する基は縮合用の初期反応体部とする
か、または縮合後宮法で導入することらできる。

スクアレート染料は公知方法でｓｂｐ構成員とコンジュ
ゲートすることができる。かかるコンジュゲーンヨンは
スクアレート染料とｓｂｐ構成員の間の直接的な結合形
成をもたらす。他方、前記したクアレート染料またはｓ
ｂｐ構成員中に導入することができる。カルボン酸、ヒ
ドロキシ、チオ、アミノ、アルデヒド、アミド、活性化
エチレン、例えばマレイミド、スルホン酸等の結合基が
染料またはｓｂｐ構成員中に当初から存在しない場合、
かかる基はスクアレート染料またはｓｂｐ構成員中に導
入することができろ。ｓｂｐ構成員を包含するコンジュ
ゲーション法は、例えば米国特許第３８１７８３７号に
記載されており、その開示をこの明細書に含めろ。

この発明の化合物はアッセイとしての用途に非常に望ま
しい性質を有している。該化合物は高い吸光係数、高い
量子係数、■に近い値、化学的安定性および満足なスト
ークス・ノットを有する。

さらに加えて、該化合物が血ｔＷまたはそれ自体蛍光性
である他の組成物の存在下に用いられる場合、該化合物
は媒体中の他の化合物により吸収されるものとは実質的
に異なる範囲のエネルギーを吸収する。前記し１こよう
に、この発明の化合物は６０別の利点は、上記化合物が
Ｈｅ／Ｎｅレーザーと共に用いることができ、その結果
小容潰の使用と光りファイバーの使用が可能になる点で
ある。

スクアレート染料は（比較的）疎水性である物質に分類
され、また水性環境中で処理することか困難であること
から、該染料がこの発明の方法に使用できるのは驚くべ
きでちる２ この発明の一つの態様は目的物質を含むことが予想され
ろサンプル中の該物質のアッセイを包含する。該アッセ
イにおいて、蛍光化合物は該サンプル中の目的物の存在
または量と相関するシグナルを生成するのに用い、該蛍
光化合物の励起用のエネルギー源も、また使用される。

かかるアッセイの改良はスクアレート染料、特に６００
ｎｍ以上の最大吸収を有する水適合性のスクアレート染
料を蛍光化合物として、またヘリウム／ネオンレーザ−
をエネルギー源として用いることからなる。

スクアレート染料は水溶性付与基を該染料中に導入する
ことにより水適合性にすることができる。

別法として、スクアレート染料は約０．０１−１０％の
洗剤（表面活性剤）、例えばトリトン（Ｔ　ｒｉｔｏｎ
）Ｘ−１００またはドデシル硫酸ナトリウム、ｌＸｌ０
−’〜１ＸｌＯ”Ｍのシクロデキストリン等をアッセイ
媒体中に用いて水適合性にすることができる。さらに、
別法として０．０２〜２０１１ｍのラテックス粒子、例
えばリポソーム、細胞等をスクアレート染料で染色して
水適合性を与える。

ヨーロッパ特許出願第８５３０６０５４．９号（カナダ
特許出願第４．８９４５５号、特願昭６０−１８９３５
０号およびオーストラリア出願第４６８２０号／８５と
同等）は細胞、とくに赤血球に合されたスクアレート染
料の使用を開示している。この発明のこの態様は細胞へ
の組み込み以外のスクアレート染料の使用も包含する。

この発明の別の態様はアナライトがｓｂｐ構成員である
場合の、該アナライトを含むことが予想されるサンプル
中の該アナライト用のアッセイの改良点を包含する。該
方法は染料にコンジュゲートしたｓｂｐ構成員を包含し
、この発明の改良点は染料としてスクアレート染料を用
いることからなる。

例えば、蛍光アッセイには特異的結合対の一員にコンジ
ュゲートした蛍光化合物を試薬として用いることができ
る。かかるアッセイは特異的結合対の一員でもあるアナ
ライトの測定にも使用される。アナライトまたは該アナ
ライトの特異的結合対コンプレックスはアナライトの存
在の指標となる。この発明の改良は蛍光アッセイにおい
て、特異的結合対の一員にコンジュゲートしたスクアレ
ート染料である試薬を用いろことからなる。別の例は特
異的結合対の一員に結合された蛍光化合物を有する蛍光
試薬の使用による決定部位またはレセプターの存在を測
定する方法である。蛍光試薬の決定部位またはレセプタ
ー表の結合、または決定部位またはレセプターの特異的
結合対構成員錯体は決定部位またはレセプターの存在の
指標として測定されろ。この発明の改良点はスクアレー
ト染料と特異結合対の一員とのコンジュゲートである蛍
光剤を用いることからなる。該方法は決定部位またはレ
セプターが細胞と会合している場合、を有する。

この発明のコンジュゲートは定性的、早足性的または定
量的にサンプル中のアナライトを測定するのに使用する
ことができる。化合物が生理学的流体中で検知される場
合、サンプルには血清、尿、すい液、リンパ液等が包含
される。目的化合物が化学的加工または生態学的事象に
包含される場合、サンプルは水性媒体とすることができ
るか、または抽出により有機媒体、土壌、無機混合物等
から得ることができる。

該アッセイにおける他の試薬は、ｓｂｐ構成員がアナラ
イト用のレセプターであるこの発明の化合物とすること
ができる。

曲記したように、この発明のｊヒ合物には公知のイムノ
アッセイ法で測定できる化合物にコンジュゲートされる
スクアレート染料が包含される。該コンジュゲートはサ
ンプル中のアナライトに対してアッセイ媒体中で競合す
る試薬である。したがって、該コンジュゲートは、アナ
ライトのレセプタｍ　＋−−％Ｊ　ｌ　−ｒ−ｙふ二／
　Ｌ　Ｌ、４４ム−７？−に−１／Ａ＋−半４）すｒ割
合のアナライト構造を保有する。

該アッセイは分光学的活性化合物に関する環境変化に基
づくか、またはクエンチャ−（消光剤）が蛍光剤に影響
を及ぼすのに十分な接近範囲内に該蛍光剤〜クエンチャ
一対を相互に位置させることに基づく分光学的変化を包
含する。また、会合および非会合蛍光剤の分離、および
一方または両方のフラクション中の蛍光剤の検知を包含
する方法を用いろことができる。

この方法を実施するには通常水性媒質を使用する。その
他の極性溶媒も水とともに使用できる。

そのような溶媒は、通常、炭素原子数１〜６個、一層多
くは炭素原子数１〜４個の酸素原子を含んだ有機溶媒、
即ち、アルコールおよびエーテル等である。これらの溶
媒の量は、通常、約４０（重量）％より少なく、一般に
約２０（重量）％より少ない。

媒質のｐＩ（は、通常、約４〜Ｉｆの範囲にあり、さら
に約５〜ＩＯ１好ましくは５．４〜９．５の範囲にある
。ｐＨは、ポリヌクレオチド・アナライトと結合させ、
ｓｂｐ＋ｉが成Ｈの有色水孕を惟持し、△ 一方では信号の発生がうまく最適となるように選ぶ。場
合によっては、これらの点を配慮して妥協することもあ
る。所望のｐＨを得て、測定の間中このｐｒｔを維持す
るために、さまざまのバッファーを使用することができ
る。それらのバッファーを例示すれば、はう酸塩、りん
酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等のバッファーか
挙げられる。

この発明において使用するバッファーを厳密に特定する
ことはないが、個々の測定においては、１つのバッファ
ーが他よりすぐれて好ましい場合がある。

この方法を実施するには、普通、過変な温度を用い、測
定の間中一定の温度を維持するっ測定時の温度は一般に
約１０〜５０℃であり、多くは約１５〜４０℃である。

先に述べたように、ポリヌクレオチド・アナライトが１
本鎖でない場合は、試料を処理して１本鎖物質を調製し
なければならない。

測定可能なアナライトの濃度は、一般に約−１０−’　
〜１０−１５ｇ／ｍ１２の間であり、多くは約ｌ０−６
〜１０−Ｉ３ｇ／　ｍ（ｌの間である。測定が定性的で
あるか、または半定量的もしくは定量的であるかにより
、また個々の検出手技およびアナライトの濃度を考慮し
て、他の試薬濃度を決定する。

種々の試薬の濃度は、対象となるアナライトの濃度範囲
によって決定するが、個々の試薬の最終濃度は、普通、
対象物の濃度範囲全般にわたって測定感度が最適となる
よう実験的に決定する。

アナライトに相補的な特異的結合対の一員の総結合部位
は該アナライトの結合部位に基づき、関心のある最少濃
度の約０．１倍以上であって、またアナライト結合部位
に基づき、所望の最大濃度の約１００００倍以下であり
、通常は所望の最大濃度の０．１〜１０００倍、より好
ましくは約０゜３〜ｌＯ倍である。リガンドアナライト
については、標識リガンドを用いる場合、同等物に基づ
く標識リガンド濃度は、一般的には所望の最少濃度の約
ＩＯ″６以上、好ましくはｌＯ゛２以上であって、所望
の最大濃度の１００倍以下、好ましくは１０倍以下であ
る。

アッセイ媒体中のこの発明の化合物濃度はアッセイのタ
イプ、不均一系または均−系、競走的または直接的等に
依存する。通常、この発明の化合物はアッセイ媒体中、
約１Ｏ−８〜１０−１５、通常は約１０６〜Ｉ　Ｏ”Ｍ
５度で存在できる。

種々の試薬の添加順序は、また広範に変化させることか
でき、前記したと同様な多くの考慮事項に依存する。

この発明のアッセイ法は不均一系および均−系アッセイ
の両方への適用を包含する。例えば、不均一系のアッセ
イは米国特許第４２５６８３４号および第４２６’１９
６８号に記載されている。均−系のイムノアッセイは米
国特許第３９９３３４５号開示のイムノ蛍光法、米国特
許第４２３３４０２号開示の酵素チャンネル法、および
マギオ（Ｍａｇｇｉｏ）（Ｍ掲）および米国特許第３８
１７８３７号開示の他の酵素イムノアッセイによって例
示される。該アッセイは拮抗的または直接的とすること
ができ、標識リガンドまたは標識レセプターのいずれか
であるこの発明の化合物を包含することができる。

この発明に従い、アナライトが含まれることが予想され
るサンプル中の該アナライトの存在またはｍを検知する
別の方法は該アナライトがリガンドおよびその相補的レ
セプターからなるｓｂｐ構成員である場合である。該方
法は（１）アッセイ媒体中での前記したサンプル、スク
アレート染料およびｓｂｐ構成貝のコンジュゲート、お
よび第２　ｓｂｐ構成員（２つのｓｂｐ構成員はアナラ
イトに相補的である。）の結合、および（２）該サンプ
ル中のアナライトの存在または量に関連するものとして
化合物（１）の蛍光に対する該サンプルの効果の測定か
らなる。

第２　ｓｂｐ構成員は、両方のｓｂｐ構成員がアナライ
トに結合される際コンジュゲートの蛍光を消光しうる化
合物にコンジュゲートすることができる。

また、第２　ｓｂｐ構成員は粒子または表面あるいは支
持体に結合させることができ、それによって溶液中に残
っているコンジュゲートからの支持体コンジュゲートの
分離を可能とすることができる。

例えば、１つの方法ではスクアレート染料用のクエンチ
ャ−（消光剤）を用いろ。一方の試薬はスクアレート染
料とりガントアナライト同族体のコンジュゲートからな
るこの発明の化合物である。

他方の試薬はクエンチャ−とアナライトのレセプターで
あるｓｂｐ構成員のコンジュゲートである。

サンプル中のりガントアナライトおよび試薬中のりガン
トアナライト同族体はアナライトのレセプターについて
拮抗する。アナライトのレセプターが標識リガンドアナ
ライト同族体と結合する場合、蛍光剤およびクエンチャ
−はクエンチング距離内にはこばれる。この発明の範囲
内ではない蛍光化合物を用いる類似のアッセイは米国特
許第３９９６３４５号に広範に記載されている。該アッ
セイ法は１７欄からはじまり、２３欄で終わっており、
この記載をもってこの明細書の記載とする。蛍光化合物
：リガンドおよびレセプターの比は前記特許の４〜６欄
に記載されており、この記載をもってこの明細書の記載
とする。

関連しているが、異なる１つの方法において、一方の試
薬はスクアレート染料とりガントアナライトのレセプタ
ーのコンジュゲートであるこの発明の化合物とすること
ができる。別の試薬はスクアレート染料のクエンチャ−
とリガンドアナライトのレセプターとのコンジュゲート
である。前記２つの試薬はサンプルと合され、リガンド
アナライトの存在により一緒にされると、スクアレート
染料およびクエンチャ−はクエンチング距離内にらたろ
される。代表的なりエンチャーは、例えばガロノアニン
とすることができ、これはアミド結合を介してｓｂｐ構
成員にコンジュゲートすることかできる。

該アッセイはスクアレート染料コンジュゲートおよびク
エンチャーコンンユゲートを該サンプルと合することに
よって行なわれる。蛍光は既知量のアナライトを有する
アッセイ媒体と比較して測定する。

別の例において、この発明の化合物はスクアレート／Ｉ
Ｌとりガントアナライトのレセプターとのコンジュゲー
トである。リガンドまたはリガンド同族体は支持体また
は粒子に結合する。同様なアッセイは米国特許出廓第９
６４０９９号（１９７８年１１月２４日出願、特許第４
２７５１４９号）に記載されている。これらのアッセイ
はシグナル・モジュレイターとの相互作用にバルク溶液
中にある蛍光粒子を利用できるか、または粒子環境が該
相互作用を妨害する場合には該粒子に結合された蛍光剤
粒子を有することを基礎とする。また、該粒子は、蛍光
剤コンジュゲートが該粒子に結合したとき蛍光剤シグナ
ルをモジュレイトする環境を提供することができる。

別の方法にはリガンドのレセプターと染料のレセプター
の同時点での結合が阻害される場合に、該リガンドおよ
び該スクアレート染料のレセプターを用いるという立体
排除が包含される。さらに、染料のレセプターが染料に
結合している場合、該染料の蛍光は実質的に減少する。

さらに、蛍光が完全に阻害されないとしてもそれ以上の
減少が、クエンチャ−と染料レセプターとのフンジュゲ
ージョンにより達成することができる。同様なアッセイ
が米国特許第３９９８９４３号（１９７６年１２月２１
日発行）に広範に記載されている。該アッセイは当該特
許の３〜５欄に記載されており、この記載をもってこの
明細書の記載とする。

一般的に、該方法はアナライトを含むことが予想される
サンプルのアッセイ媒体への混合、ｓｂｐ構成員と染料
のコンジュゲートおよび選択された特異的なアッセイプ
ロトコールに従う他の試薬を包含する。ついで、サンプ
ルを励起源にさらす。

蛍光は速度または平衡モードのいずれかによって測定さ
れ、速度モードについて読み取りは全ての物質が合され
た後約１秒〜１時間以内で行なわれ、他方、平衡モード
についての読み取りは約２４時間までもの長時間行なう
ことができる。

便宜上、この発明に用いられる試薬はサンプル中のアナ
ライ゛トをアッセイするのに用いられる所定量の試薬と
共に充填されたキットで提供することができる。該試薬
は、前記したこの発明の化合物、適当な場合クエンチャ
−とのｓｂｐ構成員のコンジュゲート、またはその他の
検知可能なングナルを得るのに必要なこの発明の化合物
との反応相手を包含することができる。加えて、補助薬
のような他の添加剤も包含される。種々の試薬の相対量
は広範に変化させることができ、アッセイの感度を実質
的に最適にする試薬の溶液濃度を提供できる。該試薬は
乾燥粉末として提供でき、通常は賦形剤を含む凍結乾燥
形とでき、これは希釈によりアッセイを実施するのに最
適な濃度を有する試薬溶液を提供できる。

実施例 つぎに、実施例を挙げてこの発明をさらに詳しく説明す
る。全ての温度は℃で、部および％は特に断らない限り
重量で示す。

っぎの短縮名を用いる。

ＤＭＦ：　ジメチルホルムアミド ＢＧＧ：ウシ・ガンマ−・グロブリン ＰＢＳ：　リン酸緩衝食塩水（０，０１Ｍリン酸ナトリ
ウム、０　、１５　ＭＮａＣ（！、　　Ｏ、ＯＯ５ＭＮ
ａＮ３、ｐＨ７，０） ｔＱｃ　：薄層クロマトグラフィー ＮＨＳ：　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドＥＤＡＣ：エ
チル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
塩酸塩 ＰＢＳ／ＢＣＤ：　０．０１Ｍβ−シクロデキストリン
含有ＰＢＳ ＰＢＳ／１０％ＢＧＧ；　　１００ＲｇＢＧＧ１０２含
有ＰＢＳ ＢＧＧ；ウシ・ガンマ−・グロブリン ＰＢＳ／ＢＧＧ：　ＢＧＧ　Ｉ　０ｒ１９／Ｒ（ｌ含有
ＰＢＳＰＢＳ／ＢＧＧ／トリトンニトリトンＸ−１００
（１０ｍ９／Ｈの含有ＰＢＳ／ＢＧＧＰＢＳ／ＳＤＳ：
　ＳＤＳ　５０ｍ、９／ｍＱ、含有ＰＢＳＳＤＳ：　ジ
デシル硫酸ナトリウム 実施例１ （アミノデキストランの製造） 温度計を装着した５０ｍＱの丸底フラスコに、デキスト
ランＴ５００（ファルマシア）５．０ｇ、脱イオン水１
５ｍＱ及び磁気撹拌子を入れた。該混合物を撹拌し、油
浴中で８０°Ｃに加熱した。これにＺ　ｎ（Ｂ　Ｐ　ａ
）ｚ’ＸＨｔｏ（アルファ）塩１８７５９を添加した。

完全に溶液となり、温度が８０°Ｃに安定した後、エピ
クロロヒドリンＩＯ，Ｑ３９を５〜１５分間かけて滴下
しｆこ。

混合物を撹拌し、８０℃で３時間加熱した。加熱を止め
た後、反応混合物を撹拌し、−晩、室温に冷却した。

得られた透明溶液をメタノール２５０ｚＱに強く撹拌し
ながら滴下した。生成した白色沈澱物をメタノールで洗
浄し、Ｎ２で乾燥した。さらに、−晩、真空乾燥器で乾
燥し、クロロデキストラン４７１ｇを得た。水で充填、
溶出されたセファデックスＧ−２５カラムで精製された
凍結乾燥物質の元素分析の結果、クロロデキストランＩ
ｍｇ当たり３．３８５Ｗｍｏｌの塩素原子が測定された
。

脱イオン水ＬｍＱにクロロデキストラン１ｇを溶解した
溶液を濃Ｎ　Ｈ３水溶液４０ｍＱに撹拌しながら滴下し
た。反応混合液を３日間撹拌した。該溶液をロートベイ
パーで５ｍＱまで蟲縮した後、強く撹拌されたメタノー
ル５００ｍＱに滴下した。得られた白色沈澱物をシ戸取
し、Ｎ２の存在下メタノールで洗浄し、Ｎ、で乾燥した
。さらに、−晩、真空乾燥器で乾燥し、アミノデキスト
ランの白色粉末１゜１３９を得た。元素分析（Ｃ，Ｈ，
Ｎ、ＣＩ）の結果、アミノデキストラン塩酸塩１ｍｇ当
たり２．３０Ｘ　１０−’ｍｍｏｌのアミンが測定され
た。また、ＩＭのＮＨ。

水溶液で溶出されたセファデックスＧ−２５で精製した
凍結乾燥した試料の元素分析の結果、アミノデキストラ
ンＩｎ当たり２．９８ｘ　１０−’ｘｍｏｌのアミンか
測定された。原料物質としてはこれ以上精製せずに用い
た。

実施例２ （ノボキシゲニン結合アミノデキストランの製造）通常
のトリチウム標識（トルエン：エタノール（ｌ：９）混
合溶液中に１ｍＣ１／ｘ１２の溶液５００μｅを含有、
２０　Ｃｉ／　ｉｍｏｌ）を含有するジゴキシン及び標
識化されていないジゴキシン（２，０９，２，５６ｍｍ
ｏｌ）をエタノール５０ｍＱに溶解した。次いで、エタ
ノール７５ｍｄ。

蒸留水１００酎及び濃塩酸水溶液！村を添加した。

溶液を４５分間還流した。

溶液を冷却した後、５ＮのＮａＯＨ水溶液で中和し、１
００ｍＱに濃縮した。得られた白色沈澱物を）戸数し、
８０％エタノール水溶液で再結晶し、真空乾燥し、トリ
チウム標識化されたノボキシゲニン５５７＋Ｈを得た。

ｍｐ：２０５−２０７℃、０．１６９ｘＣ４＃＋ｍｏｌ
、　３゜７　Ｘ　１１０８ｃｐ／ｍｍｏｌ。

トリチウム標識化されたノボキシゲニンを、タム及びギ
ュブラーの方法（ヘルベチ力・シミ力・アクタ・データ
（Ｈｅｌｖ、　Ｃｈｉｍ、　ｄｅｔａ）第４２巻、第２
３９頁、１９５９年）によってｐｔ及びｏ、で酸化し、
３−ケトノボキシゲニンとした。

以下の方法で、トリチウム標識化された３−ケトノボキ
シゲニンをトリチウム標識化されたカルボキシメトキシ
ムに変えた。

トリチウム標識化された３−ケトノボキシゲニン（２２
８ｍｇ、０．５９次ｍｏｌ）、カルボキシメトキシルア
ミンのヘミ塩酸塩（１４０ａｇ、０．６４ｘｍｏｌ、ア
ルドリッチ・ケミカル・カンパニー）及び酢酸ナトリウ
ム（２９４Ｍｇ、３．６Ｈｍｏｌ）をメタノール（１８
ｄ、モレキュラーシーブ３Ａで乾燥）に溶解した透明溶
液を窒素の存在下室温で３時間撹拌した。該試料の一部
を薄層クロマトグラフィー処理した結果、完全にオキシ
ム誘導体を形成していた（Ｒｆ　　Ｏ，３３，０，５：
１：ｌＯ／　ＨＯＡｃ　　ＭｅＯＨ−ＣＨＣｉｓ、シリ
カゲルプレート）。得られた反応生成物を剥離乾燥し、
残査を５〜１０°Ｃで５％Ｎ　ａＨＣＯｓ　３２ｍ１２
に溶解し、クロロホルム２０ｍ（ｌで３回抽出した。ク
ロロホルム抽出物は、廃棄した。５〜ｌＯ℃で、重炭酸
塩層をｌＮの塩酸２８肩σでｐＨ２〜３まで酸性化し、
酢酸エチル２５ｍＱ、で１０回抽出した。酢酸エチル抽
出物を飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウム無
水物で乾燥した。溶媒を濃縮し、メタノール−酢酸エチ
ル−ヘキサンの混合溶液で再結晶した固形のトリチウム
標識化された３−ケトノボキシゲニンカルボキシメトキ
シムを得た。ｍｐ：２０２〜２２０’Ｃ（分解）；　Ｉ
　Ｒ（Ｋ　Ｂ　ｒ）：３６００ｃｍ−’　〜３２００ｃ
ｒ’（酸）。

新しく蒸留され７：（ＣａＨ２）ＤＭＦ　３０μｄに上
記で得られた３Ｈ−ジゴキシゲニンカルボキンメチルオ
キノム２．’１６ｍ９とＮ　Ｈ９０，８４９ｍＶとを添
加して０℃で撹拌した溶液に、ＥＤＡＣ１，１８ｍｇを
添加し、次いで、１時間後にＥ　Ｄ　Ａ　ＣＯ；’ｈｔ
ｔｇを添加し、３　Ｈ〜ジゴキシゲニン力ルボキシメチ
ルオキシムのＮＨＳエステルを反応液中に得た。

０．１Ｍのピロリン酸ナトリウム（ｐＨ１１１，５）１
．ＯｍＱに、実施例１で製造したアミノデキストラン１
０ｍｇを溶解した溶液に０°Ｃで、ＤＭＰに３Ｈ−ノボ
キシゲニンＮ　１４　Ｓエステルを溶解した上記水溶液
９．５μＱをマイクロリッターシリンジで２〜３分間か
けて添加した。２時間後、ｌ０ｍｇ／ｍＱの塩化ナトリ
ウムを含有する０、１Ｍのピロリン酸ナトリウム１４ｍ
＋ｊ（ｐ）Ｉ８．５）で反応混合液を１５ｍ（ｌに希釈
し、アミコンＩ過装置で洗浄し、微粒子を除去し、次い
で、希釈／濃縮緩衝液として、１０ｍＭのリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて１　、５ｍ（ｌに濃
縮した。最終溶液をリン酸ナトリウム緩衝液で７．０１
に希釈した。アミノデキストランの旋光分析の結果、溶
液ＩＷ１２当たり１．３７７＋＋ｇのアミノデキストラ
ンか測定された。デキストランのソンチレーシジンカウ
ンターによる分析の結果、溶液１ｍＱ当たり４．７０２
ＸｌＯ＝５＊ｍｏ！のノボキシゲニンが測定された。ア
ミノデキストラン及び３１−１−ジゴキシゲニン力ルポ
キジメチルオキシムを標準として用いた。このようにし
てアミノデキストラン１１１ｇ当たり３．４１５ｘ　１
０−１０−５ｘのジグキシゲニンが定量された。

実施例３ （ジゴキシゲニン結合磁性粒子の製造）ジャーナル・オ
ン・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ　、　　ｒ　ｍｍｕ
ｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）（１９８２年）第５２巻、
第３４１〜３５１頁にレンボー等によって記載されたレ
ンボ−（Ｒｅｍｂａｕｍ）磁性酸化鉄の存在下アクリル
酸とアクロレイン誘導体との重合によって生成された磁
性粒子を用いた。ｌ　、　５ｘＣのポリプロピレン製遠
心分離用チューブの中に、表面にアルデヒド基を含有し
ていると報告されている該物質５．０ｍｇを入れ、これ
に、実施例２で製造されたジグキシゲニン結合アミノデ
キストラン（ジグ−デキストラン）溶ａ１８２μρを添
加した。チューブにふたをして、−晩、垂直方向に回転
させた。２分間粒子を集めるために遠心した後、上澄み
をシンチレーションカウンターにかけた結果、磁性粒子
ＩＮｇ当たりジグキシゲニン３６．６μｍｏｌが磁性粒
子に付着していた。該磁性粒子をＰｒ３Ｓ２００μＱで
５回超音波洗浄し、次いで、遠心し、そして、洗浄物を
デカンテーションした。洗浄物をシンチレーションカウ
ンターで測定した結果、約４５％が粒子とともに残って
いた。

この最終分析の結果、粒子１１当たり６．９０ＸＩＯ−
’ｘｍｏ　ｌのジグキシゲニン及び懸濁液ｌπＱ当たり
１．７３Ｘ　１０−”ｍｍｏｌのジグキシゲニンが測定
された。

実施例４ （スクアレート染料結合抗ジゴキシンの製造）３−ジメ
ヂルアミノフェノール、スクアリン酸及び実施例６で生
成されたＮ−エチル−Ｎ−３＝ヒドロキシフエニルグリ
シンメチルエステルの等モル量を、ｎ−ブタノール：ベ
ンゼン（２＋　１　（容量））の混合溶液中で共沸的に
水を除去しながら還流し、次いで、シリカゲルクロマト
グラフィでモノメチルエステル染料を単離することによ
り、ｌ−［４−（ジエチルアミノ）−２−ヒドロキシフ
ェニル］−３−［４−（Ｎ−エチル−カルボキシメチル
アミノ）−２−ヒドロキシフェニル］−２．４−ジヒド
ロキシシクロブテンジイリウムニ水酸化物（二分子内塩
、ＤＥＣＡＳ）を生成した。深青色のメチルエステルを
ＮａＯＨで加水分解した後、酸性化して、ＤＥＣＡＳを
生成した。

０℃で、新しく蒸留された（ＣａＨｔ）ＤＭＦ　１２０
μＱにＤＥＣＡＳ　　３．０即及びＮＨＳ　　Ｏ，９９
解を溶解した溶液にＥＤＡＣ１，３ｍ９を添加し、ＤＥ
ＣＡＳｃ）ＮＨＳエステルを生成した。薄層クロマトグ
ラフィ処理（シリカ、クロロホルム：メタノール−９０
：１０（容量）混合溶液）の結果、ＤＥＣＡＳのＮｌ−
ｌ５エステルの存在を示し、１時間後出発物質の消滅を
示した。

Ｐ　Ｂ　Ｓ　０．５ｍＱにポリクロナールひつじ抗ジゴ
キンン８７ｍ９を溶解した溶液にｐＨ８，５のピロリン
酸ナトリウム（０，ＩＭ）０．５ｍ１２を添加した。０
℃で強く撹拌した抗体溶液に、上記で得られたＤＥＣＡ
ＳのＮ　ＨＳエステル溶液２５μρを２回ゆっくりと添
加した。この時の添加に要する時間は２〜３分間であり
、ついで０℃で２０〜３０パルスの超音波にかけた。

５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣ１及
び塩酸ナトリウム１０ｍｇ／ｍＱから成るｐＨ７の緩衝
液で作ったセファデックスＧ−２５の１８ｆｆ（！床で
クロマトグラフィ処理した。ボイドボリュームバンドを
集め、３日間４°Ｃで遠心し、少量の青色の沈澱物を除
去した後、ＰＢＳ中で作った不溶性のポテトスターチ１
８ａ＆でクロマトグラフィ処理した。最初に移動した前
帯部は、シリカ上にスポットし、ジメトキシエタン酸で
溶出したとき、非共有結合染料を示さなかった。限外シ
濾過で１．２ｉｆ２に濃縮した後、標準としてＤＥＣＡ
Ｓ及びひつじジゴキシンを用いてＰＢＳ／ＢＣＤでＵＶ
分析した結果、６５０ｎｍにλｍａｘを有し、染料と蛋
白質との比率は２゜２であった。

実施例５ （ジゴキシンに関するアッセイ） バッファー゛ ｌ３Ｓ ＰＢＳ／ＢＣＤ ＰＢＳ／ＢＧＧ／トリトン ＰＢＳ／ＳＤＳ 試薬： 実施例４で製造されたひつじ抗ジゴキシン染料コンジュ
ゲート 同容量のＰＢＳ／ＢＧＧ−１−リドン（Ｍ−ジグ）で希
釈された、実施例３で製造された磁性粒子−ジグキシゲ
ニンーアミノデキストラン試薬ＰＢＳ／ＢＧＧ−トリト
ン中の以下の濃度のジゴキシンカリブレーター： １．０ｘｌＯ’ｎ９／ｍσ ３、Ｌ６ｘ　１０’ｎ９／酎 １、ＯＸ　ｌ０３ｎ９／ＲＱ ３．１６ｘ　ｌＯ”ｎ９／１（２ １、ＯＸ　１０”ｎ９／ｆｆ１２ ０ｎｇ／Ｍ（１ プロトコル： Ａｂ染料２５ｕＱをＰＢＳ／ＢＧＧ−）リドン１０ａＱ
に添加し、 カリブレーター５０μｅを添加した。

次いで、ふたをして、２０分間温装した。

Ｍ−ジグ（Ｄ　ｉｇ）１００μＱを添加した。

次いで、垂直回転しながら２時間装置した。

チューブを遠心し、上澄み液を静かに流した。

１〜２パルスの超音波にかけながらＰＢＳ／ＢＧＧ−ト
リトン２００μρを添加した。

チューブを１分間遠心し、上澄み液を静かに流した。

１〜２パルスの超音波にかけなからＰＢＳ／ＢＧＧ−ト
リトン２００μＱを添加した。

チューブを１分間遠心し、上澄み液を静かに流した。

１〜２パルスの超音波にかけながらＰＢＳ／ＢＧＧ−ト
リトン２００μＱを添加した。

チューブを１分間遠心し、上澄み液を静かに流した。

２０〜３０パルスの超音波にかけながら、ＰＢＳ／Ｓ　
Ｄ　Ｓ　５０μσを添加した。

チューブを温流水で２０秒間温めた。

ＰＢＳ／ＢＣＤ１５０μＱを添加した。

チューブを１分間遠心した。

上澄み液１９０．ｃｌをＰ　Ｂ　Ｓ／Ｂ　ＣＤ７５０μ
Ｃで希釈した。

溶液を繊維光学レーザー蛍光読取装置（λｅｘ＝６３３
ｎｍ）で測定した。

結果を第１表に概暗示した。

第１表 上記結果が示しているとおり本発明によるとジゴキシン
に関する速くて、正確で、感度のよいアッセイを実施す
ることができる。ジゴキシンの濃度が２桁（Ｉ　Ｘ　１
０’ｎ９７１Ｎ（からＩ　Ｘ　ｌＯ’ｎ９／　ｍ（ｌに
）増加的に減少するという結果になる。さらに、上記ア
ッセイはジゴキシン濃度Ｉ　Ｘ　１０”ｎｉＦ／　ｍ（
ｌと３．１６ｘ　ｔＯ’ｎ９／ＭＱとを容易に識別した
。

実施例６ （１，３−ビス［４−（Ｎ−エチル−カルボキシメチル
アミノ）−２−ヒドロキシフェニル］−２．４−ジヒド
ロキシシクロブテンノイリウムニ水酸化物（ＤＣＡＳ）
及びそのビスヒドラジドの製造） テトラヒドロフラン８ｒＪＯｍｔｌに３−アセトアミド
フェノール１６１９を溶解した溶液に、ジクロロメタン
にボラン−メチル硫化物を溶解した１、０Ｍ溶液２７５
ＭＱを１〜２時間かけて滴下した。４〜５時間加熱還流
し、次いで、メタノールＩＱにゆっくりと注いだ。溶媒
をヘビーンロツプ状になるまで濃縮し、冷却及びスクラ
ッヂングをして結晶を沈澱させた。固形物を胛取し、メ
タノールに再び溶解した。上記のとおり濃縮及び結晶化
した結果、３−（エチルアミノ）フェノールが収率７４
％で製造された。

記で得られた３−（エチルアミノ）フェノール（４，８
９，３５ｍｍｏｌ）及びエチルジイソプロピルアミン（
４，４５ｇ、３５ｍｍｏｌ）をトルエン２５ｍＱ、中で
合わせた。混合物を１００℃で３０分間加熱し、次いで
、減圧濃縮し、５％容量のメタノール／塩化メチレンを
用いてシリカゲルカラムでクロマトグラフィ処理した。

合わせた画分を飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、０９Ｉ
Ｎ塩酸で中和した。合わせた両分をＮａｔｓＯ４で乾燥
し、濃縮して、Ｎ−エチル−Ｎ−３−ヒドロキシフェニ
ルグリシンメチルエステル７．２４９を得た。

ＬＯｍ（ｌの丸底フラスコ中で上記生成物（０，７８９
，３゜７３ｍｍｏ１）とスクアリン酸（０，１９ｇ、１
．６７ｍｍｏｌ）とを合わせた。ｎ−ブチルアルコール
（１ｍＲ）及びベンゼン４ｍ（ｌを添加し、混合物を一
晩還流した。溶媒をロータリーエバポレーションで除去
した。

上記で得られた乾燥生成物（５０ｍｇ）をＤ　Ｍ　Ｆ’
　１０ｍ１２に溶解し、ヒドラジン無水物１ｙｔＱを添
加した。混合物を一晩、室温で攪拌した。反応混合物を
水５０ＴＩＱで希釈し、希塩酸を添加して生成した沈澱
物を収集し、水で洗浄し、吸引漏斗で乾燥した。

実施例７ （スクアレート染料−ジゴキシンコンジュゲートの製造
） ０℃に維持されているＮ、Ｎ−ツメチルホルムアミド５
酎にジゴキシン３９ＯＮ９（０，５肩ｎｏｔ）を溶解し
、強く撹拌した溶液に、過ヨウ素酸ナトリウム２１４ｍ
ｇ（１，０ｍｍｏｌ）を脱イオン水５ｄに溶解した溶液
を滴下した。反応物を０℃で４時間撹拌し、固形過ヨウ
素酸ナトリウム１０７ｍｇ（０，５ｍｍｏｌ）を添加し
た。更に、１６時間撹拌しながら室温まで徐々に温めた
。

反応物を水１０ＲＱで希釈し、２０分間撹拌した。次い
で、飽和塩化ナトリウム１０１１Ｑを添加し、酢酸エチ
ル１５酎で３回抽出した。酢酸エチル層を合わ仕、水１
５好で６回、飽和塩化ナトリウム１５ｆｆσで１回洗浄
し、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤をデ過し、ロー
タリーエバポレーションで酢酸エチルを除去し、ジゴキ
シンジアルデヒド２４６ｘｇ（収率３１％）を得た。シ
リカゲルによる薄層クロマトグラフィ処理（クロロホル
ム−メタノール（９・１）混合溶液、Ｒｆ　Ｏ，４３）
によって精製し、純度９５％以上とした。

生成物は、これ以上精製せずに次の反応に用いた。

実施例６の方法で生成されたＤＣＡＳビスヒドラジン塩
２５ｍｇ（０，０５ｍｍｏｌ）及び上記で生成されたジ
ゴキシンジアルデヒド７８ｍ９（０，１０ｍｍｏｌ）に
乾燥ジメチルホルムアミド２ＪＩ＋２及びＮ、Ｎ−ジイ
ソプロピルエチルアミン１７μσ（０，１０ｍｍｏｌ）
を添加した。新しい生成物が形成されている間中、４８
時間、窒素の存在下、室温で撹拌した。展開溶媒として
、クロロホルム−メタノール（９：ｌ容量比）混合溶液
を用いて、薄層クロマトグラフィ処理した結果、生成物
はＲｒ　Ｏ，４５を有し、青緑色を呈した。反応混合物
をロータリーエバポレーションによって濃縮乾固し、２
枚の２０　Ｘ　２０ｃｍのシリカゲル型ＧＦ試料用プレ
ートで展開溶媒としてクロロホルム−メタノール（９：
ｌ容量比）混合溶液を用いて、試料用薄層クロマトグラ
フィ処理することによって精製した。Ｒｆ　Ｏ，４５の
生成物に対応するバンドをプレートからこすり落とし、
メタノールでシリカゲルから溶離した。メタノールを濃
縮し、暗線青色の固形生成物を得た。

実施例８ （ひつじ抗ジゴキシンーガロシアニンコンジュゲートの
製造） ０℃で、ｐｉ（８，０のリン酸緩衝食塩水１０ｍ１２に
ひつじ抗ジゴキシン１６ｆｆ（！を撹拌して溶解した溶
液に、乾燥ＤＭＦにガロシアニンＮＨＳエステル（ＤＥ
ＣＡＳのＮＨＳエステルの製造に関する実施例４と類似
の製法によって生成された）を溶解した０、１Ｍ溶液０
．１１を５分間かけて滴下した。０〜４°Ｃで１８時間
撹拌した後、４Ｍのヒドロキシルアミン塩酸塩０．１ｉ
ｆ２を１度に添加し、０〜４℃で３０分間撹拌しつづけ
た。青色溶液をゲルｒ過によって精製し、透析し、遠心
し、１．４４ｍｇ／ｍＱの青色の抗体溶液７．６ｍ（！
を得た。溶液は、抗−ジゴキシン１モル当たり平均２．
６モルのガロシアニンを含有していた。コンジュゲート
の極大吸収波長は、２７８ｎｍ及び６２５ｎｍであり、
コンジュゲートの相対量子収量は、０．０２であった。

実施例９ （コンペティティプアッセイ） アッセイ緩衝液及びアッセイ緩衝液の３種類の試薬スト
ック溶液を製造した： アッセイ緩衝液：ｐ８７．４の１０１！Ｍのリン酸緩衝
食塩水、β−ンクロデキストリン１０ｍＭ及び兎の血清
アルブミン０．１％。

スクアレート染料−ジゴキシンコンジュゲート・スクア
レート染料１．ＩＸ　１０−７Ｍ及びジゴキシン２．２
Ｘ　１０−７Ｍ０ ジゴキシン＋１０００ｎ９／ｘＱ。

ひつじ抗ジグキシーガロシアニンコンジュゲート・抗体
１３．、４　ｍ９／　ｍＱ又は８．４Ｘ　１０−５Ｍ。

（アッセイプロトコール） プラスチック製アッセイカップにスクアレート染料−ジ
ゴキシンコンジュゲートストック溶液１０μＱ１抗体−
ガロシアニンストック溶液１２μＱ、ジゴキシンストッ
ク溶液０．１，２．５．１０．２０゜５０．７５及び１
００μｇ及びアッセイの総容量か２００μｅになる債の
アッセイ緩衝液を添加した。アッセイ溶液を室温で１時
間温置した。次いで、アッセイ緩衝液８００μＱを添加
し、励起源として、６３２．８ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザ
ーを用いて、光フアイバー蛍光光度計で蛍光を測定し、
６６０±１０ｎｍでの発光を測定した。結果を第２表に
示した。

第２表 上記の結果が示しているとおり、本発明によるとジゴキ
シンに関する速くて、正確で、感度のよいアッセイを実
施することができる。ジゴキシンの濃度が２桁（１〜１
１００ｎ／　ｍＱ）増加すると、実測された蛍光が１８
．３３ｋＨｚから３１．２３ｋＨｚに本質的に増加する
という結果になる。さらに上記アッセイは、ジゴキシン
濃度の低いレベル間で、例えば１及び２ｎｇ／ｍ（ｌで
容易に識別した。

実施例１０ （１，３−ビス［４−（ノエチルアミノ）−２−（ヒド
ロキシフェニル）−２，４−ンヒドロキシシクロブテン
ジイリウムニ水酸化物（二分子内塩ＤＥＡＳ）の製造） ＤＥＡＳは、以下のとおり製造した：ｎ−ブタノール・
トルエン（２１）混合溶液９ＯｍＱ中でスクアリン酸（
７４１ｘ９．６５１１ｍｏｌ）と３Ｎ、Ｎ−ノエチルア
ミノフェノール（２，１ｈ、１３ｍｍｏｌ）とを撹拌し
ながら、混合した。混合物を一晩還流し、水を共沸除去
した。次いで、反応物を進行させ、メタノール：トルエ
ン（１：９）混合溶液を用いて、薄層クロマトグラフィ
処理した。次いで、反応混合物を蒸留し、トルエン約４
０吋を除去し、反応混合物を室温まで冷却した。結晶粉
末をろ別し、室温で乾燥し、生成物２．５９を得た。Ｕ
Ｖ（ＤＭＦ）λｍａｘ６５０ｎｍ、　ｅ　−２４０，０
００、蛍光（Ｄ　Ｍ　Ｆ　）６５０／　６６６ｎｍ０実
施例１１ （Ｄ（Ｒｈｏ）型血液型抗原の定量のためのアッセイ）
ジメチルホルムアミド（Ｄ　Ｍ　Ｉ？”　）にＤＥＡＳ
を溶解した飽和溶液をＤＭＦで１：１０（容量）に希釈
した。連続渦巻条件下、ＤＥＡＳ希釈溶液５０μＱに０
（Ｒｈｏ）型陽性の全血試料１ｍＱを滴下し、混合した
。

得られた混合溶液１０μａと、Ｄ（Ｒｈｏ）型血液型抗
原に特異的な抗体（商業的に入手可能なタイピング試薬
）１０μＱとを混合した。混合物を、１分間、周囲の温
度に保持し、次いて、血清アルブミン及びスクロースを
含有するリン酸援衝液１．５ｕＱで希釈した。

容量限定法及び米国特許第４，５６４．５９８号明細書
（米国特許出願第３９７，２８５号、出願臼１９８２年
７月１２日）に開示されている粒子計数装置によって、
細胞の凝集反応の結果として起こる蛍光の変化について
媒質を分析した。

スプリッター・モニター（ＦＯＭＳ−８５０−Ｐ型、カ
リフォルニア州パウロ・アルドのカブトロン・インコー
ポレーション）から得られた“Ｙ”形繊維光学カップラ
ーの単一になっている方のファイバ一端を培地に＆ａし
た。該ファイバーは、直径５０ミクロンであり、半角１
２°及び有効試料容量Ｉ　Ｘ　”ｒＯ−７ｍＱの励起錐
体を有していた。２つに枝分かれした繊維の一方にＨｅ
−Ｎｅレーザー（６３２，９ｒ＋ｍ）からの励起光を注
いだ。浸漬された繊維の端に差し込まれているセルから
発せられた蛍光は、２つに枝分かれした繊維に均等に伝
導するように繊維の岐路で分かれる。干渉を１過により
除去した後、２番目の枝分かれした繊維を進んでいる部
分を嵩増加ＥＭＩ光電子増倍管により、妨害光のシ戸去
後、５０−５００秒にわたる時間の間、０．１秒に１回
の割合で、ゲートタイム１ミリ秒で読取った。

ゲートタイム当たりの蛍光パルスの平均値をコンピュー
ターで定めた。

標準発光レベルを確立するために２種類の対照実験を行
った。

ａ）常用のタイピングによってＤ（Ｒｈｏ）型陰性の型
になっている試料を同じ方法でアッセイした。

ｂ）商業的に利用でき、抗体以外は、Ｄ（Ｒｈｏ）型タ
イピング剤の全成分を含有している“Ｒｈ対照”剤を、
抗体剤の代わりに上記アッセイに用いた。

５つの陽性及び５つの陰性の個体から得られた試料の結
果を第３表に概略示した。

第３表 ＊前記の変動分析によってシグナルを得た。シグナル４
０以上は、陽性とみなした。

実施例ｌ２ ＡＳＢ及びＯ型の血液型抗原に関して、各々Ａ（αＡ）
及びＢ（αＢ）型の血液型抗原に特異的な抗体及び０型
個体（αＡ、Ｂ）から得られた抗体を用いて、実施例１
１のアッセイを繰り返した。次いで、キンスラント（前
掲）の示唆に従って、ＤＥＡＳとβ−ンクロデキストリ
ンとで錯体を作った。結果を第４表に概略示した。

第４表 ＊前記の変動分析によってノブナルを得た。シグナル４
０以上は、陽性とみなした。

上記データが示しているように、蛍光化合物としてスク
アレート染料を用い、スクアレート染料の励起エネルギ
ー源としてＨｅ−Ｎｅレーザーを用いた本発明の改良さ
れた蛍光アッセイ法は、血液型抗原のような幅広く多様
な分析物をアッセイするために有用である。また、通常
、該方法は単一工程で実施する。二とができる。そして
、アッセイの感度の良さで試料の他の成分からのバック
グラウンド干渉の影響は、最小にすることができる。

さらに分離工程及び洗浄工程なしで、アッセイの結果を
得ることができる。

上記実施例を挙げて本発明の詳細な説明したが、本発明
の趣旨及び範囲内において多様化及び変化することがで
きる。

特許出願人　シンテックス（ニー・ニス・エイ）インコ
ーホレイテッド

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料中のアナライトの測定用アッセイに使用する
   ものであって、染料と、リガンドおよびその相補的レセ
   プターからなる特異的結合対（ｓｂｐ）の一員とのコン
   ジュゲートである化合物において、上記コンジュゲート
   中の染料としてスクアレート染料を用いることを改良点
   とする、化合物。
2. （２）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＤおよびＹは、同一または異なって、それぞれ
   −ＣＨ＝および−Ｎ＝からなる群から選ばれた部分１〜
   ６個の鎖を含み、上記鎖は交互の単結合および２重結合
   を含むとともにＯ、Ｓおよびジ置換窒素からなる群から
   選ばれた官能基で終結し、ＤおよびＹの両者における上
   記部分の数および上記末端官能基の合計は偶数であり、
   上記鎖、またはその末端官能基を含む部分は脂肪族また
   は１個またはそれ以上の脂環式もしくは芳香環の部分、
   またはそれらの組合わせであり、上記鎖または環、また
   は官能基は水素以外に１−３０個の原子を含む置換基０
   個、１個またはそれ以上を有し、上記原子は炭素、酸素
   、窒素、硫黄、原子番号９−５３のハロゲン、ひ素、け
   い素、セレンおよびりんからなる群から選ばれたもので
   あって、上記置換基は一緒になって脂環式もしくは芳香
   環であり得る環を１個またはそれ以上形成していてもよ
   く、ＤまたはＹの少なくとも一方はＡに結合し、Ａは、
   リガンドおよびその相補的レセプターからなる特異的結
   合対（ｓｂｐ）の一員少なくとも１個を含む基であり、
   ｎは平均してｌからＡの分子量を１００で割った値まで
   の数であり、ｑは１または２である］ を有する、特許請求の範囲第１項記載の化合物。
3. （３）下式の化合物 ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） および ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） ［式中、Ａ＿３は特異的結合対の一員、 ｎ＿３は平均してｌからＡ＿３の分子量を５０００で割
   った値までの数、 ｔは１または２、 ｑ＿３は１または２、 Ｒ＿３は、炭素原子１−１０個、酸素原子０−６個、お
   よび窒素原子０−３個を有する置換基群から独立に選ば
   れた基であり、また一緒になって脂環式もしくは芳香環
   を形成することができ、 Ｒ＿４は、ヒドロキシ、水素、ホスフェート、ホスホネ
   ート、スルホネート、ニトロ、ハロゲン、アミノおよび
   Ｒ＿３からなる群から独立に選ばれた基、ＬはＲ＿３の
   任意の水素を置換するものであり、結合手またはＡ＿３
   に対する結合基である］ からなる群から選ばれたものである、特許請求の範囲第
   ２項記載の化合物。
4. （４）窒素上のＲ＿３の少なくとも１個がＬで置換され
   た水素を有するものである、特許請求の範囲第３項記載
   の化合物。
5. （５）窒素上のＲ＿３の残り全部が炭素数１−５の低級
   アルキルである、特許請求の範囲第４項記載の化合物。
6. （６）ｔが１、Ｒ＿４がヒドロキシである、特許請求の
   範囲第３−５項の何れか１項記載の化合物。
7. （７）Ｌが非オキソ・カルボニル、カルバモイル、チオ
   カルバモイルおよびアミノから選ばれたものである、特
   許請求の範囲第３−６項の何れか１項記載の化合物。
8. （８）スクアレート染料が６００ｎｍより大きな極大吸
   収を有する、特許請求の範囲第１−７項の何れか１項記
   載の化合物。
9. （９）アナライトを含有する疑のある試料中のアナライ
   トのアッセイ法であって、アナライトが特異的結合対の
   一員（ｓｂｐ構成員）であり、上記方法が染料にコンジ
   ュゲートとたｓｂｐ構成員を含む方法において、上記染
   料としてスクアレート染料を用いることを改良点とする
   、アッセイ法。
10. （１０）アッセイが、アッセイ媒質中で、試料、ｓｂｐ
    構成員染料化合物および第３のｓｂｐ構成員を合わせ（
    ここで３種のｓｂｐ構成員中２種は残る構成員に対して
    相補的である）、 上記試料中におけるアナライトの存在または量に関連す
    るものとして化合物の蛍光に対する上記試料の効果を測
    定することを含む、特許請求の範囲第９項記載のアッセ
    イ法。
11. （１１）第３のｓｂｐ構成員が、化合物に上記第３のｓ
    ｂｐ構成員が結合したとき化合物の蛍光を消滅させる能
    力のある化合物にコンジュゲートしている、特許請求の
    範囲第１０項記載のアッセイ法。
12. （１２）関心の対象である物質を含む疑のある試料中の
    上記関心の対象物質のアッセイ法であって、蛍光化合物
    を用いて上記試料中における関心の対象物質の存在また
    は量に関連してシグナルを発生させ、また上記蛍光化合
    物を励起させるためにエネルギー源を用いる方法におい
    て、蛍光化合物としてスクアレート染料を用い、エネル
    ギー源としてヘリウム／ネオンレーザーを用いることを
    改良点とする、アッセイ法。
13. （１３）スクアレート染料が水相容性である、特許請求
    の範囲第１２項記載のアッセイ法。
14. （１４）スクアレート染料がセルに含有されない、特許
    請求の範囲第１２または１３項記載のアッセイ法。
15. （１５）アナライトを含有する疑のある試料中のアナラ
    イトの存在または量の測定用キットであって、上記アナ
    ライトが特異的結合対の一員であり、キットがパッケー
    ジされた組合わせとして、 第２のｓｂｐ構成員にコンジュゲートしたスクアレート
    染料からなる第１の化合物、 第３のｓｂｐ構成員からなる（ここで上記３種のｓｂｐ
    構成員中の２種は残るｓｂｐ構成員に対して相補的であ
    る）第２の化合物、および 必要に応じて補助物質 を含むものである、キット。
16. （１６）ｓｂｐ構成員をスクアレート染料とコンジュゲ
    ートさせることを特徴とする、特許請求の範囲第１項記
    載の化合物の製造法。